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Departamento de Farmacología
Efecto de la tetrahidrobiopterina en la fibrosis
pulmonar inducida por bleomicina
TESIS DOCTORAL
Presentada por: Patricia Almudéver Folch
Dirigida por: Dr. D. Julio Cortijo Gimeno
Valencia, 2011
D. Julio Cortijo Gimeno, Catedrático de Universidad
adscrito al Departamento de Farmacología de la Universidad
de Valencia.
CERTIFICA:
Que Dña. Patricia Almudéver Folch, Licenciada en
Farmacia por la Universidad de Valencia, ha realizado bajo mi
dirección la presente Tesis titulada:
Efecto de la tetrahidrobiopterina en la fibrosis
pulmonar inducida por bleomicina
para la obtención del título de Doctor.
Y para que así conste a los efectos oportunos, firmo
la presente certificación.
Valencia, marzo de 2011.
Fdo. Julio Cortijo Gimeno
Mi más sincero agradecimiento a las siguientes personas:
Dr. Julio Cortijo Gimeno, por darme la oportunidad de incorporarme a su
grupo de investigación y por la confianza depositada en mi durante este
tiempo.
Dr. Manuel Mata Roig y Dr. Javier Milara Payá, por sus enseñanzas y
por su ayuda en todo momento.
Pedro Santamaría Ferrer, Dr. David Ivars Santacreu, y Dra. Lara Milián
Medina, por su soporte técnico, de gran utilidad para la confección de
este trabajo.
Dr. Alfredo de Diego Damiá, por su colaboración con la investigación
traslacional y con esta tesis en particular, a pesar de su trabajo
asistencial.
Dra. Teresa Garrigues Pelufo y Dr. José Esteban Peris Ribera, por
despertar mi interés por la investigación, porque trabajar con ellos fue
muy enriquecedor, y por su gran ayuda siempre que la he necesitado.
A mis compañeros de laboratorio, que sufren mi día a día y siempre
están dispuestos a colaborar: Pilar, Adela, Teresa, Javi, Kaya, Elena,
Amelia y Nicla; y a los que lo sufrieron en el pasado: Eva, Adrián,
Marco, Mariola, Begoña y Sonia.
A los investigadores de la Fundación de Investigación del Hospital
General de Valencia (FIHGV), a la Dra. María Dolores Miñana y a su
grupo: Amparo, Elena y Jordi. Al Dr. Rafael Sirera y la Dra. Eloisa
Jantus y su equipo “las oncogirls”: Sandra, Elena y Marta. A Sisco y a
Carmen del laboratorio de cardiovascular. También a mis compañeros
de administración y servicios de la FIHGV, en especial a Susi, Cristina,
Olivia, Enrique, José, Amparo y Patricia. Y a las bibliotecarias: Julia,
Pepa y Elvira. A todos ellos gracias por su ayuda y compañerismo.
A todos mis amigos, por su respeto hacia mi trabajo siempre.
A mi familia en general, y a mis padres en particular por su sacrificio y
confianza durante toda mi carrera.
A Jesús, por su apoyo incondicional, sin el cual este trabajo no habría
sido posible.
A mis padres
A mi familia
A Jesús
“Es justamente la posibilidad de descubrir, lo que hace
que la vida sea más interesante.”
Índice
9
ÍNDICE
1. INTRODUCCIÓN ........................................................................... 13
1.1. Vías respiratorias .................................................................... 14
1.1.1. Histología ......................................................................... 17
1.1.2. Funciones pulmonares ..................................................... 20
1.2. Fibrosis pulmonar idiopática ................................................... 22
1.2.1. Patogenia ......................................................................... 25
1.2.2. Farmacología de la fibrosis pulmonar idiopática ............. 31
1.2.2.1. Corticoides ................................................................ 32
1.2.2.2. Agentes inmunomoduladores ................................... 33
1.2.2.3. Tratamientos alternativos .......................................... 34
1.2.3. Modelos experimentales .................................................. 41
1.3. Estrés oxidativo y fibrosis pulmonar idiopática. ...................... 47
1.4. Tetrahidrobiopterina y sepiapterina......................................... 51
2. OBJETIVOS ................................................................................... 57
3. MATERIALES Y MÉTODOS .......................................................... 61
3.1. Material .................................................................................... 62
3.1.1. Fármacos ensayados ....................................................... 62
3.1.2. Reactivos utilizados ......................................................... 67
3.1.3. Animales de experimentación .......................................... 69
3.1.4. Pacientes ......................................................................... 70
Índice
10
3.2. Métodos ................................................................................... 72
3.2.1. Modelo animal .................................................................. 72
3.2.2. Protocolo experimental .................................................... 74
3.2.3. Preparación y administración de fármacos ...................... 80
3.2.4. Extracción de muestras .................................................... 83
3.2.5. Ensayos de inflamación pulmonar ................................... 84
3.2.6. Histología ......................................................................... 88
3.2.7. Método analítico para la determinación de BH4 en
muestras biológicas ................................................................... 88
3.2.7.1. Validación del método analítico ................................ 93
3.2.8. Análisis de la expresión génica. RT-PCR ........................ 95
3.2.8.1. Extracción de ARN total ............................................ 95
3.2.8.2. Transcripción inversa (RT) ........................................ 96
3.2.8.3. RT-PCR a tiempo real ............................................... 99
3.2.9. Análisis estadístico de los resultados ............................ 106
4. RESULTADOS ............................................................................. 107
4.1. Validación del modelo murino de fibrosis pulmonar inducida
con bleomicina. ............................................................................ 108
4.2. Validación del método analítico para la determinación de BH4
en muestras biológicas. ............................................................... 113
4.3. Cuantificación de niveles sanguíneos y tisulares de
tetrahidrobiopterina en modelos experimentales de fibrosis (ratón
Índice
11
C57BL/6J, rata wistar) y en enfermos diagnosticados de fibrosis
pulmonar idiopática. ..................................................................... 116
4.4. Efecto farmacológico de la tetrahidrobiopterina (BH4) 20
mg/Kg/día via oral en ratón a día 7 y a día 14 de la inducción de
fibrosis pulmonar. ......................................................................... 119
4.4.1. Evolución del peso corporal ........................................... 119
4.4.2. Peso del pulmón, proteínas en pulmón e índice de
hipertrofia ventricular derecha.................................................. 120
4.4.3. Expresión génica ............................................................ 123
4.4.4. Determinación de la concentración de tetrahidrobiopterina
................................................................................................. 129
4.5. Efecto farmacológico de la sepiapterina 10 mg/Kg/día via oral
en la fibrosis pulmonar inducida con bleomicina en ratón a día 7 y a
día 14. .......................................................................................... 132
4.5.1. Evolución del peso corporal ........................................... 133
4.5.2. Peso del pulmón, proteínas en pulmón e índice de
hipertrofia ventricular derecha.................................................. 134
4.5.3. Expresión génica ............................................................ 136
4.5.4. Determinación de la concentración de tetrahidrobiopterina.
................................................................................................. 142
4.5.5. Estudio farmacocinético de la sepiapterina vía oral……145
4.6. Efecto farmacológico de la BH4 5mg/Kg/día vía intratraqueal,
en la fibrosis pulmonar inducida con bleomicina en rata wistar a día
14.................................................................................................. 148
4.6.1. Evolución del peso corporal ........................................... 149
Índice
12
4.6.2. Peso de pulmón, proteínas en pulmón e índice de
hipertrofia ventricular derecha.................................................. 150
4.6.3. Células extravasadas en lavado broncoalveolar. .......... 152
4.6.4. Concentración de proteínas en lavado broncoalveolar
(LBA). ....................................................................................... 154
4.6.5. Expresión génica ............................................................ 155
4.6.6. Determinación de los niveles de BH4. ........................... 162
4.7. Efecto farmacológico del roflumilast 1 mg/Kg/día vía oral en la
fibrosis pulmonar inducida con bleomicina. ................................. 164
4.7.1. Evolución del peso corporal ........................................... 165
4.7.2. Peso del pulmón, proteínas en pulmón e índice de
hipertrofia ventricular derecha.................................................. 166
4.7.3. Células extravasadas en lavado broncoalveolar (LBA). 168
4.7.4. Concentración de proteínas en lavado broncoalveolar
(LBA). ....................................................................................... 169
4.7.5. Expresión génica ............................................................ 170
4.7.6. Determinación de los niveles de BH4. ........................... 177
4.8. Tabla resumen resultados ..................................................... 179
5. DISCUSIÓN.................................................................................. 181
6. CONCLUSIONES ......................................................................... 193
7. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................ 197
8. ABREVIATURAS .......................................................................... 213
1. INTRODUCCIÓN
Introducción
14
1.1. Vías respiratorias
Los pulmones están ingeniosamente estructurados para
llevar a cabo su principal función, el intercambio de gases:
extraer oxígeno del aire para llevarlo a la sangre venosa y
eliminar anhídrido carbónico al exterior. Además filtran
materiales tóxicos para eliminarlos de la circulación,
metabolizan determinadas sustancias (medidores inflamatorios,
hormonas,…), son fuente de otros mediadores y citoquinas y
actúan como diana de hormonas circulantes o generadas
localmente. Es una de las principales interfases entre el
organismo y el medio exterior1.
El sistema respiratorio está formado por los pulmones y
las vías respiratorias.
El pulmón normal del adulto pesa entre 500 y 600
gramos. Anatómicamente los pulmones, con una superficie lisa
y brillante, comprenden varios lóbulos; el pulmón derecho tiene
tres lóbulos denominados superior, medio e inferior mientras
que el izquierdo cuenta sólo con dos lóbulos y la língula que
representa al lóbulo medio.
Las vías respiratorias están formadas por la boca, las
fosas nasales, la faringe, la laringe, la tráquea, los bronquios y
los bronquiolos (Figura 1).
Introducción
15
Figura 1. Vía aérea respiratoria.
Los bronquios principales derecho e izquierdo se originan
en la tráquea y posteriormente comienzan a dividirse dando
lugar cada vez a vías más pequeñas. En la tráquea y bronquios
principales, el cartílago tiene forma de placas en C, quedando
libre de cartílago la porción membranosa posterior. Sólo existe
músculo liso en esta porción membranosa. Sin embargo a
medida que el bronquio principal penetra en el pulmón, cambia
esta organización de manera que el cartílago forma placas
discontinuas y el músculo rodea toda la pared. La ramificación
progresiva va a dar lugar a los bronquiolos, que se diferencian
de los bronquios por la ausencia de cartílago y aparición de
glándulas submucosas en su pared. Los bronquiolos se
ramifican generando los denominados bronquiolos terminales,
Introducción
16
que miden menos de 2 mm de diámetro. En la parte terminal de
estos bronquiolos encontramos el acino o unidad respiratoria
terminal, con forma esférica y un diámetro de 7 mm. Estos
acinos contienen los alveolos, lugar donde se produce el
intercambio gaseoso. Un acino está formado por los
bronquiolos respiratorios (procedentes del bronquiolo terminal),
que se continúan con los conductos alveolares, e
inmediatamente se ramifican y desembocan en los sacos
alveolares cuyas paredes están formadas enteramente por
alvéolos, que constituyen los extremos ciegos de las vías
respiratorias (Figura 2).
Figura 2. Esquema de un acino.
Introducción
17
1.1.1. Histología
Desde el punto de vista microscópico, excepto las
cuerdas vocales que estan tapizadas por el epitelio escamoso,
todo el árbol respiratorio incluyendo la laringe, tráquea,
bronquios y bronquiolos, está tapizado por células epiteliales
pseudoestratificadas, columnares altas, ciliadas, muy
entremezcladas y con células caliciformes mucosecretoras. La
mucosa bronquial también presenta células neuroendocrinas2,
que contienen gránulos de neurosecreción: serotonina,
calcitonina y péptido liberador de gastrina (bombesina).
Dispersas por toda la pared de la tráquea y de los bronquios,
pero no de los bronquiolos, existen numerosas glándulas
submucosas mucosecretoras. La superficie bronquial está
recubierta por cilios que se rodean de una capa de agua y
proteínas, ricas en lisozima e inmunoglobulinas, pero al
contrario que los alvéolos no contiene surfactante pulmonar y a
diferencia de los bronquios no contiene moco. Cómo ya se ha
comentado, no hay células mucosas en las paredes de los
bronquiolos, en su lugar existen las células clara que segregan
una proteína de revestimiento pobre en moco.
Las paredes alveolares o septos alveolares no son
sólidas, sino que están perforadas por numerosos poros de
Khon, que permiten el paso de las bacterias y exudados entre
alvéolos adyacentes. Estas paredes alveolares están formadas
por:
Introducción
18
���� El endotelio capilar : los capilares pulmonares
tienen un diámetro muy pequeño (5 a 7 µm) y están
limitados por el endotelio que descansa sobre la
membrana basal. Las células endoteliales miden la
mitad de los neumocitos tipo I, presentan una región
perinuclear de 3 mm de espesor y largas
prolongaciones citoplásmicas enrolladas que forman la
pared misma de los capilares. Las células endoteliales
están unidas entre sí por uniones menos estrechas que
las de las células epiteliales (mácula occludens o spot
juntions), de una longitud de 40 nm; las membranas
celulares están separadas por un espacio de 10 a 15
nm pero permiten la existencia de varios
estrechamientos de sólo 4 nm (spot). Lo esencial de las
transferencias convectivas y de difusión del agua,
electrolitos y moléculas hidrosolubles de un PM<40.000
se lleva a cabo a través de estas uniones, pero la
transferencia de macromoléculas se ve limitada por su
escaso diámetro y por la existencia de un gel proteico y
mucopolisácarido cuyas mallas retienen las grandes
moléculas. Las células endoteliales son ricas en
filamentos y son susceptibles de contraerse bajo el
efecto de la histamina, serotonina y bradicinina,
aumentando la permeabilidad capilar al abrirse las
uniones.
Introducción
19
���� La membrana basal y el tejido intersticial
adyacente: separan las células endoteliales del
revestimiento epitelial alveolar. En estas porciones del
septo alveolar, se fusionan las membranas basales del
epitelio, mientras que en las porciones más gruesas,
están separadas por un espacio intersticial (el intersticio
pulmonar) que contiene fibras elásticas, pequeños
haces de colágeno, algunas células de tipo fibroblástico,
células musculares lisas, células cebadas, linfocitos y
unos pocos monocitos.
���� El epitelio alveolar: forma una capa continua con
dos tipos celulares, los neumocitos tipo I o neumocitos
membranosos, células aplanadas, que tapizan el 95%
de la superficie celular y alveolar y los neumocitos tipo II
o neumocitos granulares, que tienen microvellosidades
en su superficie, son de forma cuboidal y sintetizan y
secretan un fosfolípido denominado surfactante
pulmonar. Estas células tipo II son importantes ya que
es el principal tipo celular implicado en la reparación del
epitelio alveolar tras la destrucción de los neumocitos
tipo I.
Unidas de forma laxa a las células epiteliales se
encuentran los macrófagos alveolares, éstos derivan de los
monocitos de la sangre y pertenecen al sistema fagocítico
mononuclear.
Introducción
20
Junto al revestimiento epitelial alveolar existe una capa
de glicoproteínas sobre la cual se sitúa una fina película de
fosfolípidos, principalmente fosfatidilcolina (lecitina), que es el
surfactante pulmonar. Esta lecitina disminuye la tensión del
revestimiento y mantiene la estabilidad del alveolo. La mitad de
la adaptabilidad del pulmón se debe a esta fuerza de
disminución de la tensión superficial y no al tejido elástico. El
surfactante, producido en los neumocitos tipo II, resulta
esencial para mantener abierta la superficie respiratoria y
defenderla frente a la entrada de microorganismos a las células
epiteliales y a través de estas a los capilares sanguíneos y al
resto del organismo.
1.1.2. Funciones pulmonares
La principal función del sistema respiratorio es el
intercambio gaseoso, pero también existen otras funciones
pulmonares no respiratorias entre las que podemos incluir la
defensa frente a sustancias inhaladas, funciones relacionadas
con la circulación sanguínea y funciones metabólicas.
Cada día las vías respiratorias están expuestas a más
de 10.000 litros de aire contaminado con polvo, sustancias
químicas, y microorganismos nocivos. Sin embargo, el pulmón
normal es ésteril, gracias a la eficacia de los mecanismos de
filtrado y aclaramiento:
Introducción
21
� Aclaramiento nasal: en las regiones donde el
epitelio no es ciliado, las partículas se eliminan durante
el estornudo y con el moco nasal. En la parte posterior,
con epitelio ciliado, las partículas son barridas hacia la
nasofaringe y después deglutidas. La presencia de
epitelio pseudo-estratificado ciliar y las secreciones de
las células calciformes (moco) son los responsables del
aclaramiento. Cada célula ciliar del sistema de
conducción tiene alrededor de 250 cilios que producen
aproximadamente mil pulsaciones por minuto. De
manera que las partículas suspendidas en el aire de un
tamaño entre 3-10µm son atrapadas en este epitelio y
de aquí rápidamente eliminadas por el movimiento del
moco hacia la faringe, para ser finalmente deglutidas.
� Aclaramiento traqueobronquial: es la acción
mucociliar en este caso la que arrastra las partículas a
la orofaringe, donde serán deglutidas o expectoradas
como hemos visto anteriormente.
� Aclaramiento alveolar: las bacterias o partículas
sólidas depositadas en los alveolos son fagocitadas por
los macrófagos alveolares, que las eliminan por
digestión o por transporte a los bronquios respiratorios.
Si la sobrecarga de partículas es intensa y sobrepasa la
capacidad de transporte de los macrófagos, algunas
partículas pueden llegar a los ganglios linfáticos y a
Introducción
22
través del flujo sanguíneo llegar a cualquier parte del
organismo.
La actividad metabólica de los pulmones es muy
intensa, participan en los fenómenos de conversión y activación
de sustancias vasoactivas y en la producción, almacenamiento
y liberación de sustancias utilizadas localmente o en otras
partes del cuerpo. Muchas sustancias vasoactivas de la sangre
se inactivan, se alteran o son eliminadas al pasar por los
pulmones. Se cree que esta actividad metabólica se realiza en
el endotelio de los capilares pulmonares3.
1.2. Fibrosis pulmonar idiopática
Las enfermedades pulmonares intersticiales difusas son
un grupo de patologías que se caracterizan por la inflamación y
cicatrización de los alveolos y del intersticio. Se produce una
pérdida de las unidades funcionales alveolares y una reducción
en la transferencia de oxígeno a la sangre.
La fibrosis pulmonar idiopática (FPI), también llamada
alveolitis fibrosante criptogénica, es la enfermedad pulmonar
intersticial de mayor incidencia y peor pronóstico. Es una forma
específica de neumonía intersticial fibrosante crónica, de origen
desconocido y limitada al pulmón, con la apariencia histológica
de neumonía intersticial usual en la biopsia de pulmón. Cursa
con la sintomatología inicial de insuficiencia respiratoria
causada por ejercicio y tos seca.3-6
Introducción
23
La FPI afecta a 5 millones de personas en todo el mundo
de edades comprendidas entre 40 y 75 años, siendo más
frecuente en hombres que en mujeres, con una incidencia de
10,7/100.000 y 7,4/100.000 y una prevalencia de 20,2/100.000
y 13,2/100.000 respectivamente7-9. Todavía no existe ningún
tratamiento eficaz para combatirla, siendo la supervivencia
media de 2,8 años10,11, similar a la de pacientes con cáncer de
pulmón3.
Actualmente, la clínica y el diagnóstico de la FPI está
bien consensuado y establecido, ya que a principios de este
siglo, el grupo multidisciplinario internacional de la American
Thoracic Society (ATS) y la European Respiratory Society
(ERS) redactaron un consenso donde se compilan los criterios
clínicos, radiológicos y anatomopatológicos que permiten el
diagnóstico de la FPI4,5. Los síntomas ya nombrados de disnea
y tos improductiva surgen de forma insidiosa y empeoran
progresivamente; en fases avanzadas aparece insuficiencia
respiratoria, hipertensión pulmonar y signos de cor pulmonale.
A la auscultación respiratoria destacan los estertores
crepitantes. En un 50% de los casos se puede observar
acropaquia en los dedos de las manos. La tomografía axial
computerizada (TACAR), con una sensibilidad diagnóstica del
90%6, permite observar, en más de la mitad de los casos,
imágenes características de neumonía intersticial usual12, es
decir, afectación de predominio basal y periférico caracterizada
por alteraciones reticulares, bronquiectasias de tracción y áreas
Introducción
24
en panal subpleural, con escaso o ausente vidrio deslustrado,
junto con disminución del volumen pulmonar. Las alteraciones
del lavado broncoalveolar (LBA) suelen consistir en neutrofilia
asociada o no a moderada eosinofilia. La linfocitosis no es una
característica de la FPI; cuando el porcentaje de linfocitos es
superior al 15% o el de eosinófilos mayor del 20%, deben
descartarse otros diagnósticos5.
Cuando los pacientes no cumplen estrictamente los
criterios clínico-radiológicos, la biopsia pulmonar a cielo abierto
sigue siendo necesaria, lo que ocurre en el 25-40% de casos.
Los hallazgos histológicos principales en la FPI, son daño
epitelial persistente, acumulo de fibroblastos/miofibroblastos, y
abundante depósito de colágeno con afectación predominante
subpleural, y en algunos casos discreta inflamación
intersticial13. Se denominan cambios en panal a las zonas
aéreas alargadas y quísticas con neumocitos tipo II anormales.
La heterogeneidad temporal, zonas modificadas alternando con
zonas de parénquima normal, es lo que la diferencia de otras
patologías intersticiales. La presencia de abundantes focos
fibroblasticos y miofibroblásticos se correlaciona con la
mortalidad en la FPI14,15, y se intenta unificar los criterios de su
cuantificación para su utilidad pronóstica16.
La evolución de la enfermedad es progresiva y cursa con
episodios de agudización que empeoran la situación clínica del
paciente. Los parámetros funcionales utilizados para evaluar el
pronóstico de la FPI, son la FVC (capacidad vital forzada) y la
Introducción
25
DLCO (capacidad de transferencia de CO) al diagnóstico y
evolución17-20. Otros estudios sugieren que la prueba de
marcha de seis minutos21 y los cambios tomográficos18 también
pueden ser útiles para valorar la evolución de la FPI.
1.2.1. Patogenia
Inicialmente se pensaba que la causa principal de la
fibrosis pulmonar era la inflamación alveolar crónica22,23. Esta
hipótesis quedó en entredicho tras observar clínicamente que
el grado de inflamación pulmonar no se correlacionaba con la
gravedad de la fibrosis y que el uso de fármacos
antiinflamatorios e inmunosupresores no modificaban la historia
natural de la enfermedad4,5,13. En su lugar, apareció una nueva
hipótesis que proponía que la FPI es consecuencia de una
lesión epitelial de causa desconocida seguida de un proceso
anormal de cicatrización, y que es independiente de la
inflamación inicial.
Durante la última década se han desarrollado diferentes
conceptos que nos aportan información para perfilar esa
hipótesis:
Introducción
26
1. Importancia de la membrana basal (MB) de la barrera
alveolo-capilar para conservar la arquitectura del pulmón
dañado.
La barrera alveolo-capilar es el área de intercambio de
gases en el pulmón y supone la superficie más grande del
pulmón que separa su interior del ambiente. Está compuesta
por células epiteliales alveolares tipo I, células endoteliales
capilares y sus membranas basales respectivas.
Aproximadamente a mitad de la barrera las dos membranas se
fusionan, y por el resto están separadas por una pequeña capa
de intersticio. Como ambos tipos celulares son aplanados, tiene
mucha superficie pero poco citoplasma, y la barrera está
compuesta básicamente por cuatro bicapas lipídicas, el mínimo
citoplasma posible y las MBs, con un espesor de 0,3µm.
Cuando se lesiona la barrera, se produce hemorragia y
extravasación de plasma al tejido pulmonar; la activación
plaquetaria y la desgranulación producen liberación de
mediadores lipídicos, citoquinas, y factores de crecimiento a la
matriz que generan la activación de células epiteliales,
endoteliales, fibroblastos/miofibroblastos y leucocitos. Cuando
la MB no está afectada y el estímulo de la lesión se elimina, se
produce una reparación normal y completa mediante los
procesos simultáneos de reabsorción de los depósitos en la
matriz extracelular, y de reepitelialización y reendotelización de
la barrera alveolo-capilar24,25. En cambio, en pacientes con FPI,
se producen las siguientes circunstancias25-31 (Figura 3).
Introducción
27
� Perdida de células endoteliales y epiteliales tipo I.
� Pérdida de la integridad de la membrana basal de la
barrera alveolo-capilar con colapso de las estructuras
alveolares y fusión de sus membranas basales.
� Proliferación de células epiteliales alveolares tipo II
y células endoteliales en una matriz extracelular
inapropiada, sin restablecimiento de la estructura
epitelial normal.
� Reclutamiento y proliferación de fibroblastos y
miofibroblatos con depósito de matriz extracelular
madura generándose el estado final de fibrosis alveolar.
Figura 3. Diagrama representativo de la respuesta fibrótica fisiológica y patológica tras lesión pulmonar.
Introducción
28
2. Fallo en la reepitelialización y reendotelización como
pérdida de la integridad de la membrana basal en la
neumonía intersticial asociada a fibrosis pulmonar conlleva
destrucción de la estructura pulmonar y fibrosis patológica.
El análisis estructural del tejido pulmonar de pacientes con
FPI demuestra que:
� Las células endoteliales y los neumocitos tipo I han
sufrido daños y se ha perdido la integridad de la barrera.
