INDICEOBJETIVOGENERAL..pag OBJETIVOS ESPECIFICOS....pagFUNDAMENTO TEORICO.pagCONDICIONES NECESARIAS PARA LLEVAR A CABO LA FERMENTACION..pagBIOLOGA DE LAS FERMENTACIONES. .pagFASES EN LA FERMENTACINpagREQUERIMIENTOS NUTRICIONALES DE LA LEVADURA.pagREQUERIMIENTOSpag COMPOSICIN DEL EXTRACTO DE LEVADURA PRODUCIDO MEDIANTE AUTOLISIS..pagVARIABLES QUE AFECTAN LA FERMENTACION ALCOHOLICApagTEMPERATURApagPH .pagAJUSTE DEL PH pagAIREACIN..pagINHIBIDORES .pagCONCENTRACIN INICIAL DE AZCARES pagMATERIALES Y METODOS .pagMATERILAES Y REACTIVOS ..pagPROCEDIMIENTO PARA LA FERMENTACION .pagREACTIVOS pagMATERIALES ..pagMETODO pagDETERMINACIN DEL TTULO DEL LICOR DE FEHLING ..pagDETERMINACIN DE AZCAR REDUCTOR DE LA MUESTRA .pag MATERIALES .pagREACTIVOS ..pag PROCEDIMIENTO DESTILACIN ..pagPRESENTACION DE RESULTADOS .pagRESULTADOS DE LA FERMENTACIN ..pag CARACTERSTICAS D EL SUTRATO .pagNUTRIENTES ADICIONADOS .pagTITULACION PARA DETERMINAR AZUCARES REDUCTORES ..pag

PRACTICA N1

FERMENTACION ALCOHOLICA A PH REGULADO Y TEMPERATURA CONSTANTE USANDO COMO MATERIA PRIMA EL MELON

1. OBJETIVO GENERAL

- Evaluar la fermentacin alcohlica a ph regulado y a temperatura constante.

2. OBJETIVOS ESPECIFICOS

- Determinar mediante fermentacin alcohlica los parmetros que rigen su proceso.- Determinar la cantidad y concentracin necesaria para regular su Ph. -Determinar y regular la densidad adecuada para llevar a cabo la fermentacin.- Determinar la cantidad de nutrientes ( levadura, urea, etc ) para llevar a cabo la fermentacin.-Determinacin de los azucares reductores.

3. FUNDAMENTO TEORICO

CONDICIONES NECESARIAS PARA LLEVAR A CABO LA FERMENTACION La fermentacin alcohlica , es un proceso biolgico de fermentacin en plena ausencia de aire (oxgeno - O2), originado por la actividad de algunos microorganismos que procesan los hidratos de carbono (por regla general azcares: como pueden ser por ejemplo la glucosa, la fructosa, la sacarosa, el almidn, etc.) para obtener como productos finales: un alcohol en forma de etanol , dixido de carbono (CO2) en forma de gas y unas molculas de ATP que consumen los propios microorganismos en su metabolismo celular energtico anaerbico. El etanol resultante se emplea en la elaboracin de algunas bebidas alcohlicas, tales como el vino, la cerveza, la sidra, el cava, etc. La fermentacin alcohlica tiene como finalidad biolgica proporcionar energa anaerbica a los microorganismos unicelulares (levaduras) en ausencia de oxgeno para ello disocian las molculas de glucosa y obtienen la energa necesaria para sobrevivir, produciendo el alcohol y CO2 como desechos consecuencia de la fermentacin. Las levaduras y bacterias causantes de este fenmeno son microorganismos muy habituales en las frutas y cereales y contribuyen en gran medida al sabor de los productos fermentados. Una de las principales caractersticas de estos microorganismos es que viven en ambientes completamente carentes de oxgeno (O2), mxime durante la reaccin qumica, por esta razn se dice que la fermentacin alcohlica es un proceso anaerbico.BIOLOGA DE LAS FERMENTACIONES.Aproximadamente el 96% de la produccin del etanol mediante fermentacin anivel industrial se lleva a cabo mediante cepas de Saccharomyces cerevisiae. El etanol se produce en la ruta de gluclisis, especficamente en la va anaerbica, en la que el piruvato producido se convierte en acetaldehdo y etanol. La reaccin global es la siguiente:Azucares + levaduras ==> Acohol etlico + CO2 + Calor + Otras sustancias

