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DETECCIÓN DE GENES BACTERIANOS COMO BIOMARCADORES
MOLECULARES ASOCIADOS A LA CONTAMINACIÓN ANTROPOGÉNICA DE UN
CUERPO DE AGUA SUPERFICIAL
ANA MARÍA JOSÉ CANDELARIA CANO LARROTTA
UNIVERSIDAD DE SANTANDER
FACULTAD DE CIENCIAS, NATURALES Y AGROPECUARIAS
PROGRAMA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
BUCARAMANGA, COLOMBIA
2019
II
DETECCIÓN DE GENES BACTERIANOS COMO BIOMARCADORES
MOLECULARES ASOCIADOS A LA CONTAMINACIÓN ANTROPOGÉNICA DE UN
CUERPO DE AGUA SUPERFICIAL
ANA MARÍA JOSÉ CANDELARIA CANO LARROTTA
Trabajo de grado presentado como requisito para optar al título de
Microbióloga Industrial
Director de investigación
WILFREDO VALDIVIESO QUINTERO
UNIVERSIDAD DE SANTANDER
FACULTAD DE CIENCIAS, NATURALES Y AGROPECUARIAS
PROGRAMA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
BUCARAMANGA, COLOMBIA
2019
III
IV
DEDICATORIA
A mis padres Gloria y Jorge quienes han sido el pilar fundamental para ser la mujer en que me
he convertido y la profesional en la que me convertiré. Por creer en mí y apoyarme en las
decisiones que he tomado para mi vida, por acompañarme y estar siempre cuando los necesito en
los momentos tristes y felices. Por enseñarme la esencia de ser humana, siempre ayudando al que
lo necesita. Mi orgullo es para ustedes por ser los mejores papás que cualquier persona pudiera
tener.
A mis hermanos Juan y Andrés por tener la paciencia suficiente de soportar mi mal humor. De
hacer de todo hasta lo imposible para que siempre esté bien y goce de mi vida. Son el motor más
grande que puedo tener, mi gran orgullo como hermanos y mi ejemplo a seguir. Cada uno de mis
logros va dedicado a ustedes y a mis padres.
A Dios y a la Virgencita porque conocieron mis momentos más difíciles y no me dejaron sola
en ningún momento. Me ayudaron a levantarme de cada tropiezo que di en este largo camino y
me han abierto las puertas para tener una vida llena de felicidad. A ellos les dedico este, mi
logro.
V
AGRADECIMIENTOS
Agradezco especialmente a mi director de tesis Wilfredo Valdivieso Quintero, quien hace año
y medio me abrió las puertas para poder llevar a cabo este proyecto. Por haber creído en mí y
jamás dudar de las grandes cosas que puedo lograr, por haberme permitido darle un giro de 360⁰
a este proyecto. Mil gracias por su acompañamiento, su asesoría, su disponibilidad, su alegría, su
optimismo, su completa confianza hacía mí, por escucharme en los momentos de impotencia y
comprenderme a su manera y sobre todo por enseñarme a ser una profesional independiente en
mi trabajo. Mil y mil gracias, más que un tutor es una excelente persona, colega y gran amigo.
Agradezco a mis amigos y colegas de universidad César Echeverría, Kelly Díaz, Eliud
González, Diego Dovale, Brisley Mora, Carolina Toloza y a todos aquellos que me dieron sus
ánimos y apoyo incondicional para sacar adelante este proyecto y que fueron parte fundamental
de principio a fin de este gran recorrido
A mis compañeras y amigas de laboratorio Angélica Sanmiguel, Alejandra Castro y Mª del
Mar Enciso que siempre estuvieron conmigo para cualquier inconveniente que se presentaba en
el laboratorio. Gracias por cada una de las risas y por haber hecho más alegre y ameno el trabajo
en el laboratorio.
A mis profesores por haberme enseñado el verdadero sentido y amor a la Microbiología
Industrial.