� Se produce depósito intralveolar de matriz con
acumulación de fibroblastos y miofibroblastos.
� Existe obstrucción y fibrosis alveolar; se produce el
denominado foco fibroblástico, con la consecuente
pérdida de la estructura y la función alveolar.
3. El Tgf-β (factor transformador del crecimiento beta) es
necesario pero no imprescindible para generar fibrosis
permanente.
Se ha demostrado que la sobreexpresión condicionada de
Tgf-β promueve la fibrosis peribronquial con extensión al
parénquima pulmonar en modelos animales y que si se
elimina el gen una vez instaurada la fibrosis, ésta desaparece
y se normaliza la estructura peribronquial y del parénquima
pulmonar32.
Introducción
29
4. Para que se produzca la fibrosis pulmonar, es necesaria la
exposición de manera persistente a agentes irritantes,
antígenos, o lesión.
Se produce inflamación crónica, lesión epitelial y endotelial
de la barrera alveolo-capilar con pérdida de la membrana
basal, colapso alveolar, activación de fibroblastos y
miofibroblastos y deposito de la matriz extracelular.
5. La transición epitelio-mesenquimal (EMT) y el fibrocito son
mecanismos celulares críticos en la regulación de la
fibrosis.
Los fibroblastos y los miofibroblastos juegan un papel
importante en el depósito de matriz extracelular en la fibrosis
pulmonar. Se ha observado que los fibrocitos circulantes son
células progenitoras mesenquimales que se extravasan al
foco de la lesión tisular, se diferencian a fibroblastos y
miofibroblastos, y contribuyen a la generación de matriz
extracelular durante la fibroproliferación31,33 (Figura 4). Se
cree que el daño tisular con presencia de Tgf-β, induce la
transición de células epiteliales tipo II o neumocitos tipo II a
estas células con fenotipo mesenquimal, fibroblastos y
miofibroblastos, que contribuyen a la fibroproliferación34-37.
Introducción
30
Figura 4. Posibles fuentes de fibroblastos pulmonares.
La EMT, evento crítico en la patogénesis de la fibrosis,
está inducida principalmente por Tgf-β, que es activado por
especies reactivas de oxígeno, y se ha visto atenuado por el
óxido nítrico (NO), el cual es un potente mediador de la
alveolización y del crecimiento pulmonar38,39. Las células
alveolares epiteliales producen NO por la acción de la enzima
óxido nítrico sintasa endotelial (NOS), principalmente por las
isoformas endotelial (eNOS) e inducible (iNOS). La
administración exógena de NO atenúa la acumulación de
matriz extracelular, aumenta el crecimiento pulmonar y
disminuye el número de miofibroblastos40.
Introducción
31
Otro desequilibrio observado en la alteración mesenquimal
de la FPI es la respuesta inmune Th1/Th2, en la que existe un
aumento en la síntesis de IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13 al activarse
las células Th2 (células T helper tipo 2)41. En los modelos
animales de fibrosis pulmonar donde se ha inhibido la
respuesta Th1 se observa un predominio en los productos
moleculares de la respuesta Th2 y mayor depósito de
colágeno.
1.2.2. Farmacología de la fibrosis pulmonar
idiopática
Actualmente no existe ningún tratamiento eficaz ni
específico aprobado por la EMA (Agencia Europea de
Medicamentos) o la FDA (Food and Drug Administration) para
la fibrosis pulmonar idiopática. Sí existe un tratamiento
específico aprobado recientemente en Japón42-44.
Como se ha comentado anteriormente, la teoría
patogénica inicial consideraba la FPI como consecuencia de
una agresión inicial no identificada que iniciaba el ciclo de una
inflamación crónica que se traducía en fibrosis. La presunción
de que la interrupción de la cascada inflamatoria antes de la
presencia de una lesión parenquimatosa irreversible podría
aliviar la fibrosis, propició que el tratamiento con
antiinflamatorios pareciera razonable. Tradicionalmente se han
usado corticosteroides, inmunosupresores o citotóxicos. No
Introducción
32
obstante, en la actualidad se ha aclarado que estas opciones
de tratamiento no confieren un beneficio demostrado y
producen efectos adversos potencialmente graves.
Hoy por hoy se están llevando a cabo 32 ensayos
clínicos en todo el mundo para la FPI con intervención
farmacológica45,46, y continúan aumentando los conocimientos
sobre la patogenia e historia natural de la enfermedad, que
condicionan las estrategias terapéuticas nuevas. Todo ello
hace pensar que nos encontramos en un momento decisivo en
el estudio y tratamiento de la FPI.
A continuación, se resumen las propiedades de los
tratamientos que se han utilizado hasta el momento como
opción terapéutica para la FPI. Desde los medicamentos más
convencionales como es el uso de corticoides y citotóxicos
hasta tratamientos más actuales.
1.2.2.1. Corticoides
A pesar de que los corticosteroides se han
considerado la base principal del tratamiento durante
décadas, no hay disponibles ensayos controlados que hayan
usado estos agentes solos para el tratamiento de la FPI. En
una revisión de estudios no controlados, los autores
revelaron que la mejora a corto plazo de la función pulmonar
no afectó a la supervivencia a los 3-5 años47 y el hecho de
que estos estudios sean anteriores al consenso de
Introducción
33
diagnóstico para las enfermedades intersticiales de la
ATS/ERS, no genera pruebas concluyentes que respalden
su uso para la FPI.
La terapia con corticoides produce reacciones
adversas significativas. Entre ellas, úlcera péptica, cataratas,
aumento de la presión ocular, hipertensión, alteraciones
metabólicas, complicaciones musculoesqueléticas,
osteoporosis y miopatías, así como efectos psicológicos tipo
depresión, euforia y psicosis. Por ello, la evaluación del
paciente durante y después del tratamiento es muy
importante.
El informe de consenso publicado por la ATS/ERS,
recomienda un tratamiento combinado con corticoides y
azatioprina o ciclofosfamida (inmunosupresores)4.
1.2.2.2. Agentes inmunomoduladores
La azatioprina y la ciclofosfamida son los fármacos
de segunda línea utilizados con más frecuencia,
habitualmente en combinación con corticosteroides. Apenas
se dispone de información de buena calidad relativa a la
eficacia de estos agentes en la FPI, y no se justifica el uso
sistemático de estos fármacos en el tratamiento de estos
procesos48.
Introducción
34
� Ciclofosfamida
Antineoplásico de tipo fosforamida, del grupo de
las mostazas nitrogenadas. Se absorbe por via oral
y en el hígado se activa por biotransformación a
varios compuestos citotóxicos que inhiben la
función linfocitaria3.
� Azatioprina
Es un análogo de purina que es convertido a
mercaptopurina en los tejidos del organismo. Este
inhibe la adenina desaminasa, que perjudica la
proliferación de células, sobre todo leucocitos y
linfocitos. Es menos tóxico que la ciclofosfamida.
No induce lesión en la vejiga y presenta discreto
potencial oncogénico discreto3.
1.2.2.3. Tratamientos alternativos
� INF-γ
Es una citoquina que regula la función de los
macrófagos e inhibe la fibrogénesis. Combinada con
un glucocorticoide mejora la estabilización de la
enfermedad en pacientes en estadios poco
avanzados de FPI49. En cambio, en pacientes más
graves no parece que beneficie ni mejore la
supervivencia50.
Introducción
35
� Antagonistas de la endotelina 1
La endotelina 1 ha mostrado ser una molécula
con fuertes efectos fibrogénicos, como la inducción
de proliferación de fibroblastos y su diferenciación a
miofibroblastos e incremento de la síntesis de
moléculas de la matriz extracelular. Se encuentra
incrementada en los pulmones de pacientes con FPI,
donde la expresan sobre todo las células del epitelio
alveolar. Experimentalmente se ha demostrado que
la inyección percutánea de un plásmido que expresa
endotelina en pulmones de rata induce cambios
fibróticos que se localizan específicamente en las
regiones donde se expresa este gen51,52. Asimismo,
ratones transgénicos que sobrexpresan la pre-
proendotelina 1 humana desarrollan fibrosis
pulmonar difusa y progresiva sin ninguna agresión
desencadenante53. Sobre la base de estos hallazgos
se ha intentado su bloqueo en modelos
experimentales y así se ha demostrado que la
administración oral de bosentán, un antagonista no
selectivo del receptor de la endotelina 1, protege
contra la fibrosis inducida por bleomicina en ratas54.
El bosentán se utiliza actualmente para el
tratamiento de la hipertensión arterial pulmonar y es
bien tolerado por esta población de pacientes55. Se
sugiere que el bosentan pueda mejorar la disnea y la
Introducción
36
calidad de vida56. Actualmente se están llevando a
cabo 5 ensayos clínicos que aportaran más
información en el futuro.
� Pirfenidona
Es un componente piridínico que en modelos
animales ha demostrado un amplio rango de efectos,
como son antifibrótico, antiinflamatorio y antioxidante;
sin embargo, su mecanismo de acción concreto se
desconoce. Tras varios ensayos clínicos de fase II y
III realizados en Japón, que concluían que la
pirfenidona podía disminuir la progresión de la
enfermedad, en 2008 se comercializó en el mercado
de Japón, siendo así el primer medicamento
aprobado para la FPI en un gran mercado50.
� N-acetilcisteína (NAC)
Es el derivado n-acetilado del aminoácido natural
cisteína. Reduce la viscosidad de las secreciones
bronquiales, favoreciendo su eliminación. Debido a la
presencia de un grupo tiólico libre, es capaz de
romper los puentes disulfuro que mantienen la
estructura tridimensional de las mucoproteínas, lo
que da lugar a la fluidificación de la secreción. Posee
propiedades antioxidantes, y como tal, previene del
daño celular epitelial mediado por radicales libres. La
n-acetilcisteína (NAC) aumenta la síntesis de
Introducción
37
glutatión, un potente mediador antioxidante tanto in
vitro como in vivo, y su administración por vía oral
disminuye la respuesta fibrótica en ratones
expuestos a bleomicina57-60. Estudios llevados a cabo
en humanos durante un año, concluyen que los
pacientes que toman NAC a dosis elevadas, sufren
menos deterioro en la DLCO y FCV61. Esto sumado a
la ausencia de efectos secundarios, hace que este
fármaco se esté añadiendo a la combinación
terapéutica convencional.
� Etanercep
Es un antagonista de los receptores solubles de
TNF (factor de necrosis tumoral), que se utiliza para
el tratamiento de la artritis reumatoide. El TNF es una
citocina multifuncional que parece tener algunas
actividades profibróticas3.
� Mesilato de imatinib
El imatinib es un inhibidor de la tirosincinasa c-
Abl, que también inhibe la activación del receptor del
factor de crecimiento derivado de las plaquetas,
(PDGF). Disminuye sustancialmente la fibrosis de la
médula ósea en seres humanos. Se han registrado 6
casos de neumonitis inducida por este fármaco, y
uno de ellos era en un paciente afectado de FPI62.
Introducción
38
� Anticoagulantes
Es una terapia en investigación. Se sabe que
durante los procesos alveolíticos o fibróticos se
produce trombosis. La anticoagulación combinada
con prednisolona parece tener efecto beneficioso en
la supervivencia de pacientes con FPI63.
� Relaxina
Es también una terapia en investigación. Se trata
de una hormona peptídica de la superfamilia de la
insulina, y está involucrada en el remodelado de la
matriz extracelular. Ha demostrado eficacia en
modelos animales de fibrosis: reduce el contenido de
colágeno y el espesor alveolar. Concretamente se ha
visto que reduce la expresión de colágeno tipo I y III,
y de fibronectina en el pulmón como respuesta a Tgf-
β (agente fibrogénico). Además inicia la degradación
de la matriz extracelular aumentando los niveles de
metaloproteinasas de matriz64.
� Trasplante pulmonar
Se debe considerar para aquellos pacientes que
presenten un progresivo deterioro a pesar del
tratamiento farmacológico, y siempre que cumplan
los criterios de inclusión para su realización.
Introducción
39
La escasa disponibilidad de órganos válidos para
el trasplante deriva de dos factores principales65-67: a)
la extraordinaria sensibilidad de los pulmones a la
infección y a la lesión producida por la ventilación
mecánica durante el período de ingreso en UCI, y b)
los donantes de órganos están desplazándose hacia
las bandas de mayor edad, por lo que queda excluida
la donación de pulmón en muchos casos. En 2005 la
media de edad de los donantes multiorgánicos en
España se situó en 51,4 años, frente a los 34,5 del
año 1992.
A la carencia de órganos disponibles hay que
sumar la mortalidad en lista de espera de trasplante
de pulmón (el 5,3% en 2006) y la restrictiva entrada
de candidatos.
En la mayoría de los casos se realiza trasplante
unipulmonar. La supervivencia a los 5 años después
del trasplante es del 50-60%.
Probablemente la terapia efectiva pase por la
combinación de varios de estos fármacos
antifibróticos y de otros en estudio, actuando a
diferentes niveles del proceso fibrogénico pulmonar.
Se ha sugerido que el recambio del epitelio alveolar
dañado por células sanas de la misma estirpe, podría
ser un tratamiento eficaz en la FPI. Estos estudios
con utilización de células madre todavía deben
Introducción
40
resolver algunos problemas básicos pero esenciales,
como son el número total de células necesarias,
rechazo inmunológico, vía de administración
adecuada, y el control de su diferenciación una vez
llegado al tejido pulmonar68, por lo que sigue siendo
una opción a largo plazo. No obstante, es importante
recalcar que los últimos resultados en este sentido
con experimentación animal son bastante
satisfactorios69.
Introducción
41
1.2.3. Modelos experimentales
En los últimos años, los modelos experimentales de
fibrosis pulmonar han aportado información muy relevante
sobre su fisiopatología, lo que ha permitido avanzar en el
conocimiento de su evolución. Además son una herramienta
indispensable para evaluar la seguridad y acción de nuevos
fármacos antifibróticos (Figura 5).
Figura 5. Investigación traslacional: los estudios experimentales son una herramienta indispensable para la investigación básica de las enfermedades respiratorias.
• Modelos experimentales in vitro
Los modelos experimentales in vitro comprenden
una amplia serie de métodos cuyo objetivo es evaluar
una respuesta celular o molecular determinada. Los
Introducción
42
estudios morfológicos aportan información relevante
sobre el desarrollo y la progresión de la fibrosis. Sin
embargo, estos modelos sólo permiten evaluar la
expresión de una determinada molécula y comparar sus
características respecto al tejido sano. Para evaluar si
estos hallazgos tienen una implicación activa en el
proceso fibrótico y determinar su papel, es
indispensable trabajar con modelos que permitan la
funcionalidad del tejido o la actividad de las células que
intervienen. Suelen utilizarse explantes de tejido
pulmonar o cultivos de células inflamatorias y
mesenquimales, obtenidas de modelos animales y de
pacientes con fibrosis pulmonar.
• Modelos experimentales in vivo
Se utilizan modelos animales en la investigación de
los mecanismos fibrogénicos por las similitudes
estructurales, bioquímicas y moleculares entre la
reacción fibrótica en humanos y animales.
La experimentación animal es el único
procedimiento que permite valorar en tiempo real el
efecto de las interacciones genéticas, bioquímicas y
medioambientales que provocan fibrosis pulmonar.
Estos modelos se utilizan para investigar un amplio
abanico de eventos:
Introducción
43
� El control de la muerte celular fisiológica
(apoptosis) tanto del epitelio alveolar como de
fibroblastos y miofibroblastos.
� Síntesis, mecanismo de acción y regulación de
mediadores fibrogénicos o antifibrogénicos.
Dependiendo del mecanismo que se desea
estudiar, se puede utilizar tanto la manipulación
génica como la inducción externa del proceso
fibrótico.
� Ensayo de nuevos fármacos antifibróticos o
intervenciones que frenen la fibrogenia.
No hay ningún modelo animal que reproduzca
exactamente todos los aspectos de la fibrosis pulmonar
en humanos70. Por este motivo la utilidad y elección del
modelo animal a utilizar estarán condicionadas por las
características del evento fibrótico determinado que se
quiere estudiar, las hipótesis y los objetivos de la
investigación, así como las consideraciones logísticas
experimentales de las que se dispone71.
El animal de experimentación más utilizado es el
ratón (Mus musculus) debido a que presenta ventajas
sobre otras especies; entre las más importantes:
genoma bien caracterizado, ciclo de reproducción corto,
camadas grandes, tamaño pequeño, fácil manipulación
y menor coste. No obstante, se ha estudiado un amplio
Introducción
44
grupo de animales. Los métodos convencionales para
inducir reacciones pulmonares fibróticas incluyen la
instilación directa de agentes fibrogénicos y la
exposición a irradiación torácica 72-74.
AGENTE INDUCTOR ESPECIE ANIMAL UTILIZADA
Bleomicina Ratón, rata, hámster, conejo, perro, mono, faisán
Amiodarona Ratón, rata, hámster
Partículas inorgánicas (sílice,
asbesto) Ratón, rata, hámster, conejo, cabra
Irradiación Ratón, rata, hámster, conejo, perro, mono, cabra
Isocianato de fluoresceína Ratón
Pentóxido de vanadio Ratón, rata
Antígenos apténicos (trinitrobenceno) Ratón, hámster
Cobalto inhalado Rata
Tabla 1. Modelos animales de fibrosis pulmonar
Entre los agentes fibrogénicos, el más utilizado es
la bleomicina, un potente agente antineoplásico que
actúa mediante un efecto oxidante, escindiendo el ADN
Introducción
45
y aumentando los mediadores fibrogénicos. Se puede
administrar de forma intratraqueal, intraperitoneal o
intravenosa, y raramente por vía intramuscular o
subcutánea. Las primeras observaciones del efecto
profibrótico de este agente antineoplásico fueron en
perros75. Posteriormente se estandarizó la instilación
intratraqueal en dosis única en ratas y ratones, hasta
determinar la dosis requerida para provocar cambios
pulmonares fibróticos uniformes, muy similares a los
observados en la FPI76,77.
Las lesiones inducidas por este agente incluyen
inflamación parcheada y variable, lesión epitelial con
hiperplasia reactiva y apoptosis, alteración de la
membrana basal, fibrosis de distribución heterogénea
(intraalveolar, subpleural o bronquiolocéntrica), así
como focos de células mesenquimales en forma de
huso de apariencia similar a los focos de miofibroblastos
observados en la neumonía intersticial usual78.
En los últimos años el modelo de bleomicina se ha
utilizado para:
a) Estudiar los mecanismos de acción de factores
de crecimiento y de diversas citocinas, así como el
efecto terapéutico de su inhibición54,59,79-83.
b) Valorar la modulación transgénica en la
respuesta fibrótica e identificar posibles loci
Introducción
46
reguladores en la predisposición genética a la
fibrosis pulmonar80,84
c) Estudiar la alteración celular epitelial,
fibroblástica y de la matriz extracelular85-87.
Aunque el modelo de bleomicina instilada es
fácilmente reproducible, cabe recordar que es un modelo
de lesión de rápida instauración y duración determinada.
Para estudiar eventos iniciales, donde predomina la
inflamación, se toman muestras de los animales entre el
tercer y el séptimo día. Por el contrario, si lo que se
pretende es estudiar la fase fibrótica de la lesión, lo
ideal es que los animales se evalúen las semanas 2 y 3,
dado que el daño provocado revierte espontáneamente
a partir de la tercera semana77. Los modelos de
administración continua de bleomicina que se han
ensayado hasta la actualidad no acaban de reproducir
con exactitud la cronicidad de la fibrosis pulmonar88.
La inducción de fibrosis con amiodarona es otro
modelo bien estandarizado en rata, ratón y hámster. Se
utiliza para el estudio de su toxicidad y administrada por
vía endotraqueal y oral se ha observado que el efecto
profibrótico deriva tanto de este compuesto como de su
metabolito, la desetilamiodarona89-91.
La inhalación de partículas como el asbesto o sílice
induce lesiones pulmonares similares en humanos y
roedores: provoca fibrosis de forma progresiva,
Introducción
47
acompañada de reacción inflamatoria granulomatosa.
Estos modelos son especialmente útiles para el estudio
de macrófagos y otros fagocitos92,93.
Otros elementos pueden inducir fibrosis en
animales, como la inhalación de cobalto y cloruro de
cadmio, paraquat o diquat vía sistémica, isocianatos y
nitrosoureas, o pentóxido de vanadio, aunque su uso
para el estudio de este proceso no ha sido
estandarizado. La irradiación como inductor de fibrosis
es también un sistema muy utilizado. Las dosis
empleadas son variables y los efectos fibróticos pueden
persistir varios meses tras la radiación94-96. El
inconveniente principal es el equipamiento, que
comporta la necesidad de grandes espacios, así como
una rigurosa utilización y mantenimiento del sistema.
1.3. Estrés oxidativo y fibrosis pulmonar
idiopática.
La clínica y el diagnóstico de la FPI está bien
consensuado y establecido4,5. Por el contrario, se desconocen
las causas precisas que la provocan, pero se sabe que la
lesión pulmonar y la depósito excesivo de tejido fibrótico tienen
un papel clave en la patogénesis de la enfermedad.
Introducción
48
Las especies reactivas de oxígeno (ERO) desempeñan
un papel fisiológico en el organismo, pero pueden dar lugar a
reacciones de oxidación indeseadas contra las cuales los
organismos han tenido que desarrollar defensas
antioxidantes97. Como respuesta a la lesión tisular se desarrolla
la inflamación cuyo objetivo es la destrucción y eliminación de
los agentes nocivos y la reparación del tejido. Cuando esta
respuesta ocurre de una manera incontrolada se produce un
daño tisular excesivo que resulta en inflamación crónica y
destrucción del tejido normal.
El estrés oxidativo se define como una alteración del
equilibrio entre las especies prooxidantes y las antioxidantes
provocándose un daño en las moléculas por la acción de estas
ERO. Así pues, el estrés oxidativo puede originarse por un
exceso de sustancias prooxidantes, una deficiencia de agentes
antioxidantes, o por ambas a la vez. Las ERO, como el anión
superóxido (02-), son liberados por los fagocitos reclutados en
los sitios de inflamación y son una de las principales causas de
daño celular y tisular.
Las células pulmonares, en particular las epiteliales tipo
II, son susceptibles de ser lesionadas por agentes oxidantes.
Se ha visto que estas células, como respuesta al estrés
oxidativo, son capaces de liberar mediadores inflamatorios
como TNF-α, IL-1 e IL-8. La liberación de estos mediadores
provoca el reclutamiento de neutrófilos y la activación de
factores de transcripción como el factor nuclear kβ (NF-kβ) y el
Introducción
49
activador de proteína-1 (AP-1), provocándose el aumento de la
respuesta inflamatoria y del daño tisular. Esta respuesta
inflamatoria, tanto alveolar como bronquial es fundamental en
la patogénesis de diferentes enfermedades pulmonares como
el asma, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC),
el síndrome de distrés respiratorio del adulto (SDRA) y la FPI.
Las características específicas de esta respuesta inflamatoria
difieren de unas enfermedades a otras, pero todas ellas están
caracterizadas por el reclutamiento y activación de células
inflamatorias en el pulmón provocando un desequilibrio entre
las especies oxidantes y antioxidantes. Existe una notable y
profunda relación entre los procesos de daño oxidativo en el
pulmón y la patología asociada a la fibrosis pulmonar.
En la fibrosis pulmonar hay un incremento de especies
oxidantes debido al acúmulo de células inflamatorias
incluyendo macrófagos alveolares activados y neutrófilos que
dan lugar a una gran generación de ERO97,98. Se ha
demostrado la presencia de niveles menores de glutation, de
hasta cuatro veces, en el LBA y fluido epitelial de pacientes con
fibrosis pulmonar respecto al de individuos sanos. También en
la fibrogénesis por BL, se ha destacado claramente el papel de
la generación de ERO. Las radicales libres de oxígeno son
altamente reactivos y cuando se generan cerca de las células
de la membrana deplecionan el glutation reducido (GSH)
intracelular produciendo fenómenos de peroxidación lipídica y
generando una reacción en cadena. De esta manera un radical
Introducción
50
hidroxilo (OH-) puede formar varias moléculas de hidroperóxido
lipídico en las células de la membrana que modifican
severamente su función y pueden llevar a la muerte celular o
dañar el DNA en las células alveolares epiteliales. Las ERO en
las enfermedades inflamatorias también pueden actuar sobre
ciertos aminoácidos como la metionina, la tirosina y la cisteína,
alterando su función98.
El tracto respiratorio humano, como se ha descrito
anteriormente, comprende desde las cavidades nasal y oral
hasta los alvéolos pulmonares, lo que supone una importante
superficie que está directamente expuesta al ambiente externo.
La atmósfera es de naturaleza oxidante. A ello contribuyen
sustancias presentes en el aire como ozono (03), óxido de
nitrógeno o agentes contaminantes como el humo del tabaco.
Además se asocian los mecanismos oxidantes del sistema
inmune que se activan ante la presencia de cualquier tipo de
microorganismo que pasa de la atmósfera al sistema
respiratorio. De manera que este sistema está expuesto de
forma continua a situaciones de desequilibrio entre las
especies oxidantes y las reductoras a favor de las primeras.
Introducción
51
1.4. Tetrahidrobiopterina y sepiapterina
La tetrahidrobiopterina (BH4) es un coenzima no proteico,
con estructura de imina heterocíclica. Fue descubierta por
Seymour Kaufman99 en 1963 como cofactor de la conversión
de fenilalanina a tirosina.
