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DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA,
PARASITOLOGÍA E INMUNOLOGÍA
1º CÁTEDRA
MICROBIOLOGÍA I.
VIROLOGÍA
SEMINARIO 12
OBJETIVOS
1. Reconocer la importancia médica de las infecciones virales en
Argentina
2. Conocer las principales vías de ingreso, diseminación y
eliminación viral
3. Analizar los principales mecanismos por los cuales una infección
viral promueve daño
4. Reconocer los diferentes tipos de infección según su
temporalidad y espacialidad
5. Evaluar la participación de los diferentes estamentos de la RI en
el control de las infecciones virales
Infecciones virales transmitidas por mosquitos
Marzo 2017
Virosis asociadas a bronquiolitis en Argentina durante 2016
Distribución de virus respiratorios por SE. SE1 a SE52 de 2016. Argentina. (n=28.511)
Diarreas virales en Argentina 2010-2011
¿QUE ES UN VIRUS?
VIRUS
• AGENTES INFECCIOSOS
• PARÁSITOS GENÉTICOS INTRACELULARES OBLIGADOS
• CARECEN DE METABOLISMO PROPIO
• PUEDEN CRISTALIZARSE
• NO SON SERES VIVOS
Y por si esto fuera poco……
Tenemos virus como
flora normal!
VIROMA
¿CÓMO ESTA COMPUESTO UN VIRUS?
ESTRUCTURA VIRAL
Proteínas estructurales y no estructurales. Virión vs. partícula viral vs. partícula defectiva
PROTEÍNA ESTRUCTURAL es
aquella que codificada por el virus se
encuentra formando parte del virión
PROTEÍNAS NO ESTRUCTURALES
son requeridas para la replicación,
pero no están en el virión.
COMPONENTES VIRALES
SIMETRÍA DE LOS VIRUS
ICOSAÉDRICA HELICOIDAL COMPLEJA MIXTA
La polaridad del genoma
RNA polaridad + RNA con capacidad de mensajero
RNA polaridad - RNA no puede traducirse directamente
CRITERIO: Acido Nucleico
Simetría de la cápside
Desnudo o envuelto
Arquitectura del genoma
CLASIFICACIÓN DE LOS VIRUS
ARN ADN
Desnudo Desnudo Envuelto Envuelto Envuelto Envuelto Envuelto
Icosaédrica Helicoidal Icosaédrica Helicoidal Compleja
ARNdc ARNsc+
ARNsc+
ARNsc+
ARNsc-
Segmentado No segmentado
Reovirus
Picornavirus
Retrovirus Coronavirus
Rhabdovirus Orthomyxovirus
ADNsc ADNdc
Lineal Circular
Parvovirus
Adenovirus Papilomavirus
Poliomavirus
ADNdc lineal
Poxvirus
ADNdc
Lineal
Circular
Herpesvirus
Hepadnavirus
ADNdc circular
Baculovirus
ESTUDIO DE LAS CARACTERÍSTICAS VIRALES
¿CÓMO SE MULTIPLICAN LOS VIRUS?
CICLO DE REPLICACIÓN
CICLO DE REPLICACION
1) Adsorción
2) Penetración
3) Desnudamiento
4) Replicación del genoma/Síntesis de proteínas virales
5) Ensamblaje
6) Egreso
LIGANDOS VIRALES Y RECEPTORES /
CO-RECEPTORES CELULARES
Unión y adsorción del virus a la célula
El ingreso del virus a la célula es el resultado de la interacción del virus
con un receptor celular especifico.
Moléculas de la superficie celular que tienen diversas funciones
En algunos casos interviene un co-receptor
Distintos virus pueden usar un mismo receptor
Algunos virus pueden usar más de un tipo de receptor
La presencia del receptor es necesaria pero no suficiente para asegurar la replicación
Receptores celulares
Tropismo: Capacidad de un virus de infectar una población
determinada de células de un órgano o tejido. Está influenciada
por factores virales (puerta de entrada) y del huésped (cofactores
celulares, co-rreceptores).