VI
TABLA DE CONTENIDO
1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................... 15
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA .......................................................................... 19
3. JUSTIFICACIÓN ................................................................................................................ 23
4. MARCO TEÓRICO ............................................................................................................ 26
4.1 Contaminación. ............................................................................................................. 26
4.2 Tipos de contaminación. .............................................................................................. 26
4.2.1 Contaminación del suelo....................................................................................... 26
4.2.1 Contaminación del aire......................................................................................... 27
4.2.2 Contaminación del agua. ...................................................................................... 28
4.2.3 Contaminación antropogénica ............................................................................. 30
4.2.4 Contaminación emergente.................................................................................... 30
4.3 Tipos de contaminantes antropogénicos emergentes. ............................................... 30
4.3.1 Plaguicidas ............................................................................................................. 32
4.3.2 Productos industriales .......................................................................................... 33
4.3.3 Hormonas............................................................................................................... 33
4.3.4 Compuestos farmacéuticos ................................................................................... 34
4.3.5 Productos de cuidado personal (PCP)................................................................. 34
4.4 Antibióticos. .................................................................................................................. 34
4.4.1 Listado de antibióticos emergente ....................................................................... 35
4.5 Hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) ........................................................... 37
4.5.1 Listado de hidrocarburos aromáticos policíclicos prioritarios ......................... 38
4.6 Biomarcadores .............................................................................................................. 39
4.6.1 Clases de biomarcadores ...................................................................................... 40
VII
4.6.1.1 Biomarcadores de exposición ........................................................................... 41
4.6.1.2 Biomarcadores de efecto ................................................................................... 42
5. MARCO REFERENCIAL.................................................................................................. 43
6. HIPÓTESIS .......................................................................................................................... 48
7. OBJETIVOS ........................................................................................................................ 49
7.1 Objetivo general ........................................................................................................... 49
7.2 Objetivos específicos .................................................................................................... 49
8. METODOLOGÍA ................................................................................................................ 50
8.1 Selección del cuerpo de agua superficial y puntos de muestreo. .............................. 50
8.2 Toma de muestras ........................................................................................................ 50
8.2.1 Tratamiento de las muestras ................................................................................ 51
8.2.1.1 Extracción de ADN a partir de las muestras de sedimentos. ........................ 51
8.2.1.2 Determinación del espectro de absorción de las muestras de agua .............. 52
8.3 Determinación de condiciones de amplificación de genes blanco. ........................... 53
8.3.1 Selección de los genes blanco ............................................................................... 53
8.3.2 Selección de los microorganismos de referencia ................................................ 53
8.3.3 Extracción de ADN de microorganismos de referencia. ................................... 54
8.3.4 Amplificación de genes blanco utilizando la reacción en cadena de la
polimerasa (RCP) ................................................................................................................ 55
8.3.5 Límite de detección de los genes blanco .............................................................. 56
8.3.6 Detección de los genes de interés en muestras agua y ADN obtenido de
sedimentos. ........................................................................................................................... 57
8.4 Asociación entre la presencia de los genes y el grado de presión antropogénico ... 57
9. RESULTADOS .................................................................................................................... 59
9.1 Selección del cuerpo de agua superficial .................................................................... 59
9.2 Puntos de muestreo. ..................................................................................................... 60
VIII
9.3 Extracción de ADN genómico y de cepas de referencia ............................................ 66
9.4 Determinación del espectro de absorción de las muestras de agua ......................... 67
9.5 Genes blanco y productos de la amplificación. .......................................................... 69
9.6 Límite de detección de genes blanco ........................................................................... 72
9.7 Detección de los genes 16S, intl1 y PAH-RHDαGN................................................... 73
9.8 Asociación de la presencia de los genes y el grado de la presión antropogénica. ... 77
10. DISCUSIÓN ......................................................................................................................... 82
11. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ................................................................ 88
12. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................. 89
13. ANEXOS............................................................................................................................. 107
IX
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Clasificación de los contaminantes emergentes por familia .......................................... 31
Tabla 2. Antibióticos de alta preocupación ecotoxicológica en cuerpos de aguas ...................... 36
Tabla 3. Listado de HAP prioritarios en aguas superficiales por la EPA-US .............................. 38