El rendimiento terico de 1 gramo de glucosa es de 0.51 gramos de etanol y 0.49 gramos de CO . Aproximadamente el 10% de la glucosa se transforma en biomasa y el rendimiento en etanol y CO alcanzan el 90% del valor terico. El ATP formado se utiliza para las necesidades energticas de la clula.FASES EN LA FERMENTACIN:

1 fase (primeras 24 horas), predominan levaduras no esporogeneas, que resisten un grado alcohlico 4-5. Son sensibles al anhdrido sulfuroso.

2 fase,(2-4 da), predomina el Sacharomyces cerevisiae que resiste hasta un grado de alcohol entre 8 y 16. En esta fase es cuando se da la mxima capacidad fermentativa

3 fase, sigue actuando Sacharomyces Cerevisiae junto a Sacharomyces Oviformis. Tambin pueden existir otros microorganismos procedentes principalmente de las bodegas y de los utensilios, suelen ser hongos entre los que destacan Penicillium, Aspergilus-Oidium,...

Otras-sustancias-generadas-en-la-fermentacin-son:-cido-actico-cido-lctico-cido-pirvico-y-acetaldehido- cido succnicoREQUERIMIENTOS NUTRICIONALES DE LA LEVADURA

Los microorganismos se cultivan en agua, a la que se le han aadido los nutrientes apropiados. La solucin acuosa que contiene los nutrientes necesarios se denomina medio de cultivo. Lo nutrientes existentes en el medio de cultivo dan a la clula microbiana todos los ingredientes requeridos para que produzca ms clulas semejantes a ella misma. Adems de las fuentes de energa, que pueden ser substancias orgnicas o inorgnicas, o luz, el medio de cultivo debe de tener fuentes de carbono, de nitrgeno y macro y micro nutrientes respectivos.Un medio de cultivo ptimamente equilibrado es obligatorio para considerar la mxima produccin. La composicin de los medios de cultivo debe ser constantemente adaptada a los procesos de fermentacin. En general los requerimientos bsicos de nutrientes para los microorganismos y las formas comunes de satisfacerlos en los cultivos se enuncian en la siguiente tabla.

Requerimientos

Composicin del extracto de levadura producido mediante autolisis

VARIABLES QUE AFECTAN LA FERMENTACION ALCOHOLICATEMPERATURALa temperatura es el factor de influencia decisiva para las actividades de las levaduras. La temperatura ms adecuada para su reproduccin y la fermentacin oscila entre 22 C a 27 C y se reproduce con mayor rapidez cuando la temperatura es de 25 C. A temperaturas superiores a 30 C, las levaduras pierden capacidad para desdoblar los azcares y al aproximarse a 40 C dejan de crecer y reproducirse (Alvarez, 1991, 112). En una fermentacin alcohlica nunca se debe superar temperaturas de 32 C durante el periodo fermentativo ya que se corren varios riesgos(Madrid, Marzo de 1991). Inactivacin de las levaduras responsables de la transformacin de los azcares en alcohol y CO . Prdida de alcohol por evaporacin con merma de grado alcohlico. Iniciacin de fermentaciones indeseables.La influencia de la temperatura sobre el poder fermentativo, medida del porcentaje de etanol que una cepa de levadura es capaz de producir, es diferente. Cuando se fermenta a temperatura baja o moderada las fermentaciones son lentas, pero el grado alcohlico alcanzado es generalmente mayor que a temperaturas elevadas o superiores a los 30 C 35 C (Surez, 1990, 211).Adems las fermentaciones alcohlicas efectuadas a 25 C obtienen mejores resultados que las efectuadas a 30 C ya que: El crecimiento de microorganismos determinado, muestra que a 25 C la levadura se desarrolla un 25.5% ms que a 30 C; El consumo de slidos solubles, sacarosa y grado alcohlico a 25 C es de 42.8 %, 71.0 % y 7.3 GL respectivamente mientras que a 30 C es de 36.4%, 63.8 % y 6.0 GL(Merchan y Castillo, 1999, 120).El buen desarrollo de la fermentacin esta en parte ligado a la necesidad de evitar que las levaduras sean sometidas a temperaturas demasiado elevadas. La experiencia ha demostrado que son tanto ms sensibles a la elevacin de temperaturas cuanto ms vieja sea la poblacin, lo que constituye una causa de ralentizacin y a veces de parada de la marcha fermentativa, mientras quedan en el medio azcares aun no transformados en alcohol.A partir de 30 C se puede considerar que las levaduras reducen progresivamente su actividad, hasta cesarla completamente cuando se aproxima a los 40 C. El hecho de tratar de mantener la temperatura a un nivel razonablemente bajo no aspira solamente a la mayor regularidad de la fermentacin y mayor grado alcohlico, si no que tiende a frenar la perdida por volatilizacin de una fraccin importante de compuestos aromticos (Surez, 1990, 211).pH