Un virus no puede infectar cualquier tipo de célula...
Susceptibilidad no es lo mismo que Permisividad
Una célula es susceptible si tiene el receptor para el virus.
Una célula es permisiva si tiene todos los factores celulares requeridos para completar una infección productiva.
CICLO DE REPLICACIÓN
1) Adsorción
2) Penetración
3) Desnudamiento
4) Replicación del genoma/Síntesis de proteínas virales
5) Ensamblaje
6) Egreso
SÍNTESIS DE PROTEÍNAS
DISTINTAS ESTRATEGIAS SEGÚN EL GENOMA VIRAL
Clasificación de Baltimore
Mecanismos generadores de VARIABILIDAD GENÉTICA
MUTACIONES
DELECIONES
INSERCIONES
RE-ASOCIACIONES
RECOMBINACIONES
CICLO DE REPLICACIÓN
1) Adsorción
2) Penetración
3) Desnudamiento
4) Replicación del genoma/Síntesis de proteínas virales
5) Ensamblaje
6) Egreso
Egreso de la progenie viral de la célula
Exocitosis Brotación
Lisis
No todos los virus exhiben la misma estrategia de replicación
Selección del más apto (fitness ) MULTIPLICACION VIRAL
Mutaciones
Diversidad genética
Cuasiespecies
Genotipos
Serotipos
Presiones (rta. inmune; drogas)
¿Nos infectamos con un solo virus?
La presión de selección (ej: sistema
inmune, terapia) altera la composición
…algunos serán eliminados pero otros…
…perduran !
CUASIESPECIES:
variantes genéticas cercanamente
relacionadas y viables
¿QUÉ IMPORTANCIA TIENE CONOCER
LA ESTRATEGIA DE REPLICACIÓN
VIRAL PARA UN MÉDICO?
Posibles blancos de acción de compuestos antivirales contra HCV
Host-Targeting Agents to Prevent and Cure Hepatitis C Virus Infection. Zeisel et al 2015
EGRESO VIRAL
ENSAMBLADO REPLICACIÓN TRADUCCIÓN
ENTRADA
LIBERACIÓN DEL GENOMA VIRAL
ANTIVIRALES DE ACCIÓN DIRECTA
INHIBIDORES DE LA ENTRADA VIRAL
INHIBIDORES DE LA REPLICACIÓN VIRAL
TRANSMISIÓN CÉLULA-CÉLULA
HEPATOCITO
¿SIEMPRE QUE UN VIRUS ENTRA
EN CONTACTO CON UNA CÉLULA
SUSCEPTIBLE PRODUCE
PROGENIE?
INFECCIÓN PRODUCTIVA
Ciclo de replicación completo con producción de progenie viral.
INFECCIÓN ABORTIVA
El virus infecta una célula susceptible pero no completa su ciclo de replicación por carecer de algún gen viral esencial o
celular no expresado
No necesariamente es benigna para la célula
Tipos de infección a nivel celular
Patogénesis viral
Espectro de eventos (muy complejos)
desencadenados por una población
viral que conducen al daño
y a la enfermedad
INGRESO VIRAL AL HOSPEDADOR REPLICACIÓN VIRAL DISEMINACIÓN VIRAL EN EL ORGANISMO (desde la puerta de entrada al órgano blanco) DISEMINACIÓN VIRAL EN EL AMBIENTE PERSISTENCIA VIRAL EN EL AMBIENTE TRANSMISIÓN VIRAL AL NUEVO HOSPEDADOR
PATOGÉNESIS DE LAS INFECCIONES VIRALES
Vías de entrada al organismo
CONJUNTIVA
TRACTO RESPIRATORIO
TRACTO GASTROINTESTINAL
TRACTO UROGENITAL
SANGRE
ARTROPODOS
INJURIA
PIEL y MUCOSAS
VERTICAL
Algunos términos de utilidad...
Patogenicidad: representa el número de personas enfermas sobre el total de infectados
Virulencia: gravedad con la que se presenta la enfermedad.
