Desarrollo de RT-PCR para diagnóstico de Dengue y Chikungunya en México (DUPLEX). Dr. José Alberto Díaz Quiñonez Director General Adjunto de InDRE Dirección

Desarrollo de RT-PCR para diagnóstico de Dengue y

Chikungunya en México (DUPLEX).Dr. José Alberto Díaz Quiñonez

Director General Adjunto de InDREDirección General de Epidemiología

Subsecretaría de Prevención y Promoción de la Salud

Agenda

• Panorama Epidemiológico - Vigilancia Epidemiológica y Virológica de dengue en México (RNLSP)

• Algoritmo de dengue

• Técnicas diagnósticas para dengue

• qRT-PCR DUPLEX (Dengue/Chikungunya)

• Genotipificación (DENV Y CHIKV)

• Diagnóstico diferencial (ZIKA)

Panorama Epidemiológico de Dengue

http://www.epidemiologia.salud.gob.mx/doctos/panodengue/PANORAMAS_2015/Pano_dengue_sem_33_2015.pdf









-

+



Vigilancia Virológica de Dengue Tipificación mediante RT-qPCR


AGS BC BCS

CAM

P

CHIS

CHIH

COAH CO

L

DF

DG

O

GTO

GRO

HG

O

JAL

MEX

MIC

H

MO

R

NA NL

OAX PU

E

QRO

QRO

O

SLP

SIN

SON

TAB

TAM

PS TLX

VER

YUC

ZAC0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

DenV-1DenV-2DenV-3DenV-4

Entidad Federativa

Núm

ero

de re

gist

ros

y m

uest

ras

Vigilancia Virológica de Dengue Tipificación mediante RT-qPCR

Coordinación de Vigilancia Epidemiológica por LaboratorioDirección de Diagnóstico y referencia / InDRE

Algoritmo de Diagnóstico por Laboratorio

DGE/InDRE

ELISA NS1

De 4 a 5 Días de Evolución

ELISA IgM

ELISA IgG

NO

SI

NEG

NEG

NEG

Para Vigilancia Virológica por RT-qPCR:

• Se deberán analizar el 10% de muestras positivas a NS1 de DNG

y el 100% de DG

Se confirma caso

Con base en definición de casoContinuar con Dx diferencial

FD: Chikungunya, ZIKA EFE´s FHD: Leptospirosis Ricketsiosis Fiebre amarilla ( en caso de viaje a zona endémica)

ELISA IgM

ELISA IgG

Se confirma caso

Se confirma caso

POS

POS

POS

POS

POS

Tiempo estándar de servicio 3 días de evolución

Muestras de 0-5 días de iniciada la fiebre

Muestras de ≥ 6 días de iniciada la fiebre

NEG

NEG

Capacidad metodológica Para Dengue

VIROLÓGICOSAISLAMIENTO VIRAL

Células C6/36

BHK21

Vero

INMUNOFLUORESCENCIA

MOLECULARES

RT- PCR punto final

RT- PCR tiempo real

Secuenciación

SEROLÓGICOSANTICUERPOS

IgMIgG

ANTÍGENO NS1MNT

DGE/InDRELaboratorio de Arbovirus y Virus HemorrágicosDivisión Biología Molecular/Innovación y desarrolloDivisión Serología

13

RNLSP con capacidad de Vigilancia Molecular en dos plataformas

(CFX96 y 7500) - RT-qPCR

RNLSP con capacidad de Vigilancia Serológica(ELISA de captura)

Capacidad Instalada en la RNLSP

DGE/InDRE

Baja California y Tlaxcala no tienen

implementado el RT-qPCR. Aguascalientes (amarillo) esta

en fase de implementación por evidencia de circulación

vectorial

2004 2006 2012-12008 2013-1 2015-1

Panel exclusivo para serología (IgM e IgG)Envío anual

Panel exclusivo para serología (IgM, IgG)Envío semestral

Panel exclusivo para serología (IgM, IgG)Se incluye NS1

2012-2

Panel exclusivo para serología(PAN-SER-DEN) y BiologíaMolecular RT-qPCRpor separado(NAT-DEN)

Panel para Serología Algorítmico) y BiologíaMolecular RT-qPCRPor separado

Panel algorítmico (IgM, IgG, NS1 y

RT-qPCR)“SMART-DEN”

Panel algorítmico y diferencial

(IgM, IgG, NS1) yRT-qPCR

DENV Y CHIKV)“SMART-ARBO”

