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Degradación de Poliestireno mediante la microbiota del Tenebrio molitor y

Artemia franciscana

Resumen

El poliestireno (PS) es un problema de contaminación a nivel mundial, debido a la

deficiencia de su reutilización y la dificultad para ser degradado. Con el objetivo de

encontrar una solución sustentable a este conflicto se realizaron diversas pruebas con

la microbiota de las larvas del Tenebrio molitor y la Artemia franciscana para

determinar la capacidad de degradación de este polímero.

Para la realización de esta investigación se alimentaron durante una semana las

larvas de Tenebrio molitor con espuma de poliestireno y las Artemia franciscana con

alimento comercial.

Posteriormente, se obtuvo la microbiota por disección del tubo digestivo de las larvas

de Tenebrio molitor y del encéfalo de la Artemia franciscana la cual se incubó a 30 ±

2 ºC por cinco semanas en medio libre de carbono adicionando 1 g de poliestireno

para emplearlas en la degradación de espuma de poliestireno.

De la microbiota obtenida se realizó el aislamiento sobre placas con medio Luria

Bertaini a 24 h y 30 ± 2 ºC. Las colonias aisladas fueron incubadas en caldo nutritivo

permitiendo el desarrollo bacteriano el cual se cuantificó por el método McFarland.

Los resultados obtenidos hasta el momento nos permiten concluir que la larva de

Tenebrio molitor tiene la capacidad para consumir el poliestireno y las bacterias

aisladas de su tracto digestivo pueden utilizar el PS como fuente de carbono. Sin

embargo, las bacterias aisladas de la Artemia franciscana no son capaces de

degradar el poliestireno.

Introducción

Antecedentes

La contaminación producida por los polímeros ha crecido de manera exponencial en

los últimos años por lo que distintas instituciones han dedicado sus esfuerzos a la

investigación en la degradación de los mismos. También se ha buscado diversas

soluciones como el uso de plásticos biodegradables, compuestos de almidón o

colágeno que permanecen poco tiempo en el ecosistema. No obstante, la desventaja

de estos productos es el elevado costo de producción en comparación al costo de los

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plásticos tradicionales, razón por la cual, los plásticos tradicionales siguen siendo el

principal producto industrial (Zimmer; 2015).

Uno de los polímeros más utilizados a nivel mundial es el poliestireno junto con el

polietileno, polipropileno y el PVC con una demanda mundial de aproximadamente

21.6 millones de toneladas al año (Góngora, 2014). Uno de los riesgos

medioambientales ocasionados por la producción de espuma de poliestireno es que

libera sustancias químicas perjudiciales a la atmósfera e incrementa los gases de

efecto invernadero, con lo que aumenta la contaminación de nuestro suministro de

aire y de la capa de ozono.

Por lo que en diversas ciudades del mundo se ha prohibido el uso de PS por las

repercusiones ambientales y la dificultad para su disposición, reciclado o degradación.

Así en Estados Unidos de América ya son más de 70 las ciudades estadounidenses

(Washington DC, San Francisco, Minneapolis, Portland y Seattle, entre ellas) que

prohíben su uso. En otras latitudes como París o Toronto el tema es objeto de debate

(BBC, 2015).

Además, algunas investigaciones indican que el PS causa graves daños en los

ecosistemas marinos, el poliestireno presente genera dos clases de problemas para

los animales marinos: mecánicos y biológicos. Al causar problemas en las vías

respiratorias, además puede absorber contaminantes tóxicos presentes en el

ecosistema (BBC, 2015).

Marco Teórico

El estireno es un hidrocarburo de fórmula C8H8 que al ser polimerizado da como

resultado el poliestireno (PS), el cual es un polímero termoplástico [−CH (C6H5) CH2−]n

muy frágil a temperatura ambiente, por lo cual se modifica mediante la adición de

polibutadieno, para mejorar su resistencia al impacto llamándose así poliestireno de

alto impacto (HIPS, por sus siglas en inglés) también conocido como poliestireno de

espuma, este polímero posee buena resistencia dimensional, propiedades

balanceadas de fuerza y resistencia al calor. Debido a su resistencia al impacto, su

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fácil manejo y bajo costo son típicamente utilizados para aplicaciones del hogar,

juguetes y componentes eléctricos (Blackwell plastics, 2012).

Como todos los polímeros termoplásticos, tienen cualidades hidrófobas que impide

que sean vulnerables a la hidrólisis. Además, el uso de antioxidantes y retardantes de

flama durante el proceso de elaboración, incrementan la vida y la calidad del producto,

pero también impiden su degradación y oxidación (Ho, Roberts, & Lucas; 2017).