Se sintetiza en el citoplasma de las células animales por
la vía de recuperación de purinas y por la vía de síntesis de
novo. La enzima que cataliza el primer paso de la síntesis de
novo de BH4 es la guanosina trifosfato ciclohidrolasa I (GTPCH
I)100. La piruvoil tetrahidropterina sintasa (PTPS) y la
sepiapterina reductasa (SR) son dos enzimas adicionales
necesarias para la producción final de BH4 (figura 6). La BH4
se oxida a BH2 y en la vía de recuperación, puede
reconvertirse en BH4 por la actividad de la dihidrofolato
reductasa (DHFR).
Figura 6. Biosíntesis de BH4 por las vías de síntesis de novo y recuperación. La neopterina es un producto directo y estable de la síntesis de BH4 que puede servir como indicador de la actividad de GTPCH.
Introducción
52
La BH4 es altamente inestable, a temperatura ambiente y
en solución es fácilmente oxidable, termolábil, fotosensible y
posee baja permeabilidad en membranas celulares. Puede
reaccionar con oxígeno molecular, anión superóxido, peróxido
de hidrógeno y peroxinitrito101,102. Por ello, se ha sugerido que
la BH4 protege las células contra el daño oxidativo102. La
velocidad de oxidación de la BH4 en solución depende de
diversos factores, incluyendo el pH, la temperatura, la fuerza
iónica y la concentración de reactantes.
La oxidación de la BH4 en primer lugar genera quininido-
BH2 (qBH2), el cual tautomeriza rápidamente a su forma más
estable BH2 ó productos de pterina que han perdido su cadena
lateral dependiendo de las condiciones de reacción.
Las pteridinas son cofactores ampliamente distribuidos en
las células de mamíferos103,104 y en formas de vida inferiores99
donde generalmente funcionan como co-sustratos o moléculas
reguladoras alostéricas. La tetrahidrobiopterina en concreto es
cofactor de varias enzimas: fenilalanina hidroxilasa, triptófano
hidroxilasa, tirosina hidroxilasa y óxido nítrico sintasa (NOS) en
sus 3 isoformas. En este último caso, actúa modificando la
estructua de la NOS virando su grupo hemo férrico a un estado
de spín más alto. Así, a nivel del endotelio (eNOS) se
desencadena un aumento de la unión a la l-arginina y se
estabiliza la forma dimérica activa de la enzima. Si la
disponibilidad de BH4 es baja, se produce un desacoplamiento
de NOS, y se inhibe la producción de óxido nítrico (NO) al
Introducción
53
mismo tiempo que se producen especies reactivas de oxígeno
(ROS), como son: anión superóxido (O2-), peróxido de
hidrogeno (H2O2) y anión peróxinitrito (ONOO-) (Figura 7).
La tetrahidrobiopterina endógena es esencial para varios
procesos biológicos tales como el metabolismo, la función
cerebral, la respuesta inmune, la proliferación celular y la
homeostasis vascular.
Durante la última década, numerosos estudios han
demostrado que la inactivación química de BH4 por estrés
oxidativo causa desacoplamiento de eNOS y disfunción
endotelial105.
La BH4 además es un medicamento (Kuvan®),
desarrollado sintéticamente (sapropterina o dihidrocloruro de
tetrahidrobiopterina) y comercializado por BioMarin
Pharmaceutical Inc. En 2007 fue aprobado y declarado por la
FDA (Food and Drug Administration) y la EMA (Agencia
Europea del Medicamento) como medicamento huérfano, con
la indicación terapéutica única de hiperfenilalaninemias (PKU).
Un defecto en la síntesis y/o regeneración de
tetrahidrobiopterina causa fenilcetonuria tipo IV y deficiencia de
neurotransmisores (dopamina y serotonina). La elevación
prolongada de los niveles de fenilalanina en sangre, en
pacientes con fenilcetonuria, puede causar graves daños
neurológicos, incluyendo el retraso mental grave, microcefalia,
retraso del habla, convulsiones y alteraciones del
comportamiento.
Introducción
54
Figura 7. Representación esquemática del desacoplam iento de la óxido nítrico sintasa endotelial. En condiciones fisiológicas (arriba), la BH4 se une al dominio oxidasa de la NOS, esta se activa y a partir de l-arginina y O2 genera NO y citrulina. El NO difunde rápidamente a la célula muscular subyacente para producir relajación mediante el aumento de los niveles de cGMP. En condiciones patológicas (abajo) la bioactividad de la BH4 está disminuida y la NOS genera NO y también anión superóxido (O2
-). Se forma peróxido de hidrógeno (H2O2) a partir de O2-, y peroxinitrito
(ONOO-) a partir de O2- y NO. En estas condiciones la suplementación con BH4
restablece la actividad inicial de la NOS y aumenta la producción de NO.
Introducción
55
El desarrollo de análogos de BH4 con biodisponibilidad
oral, mejora el acceso al espacio intracelular, la duración de la
acción y la potencia, facilitando el éxito terapeútico.
Recientemente hay disponibles dos nuevos análogos, 6-acetil-
7,7-dimetil-5,6,7,8-tetrahidropterin (ADDP) y el 6-hidroximetil
pterin (HMP), que son componentes más estables, capaces de
difundir a través de membranas celulares y de mejorar la
actividad de la NOS106.
La suplementación con BH4 mejora la disfunción
endotelial en varias condiciones como hipercolesterolemia,
diabetes, hipertensión, enfermedad arterial coronaria y fallo
cardíaco. También mejora la función endotelial en fumadores y
en sujetos de edad avanzada103. La concentración plasmática
de BH4 aumenta con la administración oral103.
La administración de BH4 reduce significativamente los
niveles plasmáticos de 8-F2 isoprostano, marcador de estrés
oxidativo107.
Las citoquinas proinflamatorias, como el factor de
necrosis tumoral alfa (TNF-α), el interferón gamma (INF- γ) y la
interleuquina-1 (IL-1β), son potentes estimuladores de la
expresión y de la actividad de la GTPCH-I en el endotelio
humano, aumentando la síntesis de BH4. De modo paralelo,
las citoquinas antiinflamatorias, como IL-4, IL-10 y Tgf-β,
disminuyen la síntesis de BH4 en células endoteliales102.
En células endoteliales humanas cultivadas y en
animales de experimentación, la disponibilidad de BH4 se ve
Introducción
56
aumentada por otros fármacos, como el ácido ascórbico, las
estatinas, el enalapril, el captopril, el telmisartan, el eplerenone,
el cilostazol, la insulina y la eritropoyetina, ya que estimulan la
síntesis de BH4 o le protegen de su oxidación103.
Se desconoce si el incremento de BH4 plasmático
aumenta la concentración en el endotelio. De hecho, en
pacientes con aterosclerosis coronaria, niveles elevados de
BH4 en plasma se asocian con niveles disminuidos en el
endotelio108. Se ha demostrado que en algunos tipos celulares,
incluido las células endoteliales, la BH4 no difunde
libremente109.
La sepiapterina, precursor de la BH4, ha demostrado que
aumenta los niveles de BH4 in vitro e in vivo109, mejora la
función endotelial y reduce la producción de superóxido110.
2. OBJETIVOS
Objetivos
58
La fibrosis pulmonar idiopática (FPI), cómo se ha
comentado en el capítulo de introducción, es la enfermedad
pulmonar intersticial de peor pronóstico, ya que no existe
ningún tratamiento específico. Últimamente se apuesta por el
uso de antioxidantes, que evitan la producción de especies
reactivas de óxigeno (ERO). Dentro de esta línea de
investigación, este trabajo propone una nueva estrategia
antioxidante, mediante el mecanismo de acoplamiento de la
enzima óxido nitrico sintasa endotelial (eNOS) que produce
óxido nítrico (NO) y cuyo cofactor esencial es la
tetrahidrobiopterina (BH4).
El déficit de BH4 provoca un desacoplamiento de la
eNOS, con disminución de la síntesis de NO y mayor
producción de ERO. Esto genera estrés oxidativo y disfunción
endotelial, que podría afectar a nivel de los capilares
alveoloares, con pérdida de función alveolar y reducción de la
transferencia de oxígeno a la sangre. En consecuencia,
empeora el proceso fibrótico.
Para estudiar el papel que desempeña la BH4 en la
fibrosis pulmonar, el primer requisito fue establecer un modelo
animal que nos permitiera la generación del proceso fibrótico
del modo más similar a la patogénesis humana. El modelo
seleccionado para el estudio fue la administración intratraqueal
de bleomicina en murinos, descrito como el principal agente
fibrótico en modelos experimentales, tal como se ha explicado
en el capítulo de introducción.
Objetivos
59
Como segundo propósito se planteó la puesta a punto de
la técnica para el análisis de BH4 en muestras biológicas
mediante cromatografía líquida de alta resolución.
Con las técnicas animales e instrumentales establecidas
se pretendieron los siguientes objetivos:
1. Estudiar de forma comparativa los niveles fisiólogicos
y patológicos de BH4 en rata, ratón y humanos, con el
fin de proponer la BH4 como biomarcador de fibrosis
pulmonar.
2. Estudiar el efecto farmacológico de la BH4 vía oral, en
la fibrosis pulmonar inducida por bleomicina en ratón.
3. Estudiar el efecto farmacológico de la sepiapterina vía
oral, en la fibrosis pulmonar inducida por bleomicina en
ratón.
4. Estudiar el efecto farmacológico de la BH4 vía
intratraqueal, en la fibrosis pulmonar inducida por
bleomicina en rata.
5. Estudiar el efecto farmacológico del roflumilast y su
eficacia en recuperar los niveles de BH4.
3. MATERIALES Y MÉTODOS
Materiales y métodos
62
3.1. Material
3.1.1. Fármacos ensayados
Los fármacos utilizados para la realización de este
trabajo de investigación han sido: la bleomicina, como agente
inductor de fibrosis pulmonar, y la tetrahidrobiopterina, la
sepiapterina y el roflumilast, que se ensayan como fármacos
antifibróticos.
La bleomicina pertenece al grupo de antibióticos dentro
de los agentes quimioterápicos, y se utiliza en el tratamiento
inicial de linfomas, tumores testiculares y carcinomas de células
escamosas. Fue identificada por primera vez por Umezawa y
cois en 1966111 mientras investigaban nuevos antibióticos
antitumorales. Se obtiene de la fermentación de Streptomyces
veticilis. Es un glucopéptido citotóxico con un peso molecular
de 1415.55 g/mol .
Su acción antineoplásica se debe a la inducción de la
muerte de células tumorales, y a la inhibición de la
angiogénesis. La bleomicina tiene un efecto sobre el ion ferroso
(Fe+2) que se une al DNA. Existen dos lugares funcionales, el
dominio de unión al DNA y el dominio de unión al metal. La
unión del complejo bleomicina-Fe+2 reduce el oxígeno
molecular (O2) del medio ambiente. Se crean radicales libres de
O2 que romperán el DNA por el C4' de la desoxirribosa.
Materiales y métodos
63
Produce un síndrome de toxicidad pulmonar
caracterizado por fibrosis pulmonar en un 10% de los casos 111.
La toxicidad se relaciona con la dosis acumulativa.
Figura 8: Estructura molecular de la bleomicina.
Materiales y métodos
64
La tetrahidrobiopterina, BH4; 6R-BH4; Sapropterina;
Dadropterina; (6R-L-erythro-5,6,7,8-tetrahydrobiopterin), es un
miembro de la familia de las pterinas, con una estructura
química central de anillos pirimidínicos102. Es muy higroscópica
y reacciona fácilmente con el oxígeno, especialmente en
soluciones neutras y alcalinas.
Tal como se explica en el apartado 1.4 de la
introducción, está comercializada como Kuvan® e indicado
para hiperfenilalaninenemias. En este trabajo se estudian sus
efectos como antifibrótico.
Figura 9: Estructura molecular de la tetrahidrobiopterina (BH4).
Materiales y métodos
65
La sepiapterina (SP), S(-)-2-Amino-7,8-dihydro-6-(2-
hydroxy-1-oxopropyl)-4(1H)-pteridinone, es un precursor
intracelular de la tetrahidrobiopterina109. Es higroscópica,
sensible a la luz y poco soluble en agua (0.17 g por 100 g de
agua a 22°C). Reacciona con el oxígeno, especialmen te en
solución. En este trabajo se estudian sus efectos como
antifibrótico.
Figura 10: Estructura molecular de la sepiapterina.
Materiales y métodos
66
El roflumilast, con un peso molecular de 403.207 g/mol,
es un inhibidor selectivo de la fosfodiesterasa 4 (PDE4). Ha
sido recientemente aprobado por la EMA para el tratamiento de
la EPOC y se ha comercializado con el nombre de Daxas®.
En ensayos in vivo ha demostrado efecto antifibrótico en
el modelo animal de fibrosis pulmonar inducida con
bleomicina112 tanto en el modelo preventivo como en el modelo
terapéutico.
Figura 11: Estructura molecular del roflumilast.
Materiales y métodos
67
3.1.2. Reactivos utilizados
� Acetonitrilo. Sharlab. Ref. AC03712500.
� Ácido ascórbico. Sigma. Ref. A5960.
� Ácido clorhídrico. Panreac. Ref.131029.
� Ácido Fosfórico. Fluka. Ref. 79626.
� Ácido tricloroacético (cloroformo). Panreac.
Ref. 151067.
� Agua Dietilpirocarbonato (DEPC). Applied
Byosistems. Ref. AM9906.
� Biopterina. Fluka. Ref. 14390.
� Bleomicina sulfato 15UI (Sol. Inyectable).
Merck. C.N:656759.
� Cóctel inhibidor de proteasa. Sigma. P8340.
� DTE (1,4-Dithioerythritol). Sigma. Ref. D9680.
� EDTA (ácido etilendiaminotetraacético). Sigma.
Ref. ED2SC.
� EGTA (ácido etilenglicol tetraacético). Sigma.
Ref. E3889.
� Eosina amarillenta. Panreac. Ref. 251299.
� Etanol absoluto. Panreac. Ref. 361086.
� Formol 10%. Panreac. Ref. 143091.
Materiales y métodos
68
� Fosfato potásico dibásico anhidro. Fluka. Ref.
17835.
� Glicerol. Sigma. Ref. G7403.
� Glicógeno . Calbiochem. Ref. 361507.
� Hematoxilina de Harris. Panreac. Ref. 253949.
� HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazino
etanosulfónico). Sigma, Ref. H4034.
� Hidróxido de sodio. Panreac. Ref. 131687
� Ioduro potásico. Fluka. Ref. 57660.
� Isoflorano. Esteve veterinaria.
� Isopropranol. Sigma. Ref. I9516.
� Kit BCA para cuantificación de proteínas.
Pierce. Ref. 23227
� Kit de tinción panóptica . Panreac. Ref.
254807.0922.
� Metanol. Sharlab. Ref. ME03262500
� Methocel. Fluka. Ref. 64632.
� Nonidet P 40. Sigma. Ref. 74385.
� Parafina. Panreac. Ref. PPPLUS
� Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Sigma.
Ref. P7626.
� Polietilenglicol 400. Panreac. Ref. 162436.
Materiales y métodos
69
� Rhamnopterin. Fluka. Ref. 83644
� Sepiapterina. Schircks. Ref. 11225.
� Sondas TaqMan ® para ensayos de expresión
génica. Applied Biosystems. Las referencias de
cada sonda estan indicadas en las tablas 3 y 4 del
apartado 3.2.8.
� Tampón salino fosfato (PBS). Sigma. Ref.
P4417.
� Tetrahidrobiopterina. Schircks. Ref. 11212.
� Trizol. Roche Diagnostics. Ref. 11667157001.
� Xileno. Merck. Ref. 481769.
� Yodo. Fluka. Ref. 57660.
3.1.3. Animales de experimentación
Los procedimientos realizados fueron previamente
aprobados por el Comité de Ética y Bienestar Animal de la
Comisión de Ética de la Universidad de Valencia y por el
Comité Ético para la Experimentación Animal (CEEA) de la
Fundación de Investigación del Hospital General de Valencia.
Se emplearon ratones macho C57B1/6J (Charles
River®) de 9 semanas de edad y de un peso aproximado de
entre 18-23 g, y ratas macho Wistar (Harlan Iberica®) de 10-12
semanas de edad de peso alrededor de 250 g. Los animales
Materiales y métodos
70
permanecieron en el estabulario desde siete días antes del
inicio del experimento (periodo de aclimatación) hasta el final
del estudio con comida (dieta Harlan® Ref. 2014) y agua ad
libitum. Se repartieron de forma aleatoria en jaulas y estas a su
vez en grupos experimentales distintos. Para realizar un
seguimiento individualizado de cada animal, se identificó al
animal mediante rayas pintadas en la cola. Las condiciones
estándar del animalario fueron:
� Humedad relativa 55 ± 10%.
� Temperatura 22 ± 3ºC.
� Renovación del aire a 15 ciclos por hora.
� Ciclo luz/oscuridad 12/12 horas.
3.1.4. Pacientes
El estudio se realizó en colaboración con el Servicio de
Neumología del Hospital Universitario La Fe de Valencia.
Se incluyeron seis individuos control, dos hombres y
cuatro mujeres de entre 28 y 65 años de edad y catorce
pacientes de ambos sexos, siete hombres y siete mujeres, de
edades comprendidas entre 45 y 90 años, que acudían a su
visita médica de control por afección de fibrosis pulmonar
idiopática (FPI).
Materiales y métodos
71
La FPI se diagnosticó por la clínica que presentaba el
paciente, por radiología, mediante tomografía axial
computerizada (TAC), y en los casos que fue posible, por
biopsia transbronquial.
A los pacientes y a los voluntarios sanos que aceptaron
la participación en el estudio, tras cumplimentar correctamente
el consentimiento informado, se les realizó una extracción de 3
ml de sangre en un tubo con EDTA-K2 que contenía
ditioeritritiol (DTE) al 0,1%.
Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética de
Investigación Clínica (CEIC) del Hospital Universitario La Fe de
Valencia y se redactó de acuerdo con la Declaración de
Helsinki.
Materiales y métodos
72
3.2. Métodos
3.2.1. Modelo animal
La fibrosis pulmonar en ratón se indujo mediante
traqueotomía, realizando una pequeña incisión para retirar la
piel y dejar al descubierto una porción de la tráquea donde se
instiló un volumen de 50 µl de solución salina de sulfato de
bleomicina (BL), en dosis única de 3,75 UI/Kg (Figura 12). Se
utilizaron jeringas estériles de insulina (BD Micro-Fine + 0,33
mm (29 G) x 12,7 mm). Tras la administración se cosió por
capas la incisión de forma aséptica.
La fibrosis pulmonar en rata se provocó mediante
intubación intratraqueal. Se administraron 220 µl de solución
salina de sulfato de bleomicina (BL), en dosis única de 7,5
UI/Kg. Los animales del grupo control recibieron el mismo
volumen de solución salina libre de bleomicina (Figura 12).
La inducción de fibrosis en este trabajo de investigación
se realizó siempre el día 1 del experimento, coincidiendo con el
inicio del tratamiento farmacológico (modelo preventivo)112. El
tratamiento se administró diariamente hasta el día 7 o hasta el
día 14, según el grupo experimental.
Materiales y métodos
73
A.
B.
Figura 12. Imágenes de las formas de administración de bleomicina utilizadas para inducir fibrosis pulmonar. En ratón C57B1/6J (A), mediante traqueotomia y administración intratraqueal de 3.75 UI/Kg de bleomicina, y en rata wistar (B), mediante intubación y administración intratraqueal de 7.5 UI/Kg de bleomicina.
Materiales y métodos
74
3.2.2. Protocolo experimental
Este trabajo de investigación se dividió en 5 estudios. El
estudio 1, como se detalla a continuación, es una comparativa
entre especies, en el cual se incluye un ensayo preliminar en
humanos. Los estudios 2 y 3 se llevaron a cabo en ratón
C57B1/6J, mientras que los estudios 4 y 5 se realizaron en rata
Wistar.
El número inicial de animales en cada grupo fue
superior a 10 para disminuir la variabilidad interindividual
intraespecie, y porque el modelo animal de fibrosis con
bleomicina ofrece aproximadamente un 75 % de supervivencia
para los grupos afectados de fibrosis pulmonar. En cualquier
caso, los grupos cuyo n final fue menor de cinco se
desestimaron. Los animales se pesaron de forma periódica
durante todos los experimento. Los grupos control se
sometieron al mismo procedimiento experimental, pero se les
administró suero salino en todos los casos. A continuación se
detallan los grupos experimentales realizados en cada estudio.
Materiales y métodos
75
���� Determinación de los niveles de
tetrahidrobiopterina en modelos experimentales de
fibrosis pulmonar (ratón C57B1/6J , rata wistar) y en
pacientes diagnosticados de fibrosis pulmonar
idiopática.
Para el estudio se requiere un grupo control sano y
un grupo con fibrosis pulmonar de cada especie.
En el caso de los pacientes, se realizó un estudio
preliminar que consistió en una comparación simple de
los niveles de tetrahidrobiopterina en voluntarios sanos
(n=6) y en pacientes diagnosticados de fibrosis
pulmonar idiopática (n=14).
En el caso de los animales de experimentación, se
estudio la evolución temporal de los niveles de BH4 en
plasma, pulmón e hígado, a día 7, 14, y en el caso de
los ratones a día 21, desde la inducción de fibrosis
pulmonar con bleomicina tal como se representa a
continuación.
Materiales y métodos
76
���� Efecto farmacológico de la tetrahidrobiopterina
(BH4) 20 mg/Kg/día via oral en ratón a día 7 y a dí a
14 de la inducción de fibrosis pulmonar.
Se estudiaron cuatro grupos experimentales:
(i) Salino i.t + vehículo v.o (n=12).
(ii) Bleomicina i.t + vehículo v.o (n=24).
(iii) Salino i.t + BH4 20 mg/Kg/día (n=24).
(iv) Bleomicina i.t + BH4 20 mg/Kg/día (n=24).
Los grupos experimentales (ii), (iii) y (iv), a su vez,
se dividieron en dos grupos de 12 animales cada uno, el
primer grupo se sacrificó a día 7 desde la inducción de
fibrosis con 3.75 UI/Kg de bleomicina y el otro a día 14.
Materiales y métodos
77
���� Efecto farmacológico de la sepiapterina 10
mg/Kg/día via oral en la fibrosis pulmonar inducida
con bleomicina en ratón a día 7 y a día 14.
Se estudiaron cuatro grupos experimentales:
(i) Salino i.t + vehículo v.o (n=12).
(ii) Bleomicina i.t + vehículo v.o (n=24).
(iii) Salino i.t + sepiapterina 10 mg/Kg/día (n=24).
(iv) Bleomicina i.t + sepiapterina 10 mg/Kg/día (n=24).
Los grupos experimentales (ii), (iii) y (iv), a su vez,
se dividieron en dos grupos de 12 animales cada uno, el
primer grupo se sacrificó a día 7 y el otro a día 14.
Materiales y métodos
78
���� Efecto farmacológico de la BH4 5mg/Kg/día via
intratraqueal, en la fibrosis pulmonar inducida con
bleomicina en rata wistar a día 14.
Para llevar a cabo este estudio se emplearon ratas
wistar, ya que facilitan la canulación intratraqueal diaria
necesaria para la administración del tratamiento con el
MicroSprayer.
En este estudio todos los grupos experimentales se
llevaron a catorce días como punto final.
(i) Salino i.t + vehículo i.t (n=10).
(ii) Bleomicina i.t + vehículo i.t (n=10).
(iii) Salino i.t + BH4 5 mg/Kg/día i.t (n=10).
(iv) Bleomicina i.t + BH4 5 mg/Kg/día i.t (n=10).
Materiales y métodos
79
���� Efecto farmacológico del roflumilast 1mg/Kg/día
via oral, en la fibrosis pulmonar inducida con
bleomicina en rata wistar a día 14.
Para llevar a cabo este estudio se emplearon ratas
wistar, ya que se pretendió comparar los resultados con
aquellos obtenidos en el estudio 4.
En este estudio todos los grupos experimentales se
llevaron a catorce días como punto final.
(i) Salino i.t + vehículo i.t (n=10).
(ii) Bleomicina i.t + vehículo i.t (n=10).
(iii) Salino i.t + roflumilast 1 mg/Kg/día v.o (n=10).
(iv) Bleomicina i.t + roflumilast 1 mg/Kg/día v.o (n=10).
Materiales y métodos
80
3.2.3. Preparación y administración de fármacos
� Bleomicina: se preparó en solución con suero
fisiológico y se administró por vía intratraqueal.
� Tetrahidrobiopterina (BH4): para la administración
oral se preparó en solución acuosa con ácido
ascórbico al 0,05% en el momento de la
administración debido a que es muy sensible al
oxígeno. Para la administración intratraqueal, la
BH4 se preparó en tampón bicarbonato, que
asegura que el pH no sea excesivamente bajo y
como consecuencia tóxico para el pulmón. Un pH
de 4,5 - 5 se consideró adecuado.
� Sepiapterina (SP): se prepara en suspensión con
methocel al 0,4 %, ácido ascórbico al 0,05 % y
protegido de la luz. La formulación se somete a
ultrasonidos y se administra vía oral agitándose
inmediatamente antes de administrar.
� Roflumilast: se preparó en suspensión con Tween
20, methocel al 0,4% y se sometió a ultrasonidos
hasta completa homogenización. Se administró
por via oral, agitándose inmediatamente antes de
administrar.
Materiales y métodos
81
La administración oral diaria de medicamento en ratón
se realizó con cánula intraesofágica.
Debido a la dificultad que supone la canulación
intratraqueal diaria, para los ensayos que conllevaron
administración intrapulmonar se eligió la especie murina de
mayor tamaño.