Panel de Evaluación Externa del Desempeño en la RNLSP


No. muestraDensidad óptica

real Unidades Interpretación Observaciones

1 Overflow Positivo IgM

2 Overflow Positivo IgM3 Overflow Positivo IgM4 Overflow Positivo IgG

5 0.161 2.8 Negativo IgM e IgG

6 Overflow Positivo IgG


8 Overflow Positivo IgG

9 Overflow Positivo IgM


2004 (únicamente serología ) 2012-2 “PAN-SER-DEN”(se incluye RT-qPCR y serología con NS1)

No. muestraDensidad óptica real Unidad

es Interpretación Observaciones

1 Overflow Positivo NS1 2 Overflow Positivo IgM3 Overflow Positivo IgG4 Overflow Positivo IgG, IGM5 0.161 2.8 Negativo IgM, IgG y NS16 Overflow Positivo NS17 0.115 2.0 Negativo IgM, IgG y NS18 Overflow Positivo IgM,NS19 Overflow Positivo IGM

10 0.123 2.1 Negativo IgM, IgG y NS1

Paneles de Evaluación Externa del DesempeñoPEED “SMART-ARBO” 2015-1


No. de muestra

Densidad Óptica LESP de

técnicas aplicadas

según algoritmo vigente

Unidades o valor indice

(si aplica según

técnica)Valor de

corte (calculado)

Factor de corrección empleado (si aplica)

Interpretación final del

resultado LESP

1NS1= 3.304 NA 0.615 NA

POSITIVO a NS1

IgM= IgG=

2NS1= 0.047 NA 0.615 NA

NEGATIVO a IgGIgM= 0.189 PANBIO 0.400 0.84

IgG= 0.137 PAMBIO 0.507 0.9

3NS1= 0.033 NA 0.615 NA

POSITIVO a IgMIgM= 3.203 PANBIO 0.400 0.84

IgG=

4NS1=

NEGATIVO a IgGIgM= 0.186 PANBIO 0.400 0.84

IgG= 0.140 PANBIO 0.507 0.9

5NS1=

POSITIVO a IgMIgM=3.245 PANBIO 0.400 0.84

IgG=

6NS1= 0.026 NA 0.615 NA


IgG=

7NS1= 0.026 NA 0.615 NA


IgG=

8NS1= 0.046 NA 0.615 NA

NEGATIVO IgGIgM= 0.169 PANBIO 0.400 0.84IgG=0.151 PANBIO 0.507 0.9

9NS1=


IgG=

10NS1= 3.281 NA 0.615

POSITIVO a NS1

IgM= IgG=

11NS1= 0.042 NA 0.615 NA

NEGATIVO a IgG

IgM= IgG=0.143 PANBIO 0.507 0.9

12NS1= 0.026 NA 0.615 NA

POSITIVO a IgG

IgM= IgG=3.237 PANBIO 0.507 0.9

Número de

muestra "X" a

Valor de Cq inicial

Valor de Cq 10-1

Valor de Cq 10-2

Valor de Cq 10-3

Valor de Cq 10-4 Interpretació

n (serotipo identificado)

M1A - D1 19.39 22.49 26.16 29.41 34.26 DEN - 1M1A - D2 13.38 15.7 20.36 25.45 29.41 DEN - 2

M10A - D1 20.58 23.63 26.87 31.24 35.23 DEN - 1M10A - D2 14.28 17.65 21.33 23.28 27.68 DEN - 2

2013-1 Panel algorítmico (IgM, IgG, NS1 yRT-qPCR) “SMART-DEN”




ESTADO:

BAJA CALIFORNIA SUR

(GRUPO 1)DICTAMINACIÓN

OBSERVACIONES

No. MUESTRA

1 Correcta Aplica el algoritmo. Negativo a NS1, realiza IgG negativo (que aplica hacerlo, según algoritmo).

2Incorrecta (determinación de IgM)

se resta 0.5 por no detectarla. Detecta IgG

Aplica algoritmo. Primera determinación negativa que en InDRE es positiva para IgM (BAJA DE 13.24). Confirma caso con IgG. Necesario checar lavados, tiempo de incubación y pipeteo.

3 Correcta Muestra rechazada por hemolisis.

4 Correcta Aplica el algoritmo. Negativo a NS1 y negativo a IgG en fase aguda.

5 Correcta Aplica algoritmo. Muestra NS1 positiva. Identifica DENV-1


7 Correcta Aplica algoritmo. Muestra negativa para IgM e IgG en fase convaleciente.

8 Correcta Aplica algoritmo. Negativa a NS1 y positiva a IgG.


10 Correcta Aplica algoritmo diferencial, negativo a dengue pasa a CHIK.

CALIFICACION Serología10.0

CALIFICACION Molecular10.0

CALIFICACIÓN FINAL 10.0Necesario checar pipeteo y lavado en muestras positivas bajas podemos identificar falsos negativos. No incluye proceso con muestras de rutina en PCR porque indica que se puede contaminar. Gráficos muy acostados poco definidos y con baja UFR. Checar en corto las sondas de DENV-1 y el protocolo.