El crecimiento de la levadura y la velocidad de fermentacin no se ve afectado por la variacin de pH entre 3.5 y 6.0 en el medio, pero a valores de pH entre 3.05 hasta 3.50 en el medio, se logra alcanzar un mximo de rendimiento de acuerdo a la formacin de producto y crecimiento de la levadura (Aleixandre, Noviembre de 1998).En una fermentacin alcohlica, el pH vara normalmente entre un mnimo de 2.8 y un mximo de 3.8, rango que depende bsicamente de la composicin del medio a ser fermentado (De Rosa, 1998, 194). Se establece que el pH en valores menores que 3.0 en un proceso fermentativo, se presenta el fenmeno de inhibicin por pH, el cual se debe al efecto que esta variable tiene sobre los centro activos de las enzimas. Estos centros presentan actividad en un determinado estado de ionizacin y este estado vara en funcin del pH el medio. Por lo tanto, la actividad enzimtica es funcin del nmero de centros activos y estos, dependen del pH del medio. Por otra parte, este fenmeno puede interpretarse por el importante efecto que el pH del medio tiene sobre la estructura y la permeabilidad de la membrana celularAjuste del pH Adicin de cido tartrico o de cido ctrico: Los dos nicos cidos que se pueden usar tanto tecnolgicamente como legalmente, son el cido tartrico y el ctrico. Desacidificacin: Los desacidificantes utilizables tcnicamente en las fermentaciones son: el carbonato de calcio, el bicarbonato de potasio y el tartrato neutro de potasio.AIREACINDurante mucho tiempo se pens que las levaduras eran microorganismos anaerobios estrictos, es decir, deba realizarse la fermentacin en ausencia de oxgeno. Sin embargo, es un hecho errneo ya que requieren una cierta aireacin. Esta oxigenacin se consigue en los procesos previos a la fermentacin y mediante remontados de aireacin en la elaboracin de tintos (habitualmente se realizan nada mas arrancar la fermentacin y a las 24 h. despus, remontados tpicos de la escuela bordolesa).Una aireacin sumamente excesiva es totalmente absurda ya que, entre otras consecuencias en el vino, no obtendramos alcohol sino agua y anhdrido carbnico Debido a que las levaduras, cuando viven en condiciones aerbicas, no utilizan los azcares por va fermentativa sino oxidativa, para obtener con ello mucha ms energa.INHIBIDORESEs importante evitar la presencia de inhibidores en el mosto como restos de productos fitosanitarios y cidos grasos saturados de cadena corta.CONCENTRACIN INICIAL DE AZCARESNo podemos pensar en fermentar un mosto con una concentracin muy elevada de azcares. En estas condiciones osmfilas las levaduras simplemente estallaran al salir bruscamente el agua de su interior para equilibrar las concentraciones de solutos en el exterior y en el interior de la clula, es decir, lo que se conoce como una plasmlisis.Esta es la base de la elaboracin de mostos concentrados estables microbiolgicamente (Be >29), si bien determinadas especies de levaduras como Saccharomycodes Ludwigii y Schizosaccharomyces pombe, entre otras, son capaces de resistir.

