Del Cytocolor hacia el Papanicoláu ecológico: orígenes

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Patología 2016 jul;54(3):66-75.

Del Cytocolor® hacia el Papanicoláu ecológico: orígenesRojas-Zumaran VA1, Moya-Salazar JJ2

1Área de Citología, Servicio de Patología, Hospital Nacional Docente Madre-Niño San Bartolomé, Lima, Perú.2Departamento de Ciencias Celulares y Moleculares, Facultad de Ciencias y Filosofía, Universidad Peruana Cayetano Heredia, Lima, Perú.

CorrespondenciaJeel J. Moya [email protected]

Este artículo debe citarse comoRojas-Zumaran VA, Moya-Salazar JJ. Del Cytocolor® hacia el Papanicoláu ecológico: orígenes. Patología Rev Latinoam. 2016;54(3):66-75.

Recibido: 19 de abril de 2016

Aceptado: 20 de junio de 2016

Resumen

ANTECEDENTES: Szczepanik propuso un método rápido de colora-ción, denominado Cytocolor®, alternativo a la coloración de Papani-coláu para el diagnóstico citológico del tracto genital femenino. En tres minutos se obtiene una evaluación oncológica, hormonal y de la flora bacteriana.

OBJETIVO: evaluar la calidad del Cytocolor® en extendidos cervicou-terinos para el diagnóstico de cáncer cervical.

MATERIALES Y MÉTODOS: investigación analítica-experimental, prospectiva de corte transversal, en 19 800 muestras obtenidas entre octubre de 1999 y diciembre del 2001 como estrategia diagnóstica en el mediano plazo (diagnóstico genitomamario en ≤ 1 hora). Se colo-rearon 50 muestras por día con el paquete de coloración Cytocolor® (Merck, Darmstadt, Germany). El informe citológico se realizó con el Sistema Bethesda 2001. El control de calidad se realizó mediante el sistema fotográfico Sony® y Merck® para su validación.

RESULTADOS: todos los extendidos cervicouterinos mostraron carac-terísticas nucleares-citoplasmáticas coincidiendo con la coloración convencional de Papanicoláu (Kappa = 0.97, IC95%: 0.92 a 0.99). La valoración de las características citológicas evidenció un índice de calidad de tinción 0.87 (ideal 1) que permitió diagnósticos de citología indeterminados atípicos (23%), lesiones de bajo y alto grados (20%) y de carcinomas (7%).

CONCLUSIÓN: el Cytocolor® fue concordante con los patrones de co-loración descrita en la coloración convencional de Papanicoláu siendo la imagen citológica análoga; por lo tanto, procede su aplicación.

PALABRAS CLAVE: prueba de Papanicoláu, neoplasias del cuello uterino, tamizado masivo, toxicidad, Cytocolor.

Patología 2016 Jul;54(3):66-75.

Abstract

BACKGROUND: Szczepanik, proposes a fast staining method called Cytocolor™ alternative to the Papanicolaou staining for cytological

From Cytocolor® towards ecological Pap test: origins.Rojas-Zumaran VA1, Moya-Salazar JJ2

Artículo originAl

www.revistapatologia.com

w w w . r e v i s t a p a t o l o g i a . c o m

Patología Revista Latinoamericana

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Rojas-Zumaran VA y Moya-Salazar JJ. Papanicoláu ecológicow w w . r e v i s t a p a t o l o g i a . c o m


diagnosis of female genital tract, obtaining in three minutes, a hor-monal and oncological evaluation of bacterial flora.

OBJECTIVE: To evaluate the quality of Cytocolor™ staining in uterine cervical smears for cervical cancer diagnosis.

METHODS: We conducted an analytical-experimental, cross-sectional prospective study in 19 800 samples obtained from October 1999 to December 2001 as a strategy diagnosed in the medium term (genital and breast diagnosis in ≤1 hour). Fifty samples per day were stained with Cytocolor™ staining kit (Merck, Darmstadt, Germany). The cytological report was conducted with the Bethesda System 2 001. Quality control was performed by Sony™ and Merck™ photographic system for validation.

RESULTS: All uterine cervical smears showed nuclear-cytoplasmic features coinciding with the conventional Pap staining (Kappa = 0.97, 95%CI: 0.92 to 0.99). The assessment of the cytological features showed a Quality Index Staining 0.87 (ideal 1) which allowed the diagnosis of atypical indeterminate cytology (23%), low and high grade lesions (20%) and carcinomas (7%).

CONCLUSION: The Cytocolor™ staining was concordant with stain-ing patterns described in conventional Papanicolaou staining being analog cytological image, therefore proceeds application.