Ejemplos:
Sarampión → alta patogenicidad
Polio → baja patogenicidad, puede tener elevada virulencia
Rabia → máxima virulencia
Sarampión
Polio
Rabia
Espectro de respuestas a nivel orgánico y celular ante la infección viral
RESPUESTA CELULAR RESPUESTA DEL HOSPEDADOR
Muerte celular Muerte del organismo
Ejs. de causas de disfunción
celular: cuerpos de inclusión,
sincicios,
transformación
Enfermedad clásica y
grave
Enfermedad leve
y moderada
Multiplicación viral sin
cambios visibles o
maduración viral
incompleta
Infección
asintomática
Exposición
sin infección
Exposición sin
adsorción o entrada
El modelo del iceberg en una infección
Sin
ca
mbio
s v
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les
Efe
cto
vis
ible
Infe
cció
n
su
bclínic
a
En
ferm
ed
ad
clín
ica
• Según espacialidad: Localizadas o sistémicas • Según temporalidad: Agudas o persistentes • Según hospedador: Inmunocompetente o inmunodeficiente • Según clínica: Asintomáticas o sintomáticas
Tipos de infección a nivel hospedador
Crónicas Latentes Lentas Transformantes
Diseminación viral: polaridad como determinante principal del patrón de infección
TIPOS DE INFECCIÓN SEGÚN ESPACIALIDAD
INFECCIÓN LOCALIZADA
la progenie viral que se libera infecta células adyacentes, desde el sitio primario de
replicación.
INFECCIÓN DISEMINADA
se disemina más allá del sitio primario de replicación. Cuando varios órganos son
afectados se hace referencia a una
infección sistémica.
Apical
Basolateral
Rotavirus: liberación por polo apical de enterocitos
Polaridad celular y liberación de la progenie
INGRESO AL ORGANISMO
SALIDA DEL ORGANISMO
INFECCIÓN DISEMINADA
INFECCIÓN LOCALIZADA
DISEMINACIÓN NEURAL
DISEMINACIÓN HEMÁTICA / LINFÁTICA
y / o
Piel: mayor tiempo de incubación; diseminación por contigüidad (HPV) Tracto digestivo / respiratorio: diseminación facilitada por el mucus.
Vías de diseminación en el organismo
Tipos de infección según temporalidad
INFECCIÓN AGUDA
1. Curso breve
2. Rápida producción de virus
3. Rápida resolución y eliminación viral
INFECCIÓN PERSISTENTE
1. La población viral perdura por períodos prolongados de
tiempo
2. La producción viral puede ser continua o intermitente
En algunos casos, persiste el genoma viral sin detección
o con expresión restringida de proteínas virales
TIPOS DE INFECCIÓN SEGÚN TEMPORALIDAD
Persistente crónica
Hepatitis B
(portador crónico)
Pro
du
cció
n V
ira
l
Aguda
Rotavirus, HAV
Rinovirus
Persistente latente
Herpes simplex
Persistente lenta
PEES (Sarampión)
Tiempo Muerte
Manifestaciones clínicas
La población viral perdura por períodos prolongados de tiempo en el hospedador; y
puede producirse virus continua o intermitentemente.
En algunos casos, persiste el genoma viral con diverso grado de expresión (nulo o restringido) de proteínas virales.
