Datación filogenética de la familia de la papaya y sus cultivos más relacionados revelando su historia biogeográfica

MATERIAL DE ESTUDIO

• -Se evaluaron las 34 especies reconocidas en la última revisión de Caricaceae.

• Se excluyó Vasconcellea heilbornii, un híbrido estéril entre V. cundinamarcensis, V. stipulata y V. werbauueri.

• 7 de 13 sp. de Moringaceae fueron elegidos como grupos extremos.

PROCEDIMIENTO REALIZADO

• La extracción se realizó de tejido de hojas. De 1 a 23 mg . Raramente de hojas secas en herbarios.

• Kit de extracción NucleoSpin, Macherey-Nagel, Düren, Germany)

• PCR realizado con protocolo estándar, usando Taq DNA polymerase y 22 primers diferentes (psbA-trnH, etc.)

• Productos de PCR fueron purificados con ExoSap clean-up kit.

• La secuenciación se confió en Big Dye Terminator kits y secuenciador automatizado ABI 3130.

• Se secuenciaron en total 228 secuencias cloroplastidiale(trnL–trnF, rpl20–rps12, psbA–trnH intergenic spacers, matK and rbcL genes)s y 35 nucleares (ITS1 y ITS2).

• Las nuevas secuencias fueron buscadas y luego subidas a BLAST , y fueron alineadas usando MAFFT vs. 6 con parámetros por defecto(http://mafft.cbrc.jp/alignment/server/).

• La estrategia de alineamiento múltiple Q-INS-i fue elegido para secuencias ITS, ya que considera la estructura secundaria y se recomienda para alineaciones de muy divergentes ncRNAs

• Errores menores de alineamiento fueron ajustados manualmente MacClade vs 4,06.

• Los alineamientos fueron exportados al servidor de corrida Gblocks vs. 0.91b con las opciones menos estrictas seleccionadas.

ANÁLISIS FILOGENÉTICO

• La base de datos cloroplástico y nuclear se combinaron, produciendo una matriz de 4711 caracteres alineados.

• Arboles filogenéticos fueron estimados con análisis de máxima verosimilitud (Maximum likelihood ML) en RAxML GUI vs. 0.93, y optimización bayesiana en BEAST vs 1.6.1.

• Análisis ML en modelo GTR+C con 6 rangos de categoría, modelos independientes para cada partición y parámetros estimados por duración de corrida específica.

• Análisis estadístico apoyado también por método bootstraping ,bajo 100 repeticiones.

• Análisis Beast basado enuncorrelated lognormal relaxed clock, el modelo de sustitución GTR + con 4 categorías y un árbol de Yule.

• Monte Carlo Markoc chains(MCMC) fueron corridas por 10 millones de generaciones, con parámetros de muestreo cada 1000 generaciones.

• Los archivos Log fueron analizados por Tracer vs. 1.5 para evaluar la convergencia y confirmar que el tamaño de muestra efectiva era mayor a 200, lo que indica que las cademas MCMC corrieron lo suficiente para llegar a la estacionalidad.

• Después se descartaron 10% de los árboles guardados como burn-in. Y un máximo de credibilidad en los árboles restantes se produjo utilizando TreeAnnotator(part of the BEAST package) y FigTree vs. 1.3.1 (http://tree.bio.ed.ac.uk).

• Se recurrió a una segunda calibración del reloj molecular, estimando el año del nodo Caricaceae/Moringaceae en la media de 65 Ma y una desviación estándar de 2 Ma.

• Dos alineaciones de 26 accesiones de plantas se utilizaron para la datación, uno que consiste genes plastidiales matK y rbcL («lento»), que exhiben bajas tasas de sustitución de nucleótidos; el otro consiste en seis marcadores (rápida).La datación se realizo utilizando BEAST con modelos de no correlación de reloj relajado para los marcadores “rápidos” y estricto para los “lentos”.

Análisis biogeográficos

• Las rangos de especies fueron asignados a una de las tres regiones: (1) África; (2) América del Sur, incluyendo al sur de Panamá, y (3) América central ,de Costa Rica a México.

• Área de reconstrucción Ancestral (AAR) se basó en el enfoque ML de dispersalextinction-cladogénesis (DEC) implementado en LAGRANGE.

• Usando una herramienta en línea (http: //www.reelab.net / lagrange / configurador / index), con el número máximo de áreas ancestrales limitados a dos. Sin restricciones de dispersión definidas fueron generados Phyton input scripts.

Resultados: