DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y DE LA AGRICULTURA CARRERA DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y DE LA AGRICULTURACARRERA DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA

Previa a la obtención de Grado Académico o Título de:

INGENIERO EN BIOTECNOLOGÍA

Elaboradoro por:EDISON PATRICIO MARCILLO TIPÁN

Evaluación de la eficiencia de un inóculo enzimático como acelerador del proceso de landfarm en biorremediación de suelos contaminados con diésel y bunker, a escala piloto.

Parroquia El Reventador, Provincia de Sucumbíos

Director: Ing. Vargas, RafaelCodirector: Ing.-Mat. Romero Saker, Pedro

• Evaluar la eficiencia de un inóculo enzimático como acelerador del proceso de landfarm en biorremediación de suelo contaminado con diésel y bunker.

OBJETIVO GENERAL

• Evaluar las condiciones físico-químicas del suelo antes de la contaminación, después de la contaminación y al final del proceso de biorremediación en niveles de macro y micro nutrientes.

• Optimizar la concentración de inóculo enzimático para obtener el mayor porcentaje de remoción de TPH en suelo contaminado.

• Evaluar la influencia de las condiciones ambientales pH y temperatura sobre un proceso de biorremediación.

• Determinar el orden cinético de degradación que cumple este proceso de biorremediación.

• Generar un escalado inverso que simule condiciones: físicas, químicas y biológicas en el suelo.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

• Los derrames de petróleo y sus derivados en el ámbito mundial, han provocado una severa contaminación del suelo y de los cuerpos de agua.

• Estos compuestos son tóxicos para los seres vivos ya que son mutagénicos y carcinogénicos (Ewis J., 1999).

Antecedentes

Derrames de bunker (oil-fuel #5)Parroquia El Reventador

Afectación a suelos u zonas pobladas

Afectación a ecosistemas

sensibles

Derrame de tanquero 10.000 gls, Reventador-2010

** 2009 Rotura de OCP, derrame de 12.000 bls** 2013 Rotura del SOTE, derrame de aprox. 10.000 bls

Derrames de diéselParroquia El Reventador

Poblaciones afectadas por liberación de

diésel

Cuerpos de agua contaminados

Derrame de tanquero 10.000 gls, Reventador-2008

• La tecnología de biorremediación con landfarming se fundamenta en la estimulación de la actividad biodegradadora de las poblaciones microbianas presentes en un suelo contaminado.

• La meta final de la biorremediación, es la mineralización del contaminante. Es decir, la completa degradación de una molécula orgánica hasta compuestos inorgánicos (CO2, agua y formas inorgánicas de N, P y S) y componentes celulares (Alexander, 1994; Eweis J, 1999).

Marco Teórico

• Los hidrocarburos totales de petróleo (TPH) se usa para describir a un grupo extenso de varios cientos de sustancias químicas derivadas originalmente del petróleo crudo.

• Los microorganismos transforman y metabolizan aeróbicamente los hidrocarburos y otros compuestos orgánicos hasta dióxido de carbono, agua y fuentes de alimento para sustentar su crecimiento y reproducción.

• La biorremediación es una técnica que puede usarse para degradar hidrocarburos y reducir su movilidad y toxicidad (Constanza O., 2001).

• A mediados del siglo XX se desarrollaron las primeras investigaciones encaminadas a estudiar el potencial de los microorganismos para biodegradar contaminantes (Zobell, 1946; Davis, 1956).

• Fase de campo Landfarming– Obtención de suelo contaminado con diésel y bunker.

(variable independiente)– Preparación y acondicionamiento de suelo a ser remediado.– Preparación de inóculo y de tratamientos de prueba.

(variable independiente – factor cuantitativo)– Elaboración y distribución de camas según diseño estadístico.– Variables de control: pH, Temperatura.– Variables de respuesta: TPH.

(variable dependiente)– Manejo y control de proceso.

Mediciones – Metodología de análisis para TPH, MESS-02 EPA 8440.418.1.– Toma de datos de pH y temperatura.

METODOLOGÍA

• Factor de estudio (T)

OBTENCIÓN DE SUELO CONTAMINADO

Suelo contaminado con bunker

Suelo contaminado con diésel

• Factor de estudio (D).• Enzima degradadora de hidrocarburo. • Concentración base 2.560 ml de

enzima por tonelada métrica de suelo contaminado con una concentración de16.000 mg/kg de TPH.

