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Objetivos
Conocer las caractersticas generales de las enzimas como
catalizadores biolgicos. Adquirir la
habilidad para medir la actividad de una enzima utilizando un
mtodo espectrofotomtrico.
Relacionar los distintos parmetros asociados a la medicin de la
actividad enzimtica que
permiten seguir y evaluar la purificacin de una enzima
Hiptesis
Si la reaccin catalizada por la enzima LDH en el sentido
piruvato a lactato oxida al NADH a NAD +,
entonces la absorbancia ir disminuyendo conforme pase el tiempo
ya que el NADH absorbe a 340
nm pero no su forma oxidada.
Resultados
Ocupamos las fracciones F1, F2, F3 de la parte 1 extraccin y
precipitacin por salado de la
prctica Purificacin de la enzima LDH de msculo esqueltico de
pollo.
Hicimos varias diluciones a cada fraccin para poder seguir la
reaccin catalizada por la LDH, de
manera que no fuera ni muy rpida ni muy lenta y pudiramos
obtener as una buena tendencia al
graficar Absorbancia vs tiempo.
Iniciamos con la F3 de la cual tomamos 2 L y 995 L de H20 lo que
nos da un factor de dilucin de:
FD= 1000 L /2 L = 500
Para la F1 y F2 se tomaron 5 L y 495 L de H2O obteniendo un FD=
500 L /5 L = 100Preparamos celdas con 600 L de 100mM amortiguador
de fosfatos, 36 L de 10 mM piruvato y
291 L agua. Adicionamos a una de ellas 63 de 4 mM NADH, tapamos
con parafilm y agitamos,
lemos la absorbancia a 340 nm; inmediatamente aadimos 10 L de la
F3 tapamos con parafilm,
agitamos y lemos la absorbancia.
Para el clculo de la actividad enzimtica en cada una de las
fracciones realizamos una curva
temporal de la actividad enzimtica de la LDH para cada fraccin
(figuras 1, 2 y 3).
Figura 1. Curva temporal de la LDH extrada en la fraccin 1.
Actividad total de la LDH en la fraccin 1:
()
() ( )
y = -0.1339x + 0.8536
R = 0.9947
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.60.7
0.8
0.9
1
- 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00
Abs
Tiempo (min)
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Figura 2. Curva temporal de la LDH extrada en la fraccin 2.
Actividad total de la LDH en la fraccin 2:
()
() ( )
Figura 3. Curva temporal de la LDH extrada en la fraccin 3.
Actividad total de la LDH en la fraccin 3:
()
() ( )
y = -0.1412x + 0.8707
R = 0.9975
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
- 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00
Abs
Tiempo (min)
y = -0.1286x + 0.7592
R = 0.9961
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
- 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50
Abs
Tiempo (min)
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Tabla 1. Tabla de purificacin de la LDH de musculo esqueltico de
pollo.
Procedimiento
Proteina
total en la
fraccin
(mg)
Actividad
total
(mmol/
min)
Actividad
enzimatica
especifica (mmol
min-1
mg-1
)
Grado depureza o veces
de purificacin
Rendimiento
Homogeneizado
F111237 0.2368 2.107 x 10
-51 100
Sobrenadante de la
precipitacin con
sulfato de amonio 45%
F2
6328.298 0.2497 3.945 x 10-5
1.872 105.44
Botn obtenido de la
precipitacin con
sulfato de amonio 70%
F3
2114.043 1.1371 53.788 x 10-5
25.528 480.194
Discusin
Para evaluar de manera cuantitativa el xito de una purificacin
de protenas se evalu el
rendimiento, que corresponde al porcentaje de actividad biolgica
en cada paso de la purificacin,
y el grado de pureza a lo largo del proceso.
La purificacin debera proporcionarnos una muestra proteica que
contuviera solo un tipo de
molcula, sin embargo en nuestro ensayo solo pudimos medir la
actividad enzimtica de las
fracciones extradas por salado con sulfato de amonio, ya que no
obtuvimos protena en las
fracciones obtenidas por cromatografa de afinidad.
Observamos que la absorbancia va disminuyendo conforme avanza el
tiempo esto debido a que el
NADH es convertido a su forma oxidada NAD+molcula que no absorbe
a 340nm, los valores de
actividad van incrementando conforme a las fracciones obtenidas,
en F2 es mayor que F1 ya que
esta se obtuvo despus de la precipitacin con (NH4)2SO4, y en la
F3 se obtuvo una valor mucho
ms grande de actividad dado que esta fraccin la obtuvimos del
botn que contena mayor
concentracin de protena.
Un alto grado de purificacin y un bajo rendimiento proporcionan
poca protena con la que
experimentar, mientras que un alto rendimiento con una baja
purificacin deja muchos
contaminantes (protenas diferentes de la de inters) en la
fraccin y complica la interpretacin de
los experimentos, experimentalmente observamos que la fraccin F3
tiene un mayor grado de
pureza y mayor rendimiento que en las otras fracciones, sin
embargo se esperaba que tuviera un
menor rendimiento ya que en estos procesos se tiende a la
perdida de protena, este resultado se
podra atribuir a que la actividad total de la protena no era
nicamente de LDH pura en la
fraccin 3.
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Conclusin
A travs de hacer uso de los criterios principales de la
actividad enzimtica y mediante el
seguimiento de la concentracin de NADH durante un intervalo de
tiempo se logr determinar la
actividad de la LDH en las fracciones obtenidas durante el
proceso de purificacin. Determinar la
actividad de una enzima como es la LDH puede tener relevancia si
se tiene una mezcla de
isoenzimas y se requiere slo de una de ellas podra saberse que
isoenzima se encuentra en una
muestra determinada ya que aunque todas tienen actividad de LDH,
tienen diferentes afinidades
por el lactato y el piruvato.
Bibliografa
1. Teijn R. J. 2001. Bioqumica estructural. Ed. Tbar. 1ra
edicin. Espaa.2. Berg, J. M. et al. 2008 Bioqumica. Editorial
Revert S. A. 1ra edicin Espaa.3. Voet. 2006. Bioqumica. Ed. Mdica
Panamericana. 3ra edicin. Argentina.