Se sabe que este material representa una problemática ambiental ya que es

industrializado en gran cantidad y su reciclaje ha sido deficiente incluso, Kaplan et al.,

(1979) sostienen que, en un hábitat natural, la degradación de este polímero por

medio de microorganismos, hongos e invertebrados es menor al 1%. Sin embargo,

Otake et al., (1995) informaron que una lámina de PS dejada por 32 años en un hábitat

natural, no tenía signos de haber sido degradado.

María Laura Ortiz Hernández del Centro de Investigación en Biotecnología de la

Universidad Autónoma del Estado de Morelos (UAEM), indica que una fuerte

problemática en México es que no existe la suficiente infraestructura para el reciclaje

de los residuos de plástico, por lo que usualmente tienen que enviarlos a países con

mayor infraestructura (La jornada, 2013) lo que evita que se realice un tratamiento

adecuado de estos residuos en el país.

El uso del poliestireno trae consigo diversos conflictos como lo es el cambio de los

ecosistemas debido a su toxicidad, problemáticas de salud, contaminación de cuerpos

de agua, entre otros. Ho B., et al., (2018) por lo que se han realizado diversas

investigaciones en las cuales se buscan diversas alternativas en las que se pretende

alcanzar la degradación de polímeros.

En este sentido, la bacteria Ideonella sakaiensis, encontrada por Yoshida, et al.,

(2016), es capaz de descomponer el tereftalato de polietileno (PET). Así lo mostraron

los resultados de laboratorio, donde se observó la degradación de un rollo de PET en

seis semanas a una temperatura de 30º C. También Yang, et al., (2015), investigaron

la capacidad de las bacterias Bacillus sp.YP1 y Enterobacter asburiae YT1 para

degradar polietileno. El grupo de Khan del World Agroforestry Centre (ICRAF) y del

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Instituto Botánico Kunming, en China demostraron que el hongo Aspergillus

tubingensis es capaz de degradar el HPDE (polietileno de alta densidad).

No obstante, investigaciones realizadas por Yang, et al., (2015) han mostrado la

capacidad para degradar poliestireno por Exiguobacterium sp. strain YT2, encontrada

dentro del tubo digestivo de la larva del Tenebrio molitor (Figura 1). A su vez, se han

realizado investigaciones donde se ha logrado el aislamiento de Exiguobacterium

mexicanum en el cerebro de la Artemia franciscana (Figura 2) (Moraga, Ávila y Vilaxa;

2015). Este pequeño organismo es un crustáceo normalmente utilizado como

alimento vivo de peces debido a su alto contenido proteico (Sánchez-Osuna et al.,

2012).

Figura 1. Larva de Tenebrio molitor Figura 2. Artemia franciscana vista desde el

microscopio estereoscópico.

El género Exiguobacterium, son bacterias descritas como gram positivas, anaerobias,

que han logrado ser aisladas en diversos ecosistemas (muchas veces, ecosistemas

muy diferentes entre sí) entre una temperatura de 12 a 55 ºC. Este género de

bacterias se ha usado para aplicaciones biotecnológicas (Vishnivetskaya, Kathariou

& Tiedje; 2009).

Algunas cepas del género Exiguobacterium, además de soportar distintas

temperaturas, son halotolerantes, pueden crecer en un amplio rango de pH (5 - 11),

toleran la radiación UV y estrés por presencia de metales pesados y no metales como

el arsénico (Pandey, Renu & Bhatt; 2016).

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Por otra parte, trabajos la revista Environmental Science and Technology, indicó que

la bacteria Exiguobacterium sp. strain YT2 tiene la capacidad de degradar el

poliestireno.

Objetivos

General

● Utilizar la microbiota de Tenebrio molitor y Artemia franciscana para degradar

espuma de poliestireno bajo condiciones controladas.

Particulares

● Extraer y cultivar la microbiota de Tenebrio molitor y Artemia franciscana.

● Aislar las bacterias con capacidad de degradar la espuma de poliestireno.

Planteamiento del problema

El poliestireno, polietileno, polipropileno y el PVC son los plásticos más consumidos

con una demanda mundial de aproximadamente 21.6 millones de toneladas al año

(Góngora, 2014). Por lo que en los últimos años se ha buscado la producción de

plásticos biodegradables, pero aún se tiene un alto costo de producción.