La forma tecnológica del MicroSprayer® garantiza que
el fármaco alcance las vías respiratorias por completo. Para la
administración diaria, cada rata se anestesió por via inhalatoria
con isoflorano; tras cerciorarse de que el animal ha perdido los
reflejos, se colocó sobre una superficie con una inclinación de
45º, y con ayuda de una luz fría externa a la altura del cuello se
llevó a cabo la intubación intratraqueal. Una vez canulada, al
catéter de 18G utilizado se le acopló una llave de 3 pasos y se
procedió a administrar el fármaco correspondiente. Se utilizó el
MicroSprayer® que consiste en una jeringa de presión dotada
de una aguja que posee en la punta un atomizador en
miniatura. Éste permite la nebulización del fármaco para que
alcance todas las vías respiratorias (Figura 13). Dicha jeringa
se acopló a la llave de 3 pasos a la que también se conecta
una jeringa cargada con aire. Primero se insuflaron 2.9 ml de
aire, a continuación se nebulizaron 200 µl del fármaco y por
último se inyectaron 1.3 ml más de aire para facilitar el arrastre
del producto (Figura 14). Se mantuvo la cánula hasta que la
rata recuperó los reflejos, ya que en caso de parada
Materiales y métodos
82
respiratoria, la cánula facilita la maniobra de reanimación (VPP,
ventilación con presión positiva).
Figura 13. Imágenes del dispositivo MicroSprayer para administración de fármacos por vía intratraqueal. De izquierda a derecha: jeringa y aguja; spray generado; radiografía a los 30 segundos de la administración de un fármaco marcado.
Figura 14. En la primera imagen se observa la cámara de inhalación con el depósito de isoflorano al fondo, y la posición en la que se debe colocar a la rata para la correcta canulación, con una la inclinación de 45ºC. En la segunda imagen se muestra la rata canulada intratraquealmente, con la llave de tres pasos acoplada al catéter.
Materiales y métodos
83
3.2.4. Extracción de muestras
Los animales se sacrificaron después de 20-24 horas de
la última dosis del periodo de experimento con una inyección
letal intraperitoneal de pentobarbital sódico (200 mg/kg). Se
realizó la extracción de sangre de la vena cava inferior,
aproximadamente 0,3 ml en el caso de ratones y 5 ml en el
caso de ratas. La sangre se recogió en tubos protegidos de la
luz y preparados con anticoagulante y una concentración final
de 0,1% de DTE para evitar la oxidación de la
tetrahidrobiopterina. Las muestras se mantuvieron a 4ºC, para
la posterior separación del plasma (2.000 g, 20 min). El plasma
se almacenó a -80ºC hasta el día del análisis. A continuación
se tomó una alícuota de tejido hepático que se sumergió en
nitrógeno líquido inmediatamente, y después se conservó a -
80ºC hasta el día del análisis. Tanto las muestras de plasma
como las de hígado se utilizaron para medir niveles de BH4.
Se llevó a cabo una toracotomía para extraer el corazón
y los pulmones. El corazón se dejó en suero para vaciarlo y
posteriormente se separó el ventrículo derecho (VD) del resto
del corazón. Se pesaron ambos ventrículos por separado para
obtener la relación VD/VI+septo cómo índice de hipertrofia
ventricular derecha. Los pulmones y la tráquea se extrajeron en
bloque y se pesó el conjunto; a continuación se separó el
pulmón derecho atando la tráquea; éste se dividió en tres
alicuotas en viales de 2 ml que se ultracongelaron con
nitrógeno líquido inmediatamente, para posteriormente ser
Materiales y métodos
84
almacenadas a -80ºC hasta el día del análisis de BH4, de
expresión génica y de proteínas. El pulmón izquierdo se
sometió a un doble lavado broncoalveolar. Se tomo una
muestra del mismo para hacer ensayos de recuento y
diferenciación celular y otra se almacenó para la cuantificación
de proteínas totales extravasadas a la luz alveolar. Para el
estudio histológico se seleccionaron dos animales de cada
grupo, a los que, en lugar de lavado broncoalveolar se les
perfundió el pulmón izquierdo con una solución fijadora de
formaldehído al 10% a una presión de 25-30 cm de agua. La
pieza se conservó suspendida en la misma solución fijadora,
evitando el contacto con las paredes del envase.
3.2.5. Ensayos de inflamación pulmonar
Para determinar la respuesta inflamatoria pulmonar que
genera la bleomicina se procedió al recuento de células totales
extravasadas, y a la caracterización de las distintas
poblaciones celulares.
���� Recuento de células totales en el lavado
broncoalveolar (LBA) de rata.
Se lavaron ambos pulmones por duplicado con 5 ml
de suero fisiológico. De los 10 ml de lavado
broncoalveolar se separó una alícuota para la
Materiales y métodos
85
diferenciación celular y el resto se centrifugó durante 20
minutos a 1200 rpm para separar las células
sanguíneas. El pellet con las células se resuspendió en
1 ml de suero fisiológico. Para el recuento de células
totales se utilizó un hemocitómetro (Nihon Kohden,
Celltac Mek 5105 k) (Figura 15).
Figura 15. Imágenes del proceso de lavado broncoalveolar de un pulmón de
rata wistar y del hemocitómetro utilizado para el contaje de células totales.
���� Diferenciación celular
Se tomó una alícuota de LBA bien homogeinizado
para fijar las células sobre un portaobjetos, utilizando
una citocentrífuga (Shandon Cytospin 4, Thermo
Electron Corporation) durante 5 minutos a 500 rpm. Se
realizó una tinción panóptica (Panreac) de las células
fijadas para cuantificar el porcentaje de cada tipo celular
mediante microscopia óptica (Eclipse E200, Nikon).
Materiales y métodos
86
���� Proteínas totales en LBA
El contenido total de proteínas se obtuvo en el
sobrenadante del LBA mediante el kit del método del
ácido bicincónico (BCA). Este sistema de cuantificación
de proteínas combina la reacción de Biuret por proteína
en un medio alcalino. La reacción de Biuret se basa en
la adición de un reactivo alcalino al Cu+2 que reacciona
con enlaces peptídicos de las proteínas reduciéndose a
Cu+1. El BCA es un compuesto capaz de formar en un
entorno alcalino un complejo púrpura con el ión Cu+1. El
color producido por esta reacción es estable y aumenta
de manera proporcional al aumento de la concentración
de proteínas. Este complejo púrpura se detecta entre
540-590 nm. Las concentraciones de proteína son
referidas a estándares de proteína común como es la
albúmina sérica bovina (ASB) con la que se elabora la
recta patrón del ensayo.
���� Proteínas totales en pulmón: extracción y
cuantificación.
Se pesaron 25 mg de tejido pulmonar congelado a -
80ºC, al que se le añadió 1 ml de tampón de lisis con la
siguiente composición:
• 20 mM HEPES
• 400 mM NaCl
Materiales y métodos
87
• 1 mM EDTA
• 1 mM EGTA
• 2,75 M de glicerol (25,3%)
• 61,6 % de agua, calidad MilliQ®
• 2 µM PMSF
• 12 µL de coctel inhibidor de proteasas
Se lisó el tejido en el sistema Tissuelyser II
(Qiagen®) a una frecuencia de 30 s-1 durante 2 min. A
continuación se centrifugó a 10.000 rpm durante 20 min.
El sobrenadante se sometió a tres ciclos de
congelación-descongelación con N2 líquido y con
agitación a 37 ºC, respectivamente. A continuación se le
adicionó NP40 al 1% y durante 15 minutos se mantuvo
en hielo con agitación énergica cada 5 minutos.
Finalmente se centrifugó a 10.000 rpm durante 20
minutos a 4ºC y se recogió el sobrenadante para
determinar la concentración de proteína total mediante
el método de BCA detallado anteriormente (apartado
3.10).
Materiales y métodos
88
3.2.6. Histología
De la muestra fijada con formaldehido e incluida en
parafina se obtuvieron cortes seriados de 5 µm de grosor con
un microtomo tipo Minot (Leica® RM 2135) para tinción con
hematoxilina-eosina e identificación al microscopio de las
estructuras pulmonares anormales y patológicas, como pueden
ser masas de colágeno en el intersticio pulmonar y celularidad
aumentada. Se tomaron fotos con una cámara (Leica® DFC
350FX) incorporada al microscopio (Leica® CTR6000).
3.2.7. Método analítico para la determinación de
BH4 en muestras biológicas
Se desarrolló un método analítico para plasma y para
tejidos, que utiliza la cromatografía líquida de alta resolución
(HPLC), con detección por fluorescencia113-115.
El fundamento del método consiste en que la biopterina,
cuantificable por ser fluorescente, representa la suma de BH4,
7,8-dihidrobiopterina (BH2) y la biopterina completamente
oxidada. Una oxidación diferencial con iodina permite medir
ambas, biopterina total y BH4. Bajo condiciones ácidas, BH4 y
BH2 se oxidan a biopterina, mientras que bajo condiciones
alcalinas, sólo BH2 se oxida a biopterina, y BH4 se degrada a
otra pterina distinta. Por tanto, la diferencia en la cantidad de
biopterina entre ambas oxidaciones representa el nivels de
BH4.
Materiales y métodos
89
oxidación oxidación
BiopterinaNaOH /I2
7,8-DBHCl / I2
Biopterina
BiopterinaNaOH /I2
BiopterinaHCl / I2
Biopterina
PterinaNaOH /I2
BH4HCl / I2
Biopterina
���� Procesado de las muestras
Las muestras de sangre se recogieron en tubos con
presencia de anticoagulante y antioxidante. Se utilizó
EDTA-K2 como anticoagulante y ditioeritritiol (DTE)
0,1% como antioxidante. El plasma se puede congelar a
-80ºC durante varios meses. De de cada muestra se
obtuvieron tres alicuotas (A, B y C), que se procesaron
de la siguiente manera113:
A) Reacción ácida : 90 µl muestra + 10 µl de patrón
interno + 20 µl HCl 1M + 50 µl de solución de iodina
(1 % (p/v) I2 + 2 % (p/v) IK) + agitar + incubar (1h a
Tª ambiente en oscuridad) + 10 µl ác. ascórbico 5
% (p/v) + 20 µl H2OMQ. Diluir 1/5.
Al valorar esta muestra se obtiene la biopterina
total, que corresponde a la suma de las tres
especies: 7,8-DB + BH4 + biopterina.
Materiales y métodos
90
B) Reacción alcalina : 90 µl muestra + 10 µl de
patrón interno + 20 µl NaOH 1M + 50 µl de solución
de iodina (1 % (p/v) I2 + 2 % (p/v) IK) + agitar +
incubar (1h a Tª ambiente en oscuridad) + 10µl ác.
ascórbico 5 % (p/v) + 20 µl HCl 2M. Diluir 1/5.
Al valorar esta muestra se obtiene la 7,8-DB y la
biopterina oxidada.
C) Sin reacción : 90 µl muestra + 10 µl de patrón
interno + 100 µl de H2OMQ.
Las muestras de tejido pulmonar y hepático se
recogieron en tubos de 2ml, e inmediatamente se
sumergieron en nitrógeno líquido. Se mantuvieron a -
80ºC hasta el día del análisis. La extracción se realizó
pesando 0,05 g de pulmón (o hígado) en 1mL de una
solución acuosa de ácido fosfórico 0,1N con 0,1% de
ditioeritritiol (DTE). El tejido se lisó en el sistema
Tissuelyser II (Qiagen). durante 2 min. a una frecuencia
de 30 s-1. El homogenizado se centrifugó a 10.000 rpm
durante 20 min a 4ºC. Se tomaron 3 alícuaotas del
sobrenadante que se procesaron de la misma forma que
el plasma, a excepción de que en el caso de tejido, la
cantidad de I2/IK necesaria para que se dé la reacción
alcalina es tres veces superior a la ácida114. En este
caso no es necesario diluir la muestra.
Materiales y métodos
91
Antes de inyectar la muestra en el cromatógrafo es
necesario desproteinizar. En este caso se realizó por
ultrafiltración, para lo cual se centrifuga a 3000g, 60 min
y 10 ºC con un filtro de 10.000 MW (Multiscreen®
Millipore), que deja pasar moléculas de PM<10.000. Las
muestras plasmáticas se diluyen 1/5 para evitar la
saturación del filtro.
���� Equipo de cromatografía líquida
El equipo de cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC) está compuesto de cuatro módulos:
bomba isocrática Shimadzu LC-10ADvp, inyector
automático Shimadzu SIL-10ADvp, detector de
fluorescencia Shimadzu RF10Avp y controlador
Shimadzu SCL-10Avp que integra todos los módulos
con el programa informático Shimadzu LCMSolutions.
Materiales y métodos
92
Figura 16. Equipo de cromatografía líquida de alta resolución (Shimadzu).
���� Fase móvil y estacionaria
La fase móvil utilizada fue una mezcla de tampón
fosfato K2HPO4 1,5 mmol/L ajustado a pH 4,6, y metanol
(calidad HPLC, Scharlau) en proporción 92:8 (V/V).
Como fase estacionaria se empleó una columna Waters
Sherisorb® 5 µm (4,6 x 250mm).
���� Condiciones de análisis
Se tomaron 10 µl de cada muestra como volumen
de inyección. El flujo seleccionado fue de 1 ml/min, la
longitud de onda de excitación fue 350nm, mientras que
Materiales y métodos
93
la de emisión fue 450nm, ya que fueron éstas las que
generaron la máxima intensidad de señal en la fase
móvil seleccionada. El análisis se realizó a temperatura
ambiente y las muestras se mantuvieron a 10ºC. El
tiempo de retención de la biopterina en estas
condiciones es de 8 minutos aproximadamente113.
Mientras que el tiempo de retención de la
rhamnopterina, compuesto utilizado como patrón interno
fue de 6 minutos aproximadamente.
Los valores de concentración de las distintas
muestras se obtienen mediante interpolación en una
curva de calibración construida a partir de una solución
patrón de biopterina en agua. Se utilizaron siete
diluciones de 1, 5, 10, 25, 50, 75 y 100 ng/ml.
3.2.7.1. Validación del método analítico
Las áreas obtenidas en los cromatogramas se
representaron frente a las concentraciones y se ajustaron
linealmente por mínimos cuadrados, según la siguiente
ecuación:
y = b·x + a
donde y es el área del pico de biopterina que
proporciona el cromatograma, x la concentración, b la
pendiente de la recta y a la ordenada en el origen. Para los
Materiales y métodos
94
cálculos matemáticos se utilizó el programa
GraphPadPrism5®.
La linealidad se ha expresado mediante el coeficiente
de correlación (r2) de cada recta, que representa la
dependencia lineal entre áreas y concentraciones.
La sensibilidad se puede definir como “la capacidad
para distinguir (análisis cuantitativo) pequeñas variaciones
en las concentraciones de analito en la muestra”. Se ha
calculado como b ± sb, siendo sb la desviación estándar de
la pendiente.
El límite de detección es la concentración de analito
que origina una señal que puede diferenciarse
estadísticamente del blanco. Se ha cuantificado como 3
sy/x/b, donde sy es la desviación estándar de la
concentración, x es la concentración y b la pendiente de la
recta.
La precisión se expresa a través del coeficiente de
variación (CV%) de la media de las áreas obtenidas de
varias concentraciones de biopterina.
La exactitud se expresa a través del error relativo de
distintas concentraciones de biopterina.
Los dos últimos parámetros se calculan preparando
cuatro curvas de al menos cuatro patrones por curva,
durante un mismo ensayo (análisis intraensayo o intradía) o
en ensayos distintos (interensayo o interdía).
Materiales y métodos
95
3.2.8. Análisis de la expresión génica. RT-PCR
3.2.8.1. Extracción de ARN total
Para la extracción del ARN total se escogió el
reactivo TriPure Isolation Reagent (Roche Diagnostics), que
es una solución monofásica de fenol y tiocianato de
guanidina (Trizol), que permite separar ARN, ADN y
proteínas. Se tomaron 20 mg de pulmón conservado a -
80ºC, se añadió 1 ml de reactivo Tripure y se lisó con el
sistema Tissuelyser II (Qiagen). A continuación, se
separaron las fases con cloroformo y se precipitó el ARN
total de la muestra con isopropanol. A fin de facilitar dicha
precipitación se le añadió a la fase acuosa 1 µl de
glucógeno. Tras una centrifugación de 5 minutos a 7500 g,
se resuspendió el ARN en 20 µl de agua DEPC.
Tras resuspender el ARN extraído, se procedió a
determinar la integridad y concentración del mismo, para lo
cual se utilizó un sistema electroforético capilar 2100
Bioanalyzer (Agilent Technologies) y el ARN 6000 LabChip®
kit (Agilent Technologies) siguiendo las instrucciones del
fabricante. Se añadió 1 µl de muestra al ARN 6000
LabChip® y se obtuvo el electroferograma. Se calculó la
concentración total de ARN y el ratio entre el área de los
picos de ARN ribosómico 28S/18S. Los ratios comprendidos
entre 1,5 y 2 indican un ARN íntegro.
Materiales y métodos
96
3.2.8.2. Transcripción inversa (RT)
Consiste en la obtención de un ADN complementario
(ADNc) a partir del ARN, por ello se denomina transcripción
inversa. Para el proceso se requieren unas ADN
polimerasas particulares, las transcriptasas inversas o
retrotranscriptasas, en nuestro caso particular se utilizó la
MultiScribe™ Reverse Transcriptase (Applied Biosystems).
Para la síntesis de ADNc a partir de ARN se utilizó el
TaqMan® Reverse Transcription Reagents kit (Applied
Biosystems), cuyos componentes se utilizaron en la
proporción que se indica en la tabla 2.
Materiales y métodos
97
Componentes Volumen para
20 µL
Concentración
Final
Tampón de RT (10X) 1,5 µl 1X
MgCl2 25 mM 3.3 µl 5.5 mM
“Random Hexamer” 0.75 µl 2.5 µM
Mezcla dNTP 3 µL 500 µM de cada
dNTP
Inhibidor RNasa 0.3 µL 0.4 U/µL
“MultiScribe Reverse
Transcriptase” (50
U/µL)
0.375 µL 1.25 U/µL
RNA 5 µL 0.06 µg/µL
Agua DEPC- RNA 5.77 µL
Tabla 2. Componentes TaqMan® Reverse Transcription Reagents kit (Applied Biosystems)
El proceso de transcripción inversa se lleva a cabo
en un termociclador Gene Amp PCR System 9700 (Applied
Biosystems), con las siguientes condiciones experimentales:
incubación de 25ºC durante 10 minutos, seguida de un ciclo
a 48ºC durante 30 minutos. Finalmente la transcriptasa
reversa se inactiva mediante una incubación a 95ºC durante
5 minutos.
Materiales y métodos
98
Figura 17. Termociclador 9800 Fast Termal Cycler utilizado para la
retrotranscripción de ARN a ADNc.
El ADNc sintetizado se mantiene a -20ºC hasta la
realización de la siguiente etapa.
Materiales y métodos
99
3.2.8.3. RT-PCR a tiempo real
La reacción en cadena de la polimerasa a tiempo real
(RT-PCR) es actualmente el método más sensible y preciso
en la detección de los niveles de ARNm. El método nos
permite la detección directa del producto de amplificación
durante la fase exponencial de la reacción, a través del
empleo de compuestos con propiedades fluorescentes, de
modo que determinando el incremento de fluorescencia se
puede determinar la cantidad de producto formado.
Se amplificaron de forma selectiva los TaqMan®
assays (Applied Biosystems), que son secuencias
específicas del ADNc, mediante la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR), la cual usa dos fragmentos cortos de
ADN, denominados oligonucleótidos, como cebadores de la
síntesis. Estos cebadores se unen específicamente a
secuencias que flanquean la región a amplificar, cada uno
en cada una de las cadenas del ADN. El proceso básico se
desarrolla en tres pasos que se repiten sucesivas veces:
1. Desnaturalización: separación de las cadenas
complementarias de ADN.
2. Unión: unión de los cebadores específicos a sus
secuencias complementarias.
3. Extensión: síntesis de la hebra complementaria a
partir del cebador respectivo.
Materiales y métodos
100
La repetición de este ciclo un determinado número
de veces produce un aumento exponencial de la cantidad de
la región diana del ADN, que viene dado por la expresión 2n
(siendo n el número de ciclos), hasta que se llega a un punto
en que disminuye la eficiencia de la enzima y la reacción
deja de ser exponencial.
La composición para cada reacción de PCR fue la
siguiente:
Componentes Volumen (10 µl) Concentración
Final
FluoCycle™ II, Mix
for probe RT-PCR
(2X)
5 µl 1X
Taq Man Gene
Expression Assays
(20X)
0,5 µl 1X
cDNA 1 µl
Agua DEPC 3,5 µl
Las mezclas se introducen en el termociclador ABI
Prism 7900 Sequence Detection System® (Applied
Biosystems) con las siguientes condiciones de amplificación:
1 ciclo a 95º C de 10 minutos, y 40 ciclos a 95º C de 15
segundos seguidos de 60º C durante 1 minuto.
Materiales y métodos
101
Figura 18. Termociclador ABI Prism 7900 Sequence Detection System®.
En este termociclador se realiza tanto la
amplificación como la detección del producto amplificado, ya
que el sistema incorpora un lector de fluorescencia y está
diseñado para poder medir, en cualquier momento la
fluorescencia emitida en cada uno de los pocillos donde se
realiza la amplificación. En el presente trabajo, el sistema de
detección por fluorescencia empleado en la PCR a tiempo
real utiliza cebadores y sondas específicas marcadas con
fluorocromos diseñados de manera especial Assays-on-
Demand Gene Expression probes (Applied Biosystems). En
la tabla 3 se exponen las características de los genes
estudiados y del amplicón (cebadores más sondas) que se
utilizaron según las instrucciones del fabricante para la
detección de los niveles de expresión génica en la especie
de ratón, mientras que en la tabla 4 se exponen para rata.
Materiales y métodos
102
Nombre del gen Símbolo del
gen Alias Referencia
Long.
amplicon (pb)
collagen, type I, alpha 1 Col1a1
Col1a-1
Mm00801666_g1 89
Cola-1
Cola1
Mov-13
Mov13
RP23-112C19.9
mucin 5, subtypes A and C,
tracheobronchial/gastric Muc5ac
2210005L13Rik Mm01276725_g1 69
MGM
endothelin 1 Edn1 ET-1
Mm00438656_m1 67
preproET
transforming growth factor
beta Tgf-β
TGF-beta1
Mm00441724_m1 99 TGFbeta1
Tgfb
Tgfb-1
connective tissue growth
factor Ctgf
Ccn2
Mm01192931_g1 84 Fisp12
Hcs24
fisp-12
GTP cyclohydrolase 1 Gch1
GTP-CH
Mm01322971_m1 122 GTPCH
Gch
glyceraldehyde 3-phosphate
dehydrogenase GAPD GAPD 4352339 107
Tabla 3. Sondas TaqMan® utilizadas en RT-PCR para ratón (Mm, Mus musculus).
Materiales y métodos
103
Nombre del gen Símbolo del gen Alias Referencia
Long. amplicon
(pb)
collagen, type I, alpha 1 Col1a1 Col1a-1 Rn01463848_m1 115
mucin 5AC, oligomeric mucus/gel-forming
Muc5ac Muc5ac Rn01451262_g1 82
endothelin 1 end1 Et1 Rn00561129_m1 88
transforming growth factor, beta 1
Tgf-β1 Tgfb1 Rn01475963_m1 78
connective tissue growth factor Ctgf CTGRP Rn00573960_g1 82
GTP cyclohydrolase 1 Gch1 Gch Rn00577450_m1 106
tumor necrosis factor Tnf TNF-alpha
Tnfa Rn00562055_m1 82
glyceraldehyde 3-phosphate
dehydrogenase GAPD GAPD 4352339 107
Tabla 4. Sondas TaqMan® utilizadas en RT-PCR para rata (Rn, Rattus norvegicus).
Materiales y métodos
104
Las sondas son oligonucleótidos marcados con un
fluorocromo donante en 5´ que emite fluorescencia al ser
excitado y un aceptor en el extremo 3´ que absorbe la
fluorescencia liberada por el donante. Para que esto ocurra,
las moléculas donante y aceptora deben estar
especialmente próximas. Además, el espectro de emisión de
la primera se ha de solapar con el espectro de absorción de
la segunda. Mientras la sonda está intacta, la fluorescencia
emitida por el donante es absorbida por el aceptor. Sin
embargo, durante la amplificación del ADN diana, la sonda
hibrida con su cadena complementaria. Al desplazarse a lo
largo de la cadena, en su acción de síntesis, la ADN
polimerasa, mediante su actividad 5´ exonucleasa, hidroliza
el extremo libre 5´ de la sonda, produciéndose la liberación
del fluorocromo donante 116. Como donante y aceptor están
ahora alejados, la fluorescencia emitida por el primero es
captada por el lector. Este proceso ocurre en cada ciclo y no
interfiere con la acumulación exponencial del producto de
amplificación.
Se tomó como control interno al ARN de la proteína
gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenada (GAPDH), dado
que este ARN se expresa de forma constante en muchos
tejidos en diferentes condiciones fisiológicas y
fisiopatológicas.
El programa informático construye estas curvas de
amplificación a partir de los datos de emisión de
Materiales y métodos
105
fluorescencia recogidos durante la reacción en tiempo real.
De este modo, al final se obtiene una representación en la
que el eje de ordenadas es el logaritmo de la intensidad de
la fluorescencia y el eje de abscisas es el número de ciclos
transcurridos.
