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DESCUBRIENDO LA ESTRUCTURA DE LAS PROTEÍNAS Lucía Pérez Coello. ESCIVE 2009. - PowerPoint PPT Presentation
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DESCUBRIENDO LA ESTRUCTURA DE DESCUBRIENDO LA ESTRUCTURA DE LAS PROTEÍNAS LAS PROTEÍNAS Lucía Pérez CoelloLucía Pérez Coello
A alumna Lucía Pérez Coello, de 2º de bacharelato do I. E. S. Otero Pedrayo de Ourense, estivo durante o verán do 2009 no IBCM (Instituto de Bioloxía Celular e Molecular de Oporto), participando no programa Estancias Científicas (ESCIVE), organizadas en España pola Fundación Española para la Ciencia y la Tecnología (FECYT).
A CONTINUACIÓN PRESÉNTANOS O TRABALLO DESENVOLVIDO DESPOIS DA SÚA ESTANCIA.
ESCIVE
OBJETIVO: impulsar el contacto de jóvenes de entre 15 y 17 años con el trabajo cotidiano en centros y departamentos de investigación españoles y portugueses.
http://www.youtube.com/watch?v=cehkhV6AIlA&feature=player_embedded
IBMC
Instituto
Biología
Molecular
Celular
BIOLOGÍA DE LA INFECCIÓN E INMUNOLOGÍA
BIOLOGÍA MOLECULAR Y ESTRUCTURAL
BIOMATERIALES
GENÉTICA HUMANA Y DOLENCIAS GENÉTICAS
MECANISMOS DE ADAPTACIÓN CELULAR
NEUROBIOLOGÍA BÁSICA Y CLÍNICA
SEÑAL E IMAGEN
Descubriendo la Descubriendo la estructura de las estructura de las
proteínasproteínas
Lucía Pérez Coello
Felipe Demígio Fernandes Pereira
ESCIVE – Ciencia Viva2009
Objetivo
• Estudiar la estructura de las proteínas;
• Comprender su función;
• Determinar los mecanismos de
funcionamiento e interacción con otras
moléculas.
Lisozima
• Enzima
• Estructura tridimensional determinada por primera vez por David Phillips, en 1965.
• Se encuentra en las lágrimas, saliva y moco humanos.
• Producida por varios organismos.
• Destruye la pared celular de las bacterias. Estrutura primária da Lisozima
Pasos para determinar estructuras de
proteínas
1. Producción de 1. Producción de proteínasproteínas
• Clonación
• Expresión (Escherichia coli)
• Purificación Cromatografia• Filtración en gel• Intercambio iónico• Afinidad
2. Cristalización2. Cristalización
MEJORA DE LOS CRISTALES
Las proteínas, como muchas moléculas, pueden ser llevadas a formar cristales cuando son colocadas en condiciones apropriadas. Para que cristalice, la proteína purificada es sometida a una precipitación lenta a partir de una disolución acuosa.
ENSAIOS DE CRISTALIZACIÓN
CONDICIONES DE CRISTALIZACIÓN
OPTIMIZACIÓN
Métodos de cristalización
• Gota colgante
• Gota sentada
•Diálisis
•Difusión en gel
Diagram of hanging drop method. Reservoir solution (blue) usually contains buffer and precipitant. Protein solution (red) contains the same compounds, but in lower concentrations. The protein solution may also contain trace metals or ions necessary for precipitation of particular proteins (McRee, 1993).
1 2 3 4 5 6
A
B
C
D
30 mg/mL 20 mg/mL 10 mg/mL
8+2
7+3
6+4
5+5
(L)
• Preparamos 3 disoluciones (de concentraciones diferentes) que contengan Lisozima en 0,1 M NaAc pH 4.8
• Disolución reservorio: 1 ml de 10% (m/v) NaCl, 0,1 M NaAc pH 4,8 e 25% (v/v) Etilenoglicol
• La gota de la lámina contiene: 6-7 L de disolución de Lisozima y 4-3 L de disolución reservorio (volumen total de 10 L)
•Ponemos las láminas sobre los pozos y los sellamos con silicona
• Los cristales deben crecer dentro de 1-2 días y estar preparados para enfriamiento criogénico.
NUESTROS NUESTROS CRISTALESCRISTALES
Próximos pasos
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/7/73/X_ray_diffraction.png
Se obtiene una muestra y se somete a
enfriamiento criogénico para evitar que se
desestabilice.
DifractómetroDifractómetro
Montaje del cristalMontaje del cristal
3. Difracción3. Difracción
Ley de Bragg :
n= 2d sin
Construyendo el modeloConstruyendo el modeloLos mapas de densidad electrónica son el resultado final del experimento de difracción. Su interpretación en términos de un modelo molecular es la primer tarea del cristalográfo.
Estructuras Estructuras en 3D en 3D
LysozymeLysozyme
http://lysozyme.co.uk/lysozyme-structure.php
Presentación del trabajo realizado