KEYWORDS: Papanicolaou test; uterine cervical neoplasms; mass screening; toxicity; Cytocolor

1Área de Citología, Servicio de Patología, Hospital Nacional Docente Madre-Niño San Bartolomé, Lima, Perú.2Departamento de Ciencias Celulares y Mo-leculares, Facultad de Ciencias y Filosofía, Universidad Peruana Cayetano Heredia, Lima, Perú.

CorrespondenceJeel J. Moya [email protected]

ANTECEDENTES

La citología exfoliativa desarrollada por George Nicholas Papanicolaou revolucionó y permitió superar la transición epidemiológica del cáncer de cuello uterino en países con alto grado de desarrollo, desde la toma de muestra, colora-ción y nomenclatura de los diferentes tipos de alteración citológica relacionados con el cáncer de cuello uterino.1 El cáncer de cuello uterino se sitúa como la primera causa de muerte en la población de sexo femenino de los países con bajo grado de desarrollo y el cuarto cáncer más común en la población femenina mundial.2,3

El examen citológico de Papanicoláu tiene como objetivo la detección de lesiones cervicales

preneoplásicas y neoplásicas, adicionalmente la evaluación hormonal y de flora bacteriana, a bajo costo.4 Los principales y novedosos aportes de este método fueron la fijación y el diseño de óptimos colorantes (verde y naranja de Papani-coláu) que facilitan la lectura de los extendidos (Método OG-EA). Durante décadas se extendió la recolección de especímenes y la tinción de extendidos a todos los sitios del cuerpo y a todas las muestras posibles.5,6 La coloración de Papanicoláu ha sufrido amplias modificaciones y aplicaciones tanto en el procedimiento de colo-ración como en su uso, esas modificaciones van desde coloraciones tisulares hasta el diagnóstico de amebas.7,8 Aunque, continúa siendo impor-tante en el diagnóstico temprano del cáncer en citología ginecológica y no ginecológica.9 Así

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Patología Revista latinoamericana Volumen 54, Núm. 3, julio-septiembre, 2016

como la toma de muestra cervical ha evoluciona-do de aspirados con pipetas con perilla de goma y espátulas tipo Ayre a citocepillos con cerdas semicirculares de varias longitudes; la técnica de coloración, preparación y uso de colorantes y sustancias ideadas por Papanicolaou, se han desarrollado exponencialmente en beneficio de médicos, citotecnólogos y, principalmente, de los pacientes10,11,12. Las principales modifi-caciones de la coloración de Papanicoláu son: en sus componentes: sucedáneos del xileno son Neo-Clear (Merck, Darmstadt, Germany), Master clear (American MasterTech Scientific, CA, USA), Pathoclear (Biopack, Buenos Aires, Argentina), Ottix Plus (DiapathS.p.A., Martinengo, Italy), etc.; de alcoholes, Ottix shaper, coloración de Papanicoláu económica rápida con ácido acético –REAP–; fijadores como Diaphane, alcohol-éter, etanol, metanol, propanol, iso-propanol, glutaraldehidos, polietilenglicoles, ácido acético y laca en aerosol.13-16 También los colorante, tiempos y metodologías de colora-ción; sobre los colorantes las modificaciones en coloración nuclear son hematoxilina progresiva, regresiva; de Harris, Gill I-II, Weigert y Meyer; en coloraciones citoplasmáticas son Orange G como OG-5,OG-6 y OG-8; y acridina-Orange; y en EA son EA-36, EA-50 y EA-65.16-19

Se han descrito diferentes coloraciones rápidas de Papanicoláu, cada una con ventajas y desven-tajas, pero que no lograrían usarse en rutina. Las principales modificaciones metodológicas de la coloración convencional son la coloración REAP, Diff-Quik (Baxter Diagnostics, Inc., McGaw Park, Ill) y la coloración rápida según Szczepanik en sus diferentes presentaciones (Merck, Darmstadt, Germany).14,20-24

En Alemania en la década de los 70 del siglo pasado, Von E. Szczepanik, presentó sus trabajos sobre resultados de la coloración rápida de los exámenes citológicos en ginecología. Szczepa-nik, en su estudio sobre “La valoración citológica

en el gabinete del ginecólogo”, propuso al “Cytocolor”, como una coloración rápida de cabecera del ginecólogo, obteniendo excelentes resultados.25,26