El parámetro de medida de la expresión de un
determinado gen es el ciclo que alcanza el nivel prefijado de
fluorescencia. Este ciclo se denomina ciclo umbral
(thereshold cycle, Ct), a partir del cual la intensidad de
fluorescencia empieza a ser apreciable. De este modo, los
valores del ciclo umbral decrecerán linealmente conforme
aumenta la cantidad de ADNc de partida. Cuantas más
copias de ARNm de partida del gen estudiado, más ADNc
se obtendrá en la transcripción inversa, y antes comenzará
la amplificación a ser exponencial.
El método para determinar la expresión a partir de
las curvas de amplificación obtenidas consiste en la
comparación de Ct. La expresión del gen problema se
normaliza a la expresión del gen de referencia, GAPDH.
Materiales y métodos
106
3.2.9. Análisis estadístico de los resultados
Todos los datos experimentales generados se
procesaron con la ayuda de los programas informáticos
Microsoft Office Excel 2007 y GraphPad Prism 5.03. Los datos
descriptivos de las variables estudiadas se presentan como
medias acompañadas de su error estándar. Las diferencias
entre los grupos estudiados se analizaron mediante análisis de
variable ANOVA con test de ajuste de corrección de Bonferroni
y, en algunos casos la t de Student para datos no pareados. La
clasificación establecida para el nivel de significación
estadística fue de p<0,05 (significativo), p<0,01 (muy
significativo) o bien p<0,001 (extremadamente significativo). En
todas las gráficas, los símbolos de almohadilla (#) y asterisco
(*) representan diferencias frente al control y frente al grupo de
bleomicina (control positivo), respectivamente. Las diferencias
aumentan con el número de símbolos, de manera que un
símbolo corresponde a *p<0,05 (significativo), dos a **p<0,01
(muy significativo) o bien tres simbolos, ***p<0,001
(extremadamente significativo).
4. RESULTADOS
Resultados
108
4.1. Validación del modelo murino de fibrosis
pulmonar inducida con bleomicina.
El modelo experimental de inducción de fibrosis con
bleomicina, ha sido correctamente estandarizado en nuestro
laboratorio a las dosis de 3.75 y 7.5 U.Kg-1, para ratón y rata
respectivamente112.
Nuestro grupo de investigación ha publicado varios
trabajos científicos con este modelo animal tanto en rata como
en ratón57,58,60,112, lo que avala la metodología empleada en
este trabajo de investigación. No obstante, para cada ensayo
se comprobó que se alcanzaba el estado de fibrosis en el
grupo de bleomicina y que existían diferencias significativas
respecto al grupo control, tomando como referencia los
siguientes indicadores: pérdida de peso corporal, hipertrofia
ventricular derecha, aumento del peso del pulmón, aumento de
células extravasadas en lavado broncoalveolar, aumento de
zonas fibróticas y células inflamatorias en pulmón, y depósitos
de colágeno. A continuación se muestran algunos resultados
típicos del modelo de fibrosis pulmonar con bleomicina en
murinos.
El primer y principal resultado en el modelo de fibrosis
pulmonar inducida por bleomicina es la observación visual por
parte del experimentador de la instauración de la lesión
pulmonar. En la Figura 19 se pueden observar las diferencias
entre un pulmón sano y un pulmón afectado de fibrosis
Resultados
109
pulmonar en la fase inflamatoria, hasta el día 7, y en la fase de
fibrosis, a partir del día 11.
Figura 19. Imagen de los pulmones extraídos de una rata control (A) y de una rata afectada, tras siete días (B) y catorce días (C) desde la inducción de fibrosis con una dosis intratraqueal de 7,5UI.Kg-1 de bleomicina.
En los cortes histológicos teñidos con hematoxilina
eosina, se observa una marcada desestructuración del
parénquima, con lesiones fibróticas, infiltración y
engrosamiento septal que reducen de forma importante el
espacio aéreo alveolar (Figura 20).
Resultados
110
Figura 20. Cambios histológicos observados en el pulmón de rata debidos a la bleomicina: A) pulmón de rata control (10x), B) infiltrado de células inflamatorias y fibroblastos en los espacios alveolares tras siete días de la inducción de fibrosis con bleomicina (5x), C) foco de fibrosis alternando con zonas de parénquima normal tras catorce días de la inducción de fibrosis con bleomicina (5x). D) engrosamiento de las paredes vasculares con restricción de la luz alveolar tras catorce días de la inducción de fibrosis con bleomicina (40x). Tinción hematoxilina eosina.
Figura 21. Medidas de colágeno en pulmón de rata tras catorce días desde la inducción de fibrosis (n=10) frente a control (n=6). A. Contenido de hidroxiprolina en parénquima pulmonar. B. Expresión relativa del ARN de colágeno tipo 1 (Col1a1). ##p valor <0,01 frente a control.
0
1000
2000
3000
4000
5000 ##
Hid
roxi
polin
a (
µµ µµg
por
pulm
ón)
0
1
2
3
4
5 ##ControlBleomicina
Exp
resi
ón r
ela
tiva
del A
RN
m d
e C
OL1
A1
A B
Resultados
111
Entre los resultados que nos aportan mayor información
del proceso fibrótico, y tal como ilustran las Figura 21 y Figura
22, se encuentran: la evolución del peso corporal, con una
pérdida del 20 % para el grupo de bleomicina; la hipertrofia
ventricular derecha causada por la hipoxia permanente del
pulmón; las células extravasadas, dónde la bleomicina hace
que abunden principalmente los neutrófilos; el peso del pulmón
y las proteínas en lavado broncoalveolar que se observan
aumentadas ante la inflamación que genera la exposición a
bleomicina; y por último, pero no menos importante, el aumento
de los depósitos de colágeno en el pulmón (Figura 21).
Resultados
112
0 5 10 15100
150
200
250
300
350
A.- Evolución del peso corporal
Días
Pes
o (g
)
B.- Hipertrofia ventricular derecha
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
##
Pes
o V
D/
peso
VI
C.- Células totales en LBA
0.0
0.5
1.0
1.5
##
Millo
nes
de c
élul
as (
x10
6 )
Control Bleomicina0.0
0.2
0.4
0.6
0.8Neutrofilos
Linfocitos
Eosinófilos
Macrófagos
D.- Tipos celulares
nº c
elul
as (
x10
6 )
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
F.- Concentración deproteínas en LBA
###
Con
c. p
rote
inas
en
LBA
(m
g/m
l)
BleomicinaControlA, B, C, E, F:
0.000
0.005
0.010
0.015
E.- Peso del pulmón
###
Pes
o pu
lmón
/Pes
o ra
ta
Figura 22. Representación gráfica de algunos de los parámetros más representativos de la fibrosis pulmonar inducida po r bleomicina en rata, a los catorce días de la instilación de 7,5 UI.Kg -1 de bleomicina (barra roja, n=10) frente al grupo control (barra verde, n=6) . A. Evolución del peso corporal del animal. B. Índice de hipertrofia ventricular derecha (ventrículo derecho/ ventrículo izquierdo x septo) C. Células totales en lavado broncoalveolar (LBA). D. Tipos de células inflamatorias en LBA. E. Peso pulmón/ peso animal. F. Concentración de proteínas en LBA.
Resultados
113
4.2. Validación del método analítico para la
determinación de BH4 en muestras
biológicas.
La valoración de la BH4 en las muestras se llevó a cabo
por cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa
(HPLC) según el método indirecto descrito en el apartado 2.11
de materiales y métodos. Un cromatograma tipo se representa
en la Figura 23. La relación entre áreas y concentraciones es
lineal en el intervalo de 0,1-100ng/ml.
Se prepararon curvas de calibración cada día, siendo en
todos los casos lineales a juzgar por los coeficiente de
correlación (r2) obtenidos, siempre superiores a 0.998. El límite
de detección de la técnica es de 0,1 ng/mL, mientras que límite
de cuantificación es de 0,5 ng/mL, ambos se obtuvieron
aplicando la normativa de validación de métodos bioanaliticos
de la FDA117.
La precisión del método, medida a través del coeficiente
de variación (CV) se presenta en las Tabla 5 y Tabla 6. El
coeficiente de variación (%) fue en todos los casos inferior al
10%, lo que indica que el método es suficientemente preciso.
La exactitud se evaluó a partir del error relativo, como se
detalla en el epígrafe 3.2.7.1 del capítulo de materiales y
métodos. Los errores relativos también son en todos los casos
inferiores al 10%, por lo que se encuentra dentro de los límites
habituales aceptados. Los resultados se muestran en las Tabla
Resultados
114
5 y 6. Es posible, asimismo, verificar que no existe relación
alguna entre la concentración y la exactitud.
Concentración
ensayada
(ng/mL)
Concentración
experimental media
(ng/mL)
CV (%)
Error
relativo
(%)
5 5,34 ± 0,17 3,13 6,81
25 25,39 ± 0,12 0,49 1,56
75 75,16 ± 0,61 0,80 0,22
100 101,37 ± 0,56 0,55 1,37
Tabla 5. Valores de concentración obtenidos en un m ismo ensayo (n=4).
Concentración
ensayada
(ng/mL)
Concentración
experimental media
(ng/mL)
CV (%)
Error
relativo
(%)
5 5,38 ± 0,21 3,84 7,52
25 25,49 ± 0,36 1,4 1,97
75 75,19 ± 1,22 1,62 0,25
100 96,73 ± 4,08 4,22 -3,27
Tabla 6. Valores de concentración obtenidos en ensa yos distintos (n=5).
Resultados
115
Figura 23. A. Cromatograma de fluorescencia típico de separación de un patrón de biopterina en las condiciones de análisis. B. El ejemplo muestra el fundamento del método analítico mediante la superposición de cromatogramas de una misma muestra de plasma de rata, procesada en condiciones de oxidación acidas (línea negra) y básicas (línea rosa).
2.
5.
7.5 10.
12.
15.
Biopterina
Biopterina 5 ng/ml
t ret=7.6
Area=1.645.950
Resultados
116
4.3. Cuantificación de niveles sanguíneos y
tisulares de tetrahidrobiopterina en modelos
experimentales de fibrosis (ratón C57BL/6J,
rata wistar) y en enfermos diagnosticados de
fibrosis pulmonar idiopática.
Como primer paso para el estudio del comportamiento de
la BH4 en el organismo afectado de fibrosis pulmonar, se
determinaron las concentraciones plasmáticas, pulmonares y
hepáticas obtenidas en una población sana y en una población
afectada de fibrosis pulmonar en las especies de ratón
C57BL/6J y rata wistar. A continuación se determinaron las
concentraciones plasmáticas en una población sana y en una
población afectada de fibrosis pulmonar idiopática en la
especie humana.
En la especie de ratón, tal como se puede observar en la
Tabla 7, se produce una disminución aguda en los niveles
plasmáticos de BH4 a los siete días de la administración de
bleomicina con diferencias extremadamente significativas,
mientras que las diferencias se reducen en el día 14 y día 21
aun siendo significativas.
Tal como se muestra en la Tabla 7, en cuanto a la rata,
no se obtuvieron diferencias estadísticamente significativas
entre el grupo control y el grupo de bleomicina a día 14, ni en
Resultados
117
plasma, ni en pulmón, ni en hígado. No obstante, la tendencia
es similar a la observada en ratón.
En humanos, se valoraron únicamente los niveles de BH4
plasmáticos. Las concentraciones plasmáticas de los pacientes
afectados de fibrosis pulmonar son significativamente menores
que las de los voluntarios sanos que participaron en el estudio.
Los niveles basales de BH4 encontrados en los distintos
tejidos en animales de investigación coinciden con los
publicados hasta el momento por otros autores114,118. Las
concentraciones obtenidas en sangre humana también
coinciden con las encontradas por otros investigadores113,119.
En conjunto, estos resultados sugieren que ante una
situación de estrés, por la aplicación de bleomicina o por la
fibrosis pulmonar idiopática, los niveles plasmáticos de BH4 se
encuentran disminuidos respecto al grupo control. Esto podría
deberse al consumo de especies antioxidantes que se produce
a nivel sistémico en la fibrosis pulmonar debido al aumento de
especies reactivas de oxígeno y de nitrógeno por estrés
oxidativo. Simultáneamente en pulmón los niveles de BH4
podrían estar aumentados por una mayor actividad enzimática
en pulmón debido a la oxidación, lo que aumentaría la
producción de antioxidantes e incluso el consumo de
antioxidantes sanguíneos.
Resultados
118
Especie Grupo
n = 26 n = 22 n = 16
p = 26 p = 22 p = 16
57,39 ± 4,92 0,13 ± 0,02 0,82 ± 0,02
n = 9 n = 8 n = 9
p = 9 p = 8 p = 9
15,18 ± 2,14 ### 0,32 ± 0,05 0,64 ± 0,03
n = 7 n = 7 n = 7
p = 7 p = 7 p = 7
35,94 ± 4,13 ## 0,23 ± 0,03 0,61 ± 0,11
n = 18 n = 9 n = 6
p = 18 p = 9 p = 6
38,48 ± 2,93 ## 0,21 ± 0,03 0,75 ± 0,04
n = 6 n = 6 n = 6
p = 6 p = 6 p = 6
32,73 ± 3,22 0,14 ± 0,04 0,81 ± 0,08
n = 10 n = 10 n = 10
p = 10 p = 10 p = 10
23,70 ± 2,79 0,23 ± 0,03 0,67 ± 0,06
n = 6
p = 6
2,53 ± 0,24
n = 14
p = 14
1,52 ± 0,15 #
RATA
Control
Fibrosis día 14
HUMANOS
Control
Fibrosis
pulmonar
idiopática
Conc. en Plasma
(ng/ml)
Conc. en Pulmón
(µg/g)
Conc. en Hígado
(µg/g)
RATÓN
Control
Fibrosis día 7
Fibrosis día 14
Fibrosis día 21
Tabla 7. Concentraciones de BH4 obtenidas en ratón C57Bl/6J, rata wistar y
humanos, en varios tejidos: plasma, pulmón e hígado . Se muestran resultados de
una población control y de una población afectada de fibrosis pulmonar. En el ratón se
estudiaron los niveles de BH4 con la evolución de la enfermedad, durante la fase
inflamatoria (día 7) y la fase fibrótica (día 14 y 21) del proceso de fibrosis inducida con
bleomicina. ##p< 0,01 frente a control. ###p< 0,001 frente a control.
Resultados
119
4.4. Efecto farmacológico de la
tetrahidrobiopterina (BH4) 20 mg/Kg/día via
oral en ratón a día 7 y a día 14 de la inducción
de fibrosis pulmonar.
El estudio farmacológico de BH4 se realizó a dos dosis,
10 y 20 mg/Kg/día. Los resultados obtenidos muestran que sólo
hay una ligera mejoría para la dosis de 20 mg/Kg/día, por lo
que se omiten los correspondientes a la dosis inferior.
En este estudio, al igual que el resto de estudios
farmacológicos realizados, se ensayó un grupo de animales
sanos que recibieron la misma dosis diaria de BH4. No se
observaron modificaciones significativas en los parámetros a
estudiar respecto al grupo control. Esto demuestra que la BH4
no ejerce efecto per se. Por ello, este grupo no se representa
en los gráficos.
4.4.1. Evolución del peso corporal
En primer lugar, como indicador del bienestar animal y
de la influencia de las dificultades respiratorias y alimenticias
que sufren los animales como consecuencia de la lesión
pulmonar producida por la bleomicina, se controló durante el
ensayo la evolución del peso corporal en función del tiempo.
Resultados
120
Como se muestra en la Figura 24, el grupo tratado con
BH4 aumenta en un 25% el peso corporal respecto al grupo de
bleomicina a punto final, día 14.
Figura 24. Representación gráfica de la evolución del peso corporal de los ratones. Se pesaron de forma periódica desde el día de la inducción de fibrosis pulmonar con bleomicina hasta el día 14 del experimento. Se representan los tres grupos principales del estudio: grupo control (color verde, n=12), grupo de bleomicina (color rojo, n=10) y grupo de bleomicina con BH4 20 mg/Kg/día (color azul, n=16).
4.4.2. Peso del pulmón, proteínas en pulmón e
índice de hipertrofia ventricular derecha.
Se estudió el efecto antifibrótico de la BH4 en la fase de
inflamación del proceso de fibrosis con bleomicina, a día 7 de la
inducción de fibrosis, y en la fase de la enfermedad en la que
predomina el estado fibrótico, a día 14. En la Figura 25 se
exponen de forma comparativa los resultados obtenidos al
determinar los parámetros de peso pulmonar, hipertrofia
0 5 10 1512
14
16
18
20
22SF i.t + vehículo v.oBL i.t + vehículo v.o
BL i.t + BH4 20 mg/kg/día v.o
Tiempo (dias)
Pes
o (g
)
Resultados
121
ventricular derecha, y proteínas totales en pulmón en ambas
fases. Tal como muestra la figura, la BH4 no revierte ninguno
de estos tres parámetros a día siete frente al daño producido
por la bleomicina.
El índice de hipertrofia ventricular derecha (Peso
ventrículo derecho / peso ventrículo izquierdo con septum) es
un indicador del esfuerzo al que se ha sometido el corazón
debido a la situación de hipoxia. Después de catorce días de
dificultad respiratoria se observaron diferencias
estadísticamente significativas en la hipertrofía ventricular
desarrollada por los animales expuestos a bleomicina sin
tratamiento y los no expuestos. La suplementación con BH4
disminuyó la hipertrofía ventricular derecha generada tras
catorce días de la lesión pulmonar producida por la bleomicina.
Resultados
122
Inflamación Fibrosis Día7 Día14
Peso del pulmón
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
######
Pe
so p
ulm
ón/ p
eso
rat
ón
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
Pes
o pu
lmó
n/ p
eso
rat
ón
###
Concentración de proteínas en pulmón
0
10
20
30
40
50###
Co
nc. p
rote
ínas
(m
g/g
)
0
10
20
30
40
50###
Co
nc.
pro
teín
as (
mg
/g)
Índice de hipertrofia ventricular derecha
0.0
0.1
0.2
0.3
Peso
VD
/ (Pe
so V
I + se
ptum)
0.0
0.1
0.2
0.3 ###
*
Peso
VD
/ (Pe
so V
I + se
ptum)
Control (n=12) Bleomicina (n=8) BL i.t + BH4 20mg v.o (n=8)
Figura 25. Representación gráfica comparativa de los parámetros: peso del pulmón, concentración de proteínas en pulmón e hipertrófia ventricular derecha (VD/(VI+septo)), en la fase inflamatoria (día 7) y en la fase crónica o fibrótica (día 14) del proceso de fibrosis inducida con 3,75 UI de bleomicina en ratón. Se representan tres grupos experimentales: control (verde), fibrosis (rojo), fibrosis con tratamiento de BH4 20 mg/Kg/día vía oral (azul). ###p<0,001 frente a control. *p<0,05 frente a bleomicina. La n es indicatoría del mínimo número de ratones utilizados para el cálculo de la media y del error de todos los parámetros mostrados.
Resultados
123
4.4.3. Expresión génica
���� Expresión génica de colágeno tipo I (Col1a1)
Los resultados se reflejan en la Figura 26. La
expresión génica de colágeno tipo I se ve aumentada
con bleomicina. La administración de BH4 durante siete
días no disminuye este aumento. En cambio, tras
catorce días de tratamiento se observa una disminución
de la expresión de Col1a1.
0
2
4
6
8
SF i.t + vehículo v.o (n=35)
BL i.t + vehículo v.o (n=8)
BL i.t + BH4 20 mg v.o (n=8)
###
Exp
resi
ón r
ela
tiva
del A
RN
m d
e C
OL1
A1
0
2
4
6
8
SF i.t + vehículo v.o (n=35)
BL i.t + vehículo v.o (n=20)
BL i.t + BH4 20 mg v.o (n=7)
###E
xpre
sión
re
lativ
ade
l AR
Nm
de
CO
L1A1 *
Día 7 Día 14
Figura 26. Cuantificación relativa de los niveles de ARNm del gen Col1a1 en tejido pulmonar a los días 7 y 14 de la inducción de fibrosis en los tres grupos experimentales: control (verde), fibrosis (rojo), fibrosis con tratamiento de BH4 20 mg/Kg/día vía oral (azul). ###p<0,001 frente a control.
Resultados
124
���� Expresión génica del factor transformador del
crecimiento beta (Tgf- β)
La expresión de Tgf-β se ve significamente
aumentada a los siete y catorce días de la
administración de bleomicina con respecto al grupo
control. La suplementación con BH4 disminuye
significativamente la expresión de Tgf-β con respecto al
grupo de bleomicina, reestableciendo los niveles
basales de expresión. Esto ocurre tanto en el grupo
tratado durante una semana como en el grupo que se
trató durante catorce días.
Figura 27. Cuantificación relativa de los niveles de ARNm del gen Tgf-β en tejido pulmonar a los días 7 y 14 de la inducción de fibrosis en los tres grupos experimentales: control (verde), fibrosis (rojo), fibrosis con tratamiento de BH4 20 mg/Kg/día vía oral (azul).###p<0,001 frente a control; *p<0,05 frente a bleomicina; ***p<0,001 frente a bleomicina.
0
2
4
6
SF i.t + vehículo v.o (n=35)BL i.t + vehículo v.o (n=8)BL i.t + BH4 20 mg v.o (n=8)
###
***
Exp
resi
ón r
elat
iva
del
AR
Nm
de
TGF-
ββ ββ
0
1
2
3
4
5
SF i.t + vehículo v.o (n=35)BL i.t + vehículo v.o (n=10)BL i.t + BH4 20mg v.o (n=7)
###
*
Exp
resi
ón r
elat
iva
del
AR
Nm
de
TGF-
ββ ββ
Día 7 Día 14
Resultados
125
���� Expresión génica del factor de crecimiento del
tejido conectivo (Ctgf).
La expresión del Ctgf a los siete y catorce días de la
administración de bleomicina se ve aumentada de forma
estadísticamente significativa respecto al grupo control.
La suplementación con BH4 durante siete o catorce días
disminuye el aumento producido por la bleomicina de
forma significativa.
0
2
4
6
8
SF i.t + vehículo v.o (n=35)BL i.t + vehículo v.o (n=8)BL i.t + BH4 20 mg v.o (n=8)
###
*
Exp
resi
ón r
elat
iva
del A
RN
m d
e C
TGF
0
2
4
6
SF i.t + vehículo v.o (n=35)BL i.t + vehículo v.o (n=10)BL i.t + BH4 20mg v.o (n=7)
###
Exp
resi
ón r
elat
iva
del A
RN
m d
e C
TGF
Día 7 Día 14
*
Figura 28. Cuantificación relativa de los niveles de ARNm del gen Ctgf en tejido pulmonar a los siete y catorce días de la inducción de fibrosis en los tres grupos experimentales: control (verde), fibrosis (rojo), fibrosis con tratamiento de BH4 20 mg/Kg/día vía oral (azul). ###p<0,001 frente a control; *p<0,05 frente a bleomicina.
Resultados
126
���� Expresión génica de la mucina 5AC ( Muc5ac).
La expresión de la mucina Muc5ac en pulmón a día
7 y a día 14 se ve aumentada por la lesión que produce
la bleomicina. La suplementación con BH4 revierte este
aumento, de forma extremadamente significativa tras
catorce días de tratamiento.
0
1
2
3
Exp
resi
ón r
elat
iva
del
AR
Nm
de
Muc
5ac
0
1
2
3 ##
***E
xpre
sión
rel
ativ
a de
lAR
Nm
de
muc
5ac
SF i.t + vehículo v.o (n=35)BL i.t + vehículo v.o (n=8)BL i.t + BH4 20 mg v.o (n=8)
SF i.t + vehículo v.o (n=35)BL i.t + vehículo v.o (n=10)BL i.t + BH4 20mg v.o (n=7)
Día 7 Día 14
Figura 29. Cuantificación relativa de los niveles de ARNm del gen Muc5ac en tejido pulmonar a los días siete y 14 de la inducción de fibrosis con 3.75 UI/Kg de bleomicina en los tres grupos experimentales: control (verde), fibrosis (rojo), fibrosis con tratamiento de BH4 20 mg/Kg/día vía oral (azul). No existen diferencias significativas entre los grupos experimentales a día 7. ##p<0,01 frente a control; ***p<0,001 frente a bleomicina.
Resultados
127
���� Expresión génica de endotelina 1 (End1).
La expresión de mRNA del gen End1, según se
muestra en la Figura 30, se vió aumentada en los
pulmones afectados por la bleomicina de forma
significativa. La administración oral de BH4 20
mg/Kg/día revirtió significativamente este efecto tanto a
los siete como a los catorce días de tratamiento.
0
1
2
3
4 ##
**
Exp
resi
ón r
elat
iva
del
AR
Nm
de
endo
telin
a-1
0
1
2
3
4
##
*
Exp
resi
ón r
elat
iva
del
AR
Nm
de
endo
telin
a-1
SF i.t + vehículo v.o (n=35)BL i.t + vehículo v.o (n=8)BL i.t + BH4 20 mg v.o (n=8)
SF i.t + vehículo v.o (n=35)BL i.t + vehículo v.o (n=10)BL i.t + BH4 20mg v.o (n=7)
Día 7 Día 14
Figura 30. Cuantificación relativa de los niveles de ARNm del gen End1 en tejido pulmonar a los siete y catorce días de la inducción de fibrosis en los tres grupos experimentales: control (verde), fibrosis (rojo), fibrosis con tratamiento de BH4 20 mg/Kg/día vía oral (azul). ##p<0,05 frente a control; **p<0,01 frente a bleomicina; *p<0,05 frente a bleomicina.
Resultados
128
���� Expresión génica de guanosina trifosfato
ciclohidrolasa I (Gch1).