Tabla 4. Microorganismos de referencia utilizados en este estudio como control de amplificación
de los genes blanco ....................................................................................................................... 54
Tabla 5. Puntos seleccionados para el estudio teniendo en cuenta las coordenadas, el municipio,
la urbanización e industrias por Km2 ............................................................................................ 62
Tabla 6. Cuantificación de ADN genómico de microorganismos de referencia y ADN genómico
de sedimentos superficiales mediante el equipo NanoDrop ......................................................... 66
Tabla 7. Genes blanco utilizados para el estudio con sus respectivas secuencias de
oligonucleótidos, temperatura de anillamiento y tamaño de banda esperado ............................... 70
Tabla 8. Asociación de la presencia de los genes y el grados de presión antropogénica en muestras
de sedimentos de la Quebrada Aguablanca .................................................................................. 78
X
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Principales estructuras aromáticas policíclicas considerabas como contaminantes por la
Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos (EPA-US). ......................................... 38
Figura 2. Biomarcadores de la exposición y biomarcadores de los efectos: utilidad en el medio
ambiente, evaluación y gestión ambiental. ................................................................................... 40
Figura 3. Comparación de cuerpos de aguas superficiales encontrados en el área metropolitana de
Bucaramanga................................................................................................................................. 60
Figura 4. Mapa de la Quebrada Aguablanca del área Metropolitana de Bucaramanga. Puntos
seleccionados para el muestreo de sedimentos y aguas. ............................................................... 61
Figura 5. Puntos de muestreo de la Quebrada Aguablanca mediante Google Maps por Km2.. .. 64
Figura 6. Fotografías correspondientes a los sitios de toma de muestra en las respectivas zonas de
muestreo seleccionadas.. ............................................................................................................... 65
Figura 7. Espectro de absorción desde 200 a 800 nm usando dos tratamientos (A) agitación por
vórtex y (B) centrifugación de las muestras de aguas seleccionadas. ........................................... 68
Figura 8. Espectro de absorción de las longitudes de onda seleccionadas: 250, 254, 262 y 294 nm
de aguas agitadas y centrifugadas. ................................................................................................ 69
Figura 9. Amplificación de las condiciones de los genes blanco utilizando el ADN genómico de
los microorganismos de referencia.. ............................................................................................. 71
Figura 10. Límite de detección de los genes 16S rDNA, intl1 y PAH-RHDαGN utilizando un
sistema convencional 2X.. ............................................................................................................ 73
XI
Figura 11. Productos de amplificación de la detección del gen 16S rDNA utilizando el ADN
genómico de las muestras de sedimento y muestras de agua directa de la Quebrada Aguablanca
mediante el sistema convencional 2X.. ......................................................................................... 74
Figura 12. Productos de amplificación de la detección del gen intl1 utilizando el ADN genómico
de las muestras de sedimento y muestras de agua directa de la Quebrada Aguablanca mediante el
sistema convencional 2X.. ............................................................................................................ 76
Figura 13. Productos de amplificación de la detección del gen RHDαGN utilizando el ADN
genómico de las muestras de sedimentos y muestras de agua directa de la Quebrada Aguablanca
mediante el sistema convencional 2X.. ......................................................................................... 77
Figura 14. Análisis de intensidades de las bandas obtenidas en la electroforesis luego de la
amplificación por RCP para cada punto utilizando el marcador 16S. .......................................... 79
Figura 15. Relación entre la presión antropogénica acumulada y las variables de intensidad de
banda obtenidas en la RCP 16S para (A) sedimentos y (B) aguas en cada punto.. ...................... 80
Figura 16. Relación entre la presión antropogénica acumulada y las variables de intensidad de
banda obtenidas en RCP intl1 para (A) sedimentos y (B) aguas en cada punto.. ......................... 80
XII
LISTA DE ANEXOS
Anexo 1. Revisión bibliográfica de blancos génicos .................................................................. 107
Anexo 2. Composición de reactivos de extracción de ADN ...................................................... 108
Anexo 3. Protocolo de extracción salting out para cepas de referencia. .................................... 110
Anexo 4. Selección de ríos y quebradas como objeto de estudio. .............................................. 112
Anexo 5. Densidades ópticas de las muestras de aguas agitadas y centrifugadas de la quebrada
aguablanca................................................................................................................................... 115
Anexo 6. Fechas de toma de muestras ........................................................................................ 116
Anexo 7. Condiciones y programas de amplificación de los blancos génicos. .......................... 117
XIII
RESUMEN
TÍTULO: DETECCIÓN DE GENES BACTERIANOS COMO BIOMARCADORES
MOLECULARES ASOCIADOS A LA CONTAMINACIÓN ANTROPOGÉNICA DE UN
CUERPO DE AGUA SUPERFICIAL
AUTOR: Ana María José Candelaria Cano Larrotta
PALABRAS CLAVE: presión antropogénica, antibióticos, HAP, genes, biomarcadores, RCP.
DESCRIPCIÓN
La presencia del hombre ha favorecido la introducción de nuevos elementos como metales
pesados y moléculas complejas que llegan a afectar a los organismos presentes que actúan como
receptores permitiendo la transferencia de genes y/o la dismunicón de las poblaciones de los
mismos. Estos efectos son ocasionados, en particular por los antibióticos que se han denominado
contaminantes emergentes por su producción a gran escala, el uso indiscriminado por las
personas y la falta de regulación de los mismos. Y a los hidrocarburos aromáticos policíclicos
(HAP) que se encuentran cada vez más en compuestos del cuidado personal.
Esto junto con la falta de planes para la disposición de antibióticos caducados y de productos del
cuidado personal, favorecen la introducción de estas moléculas a los acuíferos urbanos. Al existir
diferentes moléculas en el medio acuático no llegan a conocerse todas mediante herramientas
convencionales. Por lo tanto, con este estudio se busca una alternativa para poder conocer los
contaminantes presentes en los sedimentos y en el agua asociados a la presión antropogénica,
mediante el uso de biomarcadores moleculares no destructivos.