La tinción citológica estándar, según Szczepanik, se utiliza para la detección temprana del carci-noma genital femenino,27 pudiéndose utilizar igualmente en la citología no ginecológica. La coloración de Szczepanik (Cytocolor®) fue utilizada en unidades móviles sanitarias entre 1999 y 2003.28 El objetivo de esta investigación fue evaluar la calidad de la coloración citológica Cytocolor® en extendidos cervicouterinos para el diagnóstico del cáncer cervical, evidenciando su rendimiento diagnóstico y su omisión de pasos de coloración.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se realizó una investigación experimental pros-pectiva de corte transversal de octubre de 1999 a diciembre del 2001.28 El tamaño muestral fue calculado usando EPIDAT 4.1 (Xunta de Galicia, España) considerando una sensibilidad de 0.95, una heterogeneidad de 50% y un margen de error de 0.02; obteniéndose un tamaño mues-tral de 2 144 pacientes referidos para examen cervicouterino. Se colorearon 50 muestras por día, todas las muestras fueron observadas e informadas dentro de los 60 ± 10 minutos de admisión del paciente, así se tuvo un resultado inmediato, incluso la imagen citológica fotogra-fiada, en caso de ser derivada al segundo nivel. Se utilizó para el informe citológico los criterios del Sistema Bethesda 1991, al inicio, y del 2001, después.29,30

El paquete de coloración rápida Cytocolor® (Merck, Darmstadt, Germany) contó con la solución modificada de hematoxilina y la poli-cromática que permiten colorear un preparado citológico dentro de los tres minutos. Los exten-didos cervicouterinos se obtuvieron y fijaron en

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forma usual (toma de muestra con espátula tipo Ayre y fijación en alcohol de 90° o Merckofix (Merck, Darmstadt, Germany)), se procedió como se describe en el Cuadro 1.23-25 El rendi-miento por paquete de coloración fue de 1 000 preparaciones o tinciones en concordancia con lo recomendado por el fabricante.23

Evaluación de calidad: se realizó mediante la tecnología de laboratorio Merck® y Sony®: las muestras coloreadas fueron fotografiadas bajo el sistema digital de Sony® en forma seriada cada cinco muestras. Así, éstas fueron enviadas a MERCK KGaA-64271 (Darmstadt-Germany). Bajo este riguroso sistema de control de calidad, la experiencia en el screening del diagnóstico citológico con Cytocolor® fue validado.

Técnica de validación: la valoración total de la coloración fue evaluada de acuerdo con el índice de calidad de tinción para la evaluación individual de la calidad de la coloración en comparación con resultados de la coloración convencional, mediante la suma de los puntajes asignados a cinco parámetros de valoración: background (fondo del extendido), panorama general de la tinción, morfología celular, patrón

Cuadro 1. Protocolo de la coloración citológica de Szcze-panik, Cytocolor®

Estaciones Tiempos

1 Agua destilada 10 veces × s c/u

2 Solución hematoxilina 1 minuto

3 Lavar con agua corriente 10 veces × 5 s

4 2-propanol p.a 2 veces × s c/u

5 Solución policrómica 1 vez × 1 minuto

6 80% 2-propanol p.a. 5 veces × s c/u

7 2-propanol p.a. 5 veces × s c/u

8 2-propanol p.a. 5 veces × s c/u

9 Xileno p.a. 5 veces × s c/u

10 Xileno p.a. 5 veces × s c/u

11 Montaje con bálsamo de Canadá o Entellan®

cromático y tinción (características nucleares) y continuidad de membranas.19 Esta valoración individual de la calidad y tinción en cada caso de estudio consiste en la suma de puntajes obte-nidos al comparar el resultado de la coloración de cada extendido cervicovaginal coloreado con Cytocolor® frente al resultado obtenido con la coloración de Papanicolaou (evaluada por el Ministerio de Salud y en la Facultad de Medicina de la Universidad de Buenos Aires), cuya máxima valoración para cada parámetro asignado corres-ponde a un puntaje de 6 (Cuadro 2).27

Interpretación del parámetro de comparación de Cytocolor frente a la coloración convencio-nal: el puntaje para cada parámetro fue en la escala de 0 a 6, siendo el máximo equivalente a la tinción más óptima. Se realizó en cálculo con la siguiente formula:

ICT = puntaje obtenido Cytocolor

_______________________ máximo puntaje posible

0 = el mínimo puntaje de valoración que se asigna a un parámetro insatisfactorio.

6 = el máximo puntaje de valoración que se asigna a un parámetro óptimo.