En la Figura 31 se puede observar el aumento de
expresión de Gch1 que generó en el pulmón la
instilación de bleomicina. La Gch1 o GTPCH-1 es la
enzima principal de la síntesis de BH4 endógena. La
administración durante siete y catorce dias de BH4 a los
ratones fibróticos no disminuyó la expresión de la
enzima que la sintetiza.
0
1
2
3
4
5
#
Exp
resi
ón r
elat
iva
del
AR
Nm
de
GT
PC
H-I
0
1
2
3
4
5
##
Exp
resi
ón r
elat
iva
del
AR
Nm
de
GT
PC
H-I
SF i.t + vehículo v.o (n=15)BL i.t + vehículo v.o (n=8)BL i.t + BH4 20 mg v.o (n=8)
SF i.t + vehículo v.o (n=15)BL i.t + vehículo v.o (n=10)BL i.t + BH4 20mg v.o (n=7)
Día 7 Día 14
Figura 31. Cuantificación relativa de los niveles de ARNm del gen Gch1 en tejido pulmonar a los siete y catorce días de la inducción de fibrosis en los tres grupos experimentales: control (verde), fibrosis (rojo), fibrosis con tratamiento de BH4 20 mg/Kg/día vía oral (azul). #p<0,05 frente a control; ##p<0,01 frente a control.
Resultados
129
4.4.4. Determinación de la concentración de
tetrahidrobiopterina
Como se ha comentado previamente, en nuestro
organismo existe un equilibrio de tres especies pterinas:
biopterina, 7,8- dihidrobiopterina (BH2) y tetrahidrobiopterina
(BH4), de las cuales sólo la BH4 es activa. Ésta tiene un papel
importante en la regulación de la función del endotelio vascular
y protege del estrés oxidativo. Los estudios que se han
realizado hasta el momento parecen indicar que una
disminución de los niveles de BH4 produce el desacoplamiento
de la óxido nítrico sintasa endotelial y la generación de anión
superóxido.
Durante el estudio se analizaron los niveles de BH4
sistémicos, locales, y hepáticos. La técnica utilizada fue la
cromatografía líquida con detección por fluorescencia.
Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 32.
Se observó una disminución aguda de los niveles de
BH4 plasmáticos tras siete días de afectación pulmonar por
bleomicina. Esta caída se ve revertida de forma significativa por
el tratamiento oral con 20 mg/Kg/día de BH4.
La disminución de los niveles plasmáticos de BH4 a los
catorce días desde la bleomicina, siendo significativa, es
menos pronunciada que a los siete días. También la
administración de BH4 durante catorce días recupera los
Resultados
130
niveles plasmáticos incluso ligeramente por encima del grupo
control.
En homogenizado de pulmón ocurre de manera inversa.
La concentración de BH4 en los grupos expuestos a bleomicina
aumenta de forma significativa con respecto al grupo control y
este aumento es ligeramente mayor a los siete días de
exposición que a los catorce días de exposición.
Esta correlación inversa entre plasma y tejido ya ha sido
mencionada anteriormente por otros autores108.
En el pulmón, la suplementación oral de 20 mg/Kg/día
de BH4 no modifica los niveles, ni siquiera tras catorce días de
tratamiento.
El perfil de la bleomicina en el tejido hepático se
correlaciona con el observado en el sistémico. La bleomicina
disminuye los niveles de BH4 en hígado, pero en este caso la
administración oral de BH4 no recupera los niveles del grupo
control.
Resultados
131
Figura 32. Concentraciones de BH4 alcanzadas a día 7 y a día 1 4 de la inducción de fibrosis en los tejidos de ratón estudiados. A. Plasma; B. Pulmón; C. Hígado. En cada gráfica quedan representados los tres grupos experimentales: control (verde), fibrosis (rojo), fibrosis con tratamiento de BH4 20 mg/Kg/día vía oral (azul). #p<0,05 frente a control; ###p<0,001 frente a control; *p<0,05 frente a bleomicina.
0
20
40
60
80
SF i.t + vehículo v.o (n=30)BL i.t + vehículo v.o (n=10)BL i.t + BH4 20 mg v.o (n=10)
###
*
Con
cent
ració
n pl
asm
ática
de
BH
4 (n
g/m
l)0
20
40
60
80
SF i.t + vehículo v.o (n=30)BL i.t + vehículo v.o (n=10)BL i.t + BH4 20 mg v.o (n=7)
*
#
Con
cent
ració
n pl
asm
ática
de
BH
4 (n
g/m
l)
InflamaciónDía 7
FibrosisDía 14
A.
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
SF i.t + vehículo v.o (n=20)BL i.t + vehículo v.o (n=7)BL i.t + BH4 20 mg v.o (n=8)
###
Con
cent
ració
n de
BH
4en
pul
món
(µµ µµg
/g)
0.0
0.1
0.2
0.3
SF i.t + vehículo v.o (n=22)BL i.t + vehículo v.o (n=8)BL i.t + BH4 20 mg v.o (n=8)
#
Con
cent
ració
n de
BH
4en
pul
món
(ug
/g)
B.
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
SF i.t + vehículo v.o (n=16)BL i.t + vehículo v.o (n=8BL i.t + BH4 20 mg v.o (n=9)
Con
cent
ració
n de
BH
4 e
n hí
gado
(µµ µµg
/g)
C.
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
SF i.t + vehículo v.o (n=16)BL i.t + vehículo v.o (n=9)BL i.t + BH4 20 mg v.o (n=9)
Con
cent
ració
n de
BH
4 e
n hí
gado
(ug/
g)
Resultados
132
4.5. Efecto farmacológico de la sepiapterina
10 mg/Kg/día via oral en la fibrosis pulmonar
inducida con bleomicina en ratón a día 7 y a
día 14.
Tras los resultados obtenidos con la administración oral
de BH4, se propone la administración de su precursor, la
sepiapterina (SP). Con ello, se pretende lograr más efectividad
en elevar los niveles de BH4 tisulares109,118.
Se estudia el efecto que produce la administración oral de
sepiapterina 10 mg/Kg/día120 tal como se realizó para la BH4. A
nivel macroscópico, se midió la evolución del peso corporal, el
peso del pulmón y el peso del corazón. Se cuantificaron las
proteínas totales en pulmón. A nivel molecular, se determinó la
expresión de genes implicados en el proceso fibrótico y se
determinaron los niveles de BH4 alcanzados en plasma,
pulmón e hígado. Todos estos análisis se realizaron al final de
la fase inflamatoria, a los siete días de la inducción de fibrosis,
y en la fase fibrótica o crónica, a los catorce días de la
inducción de fibrosis.
Resultados
133
4.5.1. Evolución del peso corporal
La sepiapterina, aumenta en un 30% el peso corporal
de los animales con respecto al grupo de bleomicina a partir del
octavo día de tratamiento. En la Figura 33 se representa la
evolución del peso corporal de los tres grupos experimentales
en función del tiempo.
0 5 10 1510
12
14
16
18
20
22SF i.t + vehículo v.o (n=10)BL i.t + vehículo v.o (n=8)BL i.t + SP 10mg/Kg v.o (n=16)
Tiempo (dias)
Pes
o (g
)
Figura 33. Evolución del peso corporal de los ratones desde la inducción de fibrosis con 0,075UI de bleomicina en los tres grupos experimentales estudiados: control (color verde), fibrosis (color rojo), fibrosis con tratamiento de sepiapterina 10 mg/Kg/día vía oral (color rosa)
Resultados
134
4.5.2. Peso del pulmón, proteínas en pulmón e
índice de hipertrofia ventricular derecha.
El tratamiento con sepiapterina, al igual que ocurría con
la BH4, tal como se muestra en la Figura 34, no atenuó el
aumento del peso pulmón y de la cantidad proteínas totales en
pulmón ni a los siete ni a los catorce días desde la inducción de
fibrosis con bleomicina.
El índice de hipertrofia ventricular derecha, igual que
ocurrió en el estudio de BH4, se vió significativamente
aumentado a los catorce días de dificultad respiratoria. Se
observaron diferencias estadísticamente significativas en la
hipertrofía ventricular desarrollada por los animales expuestos
a bleomicina y los no expuestos. El tratamiento con
sepiapterina mejoró muy significativamente la hipertrofía
ventricular derecha generada tras catorce días de lesión
pulmonar causada por la bleomicina.
Resultados
135
Figura 34. Representación gráfica comparativa de lo s parámetros: peso del pulmón, concentración de proteínas en pulmón e hipe rtrofia ventricular derecha (VD/(VI+septo)), en la fase inflamatoria (día 7) y en la fase crónica o fibrótica (día 14) del proceso de fibrosis inducida con 3,75 UI de bleomicina en ratón . Se ensayaron tres grupos experimentales: control (verde), fibrosis (rojo), fibrosis con tratamiento de sepiapterina 10 mg/Kg/día vía oral (rosa). ###p<0,001 frente a control. ##p<0,01 frente a control **p<0,01 frente a bleomicina. La n es indicativa de mínimo número de resultados utilizados para el cálculo de la media y del error de los parámetros mostrados.
0
10
20
30
40
50
Pro
tein
as to
tale
s en
pulm
ón (
mg/
g)
##
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
Pes
o pu
lmón
/ pes
o ra
tón
###
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
Pe
so p
ulm
ón/ p
eso
rat
ón
###
0
20
40
60
###
Pro
teín
as to
tale
s en
pulm
ón (
mg/
g)
0.15
0.20
0.25
0.30
Pes
o V
D /
(Pes
o V
I + s
eptu
m)
0.15
0.20
0.25
0.30 ##
**
Pes
o V
D /
(Pes
o V
I + s
eptu
m)
InflamaciónDía 7
FibrosisDía 14
Peso del pulmón
Proteínas en pulmón
Índice de hipertrofia ventricular derecha
SF i.t + vehículo v.o (n=15)BL i.t + vehículo v.o (n=7)BL i.t + SP 10mg v.o (n=7)
Resultados
136
4.5.3. Expresión génica
���� Expresión génica de colágeno tipo I (Col1a1)
La bleomicina, como buen modelo de remodelado
pulmonar, produjo un incremento en la expresión de colágeno
tipo 1. El tratamiento con sepiapterina 10 mg/Kg/día disminuyó
los niveles de expresión de colágeno, tanto a día 7 como a día
14 (Figura 35).
0
2
4
6
8 ###
SF i.t + vehículo v.o (n=37)BL i.t + vehículo v.o (n=8)BL i.t + SP 10 mg v.o (n=6)
*
Exp
resi
ón r
elat
iva
del
AR
Nm
de
Col
1a1
0
2
4
6
SF i.t + vehículo v.o (n=37)BL i.t + vehículo v.o (n=30)BL i.t + SP 10mg v.o (n=7)
###
Exp
resi
ón r
elat
iva
del
AR
Nm
de
Col
1a1
Día 7 Día 14
Figura 35 Cuantificación relativa de los niveles de ARNm del gen Col1a1 en tejido pulmonar tras siete y catorce días desde la inducción de fibrosis con 3.75 UI/Kg de bleomicina en los tres grupos experimentales: control (verde), fibrosis (rojo) y fibrosis con tratamiento de sepiapterina 10 mg/Kg/día (rosa). ###p<0,001 frente a control, *p<0,05 frente a bleomicina.
Resultados
137
���� Expresión génica del factor transformador del
crecimiento beta (Tgf- β)
La expresión del Tgf-β se vió aumentada en el
grupo de animales expuestos a bleomicina. La
sepiapterina por vía oral revirtió de forma significativa el
aumento de expresión que se produce a día 7. A día 14,
la sepiapterina también atenuó significativamente este
aumento de expresión respecto al grupo de bleomicina.
(ver Figura 36).
0
2
4
6
SF i.t + vehículo v.o (n=37)
BL i.t + vehículo v.o (n=8)BL i.t + Spt 10 mg v.o (n=6)
##
*
Exp
resi
ón r
elat
iva
del
AR
Nm
de
TGF-
ββ ββ
0
2
4
6
8
10
SF i.t + vehículo v.o (n=37)BL i.t + vehículo v.o (n=30)BL i.t + Spt 10 mg v.o (n=7)
###
*
Exp
resi
ón r
elat
iva
del
AR
Nm
de
TGF-
ββ ββDía 7 Día 14
Figura 36. Cuantificación relativa de los niveles de ARNm del gen Tgf-β en tejido pulmonar a los siete y catorce días de la inducción de fibrosis con 3.75 UI/Kg de bleomicina en los tres grupos experimentales: control (verde), fibrosis (rojo) y fibrosis con tratamiento de sepiapterina 10 mg/Kg/día (rosa). ##p<0,01 frente a control, ###p<0,001 frente a control; *p<0,05 frente a bleomicina.
Resultados
138
���� Expresión génica del factor de crecimiento de
tejido conectivo (Ctgf).
Tanto a los siete como a los catorce días de la
inducción de fibrosis con bleomicina, la expresión de
Ctgf se ve significativamente aumentada respecto al
grupo control. La administración de sepiapterina
disminuye este aumento significativamente a día 14,
pero en cambio, no lo hace a día 7 (Figura 37).
0
2
4
6
8
SF i.t + vehículo v.o (n=37)BL i.t + vehículo v.o (n=30)BL i.t + SP 10 mg v.o (n=7)
###
***Exp
resi
ón r
elat
iva
del
AR
Nm
de
CT
GF
0
2
4
6
8
SF i.t + vehículo v.o (n=37)BL i.t + vehículo v.o (n=8)BL i.t + SP 10 mg v.o (n=6)
##
Exp
resi
ón r
elat
iva
del A
RN
m d
e C
TG
F
Día 7 Día 14
Figura 37. Cuantificación relativa de los niveles de ARNm del gen Ctgf en tejido pulmonar tras siete y catorce días de la inducción de fibrosis con 3.75 UI/Kg de bleomicina en los tres grupos experimentales: control (verde), fibrosis (rojo) y fibrosis con tratamiento de sepiapterina 10 mg/Kg/día (rosa). ###p<0,001 frente a control, ##p<0,01 frente a control, ***p<0,001 frente a bleomicina.
Resultados
139
���� Expresión génica de la mucina 5AC ( Muc5ac).
La lesión pulmonar producida por la bleomicina
aumentó de forma significativa la expresión de Muc5ac
a día 7 y a día 14 del proceso fibrótico.
El tratamiento con sepiapterina 10 mg/Kg/día vía
oral durante catorce días revirtió este aumento (Figura
38).
0
2
4
6
SF i.t + vehículo v.o (n=37)BL i.t + vehículo v.o (n=30)BL i.t + SP 10 mg v.o (n=7)
#
*
Exp
resi
ón r
elat
iva
del
AR
Nm
de
muc
5ac
0
2
4
6
SF i.t + vehículo v.o (n=37)BL i.t + vehículo v.o (n=8)BL i.t + SP 10 mg v.o (n=6)
#
Exp
resi
ón r
elat
iva
del
AR
Nm
de
muc
5ac
Día 7 Día 14
Figura 38. Cuantificación relativa de los niveles de ARNm del gen Muc5ac en tejido pulmonar tras siete y catorce días de la inducción de fibrosis con 3.75 UI/Kg de bleomicina en los tres grupos experimentales: control (verde), fibrosis (rojo) y fibrosis con tratamiento de sepiapterina 10 mg/Kg/día (rosa). #p<0,05 frente a control, *p<0,05 frente a bleomicina.
Resultados
140
���� Expresión génica de endotelina-1 (End1).
La expresión de endotelina-1 incrementa
significativamente en los ratones expuestos a
bleomicina, tal como se muestra en la Figura 39. La
sepiapterina disminuyó este incremento de forma
significativa, tanto a los siete como a los catorce días de
tratamiento (Figura 39).
Los resultados obtenidos con la administración oral
del precursor de BH4, coinciden por completo con los
obtenidos al administrar la propia BH4 en el estudio
anterior (Figura 30).
0
1
2
3
4
5
SF i.t + vehículo v.o (n=37)
BL i.t + vehículo v.o (n=8)BL i.t + SP 10 mg v.o (n=6)
##
*
Exp
resi
ón r
elat
iva
del
AR
Nm
de
endo
telin
a-1
0
1
2
3
4
5
SF i.t + vehículo v.o (n=37)BL i.t + vehículo v.o (n=30)BL i.t + SP 10 mg v.o (n=7)
###
*
Exp
resi
ón r
elat
iva
del
AR
Nm
de
endo
telin
a-1
Día 7 Día 14
Figura 39. Cuantificación relativa de los niveles de ARNm del gen End1 en tejido pulmonar tras siete y catorce días de la inducción de fibrosis con 3.75 UI/Kg de bleomicina en los tres grupos experimentales: control (verde), fibrosis (rojo) y fibrosis con tratamiento de sepiapterina 10 mg/Kg/día (rosa). ##p<0,01 frente a control; ##p<0,001 frente a control; *p<0,05 frente a bleomicina.
Resultados
141
���� Expresión génica de guanosina trifosfato
ciclohidrolasa I (Gch1).
La expresión génica de la enzima GTPCH-I,
encargada de la síntesis de BH4, aumentó en ratones
con fibrosis pulmonar respecto al grupo control. Por otra
parte, la administración de sepiapterina via oral, no
disminuye la expresión producida por la bleomicina.
Estos resultados coincidieron con los obtenidos en
el estudio anterior al administrar BH4 oral (Figura 40).
0
1
2
3
4
SF i.t + vehículo v.o (n=37)BL i.t + vehículo v.o (n=8)BL i.t + SP 10 mg v.o (n=6)
#
Exp
resi
ón re
lativ
a A
RN
m G
TP
CH
-I
0
1
2
3
4
SF i.t + vehículo v.o (n=37)
BL i.t + vehículo v.o (n=30)BL i.t + SP 10 mg v.o (n=7)
##
Exp
resi
ón re
lativ
a A
RN
m G
TP
CH
-I
Figura 40. Cuantificación relativa de los niveles de ARNm del gen Gch1 en tejido pulmonar a los siete y catorce días de la inducción de fibrosis con 3.75 UI/Kg de bleomicina en los tres grupos experimentales: control (verde), fibrosis (rojo) y fibrosis con tratamiento de sepiapterina 10 mg/Kg/día (rosa). #p<0,05 frente a control. ##p<0,01 frente a control.
Resultados
142
4.5.4. Determinación de la concentración de
tetrahidrobiopterina.
Los resultados del análisis cuantitativo de BH4 en
los tejidos estudiados, a los siete y catorce días del
proceso fibrótico, durante el estudio farmacológico de la
sepiapterina por via oral se muestran en la Figura 41.
Se confirmó por tercera vez una disminución aguda
de los niveles de BH4 plasmáticos tras la afectación
pulmonar por bleomicina. Es más significativa a día
siete que a día catorce del proceso.
Sin embargo, la administración de sepiapterina 10
mg/Kg/día por vía oral no recupera los niveles
sistémicos de BH4, a diferencia de lo que ocurría al
administrar directamente BH4.
En el parénquima pulmonar, se confirma también
que, de manera inversa al plasma, la concentración de
BH4 en los grupos expuestos a bleomicina aumenta de
forma significativa con respecto al grupo control. Este
aumento es ligeramente superior a los siete días de
exposición que a los catorce días de exposición.
La suplementación oral con 10 mg/Kg/día de
sepiapterina no modifica los niveles pulmonares, ni
siquiera tras catorce días de tratamiento.
Las concentraciones en hígado se correlacionan
una vez más con el perfil observado en el sistémico.
Resultados
143
En este caso la administración oral de sepiapterina
durante siete días recupera los niveles del grupo control.
En cambio, tras catorce días de tratamiento no se
observan diferencias significativas entre el grupo de
bleomicina y el grupo de bleomicina con tratamiento.
Resultados
144
0
20
40
60
80
SF i.t + vehículo v.o (n=30)
BL i.t + vehículo v.o (n=20)BL i.t + SP 10 mg v.o (n=7)
##
Con
cent
raci
ones
pla
smát
icas
de
BH
4 (
ng/m
l)
0
20
40
60
80
SF i.t + vehículo v.o (n=25)BL i.t + vehículo v.o (n=9)BL i.t + SP 10 mg v.o (n=6)
###
Con
cent
raci
ón p
lasm
átic
a d
e B
H4
(ng/
ml)
InflamaciónDía 7
FibrosisDía 14
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
SF i.t + vehículo v.o (n=20)BL i.t + vehículo v.o (n=8)BL i.t + SP 10 mg v.o (n=8)
###
Con
cent
raci
ón d
e B
H4
en
pulm
ón (
µµ µµg/g
)
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
SF i.t + vehículo v.o (n=22)
BL i.t + vehículo v.o (n=8)BL i.t + SP 10 mg v.o (n=7)
#
Con
cent
raci
ón d
e B
H4
en p
ulm
ón (
ug/g
)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
SF i.t + vehículo v.o (n=10)BL i.t + vehículo v.o (n=9)BL i.t + SP 10mg v.o (n=7)
##
**
Con
cent
raci
ón d
e B
H4
en h
ígad
o (u
g/g)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
SF i.t + vehículo v.o (n=10)BL i.t + vehículo v.o (n=7)BL i.t + Spt 10 mg v.o (n=7)
Con
cent
raci
ón d
e B
H4
en
híga
do (
ug/g
)
Figura 41. Concentraciones de BH4 alcanzadas a día 7 y a día 1 4 de la inducción de fibrosis en los tejidos de ratón estudiados. A. Plasma; B. Pulmón; C. Hígado. En cada gráfica quedan representados los tres grupos experimentales: control (verde), fibrosis (rojo), fibrosis con tratamiento de sepiapterina 10 mg/Kg/día vía oral (rosa). La administración de sepiapterina 10 mg/Kg/día a un grupo de animales sanos no varió los niveles de BH4 en plasma y en pulmón respecto al grupo control de forma significativa, por ello no se muestra en los gráficos. #p<0,05 frente a control; ##p<0,01 frente a control; ###p<0,001 frente a control;
**p<0,01 frente a bleomicina.
Resultados
145
4.5.5. Estudio farmacocinético de la sepiapterina vía
oral.
Tras los resultados obtenidos en el estudio
farmacológico de la sepiapterina, donde se observa, a
diferencia de lo que ocurre en otros tejidos, que la
administración de sepiapterina no aumenta los niveles
pulmonares de BH4 se planteó la posibilidad de que hubiera
baja disponibilidad de BH4 en pulmón y no se alcanzarán las
concentraciones suficientes para producir efecto.
Así, se realizó el estudio farmacocinético de la
sepiapterina a las dosis de 10 y 30 mg/Kg por vía oral. Las
concentraciones plasmáticas y pulmonares alcanzadas en
función del tiempo se describen en Tabla 8 y Tabla 9, y se
representan en Figura 42 y Figura 43.
Resultados
146
Plasma Dosis oral 30mg/Kg
Dosis oral 10mg/Kg
t (h) n Conc. (ng/ml) ± SEM Conc.
(ng/ml) ± SEM
0 2 24,05 ± 0,20 24,05 ± 0,20
0,5 3 14,02 ± 1,26 90,39 ± 15,27
1 3 249,96 ± 67,80 131,56 ± 21,92
2 2 717,43 ± 41,23 228,42 ± 29,64
4 2 396,42 ± 38,48 146,53 ± 48,44
6 2 110,08 ± 49,79 63,28 ± 3,08
Tabla 8. Concentración plasmática de BH4 obtenidas a distintos tiempos, tras una administración oral de 10 y 30 mg/Kg de Sepiapterina. n= nº de animales utilizados para cada punto; SEM es la media del error estándar.
0 0,5 1 2 4 60
200
400
600
80030 mg/Kg/día10 mg/Kg/día
t (h)
Co
nce
ntr
acio
ne
s p
lasm
átic
as d
e B
H4
(ng
/ml)
Figura 42 . Concentraciones plasmática de BH4 obtenidas a distintos tiempos, tras una administración oral de 10 y 30 mg/Kg de Sepiapterina. n*= nº de animales utilizados para cada punto. (Ver Tabla 8).
Resultados
147
Pulmón Dosis oral 30mg/Kg
Dosis oral 10mg/Kg
t(h) n Conc. (ug/g) ± SEM Conc.
(ug/g) ± SEM
0 2 0,12 ± 0,03 0,12 ± 0,03
0,5 3 0,15 ± 0,03 0,21 ± 0,02
1 3 0,15 ± 0,02 0,22 ± 0,04
2 2 0,19 ± 0,04 0,12 ± 0,04
4 2 0,25 ± 0,04 0,11 ± 0,03
6 2 0,09 ± 0,01 0,09 ± 0,01
Tabla 9. Concentración en tejido pulmonar de BH4 frente al tiempo, tras una administración oral de 10 y 30 mg/Kg de Sepiapterina. n= nº de animales utilizados para cada punto; SEM es la media del error estándar.
0 0,5 1 2 4 60.0
0.1
0.2
0.3
0.430 mg/Kg/día10 mg/Kg/día
t (h)
Co
nc. B
H4
(ug/
g)
en
pu
lmó
n
Figura 43 . Concentración de BH4 alcanzadas en pulmón frente al tiempo, tras la administración oral única de 10 y 30 mg/Kg de sepiapterina. (Ver Tabla 9).
Resultados
148
4.6. Efecto farmacológico de la BH4
5mg/Kg/día vía intratraqueal, en la fibrosis
pulmonar inducida con bleomicina en rata
wistar a día 14.
Como consecuencia de los resultados obtenidos en los
estudios previos con respecto a la biodisponibilidad oral de
BH4 en ratón, se pretende mejorar la biodisponibilidad
pulmonar mediante la administración local del fármaco. Para
ello, tal como se explica en el apartado 3.7 de Materiales y
métodos, se puso a punto la técnica de administración
intratraqueal con MicroSprayer® en rata wistar.