• 30% - 40% de enzima percolan. hacia niveles freáticos.

• 40 kg de suelo contaminado.• 4 niveles de dosificación.

INÓCULO ENZIMÁTICO DE PRUEBA

ESPECIFICACIÓN

40ml Inoculante enzimático en 40 kg de suelo contaminado



SIN DOSIS 0 ml

DISEÑO ESTADÍSTICO

Fuente de hidrocarburo usado

Cantidad de dosificación de inóculo enzimático

FACTOR T HIDROCARBURO CODIFICACIÓN

T1 Diesel Di

T2 Bunker Bk

FACTOR D

DOSIS CODIFICACIÓN ESPECIFICACIÓN

D1 Alta Al40ml Inoculante enzimático en 40

kg de suelo contaminado

D2 Media Me20ml Inoculante enzimático en 40


D3 Baja Ba10ml Inoculante enzimático en 40


D4 Sin dosis Sd SIN DOSIS

• Diseño estadístico multifactorial.

• 2 x 4.• 2 factores.• 4 factores.• 3 repeticiones.• Prueba de Tukey

con un alfa=0,05%.

DISEÑO ESTADÍSTICOFt x Fd x n r = Total tratamientos

T D n repetición

1 Diesel Alta T1D1R1



4 Bunker Alta T1D2R1



7 Diesel Media T2D1R1



10 Bunker Media T2D2R1



T D n repetición

13 Diesel Baja T3D1R1



16 Bunker Baja T3D2R1



19 Diesel SD T4D1R1

20 Diesel SD T4D1R2

21 Diesel SD T4D1R3

22 Bunker SD T4D2R1

23 Bunker SD T4D2R2

24 Bunker SD T4D2R3

BUNKER MEDIA

DIESEL BAJA

BUNKER SIN DOSIS

T2D2R2 T3D1R2 T4D2R3DIESEL BAJA

BUNKER MEDIA

BUNKER SIN DOSIS

T3D1R3 T2D2R1 T4D2R2DIESEL MEDIA

BUNKER ALTA

BUNKER BAJA

T2D1R3 T1D2R1 T3D2R2BUNKER

BAJABUNKER

BAJADIESEL MEDIA

T3D2R2 T3D2R3 T2D1R1DIESEL MEDIA

DIESEL BAJA

DIESEL SIN DOSIS

T2D1R2 T3D1R1 T4D1R2DIESEL ALTA

DIESEL ALTA

BUNKER ALTA

T1D1R3 T1D1R2 T1D2R2DIESEL SIN

DOSISBUNKER

SIN DOSISBUNKER MEDIA

T4D1R3 T4D2R1 T2D2R3BUNKER

ALTADIESEL ALTA

DIESEL SIN DOSIS

T1D2R3 T1D1R1 T4D1R1

Ubicación por números aleatorios2 x 4 x 3 = 24 tratamientos (UE)

• HIPÓTESIS– El tratamiento con inóculo enzimático a una

concentración de 20 ml provoca mayor remoción de TPH en suelos contaminados con diésel y el tratamiento con inóculo enzimático a una concentración de 40 ml, provoca mayor remoción de TPH en suelos contaminados con bunker.

DISEÑO ESTADÍSTICO

• El control del proceso de landfarming se dio durante un periodo de 90 días.

• Cada 7 días se daba un volteo manual de las camas de suelo y generara un ingreso de oxígeno a toda la UE.

• Cada 15 días de realizaba un proceso de humectación del suelo.

• Mediante la medición de pH se verificaba si era necesario o no la adición de cal agrícola para estabilización de pH.

• Adición de nutrientes para bioaumentación.• Re inoculación de enzima a los 60 días.

MANEJO Y CONTROL DE PROCESO

• Variables de control.– pH, Temperatura

• Variables de respuesta.– TPH

• Cinética de degradación.– Cinética de primer orden

• Tasa de degradación.• Eficiencia de remediación. • Análisis estadístico

RESULTADOS

• Esta diferencia de pH se debe posiblemente al incremento de la capacidad tampón en el suelo, inducido por la aplicación de sustratos en el suelo. (Suquilanda.1996).

pH

4,04,55,05,56,06,57,07,58,08,59,0

0 15 30 45 60 75 90 105

pH

Tiempo (dias)