Técnica de recolección y análisis de datos: los datos se registraron en un instrumento de hoja de cálculo de MS-Excel® versión 11.0–2003 para Windows. Dentro de esta matriz se evaluaron el porcentaje de diagnósticos positivos y negativos para el diagnóstico de cáncer cervical. Se utilizó estadística descriptiva para frecuencia simple. Asimismo, para la evaluación de concordancia diagnóstica se utilizó el coeficiente kappa de Cohen simple con nivel de significación de 0.05 (α=0.05). El análisis de datos se realizó en IBM® SPSS v19.0 (Armonk, USA).

Ética: la información obtenida se mantuvo en anonimato y sólo se utilizó para esta investi-gación.

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Cuadro 2. Características citológicas de la coloración citológica de Szczepanik-Cytocolor®

Parámetros Valoración

1 Background (Fondo)

Hemorrágico/sucio 0 1 2 3 4 5 6 Limpio

2 Panorama general de la tinción

Malo 0 1 2 3 4 5 6 Bueno

3 Morfología celular

No preservada 0 1 2 3 4 5 6 Bien preservada

4 Características nucleares

Patrón cromático

Grueso o grumoso 0 1 2 3 4 5 6 Finamente granular

Membrana nuclear

Engrosamiento 0 1 2 3 4 5 6 Borde irregular

5 Continuidad de membranas

No preservada 0 1 2 3 4 5 6 Bien preservada

RESULTADOS

De 19 800 muestras obtenidas y procesadas bajo la coloración rápida Cytocolor® todos los resultados mostraron características nucleares-citoplasmáticas óptimas para el diagnóstico de cáncer cervical (Kappa 0.97, IC95%: 0.92 a 0.99). Las imágenes coloreadas coinciden con la coloración Papanicoláu por las características descritas en el Cuadro 3.

De la valoración de calidad de tinción se obtuvo un índice de calidad de tinción (ICT) general equivalente a 0.87 (ideal 1). Las valoraciones parciales mostraron que el patrón cromático y

Cuadro 3. Características citológicas de la coloración cito-lógica de Szczepanik-Cytocolor®

Citoplasma cianófilo (basófilo) Verde azulado

Citoplasma eosinofílico (acidófilo) Rosa

Eritrocito Rojo

Citoplasma granulado Anaranjado rosa

Núcleos de células Azul, violeta, pardo, negro

Microorganismos Violeta azulado

tinción nuclear (ICT 0.92) fueron los de mayor valoración, y que el background (ICT 0.83) el menor. Las valoraciones parciales corres-pondientes a morfología celular (ICT 0.85), panorama general de la tinción (ICT 0.90), continuidad de membranas (ICT 0.90) también mostraron una buena correlación.

En todas las muestras, los detalles citológicos fueron coincidentes con cada estadio de la enfer-medad (p<0.05).11,17,31 La valoración oncológica en los extendidos cervicouterinos resultó en la detección de patologías cervicales dentro del Sistema de Atención Primaria como estrategia de detección precoz de patologías genitomamarias (Figura 1). Del mismo modo, las valoraciones infecciosas (Figura 2) permitieron establecer los hallazgos no neoplásicos en el reporte gi-necológico.

Del total de muestras obtenidas, 7 834 muestras (40%) fueron negativas para lesión intraepitelial o malignidad (NLIM) y 4 560 muestras (23%) fueron resultados indeterminados atípicos (ASC-US (células escamosas atípicas); ASC-H (células escamosas atípicas de alto grado de malignidad),

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Figura 1. Características nucleares-citoplasmáticas en lesiones escamosas. A) Células escamosas superficiales acidófilas y basófilas normales (40X). B) Lesión intraepitelial de alto grado (40X). C) Lesión intraepitelial de bajo grado (40X). D) Cambios celulares producidos por radioterapia (40X). E) Formación de perla cornea (20X). F) Lesión intraepitelial de alto grado (40X). G) Lesión intraepitelial de bajo grado (10X). Coloración de Cytocolor®.

AGUS (células glandulares atípicas de significa-do indeterminado). Para las anormalidades de células epiteliales 14% (2 830 muestras) fueron resultados con lesión intraepitelial de bajo grado y 6% (1 290 muestras) para lesión intraepitelial

de alto grado, además 10% (1 980 muestras) resultaron compatibles para los cambios celu-lares ocasionados por la infección de papiloma virus humano. Los resultados positivos para el carcinoma de células escamosas y glandulares

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Figura 2. Características nucleares-citoplasmáticas en citología infecciosa y reparativa. A) Células escamosas superficiales acidófilas y basófilas normales (20X). B) Células escamosas metaplásicas (20X). C) Collage de células metaplásicas con vacuolización intracitoplasmática producido por Clamidia trachomatis (10X y 20X). D) Atrofia celular (10X). E) Las células con características koilocíticas de diagnóstico de lesión intraepitelial de bajo grado tienen una cavidad bruscamente definida perinuclear (20X). Coloración de Cytocolor®.

fueron 754 (4%) y 552 (3%) muestras, respecti-vamente (Figura 3).