Para la detección de los genes asociados a los contaminantes se seleccionaron 8 puntos a lo largo
de un acuífero y se amplificaron mediante la RCP. Se observó que en los lugares de mayor
presión antropogénica se detectan una mayor amplificación de genes asociados a antibióticos y
HAP.
XIV
ABSTRACT
TITLE: DETECTION OF BACTERIAL GENES AS MOLECULAR BIOMARKERS
ASSOCIATED WITH THE ANTHROPOGENIC CONTAMINATION OF THE SURFACE
WATER BODY
AUTHOR: Ana María José Candelaria Cano Larrotta
KEY WORDS: anthropogenic pressure, antibiotics, PAH, genes, biomarkers, RCP.
DESCRIPTION
The presence of man human populations in different ecosystems has favored the introduction of
new elements such as heavy metals and complex molecules that com to affect the present
organisms that act as receptors allowing the transfer genes and/or the decrease the population.
These effects are occasional, specially by antibiotics that have become a great escalation, the
indiscriminate use of people and the lack of regulation of them. In addition, polycyclic aromatic
hydrocarbons (PAH) are increasingly found in personal care compounds.
This is accompanied by the lack of plans for the disposal of expired antibiotics, and personal care
products, favor the introduction of these factors to urban aquifers. There are different molecules
in the aquatic environment that are not known by conventional tools. Therefore, this study seeks
an alternative to analyze the contaminants present in sediments and water associated with
anthropogenic pressure, using non-destructive molecular biomarkers.
For the detection of the genes associated with the contaminants, 8 points were selected along an
aquifer and amplified by PCR. It was observed that in places of higher anthropogenic pressure a
greater amplification of genes associated with antibiotics and PAH is detected.
15
1. INTRODUCCIÓN
La contaminación es la incorporación de elementos tóxicos o sustancias que pueden llegar a
ser perjudiciales para el hombre o los ecosistemas (Bermúdez, 2010). Por otro lado, la comisión
Lancet define la contaminación de una forma más completa basada en el concepto por la Unión
Europea: “todo material no deseado, a menudo peligroso, que se introduce en el medio ambiente
de la tierra como resultado de la actividad humana, que amenaza la salud humana y que
perjudica a los ecosistemas” (European Union, 2010; The Lancet Commissions, 2017). Por lo
anterior la contaminación se ha convertido en el mayor desafío desde el inicio del antropoceno,
así como el cambio climático, la desertificación y el agotamiento del suministro de agua dulce
del mundo poniendo en peligro la estabilidad de los sistemas de apoyo de la tierra (agua, suelo y
aire) y al ser humano (Rockström et al., 2009). En particular la contaminación causada por las
emisiones industriales, los escapes de vehículos y los químicos tóxicos, han aumentado en los
últimos 500 años, y los mayores incrementos se ve en países de ingresos bajos y medios (The
Lancet Commissions, 2017).
Existen diferentes tipos de contaminación como la química, biológica, física, entre otras, que
afectan los recursos naturales básicos: agua, suelo y aire, donde estos tipos de contaminación
contribuyen a la carga ambiental de los ecosistemas, es decir, “la capacidad que tiene el medio o
el ecosistema para tolerar la alteración generada por los contaminantes presentes” (Bermúdez,
2010). En particular, dentro de los tipos de contaminación, suscita interés la contaminación
antropogénica; esta se origina en las actividades humanas que se desarrollan diariamente como
las industriales, minero, agropecuario, artesanal y doméstico, esta última es más grave por su
naturaleza y la gran variedad de contaminantes que genera (Hermilo, 2012). La contaminación
16
antropogénica no es un tema reciente, un ejemplo es la manipulación de metales como el plomo
y el cobre que desde hace 2500 años ha contribuido a la diseminación de estos metales en el
ecosistema. Esta contaminación temprana a escala hemisférica se atribuye a las emisiones de
fundición crudas y altamente contaminantes utilizadas para la producción de cobre durante la
época romana y medieval especialmente en Europa y China (Hong et al., 1996). Sin embargo, la
naturaleza y la distribución de los contaminantes en el medio ambiente han cambiado por la
liberación de nuevos compuestos contaminantes en el ecosistema acuático. La aparición de
nuevos contaminantes que no se encontraban en los ecosistemas o que aún no han sido tema de
preocupación como prioritarios son conocidos como polución emergente donde se incluyen
productos farmacéuticos como los antibióticos, drogas no prescritas, entre otros y productos de
cuidado personal (PCP) como filtros UV orgánicos, fragancias, repelentes de insectos, champús,
cosméticos, entre otros que aunque pueden mostrar una baja toxicidad, pueden causar efectos
nocivos a las especies del ecosistema en niveles muy bajos de exposición a estos productos
(EPA, 2016; Molins, 2017).