Resultados
149
4.6.1. Evolución del peso corporal
Durante el seguimiento periódico del peso de las ratas
se obtuvo el perfil que se representa en la Figura 44.
La administración de BH4 por vía intratraqueal no
mejora la pérdida de peso producida por la bleomicina.
Figura 44. Evolución del peso corporal de las ratas desde la inducción de fibrosis con 7.5 UI/Kg de bleomicina en los tres grupos experimentales estudiados: control (color verde), fibrosis (color rojo), fibrosis con tratamiento de BH4 5 mg/Kg/día vía intratraqueal (color azul).
0 5 10 15150
200
250
300
350 SF i.t + vehículo i.t (n=9)
BL i.t + vehículo i.t (n=20)
BL i.t + BH4 5mg/Kg i.t (n=12)
Tiempo (días)
Pes
o (g
)
Resultados
150
4.6.2. Peso de pulmón, proteínas en pulmón e
índice de hipertrofia ventricular derecha.
Se pesaron los pulmones y ambos ventrículos del
corazón, a punto final, el día catorce del experimento. Se
calcularon las relaciones existentes entre peso pulmón/peso
animal y ventrículo derecho/ ventrículo izquierdo. La
administración de BH4 por vía intratraqueal no mejoró ninguno
de los cocientes caculados. Estos resultados discrepan de los
obtenidos por vía oral, donde se observaba una tendencia a la
disminución del peso pulmonar y sobre todo un efecto a nivel
vascular, ya que la hipertrofía ventricular derecha disminuyó
con la administración de BH4 por vía oral.
En cuanto al parámetro de proteínas totales en
parénquima pulmonar, se observa que la BH4 tiende a
disminuir el aumento de proteínas totales producido por la
bleomicina en el tejido, si bien no es capaz de revertirlo
significativamente.
Resultados
151
Figura 45. Representación gráfica del peso del pulmón de las ratas y del índice de hipertrofía ventricular derecha a los catorce días de la inducción de fibrosis pulmonar con 7.5 UI/Kg de bleomicina en los tres grupos experimentales estudiados: control (color verde), fibrosis (color rojo), fibrosis con tratamiento de BH4 5 mg/Kg/día vía intratraqueal (color azul). n, es el mínimo número de animales utilizados para el cálculo de la media y su SEM. #p<0,05 frente a control; ###p<0,001 frente a control.
0.000
0.005
0.010
0.015###
Peso pulmón
Pes
o pu
lmón
/Pes
o ra
ta
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
SF i.t + vehículo i.t (n=6)BL i.t + vehículo i.t (n=10)BL i.t + BH4 5mg/Kg i.t (n=7)
#
Índice de HVD
Pes
o V
D/ p
eso
VI
0
100
200
300
400
500
##
Proteínas en pulmón
Con
c. p
rote
ínas
(m
g/g)
Resultados
152
4.6.3. Células extravasadas en lavado
broncoalveolar.
Dada la importancia de la extravasación celular como
medida de la respuesta inflamatoria, se cuantificaron las células
totales y diferenciadas tal como se explica en el apartado 3.9
de Materiales y métodos.
Se observó un incremento significativo de células totales
en el grupo de bleomicina respecto al grupo control. El grupo
tratado con BH4 aumentó la extravasación celular en lavado
broncoalveolar respecto al grupo de bleomicina. A su vez, el
aumento de los cuatro tipos celulares en el grupo de bleomicina
no fue remitido al tratar el pulmón con BH4. Estos resultados
hacen pensar que la administración diaria intratraqueal de BH4
empeora la lesión pulmonar con más inflamación que la
administración única de bleomicina.
Resultados
153
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0SF i.t + vehículo i.t (n=6)BL i.t + Vehículo i.t (n=7)BL i.t + BH4 5mg/Kg i.t (n=7)
##C
élul
as to
tale
s (x
106 )
Neutrofilos Linfocitos Eosinófilos Macrófagos0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Tip
os c
elul
ares
(x1
06 )
A.
B.
Figura 46. Células totales (A) y contaje diferencial (B) en lavado broncoalveolar a los catorce días de la inducción de fibrosis pulmonar con 7.5 UI/Kg de bleomicina en los tres grupos experimentales estudiados: control (color verde), fibrosis (color rojo), fibrosis con tratamiento de BH4 5 mg/Kg/día vía intratraqueal (color azul). ##p<0,01 frente a control.
Resultados
154
4.6.4. Concentración de proteínas en lavado
broncoalveolar (LBA).
La determinación de proteínas totales en lavado
broncoalveolar se utilizó, al igual que en estudios anteriores
para medir la respuesta inflamatoria pulmonar a la bleomicina.
Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 47.
El aumento extremadamente significativo que se produjo en la
concentración de proteínas en LBA del grupo de bleomicina
respecto al grupo control, no fue revertido con el tratamiento
intratraqueal de BH4.
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4SF i.t + vehículo i.t (n=6)BL i.t + Vehículo i.t (n=7)BL i.t + BH4 5mg/Kg i.t (n=7)
###
Con
c. p
rote
inas
(mg/
ml)
Figura 47. Representación gráfica de la concentración de proteínas en LBA de rata a los catorce días de la inducción de fibrosis pulmonar con 7.5 UI/Kg de bleomicina en los tres grupos experimentales estudiados: control (color verde), fibrosis (color rojo), fibrosis con tratamiento de BH4 5 mg/Kg/día vía intratraqueal (color azul). ###p<0,001 frente a control.
Resultados
155
4.6.5. Expresión génica
���� Expresión génica de colágeno tipo I (Col1a1)
La expresión génica de colágeno tipo 1 se vió
aumentada de forma significativa en el grupo de
bleomicina (3,9 ± 0,6) respecto al grupo control (1,1 ±
0,2), al igual que ocurrió en los experimentos anteriores
con ratones.
La administración de BH4 disminuye la expresión
(2,1 ± 0,4) respecto al grupo de bleomicina de manera
no significativa.
0
1
2
3
4
5SF i.t + vehículo i.t (n=6)BL i.t + Vehículo i.t (n=7)
BL i.t + BH4 5mg/Kg i.t (n=7)
#
Exp
resi
ón r
elat
iva
del A
RN
m d
e C
OL1
A1
Figura 48. Cuantificación relativa de los niveles de ARNm de Col1a1 en tejido pulmonar tras catorce días de tratamiento desde la inducción de fibrosis con 7.5 UI/Kg de bleomicina en los tres grupos experimentales estudiados: control (color verde), fibrosis (color rojo), fibrosis con tratamiento de BH4 5 mg/Kg/día vía intratraqueal (color azul). #p<0,05 frente a control.
Resultados
156
���� Expresión génica del factor transformador del
crecimiento beta (Tgf- β)
La expresión génica de Tgf-β aumentó en el grupo
expuesto a bleomicina, y la administración local de BH4
5 mg/Kg/día durante catorce días revirtió este aumento
de forma significativa.
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0SF i.t + vehículo i.t (n=6)BL i.t + Vehículo i.t (n=7)BL i.t + BH4 5mg/Kg i.t (n=7)
#
*
Exp
resi
ón r
elat
iva
del A
RN
m d
e T
GF
-ββ ββ
Figura 49. Cuantificación relativa de los niveles de ARNm del gen Tgf-β en tejido pulmonar a los catorce días de la inducción de fibrosis en los tres grupos experimentales estudiados: control (color verde), fibrosis (color rojo), fibrosis con tratamiento de BH4 5 mg/Kg/día vía intratraqueal (color azul). #p<0,05 frente a control, *p<0,05 frente a bleomicina.
Resultados
157
���� Expresión génica del factor de crecimiento del
tejido conectivo (Ctgf).
El factor de crecimiento de tejido conectivo se vió
ligeramente aumentado tras la inducción de fibrosis con
bleomicina. Este aumento fue disminuido con el
tratamiento intratraqueal de BH4 5mg/Kg/día (Figura
50).
0
1
2
3SF i.t + vehículo i.t (n=6)BL i.t + vehículo i.t (n=7)BL i.t + BH4 5mg/Kg i.t (n=7)
Exp
resi
ón r
elat
iva
del A
RN
m d
e C
TG
F
Figura 50. Cuantificación relativa de los niveles de ARNm del gen Ctgf en tejido pulmonar tras catorce días de tratamiento con sepiapterina desde la inducción de fibrosis con bleomicina en los tres grupos experimentales estudiados: control (color verde), fibrosis (color rojo), fibrosis con tratamiento de BH4 5 mg/Kg/día vía intratraqueal (color azul). No se dió significación estadística.
Resultados
158
���� Expresión génica de la mucina 5AC (Muc5ac).
Se observó un aumento de la expresión de Muc5ac,
indicativo de hipersecreción mucosa en condiciones
patológicas, y la suplementación intratraqueal con
bleomicina no mejora la expresión respecto al grupo de
bleomicina.
0
2
4
6
8SF i.t + vehículo i.t (n=6)BL i.t + vehículo i.t (n=7)BL i.t + BH4 5mg/Kg i.t (n=7)
Exp
resi
ón r
elat
iva
del
AR
Nm
de
muc
5ac
#
Figura 51. Cuantificación relativa de los niveles de ARNm del gen Muc5ac en tejido pulmonar a los catorce días de la inducción de fibrosis en los tres grupos experimentales estudiados: control (color verde), fibrosis (color rojo), fibrosis con tratamiento de BH4 5 mg/Kg/día vía intratraqueal (color azul). #p<0,05 frente a control.
Resultados
159
���� Expresión génica del factor de necrosis tumoral
alfa (Tnf- α).
La expresión de Tnf-α se vio significativamente
aumentada en el grupo de bleomicina, pero la
administración de BH4 5 mg/Kg/día durante catorce días
no revirtió este aumento.
0
2
4
6SF i.t + vehículo i.t (n=6)BL i.t + vehículo i.t (n=7)
BL i.t + BH4 5mg/Kg i.t (n=7)#
Exp
resi
ón r
elat
iva
del
AR
Nm
de
TNF-
αα αα
Figura 52. Cuantificación relativa de los niveles de ARNm del gen Tnf en tejido pulmonar a los catorce días de la inducción de fibrosis en los tres grupos experimentales estudiados: control (color verde), fibrosis (color rojo), fibrosis con tratamiento de BH4 5 mg/Kg/día vía intratraqueal (color azul). #p<0,05 frente a control.
Resultados
160
���� Expresión génica de endotelina-1 (End1).
Los niveles de expresión de ARNm de End1
incrementan con respecto al grupo control.
La administración de BH4 5 mg/Kg/día por via
intratraqueal durante catorce días provocó un aumento
extremadamente significativo con respecto al grupo de
bleomicina. Lo que indica que la expresión de End1
aumentó en respuesta a la administración de BH4.
0
5
10
15SF i.t + vehículo i.t (n=6)BL i.t + vehículo i.t (n=7)
BL i.t + BH4 5mg/Kg i.t (n=7)
***
#
Exp
resi
ón r
elat
iva
del
AR
Nm
de
endo
telin
a-1
Figura 53. Cuantificación relativa de los niveles de ARNm del gen End1 en tejido pulmonar tras catorce días desde la inducción de fibrosis con bleomicina en los tres grupos experimentales estudiados: control (color verde), fibrosis (color rojo), fibrosis con tratamiento de BH4 5 mg/Kg/día vía intratraqueal (color azul). #p<0,05 frente a control. ***p<0,001 frente a bleomicina.
Resultados
161
���� Expresión génica de guanosina trifosfato
ciclohidrolasa I (Gch1).
No se observaron cambios significativos en los
niveles de expresión del ARNm del gen Gch1 tras la
administración de bleomicina. Se observó una ligera
disminución de la expresión tras la administración BH4
intratraqueal.
0.0
0.5
1.0
1.5SF i.t + vehículo i.t (n=6)BL i.t + vehículo i.t (n=7)
BL i.t + BH4 5mg/Kg i.t (n=7)
Exp
resi
ón r
elat
iva
del
AR
Nm
de
GT
PC
H-I
Figura 54. Cuantificación relativa de los niveles de ARNm del gen Gch1 en tejido pulmonar a los catorce días desde la inducción de fibrosis con bleomicina en los tres grupos experimentales estudiados: control (color verde), fibrosis (color rojo), fibrosis con tratamiento de BH4 5 mg/Kg/día vía intratraqueal (color azul).
Resultados
162
4.6.6. Determinación de los niveles de BH4.
Se determinaron los niveles plasmáticos, pulmonares y
hepáticos de BH4 tal y como se describe en el apartado 3.11
de materiales y métodos mediante cromatografía líquida.
Coincidiendo con los resultados obtenidos para la rata
en el primer estudio, las concentraciones plasmáticas y
hepáticas diminuyen en presencia de bleomicina respecto al
grupo control, mientras que en el tejido pulmonar la
concentración de BH4 aumentó en el grupo de bleomicina con
respecto al grupo control.
La administración de BH4 intrapulmonar demostró una
clara absorción sistémica del fármaco, ya que sus niveles
plasmáticos incrementaron tras catorce días de tratamiento.
Esto ocurrió tanto en el grupo expuesto a bleomicina como en
el grupo que fue tratado únicamente con el medicamento
(Figura 56 A).
A nivel hepático y pulmonar, el fármaco no fue capaz de
restablecer los niveles del grupo control (Figura 56 B y C).
Resultados
163
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4SF i.t + vehículo i.t (n=6)BL i.t + Vehículo i.t (n=7)BL i.t + BH4 5mg/Kg i.t (n=7)
Con
c. p
ulm
ón B
H4
(µµ µµg
/g)
Figura 55. Niveles de BH4 en plasma (A), pulmón (B) e hígado (C) tras catorce días de la inducción de fibrosis en los cuatro grupos experimentales estudiados: control (color verde), fibrosis (color rojo), fibrosis con tratamiento de BH4 5 mg/Kg/día vía intratraqueal (color azul), control fármaco (azul claro). #p<0,05 frente a control; ***p<0,001 frente a bleomicina.
0
50
100
150
******
#
Con
cent
raci
ones
pla
smát
icas
de
BH
4 (n
g/m
l)
A.
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
Con
cent
raci
ones
de
BH
4 e
n pu
lmón
(µµ µµg
/g)
B.
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Con
cent
raci
ón d
e B
H4
en h
ígad
o (
µµ µµg/g
)
C.
SF i.t + vehículo i.t (n=6)
BL i.t + vehículo i.t (n=7)
SF i.t + BH4 i.t 5 mg/Kg (n=6)
BL i.t + BH4 i.t 5 mg/Kg (n=7)
Resultados
164
4.7. Efecto farmacológico del roflumilast 1
mg/Kg/día vía oral en la fibrosis pulmonar
inducida con bleomicina.
El roflumilast se ensayó a la dosis de 1 mg/Kg/día por vía
oral, en el protocolo preventivo durante catorce días.
Al igual que en el estudio farmacológico de la BH4 por vía
intratraqueal, y tal como se describe en el apartado de
Materiales y métodos se utilizó la especie de rata para este
estudio. Estos mismos resultados se confirmaron en la especie
de ratón
Resultados
165
4.7.1. Evolución del peso corporal
El grupo de bleomicina sufre un descenso en el peso
corporal a punto final del 35%, lo que demuestra una
importante pérdida de la calidad de vida en los animales con
afectación pulmonar. El tratamiento con roflumilast 1 mg/Kg/día
mejora en un 50% el peso de los animales fibróticos a punto
final.
0 2 4 7 11 14150
200
250
300
350SF i.t + vehículo v.o (n=10)
BL i.t + RF 1 mg/Kg v.o (n=10)BL i.t + vehículo v.o (n=10)
Tiempo (días)
Pes
o ra
ta (
g)
Figura 56. Evolución del peso corporal de las ratas desde la inducción de fibrosis con 7.5 UI/Kg de bleomicina en los tres grupos experimentales estudiados: control (color verde), fibrosis (color rojo), fibrosis con tratamiento de roflumilast 1 mg/Kg/día vía oral (color amarillo).
Resultados
166
4.7.2. Peso del pulmón, proteínas en pulmón e
índice de hipertrofia ventricular derecha.
En concordancia con los estudios anteriores, el grupo
expuesto a bleomicina presentó un aumento de estos tres
parámetros, a consecuencia de la inflamación y la hipoxia a la
que se ven sometidos los pulmones, con respecto al grupo
control.
La administración de roflumilast 1 mg/Kg/día por vía
oral, presentó una tendencia a mejorar el perfil de la bleomicina
en los tres parámetros estudiados (Figura 57).
Así, el peso pulmonar, aumentado debido a la
inflamación y al engrosamiento de las paredes alveolares que
se produce en la fibrosis, disminuyó significativamente con la
administración de roflumilast oral 1 mg/Kg/día.
En cuanto a las proteínas totales en pulmón seco
incrementan como respuesta a la bleomicina y revierten
parcialmente tras la administración de roflumilast 1 mg/Kg/día,
aunque sin significación estadística.
Un mayor índice de hipertrofia ventricular debido a la
hipoxia que sufren los ratones con afectación pulmonar se
observó en el grupo de bleomicina. El tratamiento oral con
roflumilast 1 mg/Kg/día mejoró ligeramente la hipertrofia
ventricular derecha.
Resultados
167
Figura 57 . Peso del pulmón, proteínas totales en pulmón e índice de hipertrofía ventricular derecha a los catorce días de la inducción de fibrosis pulmonar con 7.5 UI/Kg de bleomicina en los tres grupos experimentales estudiados: control (color verde), fibrosis (color rojo), fibrosis con tratamiento de roflumilast 1 mg/Kg/día vía oral (color amarillo). n, es el mínimo número de animales utilizados para el cálculo de la media y su SEM. #p<0,05 frente a control; ###p<0,001 frente a control; *p<0,05 frente a bleomicna.
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
###
*
Pes
o pu
lmón
/pes
o ra
ta
0
100
200
300
400
500
##
Con
cent
raci
ón d
e pr
oteí
nas
tota
les
en p
ulm
ón (
mg/
g)
0.2
0.3
0.4
VD
/(VI+
sept
o) #
SF i.t + vehículo v.o (n=10)BL i.t + vehículo v.o (n=10)BL i.t + RF 1 mg/Kg v.o (n=10)
Peso pulmón
Proteinas en pulmón
Hipertrofiaventricular derecha
Resultados
168
4.7.3. Células extravasadas en lavado
broncoalveolar (LBA).
El roflumilast disminuye de forma significativa el
aumento en el número de células totales extravasadas en
pulmón producido por la bleomicina. Concretamente, se
observa una disminución en los cuatro tipos celulares:
neutrófilos, linfocitos, eosinófilos y macrófagos.
0.0
0.5
1.0
1.5
###
SF i.t + vehículo v.o (n=10)
BL i.t + vehículo v.o (n=10)
BL i.t + RF 1 mg/Kg v.o (n=10)
*
Tot
al c
ells
(x1
06 )
Neutrofilos Linfocitos Eosinófilos Macrófagos0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
nº c
elul
as x
106 (
valo
r ab
solu
to)
A.
B.
Figura 58. Células totales (A) y contaje diferencial (B) de células extravasadas en lavado broncoalveolar a los catorce días de la inducción de fibrosis pulmonar con 7.5 UI/Kg de bleomicina en los tres grupos experimentales estudiados: control (color verde), fibrosis (color rojo), fibrosis con tratamiento de roflumilast 1 mg/Kg/día vía oral (color amarillo). ###p<0,01 frente a control; *p<0,05 frente a bleomicina.
Resultados
169
4.7.4. Concentración de proteínas en lavado
broncoalveolar (LBA).
Las proteínas totales medidas en el lavado
broncoalveolar libre de células, tal como se expone en el
capítulo de Materiales y métodos, apartado 3.9, aumentaron de
manera muy significativa tras la exposición a bleomicina;
mientras que el tratamiento oral con roflumilast revirtió
parcialmente, pero de forma significativa, este aumento.
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4SF i.t + vehículo v.o (n=10)BL i.t + vehículo v.o (n=10)BL i.t + RF 1 mg/Kg v.o (n=10)
###
*
Con
cent
raci
ón d
e pr
otei
nas
en L
BA
(m
g/m
l)
Figura 59. Concentración de proteínas en LBA de rata a los catorce días de la inducción de fibrosis pulmonar con 7.5 UI/Kg de bleomicina en los tres grupos experimentales estudiados: control (color verde), fibrosis (color rojo), fibrosis con tratamiento de roflumilast 1 mg/Kg/día vía oral (color amarillo). ###p<0,001 frente a control; *p<0,05 frente a bleomicina.
Resultados
170
4.7.5. Expresión génica
���� Expresión génica de colágeno tipo I (Col1a1).
La expresión de colágeno tipo 1 incrementa debido
a la bleomicina casi en cuatro veces la del control. El
tratamiento con roflumilast via oral 1 mg/Kg/día atenuó
de forma significativa este incremento.
0
1
2
3
4
5
###
*
SF i.t + vehículo v.o (n=10)BL i.t + vehículo v.o (n=10)BL i.t + RF 1 mg/Kg v.o (n=10)
Exp
resi
ón r
elat
iva
del A
RN
m d
e C
OL1
A1
Figura 60. Cuantificación relativa de los niveles de ARNm de Col1a1 en tejido pulmonar a los catorce días desde la inducción de fibrosis con bleomicina en los tres grupos experimentales estudiados: control (color verde), fibrosis (color rojo), fibrosis con tratamiento de roflumilast 1 mg/Kg/día vía oral (color amarillo). ###p<0,001 frente a control; *p<0,05 frente a bleomicina.
Resultados
171
���� Expresión génica del factor transformador del
crecimiento beta (Tgf- β).
Se observó un aumento de ARNm de Tgf-β
extremadamente significativo para el grupo de
bleomicina. La administración de roflumilast oral 1
mg/kg/día redujo este aumento de forma significativa
(Figura 61).
0
2
4
6
8###
*
SF i.t + vehículo v.o (n=10)BL i.t + vehículo v.o (n=10)BL i.t + RF 1 mg/Kg v.o (n=10)
Exp
resi
ón r
elat
iva
de
AR
Nm
del
TG
F-
ββ ββ
Figura 61. Cuantificación relativa de los niveles de ARNm de Tgf-β en tejido pulmonar a los catorce días desde la inducción de fibrosis con bleomicina en los tres grupos experimentales estudiados: control (color verde), fibrosis (color rojo), fibrosis con tratamiento de roflumilast 1 mg/Kg/día vía oral (color amarillo). ###p<0,001 frente a control; *p<0,05 frente a bleomicina.
Resultados
172
���� Expresión génica del factor de crecimiento del
tejido conectivo (Ctgf).
La expresión de Ctgf, como reflejo del efecto que
produce el TGF- β, aumentó muy significativamente en
presencia de bleomicina. Además, el tratamiento con
roflumilast 1 mg/Kg/día, en este caso también atenuó
este incremento.
0
2
4
6
###
*
Exp
resi
ón r
elat
iva
del
AR
Nm
de
CT
GF
SF i.t + vehículo v.o (n=10)BL i.t + vehículo v.o (n=10)BL i.t + RF 1 mg/Kg v.o (n=10)
Figura 62. Cuantificación relativa de los niveles de ARNm de Ctgf en tejido pulmonar a los catorce días desde la inducción de fibrosis con bleomicina en los tres grupos experimentales estudiados: control (color verde), fibrosis (color rojo), fibrosis con tratamiento de roflumilast 1 mg/Kg/día vía oral (color amarillo). ###p<0,001 frente a control; *p<0,05 frente a bleomicina.
Resultados
173
���� Expresión génica del factor de necrosis tumoral
alfa (Tnf).
La expresión de Tnf se vió significativamente
aumentada en el grupo expuesto a bleomicina, y la
administración de roflumilast 1 mg/Kg/día via oral remitió
este aumento de forma significativa.
0
1
2
3
4
5SF i.t + vehículo v.o (n=10)BL i.t + vehículo v.o (n=10)BL i.t + RF 1 mg/Kg v.o (n=10)
*
#
Exp
resi
ón r
elat
iva
de
AR
Nm
del
TN
F-
αα αα
Figura 63. Cuantificación relativa de los niveles de ARNm de Tnf-α en tejido pulmonar a los catorce días desde la inducción de fibrosis con bleomicina en los tres grupos experimentales estudiados: control (color verde), fibrosis (color rojo), fibrosis con tratamiento de roflumilast 1 mg/Kg/día vía oral (color amarillo). #p<0,05 frente a control; *p<0,05 frente a bleomicina.
Resultados
174
���� Expresión génica de la mucina 5AC (Muc5ac).
Se observó un aumento muy significativo de la
expresión de Muc5ac en el grupo de bleomicina. La
administración de roflumilast 1 mg/Kg/día atenuó este
aumento significativamente.
0
1
2
3
4
5
###
*
SF i.t + vehículo v.o (n=10)BL i.t + vehículo v.o (n=10)BL i.t + RF 1 mg/Kg v.o (n=10)
Exp
resi
ón r
elat
iva
del
AR
Nm
de
Muc
5ac
Figura 64. Cuantificación relativa de los niveles de ARNm de Muc5ac en tejido pulmonar a los catorce días desde la inducción de fibrosis con bleomicina en los tres grupos experimentales estudiados: control (color verde), fibrosis (color rojo), fibrosis con tratamiento de roflumilast 1 mg/Kg/día vía oral (color amarillo). ###p<0,001 frente a control; *p<0,05 frente a bleomicina.
Resultados
175
���� Expresión génica de endotelina-1 (End1).