DISCUSIÓN

La evaluación de la técnica Cytocolor® en citología exfoliativa demostró reducción de tiempo y eficiencia en la coloración, tanto de anormalidades cervicouterinas como en ha-llazgos no neoplásicos (infecciones y cambios reactivos), por lo tanto procede su aplicación. Según diversos estudios, el Cytocolor® tiene un índice de calidad de tinción equivalente a 0.87, con valoraciones de 0.92 para el patrón cromático y continuidad de carioteca hasta 0.85 para morfología celular y panorama general (ICT

0.90), reportamos valores similares de índice de calidad de tinción (0.87) frente a la coloración convencional haciéndola óptima para el scree-ning cervical (Figuras 2 y 3).17,19,32

El paquete del Cytocolor® sirve para colorear más de 1 000 extendidos cervicouterinos, traduciéndose en menos de $0.30 por lámina coloreada.21,28,33,34 Tanto el Cytocolor® como la coloración de Papanicoláu son altamente especí-ficos para el cribado en la detección del cáncer de cuello uterino.17 Ambas tinciones se pueden reproducir en el laboratorio para obtener una coloración entre 3 a 5 minutos, concentrando sus componentes y manteniendo el costo beneficio a favor del paciente; la coloración permite hacer

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Figura 3. Distribución de anormalidades cervicouterinas durante el periodo de estudio (n=19 800).

ASC23%

LSIL14%

NLIM40%

HSIL6%

SCC4%

ADEN3%

HPV10%

Other6%

NLIM: negativo para lesión intraepitelial o malignidad; ASC: resultados indetermi-nados atípicos; LSIL: lesión intraepitelial de bajo grado; HSIL: lesión intraepitelial de alto grado; SCC: carcinoma de células escamosas; ADEN: adenocarcinoma; HPV: cambios celulares compatibles con la infección por papiloma virus humano.

una declaración de completa validez respecto a la malignidad celular (hallazgos preneoplásicos y neoplásicos), el estado hormonal y la flora vaginal, por lo que es posible proporcionar al paciente información sobre hallazgos ya en la primera consulta.35

Esta coloración cuenta con soluciones modifica-das de hematoxilina y solución policromática que permiten colorear un preparado citológico dentro de tres minutos.24,25 La solución policromática de Szczepanik no utiliza orange G dentro de sus componentes, por lo cual los componentes ce-lulares que presenten queratohialina o queratina son coloreados de rosado salmón (Figura 2).26,28 Del screening resultó la detección de patologías ginecológicas y cervicouterinas (Figura 1); la estrategia de la organización consistió en la respuesta diagnóstica en el mediano plazo (≤ 60 minutos) para el tratamiento y eventual segui-miento estricto de la patología de riesgo; todos los resultados fueron retirados por los pacientes en un 100% cumpliéndose con los objetivos propuestos y obteniendo un alto porcentaje de eficacia y eficiencias, y un alto índice de satis-facción del paciente.35 Ya que en otros sistemas

sanitarios, principalmente en países con bajo grado de desarrollo, desde el muestreo hasta la emisión de resultados el tiempo de espera varía de entre 4 a 6 semanas, con un porcentaje de pérdida de pacientes entre 40 y 60%.33,34

Se propone el Cytocolor® como “Nueva Estra-tegia en Atención Primaria de la Salud para la detección y prevención del cáncer de cuello uterino” dentro de campañas sustentables y sos-tenidas en unidades sanitarias móviles,35 por ello, y como ejemplo del éxito de esta estrategia, en esta investigación se evaluaron 19 800 extendi-dos cervicouterinos coloreados bajo esta tinción rápida que evidenció alta respuesta diagnóstica, alta calidad de tinción y rendimiento óptimo prescindiendo de ácido clorhídrico, amoniaco y muchos baños de alcoholes, lo que permitió reportar el resultado en una hora aproximada-mente (incluyendo exámenes colpocitológicos y exámenes de mamá clínico-mamográficos).35 En conclusión, la coloración Cytocolor® fue con-cordante con los patrones de coloración descrita en la coloración convencional de Papanicoláu, siendo la imagen citológica análoga, por lo tanto, procede su aplicación.

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