Los contaminantes de interés para este estudio fueron los hidrocarburos aromáticos
policíclicos (HAP) y los antibióticos. Por un lado, los HAP son contaminantes de dos o más
anillos aromáticos que se producen por una combustión incompleta del carbón, petróleo,
gasolina, basuras, madera y de otras sustancias orgánicas como los alimentos y el tabaco
(ATSDR, 1995; Zafra y Valdivieso, 2016). La presencia de HAP en los ecosistemas acuáticos ha
ido en aumento, no solo por los desastres naturales que se han dado a nivel mundial, sino
también por las actividades que realiza el hombre donde la concentración de estos aumenta cada
vez más en el agua y en los sedimentos. Estas concentraciones de HAP llegan a la cadena trófica
generando toxicidad, mutagénesis, carcinogénesis a los animales y al hombre, así como
17
alteraciones en las comunidades microbianas presentes en los cuerpos de agua, por lo que se han
identificado como contaminantes prioritarios por la Agencia de Protección Ambiental de los
Estados Unidos (APA-EU, 2016) (Zafra y Valdivieso, 2016).
Respecto a los fármacos, su consumo en países como los de la Unión Europea se cifra en
toneladas por año, dentro de los más usados son los antibióticos, los cuales se emplean en
cantidades similares a los pesticidas (Jones et al., 2001). Dang (2007) llevó a cabo un estudio y
encontró que los antibióticos que tenían un mayor consumo fueron: la amoxicilina y
el sulfametaoxazol y entre los antibióticos con mayor reporte en los cuerpos de agua están las
tetraciclinas. Algunos de los fármacos como del cloranfenicol están siendo considerados por la
EPA-US como posibles candidatos a la lista de contaminantes de orgánicos prioritarios en agua
potable, ya que no cuentan con una debida regulación (Hernando et al., 2006; EPA-US, 2009;
Becerril, 2012).
Se han utilizado diferentes herramientas para detectar contaminantes como los HAP y
antibióticos, en los cuerpos de agua para conocer el efecto que estos generan sobre el ecosistema
en general: fauna, flora y microorganismos presentes. En el último siglo, con la ayuda de las
técnicas de biología molecular, se ha propuesto utilizar la detección de biomoléculas como el
ADN, ARN o proteínas específicas como biomarcadores moleculares con el fin de detectar el
efecto de uno o varios contaminantes a la exposición de estos en organismos o microorganismos
receptores (Valdivieso y Zafra, 2016). Sin embargo, la medición de estos biomarcadores
depende, en la mayoría de los casos, del sacrificio de uno o más especímenes para encontrar el
estado de afección de los mismos. Esta práctica puede acentuar aún más el problema ecológico al
sacrificar unidades supervivientes (Fossi y Marsili, 1997). Por esta razón, el presente
18
trabajo utiliza técnicas basadas en la huella genética de microorganismos como indicador de
contaminación.
Debido a que la contaminación por hidrocarburos aromáticos policíclicos y antibióticos están
aumentando cada vez más por encontrarse en cuerpos de aguas en productos domésticos como
detergentes, fármacos, PCPs, entre otros, usados o producidos por el hombre y al no tener una
buena disposición de ellos, surge la necesidad de estudiar diferentes genes que se encuentran
asociados a los diferentes contaminantes que puedan servir como biomarcadores para detectar y
conocer el efecto que este ejerce sobre los microorganismos que están presentes y que son
organismos receptores.
19
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Los contaminantes antropogénicos se han dispersado en el ambiente llegando a afectar
alrededor de un séptimo de todos los ríos de América Latina, Asia y África y estos van
aumentando durante los años (UNEP, 2016). A su vez, estos están emergiendo en aguas
superficiales y subterráneas como resultado de las actividades realizadas por el hombre en
diferentes contextos económicos y sociales: emisiones industriales, derrames accidentales,
industrias agropecuarias, mineras, quema de combustibles fósiles, deforestaciones, transporte,
construcción, urbanización, desecho de fármacos, desechos de productos de cuidado personal,
entre otras (Mofdno-Reséndez et al, 2015). Colombia es un país con numerosas fuentes hídricas,
las cuales se están viendo afectadas por este tipo de contaminantes antropogénicos. A pesar de
las estrictas regulaciones en el sistema de manejo de residuos como el decreto Legislativo N°
1278, Ley de Gestión Integral de Residuos Sólidos y la ley N° 27314, Ley General de Residuos,
los sistemas actuales de manejo de residuos siguen utilizando los métodos primitivos como
vertido abierto en tierra o el agua como vehículo de transporte de desechos, (Aderemi et al.,
2011) permitiendo la inclusión de nuevas moléculas en diferentes ecosistemas variando la
calidad física, química y biológica de las fuentes hídricas ya que estos no cuentan con las
condiciones físico-químicas y biológicas para la asimilación de los contaminantes, hecho que
induce cambios en: i) la cantidad de individuos de cada población presente, ii) en su fisiología,
iii) en la organización poblacional de las especies que hacen parte del ecosistema y iv) en la
actividad biológica que cada uno realiza (Bickham et al., 2000; Marín, 2003; Holguín et al.,
2006; Ho y Leung, 2017; Sampaio et al., 2018).