Debido a que el PS tiene un bajo reciclaje y su degradación en el ambiente puede

tardar miles de años es uno de los polímeros que usualmente es desechado al

ambiente, tanto en el suelo como en cuerpos de agua. En especial, los sistemas

acuáticos son vulnerables a la contaminación por PS, debido a su alta porosidad

puede absorber contaminantes que posteriormente pueden llegar a ser liberados en

el agua dañando la flora y fauna marina, y en consecuencia también a los seres

humanos. Por lo que es importante buscar opciones viables para su degradación,

siendo el uso de la microbiota del Tenebrio molitor y la Artemia franciscana una

propuesta favorable y sustentable con el ambiente.

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Justificación

Actualmente, no se puede prescindir del uso de polímeros ya que se encuentran en

muchos bienes materiales y de uso cotidiano como bolsas, empaques, telas, entre

otros; estos objetos, dejan de ser utilizados en un corto tiempo comparado con su vida

útil, hecho que representa un gran problema, pues los polímeros como el poliestireno

poseen tiempos de degradación muy altos y permanecen en el ambiente durante

miles de años.

Por lo que es indispensable el uso de métodos biotecnológicos para la degradación

de diversos polímeros, por lo tanto, proponemos investigar si la microbiota del

Tenebrio molitor y la Artemia franciscana pueda ser una opción viable para la

degradación del PS y de esta forma contrarrestar sus efectos negativos en los

ecosistemas.

Hipótesis

La microbiota del Tenebrio molitor y de la Artemia franciscana permitirá la

degradación de espuma de poliestireno bajo condiciones de laboratorio.

Desarrollo

Tenebrio molitor

El diseño experimental constó de tres tratamientos con tres réplicas cada uno (Figura

3); en cada tratamiento se colocaron 15 larvas del Tenebrio molitor. Las larvas del

primer tratamiento se alimentaron con 3 g de alimento (15 g alimento de engorda de

pollo, 35 gramos de salvado, 25 g de harina de maíz y 25 gramos de avena hojuela),

en el segundo se colocaron dos gramos del alimento y un gramo de poliestireno; en

el tercer tratamiento fue colocado un gramo de poliestireno. Esta dieta se mantuvo

durante una semana, tiempo en el cual se midió cada día la masa de los organismos

y del poliestireno.

Posteriormente, las larvas fueron diseccionadas para poder obtener su contenido

gástrico, el cual se lavó con solución salina, se homogeneizó con un vortex por 5

minutos y se adicionaron a matraces con 80 mL de disolución libre de carbono

adicionada con 1 g de poliestireno previamente sanitizado con etanol 96 % y solución

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salina isotónica (SSI) estéril. Los matraces se mantuvieron por 35 días en la estufa

de cultivo a 30 ºC (Figura 4).

Figura 3. Tratamientos en los que se les dio una dieta específica a las larvas del Tenebrio

molitor

Figura 4. Tratamientos con la microbiota inoculada en la estufa de cultivo, donde fueron

incubados por cinco semanas.

Tras el tiempo de incubación, las bacterias se pasaron a placas con Luria Bertaini

(LB) (Figura 5) adicionando 1 mL y de 0.5 mL del inóculo e incubadas por 48 h a 30

ºC. Después, de las colonias aisladas se pasaron a tubos de ensayo con 7 mL de

caldo nutritivo (CN) se dejaron crecer 24 h a 30 ºC. Este cultivo sirvió para inocular

matraces con 80 mL de CN y se crecieron 24 h a 30 ºC. Las bacterias se obtuvieron

por centrifugación de 3 mL del cultivo de CN a 5000 rpm por 10 minutos, las bacterias

se lavaron con SSI estéril. Posteriormente, se resuspendieron en SSI y se llevó a cabo

la cuantificación por densidad óptica mediante el método de McFarland. Finalmente,

una vez medidas las bacterias se inocularon de nuevo en 80 mL de medio libre de

carbono en los cuales se colocaron 0.2 g de poliestireno en cada matraz (Figuras 6 y

7).

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Figura 5. Realización del sembrado, teniendo así

tres métodos por cada tratamiento: estría radial,

extensión de 1 mL y extensión de 0.5 mL.

Figura 6. Preparación de los matraces con

poliestireno en medio libre de carbono para la

etapa final.

Figura 7. Colonias inoculadas en solución libre de carbono con 0.2 g de poliestireno.

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Artemia franciscana

Se tomaron de 20 Artemias franciscanas por triplicado, donde fueron diseccionadas

para obtener la microbiota de su cabeza (Figura 8). Las cabezas se colocaron en

tubos de ensayo con SSI estéril y se homogeneizaron con ayuda de un vortex por 5

minutos. Con esta solución se inocularon los matraces con 80 mL de SLC adicionada

con 1 g de poliestireno. Los matraces se mantuvieron por 35 días en la estufa de

cultivo a 30 ºC (Figura 5).