LATENTE
Herpes simplex
LENTA PEES
(post- sarampión)
TRANSFORMANTE
HPV
Pero… Un mismo virus puede ser causa de infección aguda, y/o persistente crónica, y/o latente, y/o lenta y/o asociarse a la transformación
CRÓNICA Hepatitis B Hepatitis C
INFECCIÓN PERSISTENTE
Persistencia vs. eliminación
Mecanismos virales:
1. Regulación del potencial lítico: Infecciones persistentes: ej. retrovirus Infecciones líticas ej. herpesvirus
2. Mantenimiento del genoma viral en las células: Forma episomal (circularizado y extracromosómico) en infecciones no líticas
3. Evasión a la vigilancia immune
INFECCIÓN ASINTOMÁTICA
No manifiesta signos clínicos: casos “subclínicos”
INFECCIÓN SINTOMÁTICA
Posee todas las características típicas de la enfermedad
Una infección AGUDA O CRÓNICA puede ser:
asintomática o presentar una
clínica leve, moderada o grave
Tipos de infección según la clínica
Mecanismos de lesión por virus
Infección viral Respuesta inmune
DAÑO
DIRECTO INDIRECTO
•Inducción / inhibición de la apoptosis
•Cesación de procesos esenciales
(traducción, síntesis de RNA – DNA,
transporte vesicular)
•Incremento en la permeabilidad de
membranas
•Liberación del contenido lisosomal
•Mediado por LT CD8+ (ej: miocarditis por Coxsackie
B, hepatitis por HBV o HCV)
•Mediado por LT CD4 + TH1 (ej.: encefalitis
sarampionosa, HSV)
•Mediado por CD4 + TH2 (ej: RSV)
•Mediado por Ac y/o inmunocomplejos (ej: dengue
hemorrágico, neumonía grave por influenza A
(H1N1)/2009, hepatitis B fulminante;
glomerulonefritis, vasculitis y artritis por HBV o HCV)
CTL
Efecto citopático directo
Coilocito por HPV
Mecanismos de lesión
Hepatitis por HBV Miocarditis por Coxsackie B
Glomerulonefritis
membranosa por HBV
Inmunidad
intrínseca
Inmunidad antiviral
Interferón
Virus
Anticuerpos
T
Í
T
U
L
O
DÍAS POST-INFECCIÓN 2 4 6
Cinética de la producción de interferón y virus
Interferón (IFN) tipo I
= TRIF (Tir [Toll IL-1 receptor]-domain-containing adaptor
inducing interferon)
Activating Transcription
Factor
Regulación del sistema IFN αβ
Acción de las proteínas efectoras de los IFN α/β
Estimular las helicasas RLR (RIG-like Receptor)
IFN α/β
Apoptosis
Respuesta humoral
Linfocitos T citotóxicos CD8+
Virus
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
DÍAS POST-INFECCIÓN
T
Í
T
U
L
O
IgG
Virus
IgM
Relación entre infección viral aguda y respuesta humoral
Anticuerpos Neutralizantes
a: Inhibición de la unión al receptor
b: Inhibición de la unión al
correceptor
c: Virus que necesitan bajo pH, luego
del endosoma salen al citosol, Acs
pueden retrasar o impedir la salida
del endosoma
d: Acs contra virus, que los
redireccionan hacia endosoma
degradación
Múltiples acciones de los anticuerpos ante la infección viral
Virólisis
inmune
mediada por
complemento
Inhibición de la transcitosis viral
Neutralización viral intracelular
Lísis de la célula
infectada o
eliminación de la
infección
Inhibición de la
replicación viral
Inhibición de
la liberación
viral
Inhibición de la
transmisión viral
célula a célula
Célula
protegida de la
infección viral
Virus
Infección
Anticuerpos
neutralizantes
(anti-Env)
Anticuerpos
neutralizantes
(anti-Env)
Anticuerpos
No-neutralizantes
(anti-NS1)
Anticuerpos
No-neutralizantes
(anti-Env)
Célula infectada
Inmunidad celular e infección viral
Carballal & Oubiña. Virología Médica. 2016
Acción de linfocitos T citotóxicos sobre célula blanco infectada
A. Encuentro y reconocimiento de HLA I con péptido Ag
B. Unión del linfocitos T citotóxicos (CTL) con la célula blanco
C y D. Apoptosis de la célula blanco
Beso de la muerte de un linfocito T citotóxico (específico para el HBs Ag) a hepatocitos de un ratón transgénico para el gen S.
Guidotti et al. J Immunol 152: 3245, 1994.
Acción de linfocitos T citotóxicos sobre célula que expresa antígenos virales
VIGOROSA
POLICLONAL
MULTIESPECÍFICA
DÉBIL OLIGOCLONAL
VIGOROSA POLICLONAL
MULTIESPECÍFICA
DÉBIL OLIGOCLONAL
Respuesta inmune antiviral de los Linfocitos T citotóxicos
IFN /
TNF
IL-12
Células NK
Células T citotóxicas
Anticuerpos
Carga viral
Días post-infección
1 2
3
4
Cinética de la respuesta inmune antiviral: algunos blancos del contraataque viral
¿Control o persistencia de la infección?