20
Los contaminantes emergentes han recibido gran atención, debido a que son contaminantes
que en la mayoría de los casos no reciben un control o una regulación (Becerril, 2012). Estos son
compuestos de diferente origen y naturaleza química, de los cuales se conoce poco con respecto
a la presencia e impacto en los ecosistemas y en el ser humano, por lo que se requiere el
desarrollo de investigaciones sobre los mismos. Dentro de los contaminantes emergentes se
encuentras los productos de cuidado personal como los insecticidas (DEET del inglés N, N-
diethyl-m-toluamide), parabenos (cosméticos), biocidas (triclosan) (pasta de dientes, jabones),
agente de filtros solares, almizcle sintético; esteroides y hormonas como andrógenos
(testosterona, androstenediona), estrógenos (estrona, estriol, estradiol), xenoestrógenos
(etinilestradiol, dietilestilbestrol), fitoestrógenos; productos farmacéuticos como los antibióticos
(ciprofloxacina, eritromicina, tetraciclina, sulfametoxazol), medios de contraste (loperamida,
iopamidol), prescritos (benzodiacepinas, salbutamol, carbamacepina), paracetamol, ibuprofeno y
aditivos industriales como los disolventes clorados, ftalatos, dioxinas, hidrocarburos
poliaromáticos (Silveira, 2013).
De todas las nuevas partículas y sustancias contaminantes han ganado gran importancia dos
principalmente, los compuestos tipo HAP y los antibióticos (Agudo, 2009; Quijano, 2016). Los
HAP son utilizados para producir productos de aseo personal, cosméticos, perfumes, productos
de pintura, coque, alquitrán, brea, betún, asfalto, entre otros, productos que al terminar su vida
útil son vertidos indiscriminadamente por las personas en cuerpos de agua aumentando las
concentraciones de los hidrocarburos permitidos por la normatividad.
Por otra parte, se encuentran los antibióticos que, debido a sus propiedades fisicoquímicas,
productos de degradación y a las características de los suelos, estas sustancias pueden
encontrarse en las aguas superficiales y subterráneas o pueden quedar retenidas en los
21
sedimentos generando una acumulación de estos y por ende afectando el ecosistema y a los
humanos a través de la cadena trófica (Barceló y López de Alda, sf).
La presencia de HAP y antibióticos (o sus metabolitos) en los cuerpos de agua, pueden
inducir un cambio en la expresión de genes en organismos a diferentes niveles, desde bacterias
hasta peces y plantas, e influir en las relaciones y estructuras poblacionales de las especies
receptoras. En el caso de los microorganismos, se favorece el crecimiento y propagación de
aquellas especies que poseen los genes necesarios para su metabolismo o degradación (Lindgren,
Hassellöv y Dahllöf, 2014, Yan et al., 2019). Los HAP modulan cambios poblacionales en los
microorganismos del ecosistema; al haber la presencia de una mezcla de HAP (fenantreno,
antraceno, fluorantreno, pireno, entre otros) en el medio acuático genera la disminución de la
diversidad poblacional microbiana de los filos: bacteroides, fusobacteria, plantomycetes,
mientras aumenta la presencia de bacterias del filo proteobacterias que son más abundantes en
sedimentos y agua contaminados con hidrocarburos del petróleo (Feng et al., 2009; Zhang et al.,
2010; Mason et al., 2014; Mukherjee et al., 2014). Las bacterias del filo proteobacteria como
Pseudomonas sp, Alcaligenes sp. Rhodococcus sp, Microbacterium, Sphingomonas,
Mycobacterium, entre otras, tienen la capacidad metabólica de degradar HAP presentes en el
medio acuático, para ello, las bacterias cuentan con múltiples genes (CYP1A, alkB, phnAc, nah,
entre otros) y sus productos proteicos para llevar a cabo la degradación de HAP (Jone et al.,
2003; Kim et al., 2004) y que a su vez sirven como biomarcadores para el monitoreo de estos
contaminantes.