4. MATERIALES Y METODOSPruebas preliminaresPREPARACION DEL MEDIO DE CULTIVO

Activacion de la levadura a 35C con solucin de azcar al 5 %

Se tomaran muestras cada hora durante 24 horas, hasta conseguir que los grados Brix y ph, sean constantes.Desarrollo de la fermentacin a temperaturas de 25C hasta estabilizar los solidos solubles totales

Determinacion de parmetros en funcin del tiempo: grados Brix, solidos solubles, phS

MATERILAES Y REACTIVOS

Vasos de Precipitado Probetas-Corchos Botella Mangueras Termometro -Refractometro Balanza -Acido Citrico Carbonato de Calcio Levadura -Azucar -Urea Tubos de ensayo Centrifugadora Horno 2 Melones

5. PROCEDIMIENTO PARA LA FERMENTACION

Se hace el lavado de la fruta (meln), se procede a cortar, licuar y filtrar. Al momento de realizar la filtracin se deber anotar el peso de la biomasa inicial. Se hace una medicin inicial de los grados Brix y se aade 130 gr de azcar y 3 gr de cido ctrico para que llegue a 20 grados Brix. Se ajusta la densidad aadiendo 3 gr de cido ctrico, 3 gr de urea y aproximadamente 5gr de levadura. Seguidamente se introduce este lquido a un reactor (botella de damajuana) el cual tiene dos salidas por la parte superior una para sacar las muestras y otra para se pueda liberar el CO2 producido en la fermentacin. Se debe mantener a una temperatura de 35C. Se sacaran 4 muestras cada hora, luego cada 24 hr hasta que los grados brix, ph y la densidad sean constantes. Tratamiento de cada muestra: A cada muestra se la debe centrifugar por 5 min. Luego se debe medir: el ph, la densidad y los grados brix. Seguidamente se debe decantar el tubo de ensayo, quedando solo en la parte inferior la biomasa. Se pesa este tubo de ensayo con la biomasa y luego se introduce en el horno a 100C por 10 min aproximadamente hasta tener un peso constante. Al cabo de una semana se hace la destilacin del lquido fermentado en el reactor.

PROCEDIMIENTO PARA DETERMINACIN DE AZCARES REDUCTORES POR LICOR DE FEHLING

Reactivos Solucin de glucosa al 2 por mil Solucin A (Cprica) Solucin B (Sdica)

Azul de metileno (reactivo indicador)

Agua destilada

Materiales Baln de 500mL Bureta de 25,00mL Pipeta aforada de 5,00mL Pipeta graduada de 5,0mL Probeta de 50mL Pinza de madera Mechero BunsenMETODODeterminacin del Ttulo del Licor de FehlingEn el baln se colocan 5,00mL de solucin A, 5,0mL de solucin B (Licor de Fehling) y 50mL de agua destilada. En bureta solucin de glucosa al 2 por mil. Se calienta a ebullicin sobre mechero Bunsen agitando constantemente el baln con un movimiento giratorio para evitar proyecciones de lquido. Se deja caer la solucin azucarada gota a gota manteniendo el lquido en ebullicin y movimiento. Evitar el agregado de gran volumen de lquido que enfre el Licor de Fehling y provoque la formacin de un precipitado coloidal amarillo de xido cuproso y difcil sedimentacin. La operacin est terminada desde el momento en que el lquido sobrenadante sea completamente incoloro. Para facilitar la determinacin del punto final, se agrega una a dos gotas de azul de metileno como reactivo indicador pero sin retirar el baln del fuego.El indicador es reducido y decolorado por los azcares cuando todo el cobre es precipitado. En este momento se anota el gasto de glucosa (G)Para hallar el ttulo del Licor de Fehling se procede de la siguiente forma:

2 gr de glucosa --------------- 1000 mlT ---------------- G

Conviene repetir dos a tres veces la valoracin con glucosa y promediar los gastos para la determinacin del ttulo, siempre que estos sean concordantes.Determinacin de azcar reductor de la muestraLuego de obtener el ttulo se procede a la determinacin sobre muestra muestra. Para eso se debe decolorar con carbn decolorante ( si fuese necesario) y proceder de igual forma que en la determinacin del ttulo con la variante que en bureta ahora ir nuestra muestra decolorada. Una vez obtenido el gasto de muestra necesaria para decolorar al licor de Fehling (G), se procede de la siguiente forma:G ml de muestra --------------------- T1000 ml ---------------------- X

Cuando se trabaja con mostos, cuyos contenidos de azcar se encuentra entre 150 a 250 g/L, se efecta siempre una dilucin de 100 veces, para esto hacemos dos diluciones sucesivas de 10 veces cada una. En este caso F=100. Esta dilucin la colocamos directamente en la bureta, no es necesario decolorar.Los gastos de nuestra o dilucin deben ser mayores que 5,00mL, sino hay que diluir.MTODO PARA LA DETERMINACIN DEL CONTENIDO ALCOHLICO DE ETANOL POR EL MTODO DE DESTILACIN SIMPLE

Fundamento del mtodoLa muestra se somete a destilacin simple en condiciones especficas y en el destilado se determinan los grados brix (porcentaje de etanol en volumen), utilizando un refractometro.

Materiales Cocina electrica Probeta de 250 ml Aparato de destilacin Baln aforado de 250 mlReactivos Agua destilada Procedimiento - Destilacin En un baln aforado de 250 ml adicionar la muestra y llenar hasta la marca. Instalar el equipo de destilacin. En el baln de destilacin verter la muestra, a continuacin lavar el baln que contena la muestra con agua destilada Comenzar la destilacin con un calentamiento regulado y continuo. Recoger el destilado en el mismo baln en que se midi la muestra, ste baln debe estar sumergido en agua con hielo para evitar prdidas debido a la alta volatilidad del etanol. La destilacin termina cuando se han completado las partes del baln que recibe el destilado retirando. Medir el grado de alcohol

6. PRESENTACION DE RESULTADOSRESULTADOS DE LA FERMENTACINTABLA N 1TiempoHora de medicinFecha

PhTemperaturaDensidadCociente de sacarosa BPeso de biomasa

1

12 pm21/04435 C1.05618.70.763 gr

21 pm21/04433 C1.04418.30.766 gr

32 pm21/04434 C1.04418.30.770 gr

43 pm21/04435 C0.9715.40. 784 gr

5 11 am24/04435 C0.986.80.803 gr

6 11 am25/043.534 C0.986.90.811 gr

71 pm25/04333 C0.987.70.827 gr

88 am28/ 04335 C1.07.30.868 gr

9 9 am29/04335 C1.07.30.894 gr

CARACTERSTICAS DEL SUTRATOCaractersticas (MELON)InicialFinal

Volumen2000 ml1455 ml

Densidad1.023 gr/cm31.011 gr/cm3

Grados Brix ( antes de la fermentacin)10.5 20

Grados Brix ( despus de la fermentacin)---7.3 ( constante)

PH5.54

NUTRIENTES ADICIONADOS:

NUTRIENTESCANTIDAD

Azcar130 gr

Urea terica ( 2 gr / litro)3 gr

Levadura terica ( 3 gr / Litro)5 gr

Acido ctrico(regulador de Ph)3 gr

TITULACION PARA DETERMINAR AZUCARES REDUCTORESMUESTRAGASTO DE TITULACION

GLUCOSA ( titulo)12.5 ml

MUESTRA4.9 ml ( gasto)

Para nuestro caso el titulo seria:

Para la determinacin de azucares reductores en la muestra.

= =