Caracterizada por:
•Control/disminución de los niveles de antígeno.
•Aumento/estimulación de la funcionalidad de
las CPA.
•Rta T efectora potente
Eliminación
Memoria inmunológica
Infección aguda
activación Expansión
inicial
Expansión efectoras Agotamiento/deleción
Caracterizada por:
•exceso de antígeno.
•Pobre o inhibida la funcionalidad de las CPA.
•Aumento de los inmunoreguladores negativos.
•Agotamiento de las cel T.
Persistencia
Memoria inmunológica
LT
Infección persistente
Cherie T. Ng, et al JEM 2013
Treg
CTL
efectora
ELIMINACIÓN VIRAL
DAÑO CELULAR
PERSISTENCIA VIRAL
PROTECCIÓN DEL DAÑO CELULAR
Treg
CTL
efectora
Un balance muy delicado...
La importancia del conocimiento de la patogenia viral por parte del médico.
¿Cuándo?
PATOGENIA
¿Qué? ¿Dónde? ¿Cómo?
Virus vs
Rta. inmune
MÉTODO
Localizada vs
Diseminada
TOMA DE MUESTRA
TECNICA
Temporalidad de la infección
DIAGNÓSTICO
P
R
O
F
I
L
A
X
I
S
E
P
I
D
E
M
I
O
L
O
G
I
A
Tutoría Seminario 1- Virología
1) La respuesta del interferón es considerada la primera línea de defensa contra las infecciones virales. Tratando de entender cómo se desencadena esta respuesta antiviral, identifique cuales son patrones moleculares asociados con patógenos (PAMP) que pueden intervenir y justifique: RNA bicatenario DNA 2) Los receptores de reconocimiento de patrones (RRP) que reconocen PAMPs se pueden encontrar en diversos compartimientos celulares. Indique en cuáles y justifique: Extracelular Intracelular
Tutoría Seminario 1- Virología
Luego de la infección viral se desencadenan una serie de eventos que llevan a una fuerte respuesta inmune antiviral. Ordene cronológicamente los eventos de dicha respuesta: a) activación transcripcional de IFN b) unión entre RRP y PAMP c) producción de proteínas efectoras de los IFN de tipo I d) fosforilación de factores de transcripción (STAT) y translocación al núcleo e) activación y translocación de factores de trascripción regulatorios del IFN (NF-kB, IRF-3, IRF-7) al núcleo f) producción masiva de IFN de tipo I (/ß) g) inducción transcripcional de cientos de genes h) interacción de IFN de tipo I (/ß) con receptor de membrana IFNAR i) interrupción de la replicación viral j) activación de cinasas (JAK1 y TYK2)
Tutoría Seminario 1- Virología
Los anticuerpos neutralizantes (AN) son un componente crítico de la inmunidad adaptativa antiviral. En relación a estos anticuerpos, identifique cuáles de las siguientes aseveraciones son correctas y justifique: a) pueden ser utilizados como parte de un tratamiento de profilaxis post-exposición b) previenen la infección de células blanco c) pueden eliminar virus del medio extracelular d) se generan tanto para proteínas estructurales como para no estructurales e) se unen a epitopes presentes en la superficie de la partícula viral f) en la etapa aguda de la infección viral, la producción de AN desencadena la eliminación del
virus g) en las infecciones persistentes los AN pueden no resultar efectivos para la eliminación de
la infección h) en ciertas infecciones virales los anticuerpos podrían actuar como facilitadores de la
infección i) todos los anticuerpos son neutralizantes.