Los antibióticos por su parte generan un efecto a corto plazo por la acción bacteriostático y
bactericida con la consiguiente desaparición de algunas poblaciones microbianas y su
funcionamiento ecológico lo que genera un impacto indirecto permitiendo el desarrollo de la
22
acción de bacterias resistentes a los antibióticos y, en algunos casos cepas bacterianas capaces de
degradarlos por procesos metabólicos o co-metabólicos (Ding y He, 2010). La resistencia a los
antibióticos están implicados diferentes genes que codifican para diferentes antibióticos como
aacC2 (aminoglucósidos), blasSHV (β-lactama), floR (cloranfenicol), ermA, mefA (Macrolidos,
Lincosaminas y Estreptogramina por sus siglas en inglés MLSB), sulI, suIIl (sulfonamida) y
tetA, tetC, tetO y tetW (tetraciclina). Además, se encuentran genes relacionados a la resistencia
antiséptica (qacE∆1) y genes asociados a la transferencia de resistencia a antibióticos (tnpA e
int1) por transferencia horizontal entre bacterias en ambientes acuáticos (Scekeres et al., 2018).
Teniendo en cuenta lo anterior, el estudio de la detección de genes asociados a HAP y
antibióticos en el agua y los sedimentos se hace importante dada la incidencia directa e indirecta
que generan en la dinámica poblacional de los microorganismos presentes en el ecosistema,
afectando sus procesos biológicos y por ende afectando las actividades de los organismos que
también hacen parte de él. Por ello, el presente estudio busca detectar genes asociados a
contaminantes (HAP y antibióticos) en la quebrada Aguablanca, Santander con el fin de poder
determinar diferencias entre la amplificación de los genes bacterianos asociados a los
contaminantes con la presión antropogénica que existe a lo largo del cuerpo de agua superficial.
Pregunta de investigación: ¿Pueden identificarse diferencias en la amplificación de genes
bacterianos asociados a contaminación emergente por antibióticos y contaminación por HAP con
el grado de presión antropogénica en un cuerpo de agua de la ciudad de Bucaramanga?
23
3. JUSTIFICACIÓN
Los contaminantes emergentes se refieren a los químicos que se han identificado como
presentes en aguas naturales, los cuales no tiene estándares regulatorios asociados y hasta ahora
están comenzando a ser evaluados por su importancia ecológica y riesgos tanto para la salud
pública y acuática (comunidad de peces, invertebrados, microorganismo, entre otros) y la calidad
del agua (Nearragansett Bay Estuary Program, 2017). El interés sobre estos contaminantes ha
aumentado por la gran variedad de contaminantes de interés emergente, la diversidad de sus
estructuras químicas, la falta de información en cuanto el mecanismo de transporte y
transformación y sus efectos en la salud humana y en el medio ambiente (Arbeláez, 2016).
Surge el interés de dos grupos de contaminantes por su importancia ambiental y salud pública
en los últimos años: productos de HAP y antibióticos. Los primeros al ser omnipresentes en el
medio ambiente se ha demostrado que generan una toxicidad aguada y crónica en humanos y
otros organismos (Oris y Giest, 1986; Neff y Burns, 1996; Lotufo et al., 2003) como la
carcinogénesis y mutagénesis por compuestos como benzo (a) antraceno, criseno, benzo (b)
fluoranteno, benzo (a) pireno, entre otros; en particular el benzo (a) pireno se ha identificado por
ser altamente carcinógeno. La toxicidad de los HAP se ve afectada por el metabolismo y la
fotooxidación; generalmente los HAP son más tóxicos en presencia de la luz ultravioleta; los
HAP en el medio acuático son de gran importancia ya que estos tienen una toxicidad de
moderada a alta en las especies acuáticas y en las aves a diferencia de la presencia de los HAP
en el suelo que es poco probable que ejerzan un efecto tóxico sobre invertebrados terrestres
(Peter, 2003). La EPA ha publicado una lista de 20 HAP como contaminantes prioritarios, por tal
24
motivo es importante monitorear las concentraciones ambientales de HAP para evitar los efectos
adversos de este tipo de contaminante en las especies del medio acuático.
Los antibióticos, por otro lado, en la última década, han generado gran importancia y
preocupación por los efectos adversos que el uso y la eliminación de estos podrían afectar la
salud humana y ecológica. Las concentraciones de antibióticos generalmente se encuentran en
áreas de fuerte presión antropogénica como efluentes de hospitales y efluentes de aguas
residuales (Verlicchi et al., 2015; Patrolecco et al., 2015Orya et al., 2016). Se ha demostrado que
después de pasar por el tratamiento de aguas residuales, los antibióticos, entre otros compuestos,
se liberan directamente el medio ambiente (Kümmerer, 2001) lo que conlleva a una amenaza
grave y creciente para la salud humana y la vida silvestre por la resistencia a los antibióticos
generando cientos de miles de muertes al año (Revisión sobre resistencia a los antimicrobianos,
2014).