Figura 8. Realización de la disección de la Artemia franciscana con el microscopio estereoscópico en

área estéril.

El tratamiento que se siguió es el descrito anteriormente para las larvas de Tenebrio

molitor (Figuras 6 y 7).

Resultados

En la Tabla 1, se muestran los cambios en el peso del poliestireno de los tratamientos

para las larvas de Tenebrio molitor. Los datos mostrados son el promedio de las tres

réplicas y las mediciones se realizaron diariamente.

Tabla 1. Peso promedio en g del poliestireno de cada día por tratamiento.

D1 D2 D3 D4 D5 D6

T2 0.0338±0.0004 0.0339±0.0003 0.0338±0.0003 0.0336±0.0004 0.0343±0.0017 0.0336±0.0018

T3 0.0672±0.0000 0.0669±0.0000 0.0667±0.0001 0.0680±0.0029 0.0718±0.0098 0.0718±0.0098

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Por su parte, en la Tabla 2, se aprecia el cambio del peso diario de las larvas. Esto

con el objetivo de comparar su aumento o disminución de peso en los distintos

tratamientos.

Tabla 2. Peso promedio en g de los tenebrios de cada día por tratamiento.

D1 D2 D3 D4 D5 D6

T1 0.1135±0.0133 0.1152±0.0124 0.1152±0.0126 0.1150±0.0116 0.1174±0.0135 0.1155±0.0126

T2 0.1119±0.0068 0.1143±0.0048 0.1135±0.0046 0.1150±0.0038 0.1179±0.0035 0.1121±0.0098

T3 0.1176±0.0081 0.1161±0.0079 0.1129±0.0101 0.1096±0.0095 0.1090±0.0092 0.1082±0.0092

En la Tabla 3, se muestran los promedios (tres réplicas) de consumo de poliestireno

por cada larva dentro de los tratamientos, esto debido a que los organismos utilizados

se transforman en pupas, escarabajos o murieron.

Tabla 3 Diferencias entre los promedios de las larvas y del poliestireno por cada tratamiento entre días.

Dia 1-Dia 2

Dia 2-Dia 3

Dia 3- Dia 4

Dia 4-Dia 5 Dia 5- Dia 6

Cambio total

T1 Larvas 0.0017 0.0000 -0.0001 0.0023 -0.0018 0.0021

T2 Larvas 0.0024 -0.0008 0.0015 0.0028 -0.0057 0.0003

Poliestireno 0.0001 -0.0001 -0.0002 0.0007 -0.0007 -0.0002

T3 Larvas -0.0015 -0.0033 -0.0033 -0.0006 -0.0009 -0.0095

Poliestireno -0.0003 -0.0003 0.0014 0.0038 -0.0001 0.0045

Los resultados de la Tabla 4, soportan el uso de poliestireno como fuente de carbono

por la microbiota de las larvas de Tenebrio molitor. Los resultados indican que existió

un cambio de masa entre 0.5 y 0.6 g. Sin embargo, en el caso de los tratamientos de

Artemia franciscana no se observó un cambio real en la masa de poliestireno. En este

punto es necesario aclarar que el valor inicial de la masa de poliestireno fue medido

con un instrumento de menor sensibilidad, motivo por el que solo se tiene un decimal.

Tabla 4 Peso del poliestireno antes y después de su incubación por 5 semanas con la microbiota.

Peso inicial (g) Peso final (g)

Tratamiento 1 1.0370±0.0484 0.4041±0.0082

Tratamiento 2 1.0418±0.0263 0.5183±0.0817

Tratamiento 3 1.0736±0.0133 0.5805±0.0668

Tratamiento Artemia 1.0 1.0679±0.0277

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Por otra parte, se construyó la curva de calibración para la escala de McFarland, y se

pudo determinar la concentración de bacterias iniciales adicionadas al medio libre de

carbono con 0.2 g de poliestireno. En la Gráfica 1, se muestra la ecuación de la recta

y el valor de r2 que se emplearon para estimar las concentraciones de bacterias en

UFC mL-1.

Gráfica 1. Curva de calibración de absorbancia promedio vs. UFC mL-1.

En la Tabla 5, se presentan las UFC mL-1 que fueron inoculadas inicialmente en

solución libre de carbono. No se tienen los datos finales ya que el experimento sigue

en proceso (por 6 semanas más).