Tutoría Seminario 1- Virología
En los últimos años han tenido gran impacto en la salud pública mundial diversas epidemias causadas por nuevos virus como MERS-CoV en el 2012 (Middle East respiratory síndrome coronavirus) y SARS en el 2003 (Severe Acute Respiratory Syndrome) o en otros casos variantes de virus ya conocidos (por ejemplo, nuevas variantes de influenza aviar) o virus que se presentaron de forma inesperada en nuevas regiones (por ejemplo, Ebola y Zika). En todos estos casos la rápida identificación del agente causal fue clave para el diagnóstico, tratamiento y seguimiento de los afectados así como para el control de la epidemia. Tomando como ejemplo la identificación de MERS-CoV, revisaremos a lo largo de este problema las distintas metodologías que permiten realizar la identificación y estudio de un virus. Durante el año 2012, un hombre de 60 años ingresó a un hospital de Arabia Saudita presentando fiebre de siete días, tos, expectoración y dificultad para respirar. La historia clínica descartó enfermedades cardiopulmonares previas y tabaquismo. La radiografía de tórax mostró daño consistente con una infección. El análisis de sangre reveló marcadores asociados con falla renal así como neutrofilia (aumento de neutrófilos), linfopenia (disminución de linfocitos) y trombocitopenia (disminución de plaquetas). Al día 11 de admisión el paciente murió por falla respiratoria y renal progresiva.
Tutoría Seminario 1- Virología
Desde el primer día de admisión hasta su muerte, se tomaron diversas muestras del paciente que arrojaron los resultados que a continuación se discutirán: a) La muestra de esputo fue negativa para inmunofluorescencia indirecta (IFI) de influenza A y B, parainfluenza 1 a 3, virus sincicial respiratorio (RSV) y adenovirus. Preguntas: ¿Por qué eligieron la muestra de esputo? ¿Pudieron haber utilizado otro tipo de muestra? ¿Cómo debieron procesar la muestra para poder realizar la técnica de inmunofluorescencia? ¿Por qué analizaron los virus mencionados?
Tutoría Seminario 1- Virología
b) la muestra de esputo también fue procesada y utilizada para realizar un cultivo viral en líneas celulares que tenían en el laboratorio. Los cultivos fueron mantenidos a 37C cambiándole el medio de cultivo cada 3 días. Antes de los 5 días se comenzaron a observar efectos citopáticos (Figura 1). Figura 1. Se muestran los efectos citopáticos en dos líneas celulares (LLC-MK2 y Vero) luego de infectar con HCoV-EMC.
Tutoría Seminario 1- Virología
Preguntas: ¿Cómo debieron procesar la muestra para realizar el cultivo viral? ¿Qué componentes debe tener un cultivo viral? ¿Qué indica la presencia de efectos citopáticos en el cultivo viral? ¿Qué efectos citopáticos conoce? ¿Se puede identificar el tipo de virus a través de la observación del efecto citopático que produce en un cultivo?
Tutoría Seminario 1- Virología
c) a partir de los sobrenadantes del cultivo viral se realizaron diversas técnicas de amplificación genómica (PCR) utilizando protocolos para diversos virus conocidos, arrojando resultados positivos cuando se utilizó el protocolo para deteccion de coronavirus. Preguntas: ¿En qué consiste la reacción de PCR? ¿Por qué cree que decidieron utilizar el sobrenadante de cultivo para realizar esta técnica y no una muestra del paciente? d) posteriormente decidieron secuenciar el genoma viral a fin de realizar un estudio que permita establecer las relaciones filogenéticas con otros coronavirus conocidos, pudiendo definir que se estaba frente a una nueva especie de coronavirus ya que la secuencia nucleotídica de su genoma compartía menos del 90% de similitud con otros coronavirus previamente descriptos. Preguntas: ¿Cómo se realiza una secuenciación genómica? ¿Cómo se construye un árbol filogenético y que información arroja? Figura 2.
Tutoría Seminario 1- Virología
Figura 2. Árbol filogenético realizado con secuencia de 408 nucleótidos. Incluye el nuevo virus (HCoV-EMC) y otros coronavirus humanos (H) y no humanos (Bat, F, entre otros). , ß y representan géneros dentro de la subfamilia Coronaviridae.