Variación de pHT1D1

T1D2

T1D3

T1D4

T2D1

T2D2

T2D3

T2D4

0 15 30 45 60 75 90Diesel 40ml T1D1 6,1 7,1 7,5 6,8 6,5 7,0 6,8Diesel 20ml T1D2 5,8 6,9 7,3 6,8 6,3 7,0 7,1Diesel 10ml T1D3 6,1 6,9 7,3 7,1 6,0 7,0 7,4

Testigo Diesel T1D4 7,1 7,2 7,6 7,1 7,0 7,3 6,9Bunker 40ml T2D1 5,5 6,9 7,3 7,1 6,2 7,2 7,2Bunker 20ml T2D2 5,6 6,7 7,1 7,3 6,3 6,9 7,0Bunker 10ml T2D3 5,6 6,8 7,2 7,2 6,3 7,1 7,1

Testigo bunker T2D4 7,0 7,0 7,4 7,0 7,3 7,3 7,5

TRATAMIENTOSpH (U pH) / TIEMPO (días)

• Como se observa en la gráfica, la temperatura en los tratamientos mantuvo un valor promedio de 22,6°C y oscilo en un rango de 20 a 26°C.

Temperatura

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

0 15 30 45 60 75 90 105

Tem

pera

tura

del

sue

lo (°

C)

Tiempo (dias)

Variación de TemperaturaT1D1

T1D2

T1D3

T1D4

T2D1

T2D2

T2D3

T2D4




TRATAMIENTOSTemperatura (°C) / TIEMPO (días)

• Diferencias marcadas en concentraciones iniciales.

TPH

0,02.500,05.000,07.500,0

10.000,012.500,015.000,017.500,020.000,022.500,025.000,0

0 15 30 45 60 75 90 105

Conc

entr

ació

n TP

H (m

g/Kg

)

Tiempo (dias)

Variación de TPHT1D1

T1D2

T1D3

T1D4

T2D1

T2D2

T2D3

T2D4

0 15 30 45 60 75 90Diesel 40ml T1D1 7.976,7 6.130,0 4.930,0 3.315,7 2.329,0 1.606,7 897,3Diesel 20ml T1D2 9.246,7 7.077,7 5.717,7 4.252,7 3.096,0 2.046,7 1.170,7Diesel 10ml T1D3 8.762,0 8.023,3 6.184,0 4.622,7 3.356,7 2.841,7 1.806,0

Testigo Diesel T1D4 9.165,0 8.739,7 8.218,0 7.604,7 7.153,3 6.585,3 6.300,0Bunker 40ml T2D1 22.410,7 18.266,3 15.666,7 10.646,7 7.993,3 3.982,0 2.551,0Bunker 20ml T2D2 23.161,7 19.480,0 16.173,0 12.649,3 9.973,3 6.216,0 4.744,3Bunker 10ml T2D3 23.373,3 21.361,0 19.426,0 17.432,0 13.931,3 10.091,3 8.162,0

Testigo bunker T2D4 20.853,0 20.369,7 19.937,3 19.291,3 19.192,7 19.101,0 18.772,7

TRATAMIENTOSTPH (mg/Kg) / TIEMPO (días)

0,0

2.500,0

5.000,0

7.500,0

10.000,0

12.500,0

15.000,0

17.500,0

20.000,0

22.500,0

25.000,0

27.500,0

30.000,0

0 15 30 45 60 75 90 105

Conc

entr

ació

n TP

H (m

g/Kg

)

Tiempo (dias)

Variación de TPH

0,0

2.500, 0

5.000, 0

7.500, 0

10.000 ,0

12.500 ,0

15.000 ,0

17.500 ,0

20.000 ,0

22.500 ,0

25.000 ,0

0 15 30 45 60 75 90 105

Concentración TPH (mg/Kg)

Tiemp o ( dias)

Variación de TPH

T1D1

T1D2

T1D3

T1D4

Limi te

T2D1

T2D2

T2D3

T2D4

CINÉTICA DE DEGRADACIÓN

Primer Orden

Testigo Diesel T1D4 0,9954Diesel 40ml T1D1 0,9808Diesel 10ml T1D3 0,9795Bunker 20ml T2D2 0,9741Diesel 20ml T1D2 0,9739Bunker 40ml T2D1 0,9516Bunker 10ml T2D3 0,9438

Testigo bunker T2D4 0,9413

R2TRATAMIENTOS Código

𝑑𝑐𝑑𝑡 = −𝑘𝐶

Ln𝐶𝑓 = −𝑘∆𝑡+ Ln𝐶𝑜

𝑦= 𝑚𝑥+𝑛

Primer Orden




TRATAMIENTOSLogaritmo Natural (concentración)

Método de mínimos cuadradosFactor de correlación R2.

