TRABAJO PRÁCTICO Nº 2

AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE BACTERIAS DEL ÁCIDO LÁCTICO

Objetivos: Los alumnos deberán ser capaces de: obtener un cultivo puro de un microorganismo de interés aislándolo de una mezcla de

microorganismos Caracterizar el microorganismo aislado

Características Generales de las Bacterias del Ácido Láctico (BAL)Es un grupo muy heterogéneo de bacterias Gram +, no esporuladas que tienen en común la capacidad de producir Àc. láctico por fermentación de azúcares. Son microorganismos con una limitada capacidad biosintética, por lo tanto requieren factores de crecimiento complejos como vitaminas del grupo B, purinas, pirimidinas y aminoácidos. Como carecen de porfirinas y citocromos, no realizan fosforilación por transporte de electrones, reciben energía por fosforilación a nivel sustrato. Producen energía únicamente por fermentación. Carecen de la capacidad de biosintesis del grupo hemo, razón por la cual son catalasa -.Crecen en presencia o ausencia de O2. Comúnmente no son móviles Forman colonias pequeñas nunca pigmentadas. Poseen gran tolerancia a la acidez. Viven en ambientes asociados a plantas, tracto intestinal (principalmente), fosas nasofaringeas y vagina.

Aislamiento de bacterias del Ácido Láctico

Lactococcus spp. Lactobacillus spp. Leuconostoc spp.

Pediococcus spp. Streptococcus spp.

Día 1: Para el aislamiento de BAL las diferentes muestras a utilizar (mostos de uvas tintas en fermentación malolactica, Yogurt comercial, Actimel o algún fermenta láctico) se enriquecerán durante 24 hs. a 30 ºC, en condiciones de microaerofilia, en MRS suplementado con 100 mg/L de cicloheximida, para evitar el crecimiento de levaduras.

Día 2: El enriquecimiento será luego sembrado en placas de MRS. también en microaerofilia a 28 ºC.

Día 3: Mediante análisis de colonias, tincion de gram y reaccion a la catalasa se seleccionaron las BAL. Las colonias seleccionadas repicararan a fin de obtener cultivos puros de cada aislamiento de BAL (cocos y bacilos GRAM positivos, catalasa negativos), que se conservaron en caldo MRS con 30% de glicerol a -20 ºC y -80 ºC para luego realizar su identificación.

Día 4: Para proceder a la identificación bacteriana, se extraerá ADN total de las cepas. Para ello las células se cultivaron hasta fase exponencial, se centrifugaron (5,000 x g, 15 min, 4 ºC), se lavaron dos veces en Tris/ EDTA (1M, pH 7,0) y se re suspenderán en 1 ml de lisozima Tris-EDTA (20 mg/mL), incubándose durante 2 h a 37 ºC. Tras la adición de 0,1 mg/mL de proteinasa K las células se mantendran durante 1 h a 56 ºC, luego se adiciona sarcozyl 1,5% y se incuba a 65 ºC durante 5 min. Por último, se realizó del ADN mediante columna de afinidad. El ADN obtenido se visualizara en un gel de agarosa al 0,7% teñido con bromuro de etidio, en presencia de un ladder 400 pb, para controlar su integridad.La identificación de los aislamientos se realizará mediante PCR-RFLP consistente en la amplificación mediante PCR de un fragmento de 294 pb del gen rpoB, que codifica para la subunidad beta del ARN polimerasa, y posterior digestión del amplicón con las enzimas Hinf I y Aci I. Para caracterizar a las bacterias aisladas, se evaluará la fermentación homo y heteroláctica mediante la siembra de los cultivo aislados en Medio McDonal y la actividad actividad maloláctica mediante el Kit MegaQuant TM K/LMALMQ 12/05.

Anexo:

Medio de cultivo MRS (De Man, Rogosa y Sharpe, 1960)

Fórmula (en gramos por litro) Proteosa peptona Nº3 10.0Extracto de carne 8.0Extracto de levadura 4.0Glucosa 20.0Monoleato de sorbitan 1 mlFosfato dipotásico 2.0Acetato de sodio 5.0Citrato de amonio 2.0Sulfato de magnesio 0.2Sulfato de manganeso 0.05Agar 13.0pH final: 6.4± 0.2

Medio de Cultivo Agar HHD (McDonald et al, 1987)

Fórmula (en gramos por litro)Fructosa 2,5KH2PO4 2,5Tristona 10Peptona 1,5Casaminoacidos 3Extracto de levadura 1Tween 80* 1Verde de bromocresol 20 mlAgar 20pH= 7,0

Fermentación Homo y Heteroláctica

Las bacterias lácticas homofermentadoras fermentan la glucosa exclusivamente a ácido láctico (lactato) o casi exclusivamente (90%). Descomponen la glucosa utilizando la vía de la fructosa bifosfato y transfieren el hidrógeno no liberado en la deshidrogenación del gliceraldehído-3-fosfato hasta el piruvato. Que se forme D(-), L(+) o DL lactato depende de la estereoespecificidad de las enzimas implicadas, la lactato-deshidrogenasa y la presencia de lactato-racemasa. Una pequeña porción del piruvato se descarboxila hasta acetato, etanol y anhídrido carbónico, así como a acetoína.

Las bacterias lácticas heterofermentadoras no disponen de las enzimas principales de la vía de la fructosa bifosfato, la aldolasa y la triosaisomerasa. La degradación inicial de la glucosa sigue exclusivamente la vía de las pentosas fosfato hasta la formación de lactato, etanol y anhídrido carbónico

Fermentación Maloláctica

Figura 1. Esquema de la fermentación Homoláctica

Figura 2. Esquema de la fermentación Heteroláctica

La fermentación del ácido málico constituye la transformación del ácido málico en ácido láctico (con emisión de anhídrido carbónico).

Figura 3. Esquema de la fermentación Malolactica

Esta fermentación reduce la acidez total del vino al perderse parte de la acidez fija: una parte de la acidez del vino se transforma en gas carbónico, el cual se desprende y desaparece.

Ácido málico Ácido láctico