PENDIENTE COEFICIENTE r2

-2.79027027 0.970818909


-2.841891892 0.96806097

Muestra 1

Muestra 9

NOTA: Se recomienda mantener la calidad en el pipeteo, esta es excelente. Se recomienda que la pendiente tenga un valor de -3.3 que corresponde a eficiencia de Reacción (E) del 100% . El Coeficiente r2 se recomienda que tenga un valor de 0.999.. que representa una linealidad muy considerable. Usted obtuvo una E= 84.55 % para DENV-1 y de 86.06% para DENV-4. Eficiencias de reacción bajas favorecen sensibilidad analítica baja promoviendo falso negativos. Eficiencias de reacción por encima del 100% favorecen falsos positivos.


ESTADO:

MORELOS (GRUPO 2) DICTAMINACIÓNOBSERVACIONES

1 Correcta Aplica el algoritmo. Negativo a NS1, realiza IgG negativo (que aplica hacerlo, según algoritmo).

2Incorrecta (determinación de IgM)

se resta 0.5 por no detectarla. Detecta IgG

Aplica algoritmo. Primera determinación negativa que en InDRE es positiva para IgM (BAJA DE 13.24). Confirma caso con IgG. Necesario checar lavados, tiempo de incubación y pipeteo.

3 Correcta Muestra rechazada por hemolisis.




7 Correcta Aplica algoritmo. Muestra negativa para IgM e IgG en fase convaleciente.

8 Correcta Aplica algoritmo. Negativa a NS1 y positiva a IgG.


10 Correcta Aplica algoritmo diferencial, negativo a dengue pasa a CHIK. Detecta por RT-PCR positivo a CHIK.

CALIFICACION Serología9.5

CALIFICACION Molecular10

CALIFICACIÓN FINAL 9.5Necesario checar pipeteo y lavado en muestras positivas bajas podemos identificar falsos negativos. Incluye muestras en procesos de rutina. Muestras

positivas a dengue pasa el porcentaje a chikungnya para identificar coinfecciones. Maneja las detecciones de dengue en 7500 y de CHIKV en CFX96. Realiza diluciones a todas las muestras positivas por PCR. Envía formatos de corridas.


-2.759594595 0.935188939


-2.815135135 0.956266137

Muestra 5

Muestra 10

Paneles de Evaluación Externa del DesempeñoPEED “SMART- ARBO” 2015-1


100% de concordancia en Biología Molecular (RT-qPCR) y Serología (MAC ELISA)

Paneles de Evaluación Externa del Desempeño Internacional - CDC


• Análisis serológico MAC ELISA, ELISA Comercial InBIOS• Análisis Molecular qRT-PCR y qRT-PCR “DUPLEX”

Próximo envío de resultados el 4 de septiembre

Paneles de Evaluación Externa del Desempeño Internacional - ENIVD


DENV-1

Americano /africano

Pacifico Sur

Asiático

DENV-2

Cosmopolita

Asiático

América/Asia

Genotipificación de DENV

DGE/InDRELaboratorio de Arbovirus y Virus HemorrágicosDivisión Biología Molecular/Innovación y desarrollo

DENV-3 DENV-4

Genotipo III

Genotipo II

Genotipo IV

Genotipo I

Genotipo II

Genotipificación de DENV


Distribución de Genotipos

JaliscoDENV-2

Asiático-Americano

MorelosDENV-2

Asiático-Americano

Nuevo LeónDENV-4GEN-II

TabascoDENV-4GEN-II

TabascoDENV-1Asiático

Quintana RooDENV-3GEN-III

VeracruzDENV-1Asiático


CRONOLOGÍA DEL INGRESO DE LOS CUATRO SEROTIPOS DEL VIRUS DENGUE EN MÉXICO

2014

DENV-2ASIATICO/AMERICANO

DENV-4GEN-II

DENV-3GEN-III

DG

DG ??