CINÉTICA DE DEGRADACIÓN

y = -0.0238x + 9.1052R² = 0.9808

0.00

2.00

4.00

6.00

8.00

10.00

0 20 40 60 80 100

Ln (c

once

ntra

ción

)

Tiempo (días)

Cinética de Primer Orden DieselT1D1

y = -0.0179x + 10.159R² = 0.9741

0.00

2.00

4.00

6.00

8.00

10.00

12.00

0 20 40 60 80 100

Ln (c

once

ntra

ción

)

Tiempo (días)

Cinética de Primer Orden BunkerT2D2

ln 𝐶𝑓 =−0.0238 ∆ 𝑡+ ln𝐶𝑜

ln 𝐶𝑓 =−0.0179 ∆𝑡+ln𝐶𝑜

Constante de degradación

K

diésel

bunker

Tiempo para cumplimiento de normativa ambiental RAOH 1215

0 15 30 45 60 75 90Diesel 40ml T1D1 7.976,7 6.130,0 4.930,0 3.315,7 2.329,0 1.606,7 897,3Diesel 20ml T1D2 9.246,7 7.077,7 5.717,7 4.252,7 3.096,0 2.046,7 1.170,7Diesel 10ml T1D3 8.762,0 8.023,3 6.184,0 4.622,7 3.356,7 2.841,7 1.806,0

Testigo Diesel T1D4 9.165,0 8.739,7 8.218,0 7.604,7 7.153,3 6.585,3 6.300,0Bunker 40ml T2D1 22.410,7 18.266,3 15.666,7 10.646,7 7.993,3 3.982,0 2.551,0Bunker 20ml T2D2 23.161,7 19.480,0 16.173,0 12.649,3 9.973,3 6.216,0 4.744,3Bunker 10ml T2D3 23.373,3 21.361,0 19.426,0 17.432,0 13.931,3 10.091,3 8.162,0

Testigo bunker T2D4 20.853,0 20.369,7 19.937,3 19.291,3 19.192,7 19.101,0 18.772,7

TRATAMIENTOSTPH (mg/Kg) / TIEMPO (días)

Primer Orden

k=-0.0238 k=-0.0179Diesel 40ml T1D1 N/A N/ADiesel 20ml T1D2 N/A N/ADiesel 10ml T1D3 N/A N/A

Testigo Diesel T1D4 38.83 N/ABunker 40ml T2D1 N/A 1.13Bunker 20ml T2D2 N/A 35.79Bunker 10ml T2D3 N/A 66.10

Testigo bunker T2D4 N/A 112.63

Días para cumplir con 2500 ppm TPHTRATAMIENTOS

∆ 𝑡=𝐿𝑛𝐶 𝑓 −𝐿𝑛𝐶𝑜

−𝑘

TASA DE DEGRADACIÓN

0102030405060708090

100

0 15 30 45 60 75 90 105

Tasa

de

degr

adac

ión

(%)

Tiempo (dias)

Tasa de degradación TPHT1D1

T1D2

T1D3

T1D4

T2D1

T2D2

T2D3

T2D4




TRATAMIENTOSTASA DE DEGRADACIÓN (%) / TIEMPO (días)

88,8 87,379,4

31,3

88,679,5

65,1

10,0

0102030405060708090

100

T1D1 T1D2 T1D3 T1D4 T2D1 T2D2 T2D3 T2D4Re

ndim

ient

o (%

)

Tratamientos

TPH

EFICIENCIA DE REMEDIACIÓN

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

80,0

90,0

9075

6045

3015

0

Rem

oció

n (%

)

Tiempo en dias

T1D1

T1D2

T1D3

T1D4

T2D1

T2D2

T2D3

T2D4

• En base a los resultados obtenidos en el InfoStat se tienen que existe diferencia estadística.