Tabla 5. Concentración de UFC mL-1 que fueron inoculadas en los matraces con medio libre de carbono

siguiendo la escala McFarland.

Tratamientos UFC / mL

Tratamiento 1 1.52x109

Tratamiento 2 1.05x109

Tratamiento 3 2.32x108

Tratamiento Artemia 1.2x109

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Análisis de los resultados

Se puede observar en la Figura 9 y en las Tablas 1 y 3 los valores del consumo de

poliestireno por parte de la larva del Tenebrio molitor. Los valores para las mediciones

de los días 3- 4 y 4 - 5 salen de la tendencia que se observa los primeros días y el

último día en donde si se observa una baja en la masa del poliestireno como se

esperaba. Se podría explicar el incremento en la masa correspondiente a estas dos

mediciones como un error en la medición o por no haber limpiado correctamente el

poliestireno de los residuos que generan las larvas.

También, se observa en los datos de la Tabla 4, que las bacterias en el medio libre

de carbono pueden degradar el poliestireno, como lo demostraron (Yang, et al., 2015).

Figura 9. Muestra de poliestireno con evidencia de consumo por la larva

Los datos que se obtuvieron en esta investigación muestran una degradación de 50 -

60% de la masa de poliestireno tras 5 semanas de incubación.

En el caso de la Artemia franciscana no se pudo alimentar desde un inicio con espuma

de poliestireno por lo que no se puede medir el consumo por el organismo. Sin

embargo, los datos del experimento de su microbiota en medio libre de carbono

indican que no fueron capaces de degradar el polímero en las 5 semanas de

incubación.

Cabe mencionar que de este organismo no se tienen antecedentes, sin embargo, una

de las bacterias que se han aislado de la artemia corresponde al género

Exiguobacterium sp, motivo por el que se probó su habilidad para usarla en la

degradación de poliestireno en ambientes marinos. Durante el tiempo de incubación

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se notó un ligero incremento de la turbidez del medio y la generación de burbujas de

gas.

Estas observaciones sugieren que las bacterias pertenecientes a la microbiota de la

Artemia franciscana lograron sobrevivir al periodo de incubación, ya que al sembrarse

en el medio Luria Bertani se lograron aislar colonias. Se considera que las bacterias

pudieron utilizar en menor medida el poliestireno como fuente de carbono o que

pudieron utilizar sus propios metabolitos de desecho o incluso se pudieron alimentar

de ellas mismas.

En la figura 10 se tienen las colonias de bacterias en medio Luria Bertaini donde se

puede observar un crecimiento bacteriano en los tratamientos del Tenebrio molitor y

de la Artemia franciscana. En ellas se logra ver que las colonias son morfológicamente

similares, es decir, son planas, lobuladas, genera mucílago y son de color crema y

podrían pertenecer a un mismo género.

Figura 10. Cajas de Petri con las bacterias ya inoculadas en medio Luria Bertaini y divididas por tratamientos.

Finalmente, se lograron aislar bacterias de larvas de Tenebrio molitor con capacidad

de degradar espuma de poliestireno, en el caso de la Artemia franciscana no se

cuenta con datos contundentes que sugieran la posibilidad de utilizar el poliestireno

como fuente de carbono aún en menor magnitud, razón por la cual, la investigación

sigue en proceso.

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Conclusiones

Se puede concluir a través de los resultados, mediciones y observaciones que la

microbiota de la Artemia franciscana no presenta la misma capacidad de degradación

del poliestireno que la microbiota del Tenebrio molitor.

Las bacterias aisladas del Tenebrio molitor si fueron capaces de utilizar el poliestireno

como fuente de carbono bajo condiciones controladas al disminuir la masa del

poliestireno tras 5 semanas de incubación.

Es necesario continuar con la investigación para obtener más datos que puedan

confirmar la capacidad de degradación de las bacterias aisladas de Artemia

franciscana, razón por la cual el experimento sigue en proceso donde el periodo de

incubación será mayor a cinco semanas con el objetivo de obtener datos más

específicos. Además, como parte del experimento, se realizará la identificación

genómica de las bacterias que fueron inoculadas.

Alcances y perspectiva

Para poder comprobar adecuadamente la capacidad de degradación de poliestireno

por bacterias de la Artemia franciscana el experimento se llevará a un periodo más

largo.

Las bacterias aisladas de ambos organismos se caracterizan morfológicamente y

genéticamente con la finalidad de identificar los géneros y especies de estas

bacterias.

Fuentes de consulta

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