Asiático

East/Central/South African (ECSA)

West African

EU703760.1 Malaysia 2006 HM045797.1 Indonesia 1985

HM045789.1 Thailand 1988 HM045814.1 Thailand 1975

FJ807897.1 Indonesia 2007 HM045808.1 Thailand 1978

EU703759.1 Malaysia 2006 HM045791.1 Indonesia 1983 HM045790.1 Philippines 1985 MEX Jalisco 2014 - Cultivo KJ451622.1 YAP 2013

KJ451624.1 British Virgin Islands 2014 KC488650.1 Philippines 2012 KF318729.1 China Zhejiang 2012 MEX Coahuila 2014 - Cultivo MEX Chiapas 2014 - Muestra

HM045796.1 Thailand 1995 HE806461.1 New Caledonia:2011

HM045810.1 Thailand 1958 HM045803.1 India 1963 HM045813.1 India 1963 HM045788.1 India 1973

HM045809.1 DR Congo 1960 HM045784.1 Central African Republic 1984

HM045812.1 Uganda 1982 HM045822.1 Central African Republic 1978 HM045823.1 Angola 1962

JF274082.1 India 2006 EU244823.2 Italy 2007

GU189061.1 Sri Lanka 2006 HQ456251.1 Comoros 2005

FJ445510.2 Singapore 2008 AF490259.3 Tanzania 1953

HM045786.1 Nigeria 1974 HM045818.1 Ivory Coast 1981

AY726732.1 Senegal 198390100

82

99

67

95

97

66

73

62

0.02

Genotipificación de CHIKV


Protocolo dúplex DENV/CHIKV

• Una mezcla de reacción

• Mismo protocolo de amplificación para ambos virus

• Se identifican simultáneamente co-infecciones con DENV(serotipo)/CHIKV

• Optimización de reactivos (enzima) e insumos

• Aplicado a muestras de humanos y moscos.

Protocolo de Amplificación Curvas de Amplificación


CHIKV DENV1, 2, 3, 4 CHIKV/DENV1, 2, 3, 4


Protocolo dúplex DENV/CHIKV

CHIKV DENV1/CHIKV DENV2/CHIKV

DENV3/CHIKV DENV4/CHIKV NEGATIVO

Inclusión del RP(control interno) en la reacción de RT-qPCR para detección de Virus Chikungunya


CHIKV RP

CHIKV-RP CHIKV-RP

Escala lineal

Escala logarítmica

Kit RT-qPCR Dengue - CDC

Implementación a toda la RNLSP

• Primer envío por CDC Atlanta, en septiembre• Capacitación a la RNLSP a finales del 2015


Validado en InDRE para uso en dos plataformas de amplificación (Applied 7500 y CFX96)



Cuatro serotipos y RP RP DENV-1

DENV-2 DENV-3 DENV-4

Applied 7500

Validado en InDRE para uso en dos plataformas de amplificación (Applied 7500 y CFX96)



CFX96

DENV-2DENV-1

DENV-3 DENV-4

ENTOMOLÓGICA

VIROLÓGICA

Vigilancia Entomo-virologica

El éxito y los resultados provienen del trabajo en Conjunto y multidisciplinario


Biol.

Serotipos identificados: DENV-1 y DENV-2

2012.- Detección de DENV-4 en moscos antes de que se detectaran los casos en humanos

2013.- Detección de DENV-4 en humanos

Aislamiento viral Detección de antígeno NS1 Detección molecular

GUERRERO



Biol.

MORELOS

Jojutla

Axochiapan

Tepalcingo

Yautepec

Temixco

Tlaquiltenango

A

F

E

B

D

C

Estado de México

Distrito Federal

Estado de México

GuerreroPuebla

DENV-1 mosquitos coincide con el

identificado en humanos: Detectado periodo baja actividad de Dengue.En 2103 detección de

DENV-2

JALISCO

C

B

Sinaloa

Nayarit

Zacatecas

Aguascalientes

Colima

Michoacán

A

DENV-2 circulando en humanos.DENV-4 serotipo no identificado en humanos.DETECTADOS ANTICIPADAMENTEDetección de Transmisión transovarica!!

Municipio EspecieSerotipo

identificadopor RT-qPCR

Jojutla A. aegypti♀ DENV-1

Jojutla A. aegypti♀ DENV-1

Municipio

No. De grupo

Serotipo identificado por RT-PCR Fourplex en

tiempo real

Puerto Vallarta

16 DENV-2

3 DENV-2/DENV-4

2 DENV-4

QUINTANA ROO

Quintana Roo

Cozumel

DETECTADOS DURANTE UN BROTE.DENV-2: detectado en humanos.DENV-1: no identificado en humanos.

Localidad de captura.