RESULTADOS ESTADÍSTICOS

Factor de contaminación

Concentración media de TPH (mg/Kg)

Diesel 5326,99 ABunker 15186,04 B

Comparación de tratamientos

Análisis entre el desempeño entre Oil fuel (bunker) y diésel

**Todos los análisis se realizaron al día 90 de la investigación.

Comparación del inóculo enzimático

Concentración de enzima


40 7764,43 A20 8928,98 A B10 10669,42 B0 13663,12 C


Análisis global

Factor de contaminación

Concentración de enzima


Diesel 40 3883,62 ADiesel 20 4658,29 ADiesel 10 5085,19 A BDiesel 0 7680,86 A B CBunker 40 11645,24 C DBunker 20 13199,67 DBunker 10 16253,86 EBunker 0 19645,38 E


Para el análisis global se utilizó solo los datos finales de concentración.

Proceso de Landfarm

• El método de ex-situ de landfarm para remediar suelos contaminados por hidrocarburos es una técnica que da excelentes resultados.

• Soto (2000) reporta que los contaminaste de hidrocarburo como gasolinas, diésel, kerosen son compuestos de hidrocarburos que por su naturaleza de compuestos simples con menos enlaces y ramificaciones son más fáciles de degradar en comparación a los hidrocarburos como parafinas, aromáticos y asfáltenos, ciclo parafinas, estos se consideran los más resistentes a la bioremediación.

• Enzimas oxigenasas y peroxidasas incluidas en el inóculo enzimático aceleran el proceso de remediación, según Benavidez (2005) la técnica de landfarm puede alcanzar valores aceptables de remoción en periodos que varían de 6 meses a varios años.

Discusión

• Mediante la adición de diferentes concentraciones de inóculo se determinó que las concentraciones más elevadas generan mayor remoción de TPH, porcentajes superiores al 80% de remoción.

• Las variaciones en las condiciones pH y temperatura afectan directamente al proceso: pico de pH, exceso de humedad, picos de temperatura.

• De acuerdo al modelo matemático el modelo de cinética que mejor se ajustó fue de primer grado.

Conclusión

• Mediante la relación de cálculo de concentración de inóculo se pudo hacer un escalado para un porción de 40 kg de suelo contaminado.

• El uso de un sistema de invernadero con variables de control y adición de suelo natural al sistema permitió obtener condiciones biológicas similares a la del suelo en estado libre.

• El análisis de condiciones físico-químicas para aplicar la técnica de bioaumentación la cual tuvo resultados positivos ya que el suelo al ser un suelo de características acidas y arcillo por sí solo no hubiera podido realizar un proceso de biorremediación.

Conclusiones

• El uso de un inóculo enzimático debería ser estudiado de manera más exhaustiva, en base a la legislación ambiental vigente RAOH 1215 en donde estipula que el recurso suelo para ser considerado remediado debe cumplir cuatro parámetros químicos TPH, Plomo, Cadmio, Níquel y HAP´s.

• Seria importante que para procesos de biorremediación en suelos que contengan contaminantes como bunker y crudo pesado en grandes cantidades primero se realice un pre tratamiento mediante lavados con detergentes surfactantes para mediante arrastre hidráulico se elimine de manera mecánica gran parte de contaminante y de esta manera bajar las concentraciones de TPH a concentraciones optimas de trabajo para la enzima.

• Durante el proceso de biorremediación de suelo por landfarm es necesario estimular el crecimiento de los microorganismos mediante la adición de variables abióticas principalmente provisión de agua mediante la humectación, el oxígeno mediante la aireación mecánica, ya que este es el aceptor de electrones en el proceso aerobio, llevado a cabo por bacterias y el adecuado suministro de nutrientes.

• Llevar un control de pH adecuado para intervenir en el caso de que las condiciones del mismo empiece a generar procesos de acidificación con lo cual la bioaumentación realizada se vería afectada directamente en las poblaciones bacterianas autóctonas del suelo.

• Al aplicar el proceso de bioestimulación tener un estricto control de la dosificación para evitar un excedente en la proporción de nutrientes.

• Se ha dejado planteado que para futuras investigaciones se tome valores de concentración de 0 ml, 20 ml, 50 ml y 100 ml con lo cual se pueda evidenciar más claramente cual concentración es la más idónea.

Recomendaciones

Se agradece la dirección de Ing. Rafael Vargas y codirección del Ing. Pedro Romero Sáker.

Al eterno apoyo de mis padres Luis y Graciela.

También a mis hermanos Elena y Luis que me han apoyado durante todos los momentos de mi vida

PM

MUCHAS GRACIAS

Atentamente.

Patricio Marcillo

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