La lesión pulmonar producida por la bleomicina
aumentó de forma significativa la expresión de End1. La
administración de roflumilast 1 mg/Kg/día durante
catorce días revirtió por completo este aumento.
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5SF i.t + vehículo v.o (n=10)BL i.t + vehículo v.o (n=10)BL i.t + RF 1 mg/Kg v.o (n=10)
*
#
Exp
resi
ón r
elat
iva
del
AR
Nm
de
endo
telin
a-1
Figura 65. Cuantificación relativa de los niveles de ARNm de End1 en tejido pulmonar a los catorce días desde la inducción de fibrosis con bleomicina en los tres grupos experimentales estudiados: control (color verde), fibrosis (color rojo), fibrosis con tratamiento de roflumilast 1 mg/Kg/día vía oral (color amarillo). #p<0,05 frente a control; *p<0,05 frente a bleomicina.
Resultados
176
���� Expresión génica de guanosina trifosfato
ciclohidrolasa I (Gch1).
No se observó cambio en la expresión del ARNm
del enzima encargado de la síntesis de BH4 en el grupo
de bleomicina respecto al grupo control.
La administración de roflumilast 1 mg/Kg/día
produjo una disminución no significativa de la expresión
con respecto a los grupos control y bleomicina.
0.0
0.5
1.0
1.5SF i.t + vehículo v.o (n=10)BL i.t + vehículo v.o (n=10)BL i.t + RF 1 mg/Kg v.o (n=10)
Exp
resi
ón r
elat
iva
del
AR
Nm
de
GT
PC
H-I
Figura 66. Cuantificación relativa de los niveles de ARNm de Gch1 en tejido pulmonar a los catorce días desde la inducción de fibrosis con bleomicina en los tres grupos experimentales estudiados: control (color verde), fibrosis (color rojo), fibrosis con tratamiento de roflumilast 1 mg/Kg/día vía oral (color amarillo). No se dió significación estadística.
Resultados
177
4.7.6. Determinación de los niveles de BH4.
Se pretendió investigar si uno de los mecanismos de
acción antifibrótica del roflumilast se encuentraba a nivel de la
regulación sistémica y endotelial de la tetrahidrobiopterina.
Como hemos visto en todos los estudios anteriores y
más detalladamente en el primero, los niveles de BH4
plasmáticos se detectaron disminuidos en los individuos
afectados de fibrosis pulmonar. Mientras que los niveles
pulmonares se suelen encontrar elevados.
Se midieron los niveles de BH4 en plasma, pulmón e
hígado.
Tal como nos muestra la Figura 67, se cumplió la
relación inversa en cuanto a niveles de BH4 entre plasma y
pulmón. Aunque, como se ha visto anteriormente, en la especie
de rata, los niveles de expresión génica entre control y
bleomicina no presentaron diferencias estadísticas.
Resultados
178
0
20
40
60
80
Con
cent
raci
ón p
lasm
átic
asde
BH
4 (n
g/m
l)
0.0
0.1
0.2
0.3
Con
cent
raci
ón d
e B
H4
en
pulm
ón (
ug/g
)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Con
cent
raci
ón d
e B
H4
en h
ígad
o (
µµ µµg/g
)
SF i.t + vehículo v.o (n=10)BL i.t + vehículo v.o (n=10)BL i.t + RF 1 mg/Kg v.o (n=10)
A.
B.
C.
Figura 67. Niveles de BH4 en plasma (A), pulmón (B) e hígado (C) tras catorce días de la inducción de fibrosis en los cuatro grupos experimentales estudiados: control (color verde), fibrosis (color rojo), fibrosis con tratamiento de roflumilast 1 mg/Kg/día vía oral (color amarillo), control fármaco (azul claro). No se dió significación estadística.
Resultados
179
4.8. Tabla resumen resultados
≅≅≅≅≅≅≅≅ ≅≅≅≅
≅≅≅≅ ≅≅≅≅≅≅≅≅ ≅≅≅≅
Col1a1 ≅≅≅≅Tgf-β
Ctgf
Tnf-α ≅≅≅≅Muc5ac ≅≅≅≅
End-1
Gch1 ≅≅≅≅ ≅≅≅≅Plasma
Pulmón
Hígado
Niv
ele
s d
e B
H4
Peso corporal
Peso pulmón
Proteínas totales
pulmón
Hipertrofia ventricular
derecha
Células totales LBA
=
=
=
=
=
=
=
Bleomicina
7 ó 14
TABLA R
ESUM
EN
RESULT
ADOS
Días desde bleomicina
Proteínas totales LBA
Exp
resi
ón
gé
nic
a
14
Ratones C57Bl/6J Rata Wistar
BH4 v.o
20 mg/Kg/día
Vs
Bleomicina
Vs
Bleomicina
Sepiapterina v.o
7 14 7 14 14
10 mg/Kg/día
BH4 i.t
5 mg/Kg/día
Vs
Bleomicina
Vs
Bleomicina
RF v.o
1 mg/Kg/día
=
=
=
=
=
=
=
=
=
=
=
=
=
=
=
=
=
=
=
= =
=
=
=
Tabla 10. Resumen de los resultados expuestos anter iormente. Abreviaturas: RF, roflumilast; LBA lavado broncoalveolar. En color azul, resultados nuevos de esta
memoria; en color morado, resultados ya descritos anteriormente.
5. DISCUSIÓN
Discusión
182
El objetivo de la presente Memoria es estudiar la
implicación de la tetrahidrobiopterina en la fibrosis pulmonar.
Para ello se diseñó el estudio en varias etapas. En la primera,
se investigó cómo se modifican los niveles de BH4 en
condiciones patológicas, en tres especies distintas: ratón, rata y
humanos. Se estudió un grupo control y un grupo afectado de
fibrosis pulmonar de cada especie.
La cepa de ratón empleada fue la C57BL/6J por su
validez en trabajos previos, ya que su genoma está bien
caracterizado, posee un ciclo de reproducción corto, es de
tamaño pequeño, fácil manipulación y menor coste. En rata se
eligió la cepa wistar, también muy utilizada en este y otros tipos
de estudios científicos. El ensayo en humanos, es poco
invasivo y sencillo para el paciente.
Para rata y ratón se escogió el modelo experimental de
fibrosis pulmonar inducido por bleomicina, ampliamente
utilizado por la comunidad científica a las dosis establecidas de
7.5 y 3.75 UI.Kg-1. Este modelo se caracteriza por presentar
una fase inflamatoria desde el día de la administración de
bleomicina intratraqueal hasta el día 7, y una fase de fibrosis
pulmonar que comprende desde el día 7 al día 21. El día 14 es
el más útil para valorar la fibrosis, ya que presenta gran fibrosis,
menor variabilidad en la respuesta fibrótica y menor mortalidad
que a día 21.
Los niveles plasmáticos y tisulares obtenidos en los
grupos control para cada especie (Tabla 7), coinciden con los
Discusión
183
obtenidos en otros trabajos publicados114,121,122, siendo
alrededor de 60, 30 y 3 ng/ml en plasma para las especies de
ratón, rata y humanos respectivamente; alrededor de 0,2 µg/g
en pulmón de rata y ratón, y 0,8 µg/g en hígado de rata y ratón.
En la primera especie ensayada, ratón C57Bl/6J, se
planteó estudiar la evolución de los niveles de BH4 en plasma,
pulmón e hígado en función del tiempo, durante el proceso de
fibrosis pulmonar inducida con bleomicina. Teniendo en cuenta
que la fase aguda e inflamatoria del proceso se estima hasta el
día 7 y que la fase fibrótica se da en la segunda y tercera
semana77, se midieron los niveles a día 7, 14 y 21 desde la
inducción de fibrosis.
Se observó que la fase aguda del proceso coincide con
niveles sistémicos de BH4 muy disminuidos, lo que podrían
indicar que existe inflamación crónica, que induce la producción
de especies reactivas de oxígeno (ERO) y de especies
reactivas de nitrogéno (RNS), que deberán neutralizarse por los
mecanismos de defensa antioxidantes, y si estos no son
suficientemente efectivos, se genera una situación de estrés
oxidativo97, con depleción de componentes celulares123 y de
antioxidantes plasmáticos, entre ellos, la BH4. Existen varios
estudios realizados en otras enfermedades crónicas que
registran una correlación positiva entre disminución plásmatica
de BH4 y funcionalidad reducida124-126.
Por lo mismo, el estrés oxidativo convierte a la BH4,
cofactor esencial de la eNOS, en su forma oxidada 7,8-
Discusión
184
dihidrobiopterina en el endotelio. La deficiencia de BH4
resultante causa un desacoplamiento de la eNOS,
produciéndose disfunción endotelial, frecuente en muchas
enfermedades cardiovasculares y particularmente en la
hipertensión pulmonar que contribuye a la fibrosis pulmonar127.
Incluso se ha propuesto recientemente la BH4 plasmática,
concretamente la relación BH4/BH2, como marcador de
disfunción endotelial124 y como nueva diana terapéutica para su
tratamiento128.
En la línea de la búsqueda de un biomarcador de fibrosis
pulmonar, y continuando con el primer estudio, se empleo la
rata wistar. Los resultados muestran una tendencia similar a los
obtenidos en ratón.
También se realizó un estudio preliminar en pacientes
afectados de fibrosis pulmonar idiopática, en el que a pesar de
que sólo participaron 14 pacientes, se reprodujeron los
resultados del estudio con ratones. Presentaron
concentraciones plasmáticas disminuidas con respecto al grupo
de 6 voluntarios sanos. Como limitación de este estudio, cabe
indicar que 3 de los pacientes reclutados toman medicación
para la fibrosis que podría modificar la función endotelial y el
estrés oxidativo.
En el tejido pulmonar la BH4 se comporta de manera
inversa. Los animales que fueron expuestos a bleomicina
presentan niveles elevados con respecto al grupo control.
Discusión
185
Estos niveles también se encuentran ligeramente más elevados
en la fase aguda del proceso que en la crónica o fibrótica.
Todo pulmón, como defensa al estrés oxidativo genera
moléculas antioxidantes; éstas, al igual que los mecanismos
oxidantes, varían en función de la enfermedad intersticial97. La
BH4 podría ser una de estas moléculas en la fibrosis inducida
por bleomicina en ratón. Su abundancia, debido a la extensa
superfice de endotelio capilar pulmonar y a la formación de
nuevos vasos como respuesta a la hipoxia generada por la
lesión pulmonar, podría explicar que no se produzca depleción
como ocurre en el plasma.
Estudios preclínicos han demostrado que la
suplementación farmacológica o genética con BH4 previene la
generación de anión superóxido y la disfunción endotelial en
modelos experimentales de enfermedades cardiovasculares103.
Además se ha observado que el tratamiento con BH4 tiene
efecto beneficioso en la disfunción endotelial en humanos;
mejora la relajación de los vasos sanguíneos en pacientes con
enfermedad arterial coronaria, diabetes tipo II, fumadores y
aterosclerosis100,129-131.
Actualmente se están realizando veintidós ensayos
clínicos en todo el mundo para testar su eficacia y seguridad en
diversas enfermedades45. No existen publicaciones que
relacionen directamente las enfermedades intersticiales con la
tetrahidrobiopterina, pero sí existen estudios que demuestran
efecto farmacológico de BH4 en aterosclerosis132, fibrosis e
Discusión
186
hipertrofia cardíaca115, vasoconstricción pulmonar hipóxica133, y
con la hipertensión pulmonar128,133,134, frecuente esta última en
FPI.
Tras los resultados obtenidos se planteó la administración
de BH4 como tratamiento farmacológico para la fibrosis
pulmonar, proponiéndose el estrés oxidativo y el endotelio
capilar pulmonar como dianas terapéuticas. Con la
administración de BH4 se estudiaron los parámetros más
frecuentes del proceso fibrótico, tanto en la fase inflamatoria
como en la fibrótica.
Se emplearon dosis de 20 mg/Kg/día, ya que se ha visto
en algunos estudios que la dosis efectiva se encuentra entre 5-
20 mg/Kg/día. Dosis superiores, concretamente 50 mg/Kg/día,
conllevan una pérdida de peso como reacción adversa132.
La BH4 20 mg/Kg/día por vía oral, mejoró el peso de los
animales en un 25% respecto al grupo de bleomicina a punto
final, día 14. En el estadio inflamatorio no mostró mejoría frente
al aumento del peso pulmonar, ni frente al aumento de las
proteínas totales en pulmón. En cambio, a nivel molecular
regula a la baja la sobreexpresión producida por la bleomicina
de los genes implicados en el proceso fibrótico, como son, el
colágeno tipo 1 (Col1a1), la mucina (Muc5ac), el factor
transformador del crecimiento (Tgf-β1) y el factor de
crecimiento de tejido conectivo (Ctgf). La administración de
BH4 también disminuye el aumento de endotelina-1 (End1),
seguramente vía oxido nítrico sintasa a nivel endotelial, con
Discusión
187
predominio de los receptores de ET-B y disminución de los
receptores de ET-A. En cambio, la suplementación con BH4 no
disminuyó la expresión del enzima de su síntesis, la guanosina
trifosfato ciclohidrolasa I (Gch1).
Al administrar BH4, los ratones expuestos a bleomicina,
que tal como se ha descrito en el primer estudio ofrecían una
disminución aguda de los niveles de BH4 plasmáticos,
recuperaron los niveles por completo. Por otro lado, el aumento
de los niveles de BH4 a nivel pulmonar y la disminución a nivel
hepático no fueron revertidos al administrar BH4 durante siete
días.
El estadío fibrótico se caracterizó por un aumento de la
hipertrofia ventricular derecha, que se compensó con la
suplementación de BH4. Ahora sí, tras catorce días de
tratamiento, la BH4 contrarresta el aumento del peso del
pulmón inducido por la bleomicina. Las proteínas pulmonares
no se ven afectadas en este estadio de la enfermedad. El
aumento en la expresión de colágeno tipo 1, Muc5ac, End1,
Ctgf y Tgf-β1 producido por la bleomicina fue disminuido con la
suplementación con BH4 de forma significativa. La expresión
de Gch1 se mantiene elevada aún con la suplementación de
BH4. En otro estudio también se observó una reducción
significativa en los niveles de colágeno tipo 4, tras 12 semanas
de tratamiento con BH4 en ratones ApoE-KO (con
aterosclerosis)132.
Discusión
188
La administración de BH4 durante catorce días recuperó
la bajada de los niveles plasmáticos de BH4 que se produce en
los ratones expuestos a bleomicina; mientras que en el pulmón
se mantuvieron como en la bleomicina. En hígado, los niveles
de BH4 siguen el mismo perfil que en plasma para el grupo de
bleomicina, mientras que la administración de BH4 no recupera
los niveles basales.
Además de la BH4, también se probó su precursor
endógeno, la sepiapterina, ya que algunos estudios le
adjudican un mejor alcance tisular109.
La sepiapterina consiguió un aumento de peso del 30%
con respecto al grupo de bleomicina, siendo un 5% más
efectiva que la BH4. En la fase inflamatoria revirtió
parcialmente el aumento del peso de los pulmones instilados
con bleomicina, pero no revirtió el aumento de proteínas totales
acumuladas en pulmón como consecuencia del proceso
inflamatorio. La sepiapterina disminuyó el aumento de la
expresión de Col1a1, Muc5ac, End1, Ctgf y Tgf-β1; mientras, la
expresión de Gch1 no se revierte con la administración de
sepiapterina, al igual que ocurría con BH4.
La disminución de los niveles plasmáticos de BH4 no se
recupera significativamente con la administración de
sepiapterina a diferencia de lo que ocurría cuando se
administraba BH4; la misma situación pero a la inversa ocurre
en el pulmón. En hígado sí se recupera la ligera disminución de
Discusión
189
los niveles de BH4 que sufren los animales tras siete días de la
inducción de bleomicina.
En el estado crónico, tras 14 dias de tratamiento con
sepiapterina se revierte la sobreexpresión de col1a1, Tgf-β,
Ctgf, Muc5ac y End1, mientras que no es efectiva para reducir
la expresión de Gch1.
Después del tratamiento con sepiapterina durante catorce
días no se alcanzan las concentraciones plasmáticas del grupo
control, tampoco se consigue atenuar el aumento de la
concentración en pulmón causada por la bleomicina. En hígado
la sepiapterina no alcanza a modificar los niveles ligeramente
disminuidos debido a la bleomicina.
Tras los resultados poco significativos que se obtuvieron
con la administración de sepiapterina vía oral, y para sacar
conclusiones del efecto farmacológico de la sepiapterina en la
fibrosis pulmonar, se comprobó el perfil farmacocinético y la
correcta biotransformación en BH4.
Tras una dosis única de 10 mg/Kg de sepiapterina por vía
oral, se alcanzó una concentración plasmática máxima (C max)
de BH4 de 228,4 ng/ml a las 2h (T max) de la administración.
En tejido pulmonar la C max fue de 0,22 µg/g a la hora desde la
administración, similar a la del grupo control. Estos resultados
reflejan la baja biodisponibilidad pulmonar que se obtiene con
la administración de sepiapterina 10 mg/Kg por vía oral.
Discusión
190
Con todos estos resultados se llegó a la conclusión de
que la administración oral de BH4 beneficiaba más que su
precursor el conjunto de alteraciones producidas en la fibrosis
pulmonar, notándose más la diferencia a día 14.
La administración de medicamentos por vía intrapulmonar
ha sido propuesta por varios autores como una novedosa vía
para la absorción sistémica de fármacos135. La BH4 presenta
características físico-quimícas adecuadas para esta vía de
administración. Así, se seleccionó la via de administración
intrapulmonar para llevar a cabo el estudio del efecto
farmacológico de BH4 a la dosis de 5 mg/Kg/día.
Este estudio generó resultados poco prometedores a
nivel macroscópico y de inflamación, mientras que a nivel
molecular disminuía claramente la expresión génica de Tgf-β y
ligeramente la de colágeno, Ctgf y Gch1. La administración
intratraqueal aumentó significativamente los niveles
plasmáticos de BH4, demostrando que la BH4 por via
intrapulmonar presenta absorción sistémica.
Esto podría explicarse si existe una elevada
vasodilatación por el aumento de NO en exceso, o bien un
proceso angiogénico, que hace que la End1 suba de manera
desproporcionada, incluso por encima del control, para
contrarestarlo, ya que se ha descrito su efecto como regulador
del flujo vascular a nivel local. Champion HC et al., en 1999,
demostraron que los ratones expuestos a bleomicina presentan
Discusión
191
la presión arterial pulmonar elevada y resistencia vascular
pulmonar, y que se ve atenuado al administrar eNOS136.
Finalmente se empleó roflumilast, un inhibidor selectivo
de la fosfodiesterasa 4 (iPD4) en desarrollo para la enfermedad
pulmonar obstructiva crónica, y cuyos resultados en
farmacología preclínica han sido publicados recientemente137.
El roflumilast ha demostrado eficacia al disminuir la inflamación
pulmonar inducida por tabaco, el mal funcionamiento
mucociliar, el estrés oxidativo, el remodelado vascular
pulmonar, la hipertensión pulmonar, el remodelado
enfisematoso y, por último, tal como se expone en el apartado
de resultados, la fibrosis pulmonar inducida por bleomicina que
nos ocupa112,137.
El roflumilast, en un estudio pendiente de publicar por
nuestro grupo de investigación, durante el protocolo preventivo
de la fibrosis inducida por bleomicina en ratón; demostró que
los ratones expuestos a bleomicina presentaron una
disminución de los niveles sistémicos de BH4, y estos se
revertían tras tratamiento farmacológico con roflumilast, de
manera dosis dependiente.
Durante el estudio farmacológico de roflumilast 1
mg/Kg/día durante catorce días los animales mejoraron su
calidad de vida, medida como aumento del peso corporal, en
un 50 % respecto al grupo de bleomicina. El aumento del peso
del pulmón por la bleomicina fue revertido significativamente
Discusión
192
por el roflumilast, y la hipertrofia ventricular generada fue
ligeramente atenuada.
El roflumilast por via oral revertió la inflamación de forma
significativa, disminuyendo las células totales y diferenciadas
extravasadas, y el aumento de proteínas totales en LBA.
En lo referente a genes implicados en el proceso
inflamatorio y fibrótico, el roflumilast revierte la sobreexpresión
de todos ellos generada por la bleomicina, coincidiendo con los
trabajos publicados hasta el momento112,137. El enzima
encargado de la síntesis de BH4 no se vió afectado en el grupo
de bleomicina respecto al control, y la administración de
roflumilast tiende a disminuir ligeramente esta expresión basal.
Respecto a las concentraciones de BH4 en plasma, se
observó una disminución de la concentración en el grupo de
bleomicina pero no se encontraron diferencias significativas con
respecto al control como ocurre en las especies de ratón y
humana. Aún así, el roflumilast demuestra su eficacia
aumentando las concentraciones plasmáticas por encima de
las basales, y disminuyendo las concentraciones pulmonares
que se encuentran elevadas en el grupo expuesto a
bleomicina.
6. CONCLUSIONES
Conclusiones
194
En resumen, para el estudio de la tetrahidrobiopterina
(BH4) en la fibrosis pulmonar, en primer lugar, se estandarizó el
modelo animal de fibrosis pulmonar inducida por bleomicina en
las dos especies animales ensayadas y se puso a punto la
técnica para el análisis de BH4 en muestras biológicas. En
segundo lugar, se realizó un estudio comparativo de los niveles
fisiólogicos y patológicos de BH4, en rata, en ratón y en
humano. Finalmente, tras el ajuste previo de la dosis para cada
vía de administración se realizó el estudio farmacológico de la
BH4 vía oral y via intratraqueal, de su precursor, la
sepiapterina, via oral, y por último del roflumilast via oral.
Con todo ello, en un modelo de fibrosis pulmonar
inducida por la administración intratraqueal de bleomicina en
animales de experimentación, se puede concluir que:
1. La BH4 es un posible biomarcador plasmático de
fibrosis pulmonar, ya que se encuentra disminuido en
animales afectados de fibrosis por bleomicina, e incluso
en humanos con fibrosis pulmonar idiopática.
2. La administración exógena de 20 mg/Kg/día de BH4
revierte las concentraciones plasmáticas y mejora
parámetros indicativos de fibrosis pulmonar, sobre todo a
nivel vascular.
3. La administración exógena de 10 mg/Kg/día de
sepiapterina no mejora, en general, los parámetros
Conclusiones
195
indicativos de fibrosis pulmonar. Posiblemente por la
corta semivida de eliminación que presenta y por la baja
biodisponibilidad pulmonar demostrada.
4. La administración intratraqueal de BH4 5 mg/Kg/día no
mejora el proceso fibrótico.
5. La administración de roflumilast 1 mg/Kg/día por vía
oral mejora la lesión pulmonar producida por la
bleomicina proporcionando cambios en los niveles de
BH4.
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8. ABREVIATURAS
Abreviaturas
214
� ADN: Ácido Desoxirribonucleico.
� ADNc : Ácido Desoxirribonucleico complementario.
� AMP: Adenosina monofosfato.
� AMPc : Adenosina monofosfato cíclica.
� ARNm : Ácido Ribonucleico mensajero.
� ARNm : Ácido Ribonucleico mensajero.
� BCA: Ácido bicincónico.
� BH4: Tetrahidrobiopterina.
� BL : Bleomicina
� C57BL/6J : cepa de ratón C57BLACK6, también
abreviada cómo black 6.
� CEEA: Comité Ético de Experimentación Animal.
� CEIC: Comité de Ética de Investigación Clínica.
� Col1a1: Colágeno tipo I.
� Ct: Threshold cycle. Ciclo umbral.
� Ctgf : Factor de crecimiento del tejido conectivo.
� CV: Coeficiente de variación.
� DLCO: Capacidad de transferencia de CO
� DTE: Ditioeritritiol.
� EDTA: Etylen diamine tetraacetil acid. Ácido
etilendiaminotetraacético.
� EEUU: Estados Unidos.
� ELISA: Enzyme-Linked Inmuno Sorbent Assay. Ensayo
inmunosorbente ligado a enzima.
� EMA: Agencia Europea del Medicamento.
� eNOS: Óxido nítrico sintasa endotelial.
� EPOC: Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica.
Abreviaturas
215
� ERO: Especies reactivas de oxígeno.
� Et-I: Endotelina I.
� FCV: Capacidad vital forzada
� FDA: Food and Drug administration.
� FPI: Fibrosis Pulmonar Idiopática.
� GSH: Glutation reducido.
� GTPCH-I: Guanosina trifosfato ciclohidrolasa-I.
� HPLC: Cromatografía líquida de alta resolución.
� IFN: Interferon.
� iPD4: Inhibidores de la fosfodiesterasa 4
� LBA : Lavado broncoalveolar.
� NAC: N- acetil cisteína.
� NADPH: Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato, forma
reducida.
� NO: óxido nítrico.
� NOS: óxido nítrico sintasa.
� PDE4: Fosfodiesterasa 4.
� PMSF: Fluoruro de fenilmetilsulfonilo
� RF: Roflumilast.
� RT: Retrotranscripción.
� RT-PCR: Real-Time Polymerase Chain Reaction.
Reacción en cadena de la polimerasa a tiempo real.
� SOD: Superóxido dismutasa.
� SP: Sepiaterina.
� TAC: Tomografía axial computerizada.
� TGF: Transforming growth factor. Factor transformador
del crecimiento.
Abreviaturas
216
� TNF: Tumor necrosis factor. Factor de necrosis tumoral.
� UI: Unidades internacionales.
� VD: Ventrículo derecho.
� VI: Ventrículo izquierdo.
� VPP: Ventilación con presión positiva.