Serotipo identificadopor RT-PCR Fourplex en tiempo real

Col. Repobladores DENV-2Col. Emiliano Zapata DENV-1/DENV-2Col. Emiliano Zapata DENV-1



Año ESTADO NO. DE GRUPOS RESULTADO

2014

Chiapas 36 10 POSITIVOS A CHIK

Durango 1 NEGATIVO

Guanajuato 1 NEGATIVO

Guerrero 8 8 POSITIVOS A CHIK

Jalisco 43 NEGATIVO

Michoacán 33 NEGATIVO

Morelos 8 3 NEGATIVOS, 4 DENV-1, 1 DENV-4

Nuevo León 3 NEGATIVO

Tamaulipas 22 NEGATIVO

Veracruz 10 NEGATIVO

TOTAL 165

CHIKUNGUNYAESTADO LOCALIDAD MUNICIPIO RESULTADOChiapas Tuxtla Gutiérrez Tuxtla Gutiérrez Positivo Chiapas Tuxtla Gutiérrez Tuxtla Gutiérrez Positivo Chiapas Tuxtla Gutiérrez Tuxtla Gutiérrez Positivo Chiapas Tuxtla Gutiérrez Tuxtla Gutiérrez Positivo Chiapas La Libertad Suchiate Positivo Chiapas La Libertad Suchiate Positivo Chiapas Rayón Suchiate Positivo Chiapas Rayón Suchiate PositivoChiapas Rayón Suchiate PositivoChiapas La Libertad Tuxtla Chico Positivo

CHIKUNGUNYAESTADO LOCALIDAD RESULTADOGuerrero Vicente Guerrero Positivo (29.30)Guerrero Vista Hermosa Positivo (26.84)Guerrero Niños Héroes Positivo (27.68)Guerrero Libertad Positivo (21.66)Guerrero Juchitán Positivo (33.90)Guerrero Sin dato Positivo (17.37)Guerrero Sin dato Positivo (34.60)Guerrero Sin dato Positivo (18.05)

Resultados de la vigilancia entomo-virológica 2014

DGE/InDRELaboratorio de Arbovirus y Virus HemorragicosDivisión Biología Molecular/Innovación y desarrollo

AÑO ESTADO NO. DE GRUPOS RESULTADO

2015

Chiapas 28 22 NEGATIVO Y 6 POSITIVOS

MorelosAmacuzac (Teacalco)

41 1 POSITIVO A DENV-1

Tabasco 5 NEGATIVO

Veracruz 1 NEGATIVO

Guerrero 17 14 POSITIVOS CHIK, 3 NEGATIVOS

TOTAL 92

Necesario intensificar la vigilancia entomo

virologica

Aprovechar la ventaja de esta vigilancia.

Búsqueda anticipaday preventiva

ZIKA

Resultados de la vigilancia entomo-virológica 2015


Evaluaciones para biología molecular y serología


Evaluaciones para biología molecular y serología


Diagnóstico diferencialRT-PCR y RT-qPCR SYBR Green - ZIKA


Ante la ausencia de sondas especifica:Identificación de especificidad mediante experimento de “High Resolution Melting” (HRM)

Control Positivo

Curvas de Disociación(Control Negativo)

Curvas de Disociación(Control positivo)

Curvas de disociación del Control positivo)

Curvas de disociacióndel control Negativo

Curvas del Control positivo) Curvas del

Control negativo)

Curvas del Control positivo

(Duplicado)

Curvas del Control positivo

(Duplicado)

Escala logarítmica

Escala lineal

Control Negativo

Laboratorio certificado y Acreditado Por algoritmo de diagnóstico

DGE/InDRELaboratorio de Arbovirus y Virus HemorrágicosDivisión Biología Molecular/Innovación y desarrollDivisión Serología o

Certificación ISO 9001:2008

Acreditación ISO 15189, por la Entidad Mexicana de Acreditación (EMA)

Detección de Antígeno NS1Detección de anticuerpos IgM (ELISA de captura)Detección de Anticuerpos IgG (ELISA de captura)Detección de RNA de virus dengue mediante RT-qPR “Multiplex”Detección de RNA de virus dengue mediante RT-qPCR “Fourplex”

DGE/InDRELaboratorio de Arbovirus y Virus HemorrágicosDivisión Biología Molecular/Innovación y desarrolloDivisión de serología

QFB. Alma Núñez LeónQFP. Rosalba Pérez MezaQFB. Yanelli Adriana Torres OlmosQFB. Claudia Rosales JiménezT.L. Adela Monserrat Aparicio AntonioApoyo Admvo. Rosa María Herrera BautistaM. en C. María de la Luz Torres RodríguezM. En C. Mauricio Vázquez Pichardo

Laboratorio de Arbovirus y virus hemorrágicos

Documents

Desarrollo de RT-PCR para diagnóstico de Dengue y Chikungunya en México (DUPLEX). Dr. José Alberto Díaz Quiñonez Director General Adjunto de InDRE Dirección