La identificación de estos dos grupos de contaminantes en cuerpos superficiales de aguas se
ha estudiado mediante el uso de biomarcadores que son definidos como el cambio en el sistema
biológico que puede estar relacionado con una exposición o efecto de un producto químico
ambiental o químico (Shugar et al., 1993) para ello se han utilizado especímenes vivos como
peces, mejillones, almejas, entre otros, como especies objetivo que deben ser sacrificados para su
posterior estudio, lo que propicia más al impacto del medio acuático disminuyendo las especies
de poblaciones que ya se encontraban en riesgo (Chaousis et al., 2017). Por ello, se ha
identificado el uso de biomarcadores moleculares basados en el uso de microorganismos como
especies objetivos, lo cual permite un examen rápido y económico de muestras ambientales para
detectar el efecto tóxico y genotóxico de los contaminantes en el medio (Logar, 2007). Dado que
las bacterias son más sensibles a las perturbaciones ambientales ya que responden a niveles bajos
25
de contaminantes, así como cambios físicos, químicos y bióticos. Además, cumplen con
requisitos básicos: i) están presentes en grandes cantidades en aguas contaminadas, ii) persisten
en el medio ambiente durante largos tiempos para ser detectados por diferentes métodos (Steven
et al., 2001), iii) las bacterias presentan tasas de crecimiento rápidas lo que las hace ideales como
bioindicadores para el monitoreo ambiental de factores estresantes de fuentes naturales y
antropogénicas y iv) no generan un gran impacto para el ecosistema como el uso de especímenes
vivos (Caruso et al., 2004).
Se han estudiado los cambios poblacionales de microorganismos que están asociados a
diferentes contaminantes, para ello mediante métodos moleculares se estudia la diversidad
microbiana del ambiente contaminado como la cinética de reasociación de ADN, la hibridación
de ADN-ADN y ARNMm_ADN, la clonación, secuenciación de ADN y la reacción en la cadena
de la polimerasa (RCP). Este último resulta de forma sencilla para estudiar el cambio o la
diversidad de las poblaciones microbianas utilizando genes clave para su monitorización
(Fakruddin y Mannan, 2013). En particular los genes 16S y 23S del rDNA y algunos genes
estructurales de proteínas, son candidatos para este tipo de estudios (Roszak y Colwell, 1987).
Para ello, se lleva a cabo mediante la reacción en cadena de la polimerasa (RCP) herramienta
molecular útil para este tipo de estudios ya que es una técnica rentable, relativamente fácil y
permite dar un aporte para continuar con estudios utilizando técnicas más complejas, sensibles y
cuantitativas como la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (RCPq), la reacción en
cadena de la polimerasa en tiempo real (RCP-TR), entre otras.
26
4. MARCO TEÓRICO
4.1 Contaminación.
Existen diferentes entidades que definen la contaminación, una de ellas la Ley de Agua
potable Segura (SDWA por sus siglas en inglés), esta es una ley federal de los Estados Unidos
que protege los suministros públicos de agua potable en todo el país y define a la contaminación
“como una sustancia o sustancia química, física, o radiológica en el agua”. Bajo el SWDA, la
EPA establece los estándares para la calidad del agua y así mismo garantizar la seguridad del
agua potable (EPA-US, 2016).
Por otro lado, la comisión Lancet define la contaminación al material no deseado, casi
siempre peligroso, que se introduce en el medio ambiente como el resultado de la actividad
humana, la cual amenaza a la salud humana y daña a los ecosistemas (UE, 2010).
Adicionalmente, la comisión Lancet definió el contaminante como “la totalidad de todas las
formas de contaminación que tiene el potencial de dañar la salud humana”.
4.2 Tipos de contaminación.
4.2.1 Contaminación del suelo.
La contaminación del suelo es el desequilibrio químico, físico y biológico del suelo que llega
a afectar negativamente a los humanos, plantas y animales, ya que se tiene un manejo
inadecuado de residuos sólido y líquidos. Este tipo de contaminación se da por sustancias
químicas y basuras; las sustancias químicas pueden ser tanto de tipo industrial como natural, ya
sea por residuos líquidos, como aguas residuales de vivienda o por la contaminación atmosférica.
27
Entre los principales contaminantes del suelo se encuentran los metales pesados como el cadmio
y el plomo (Bolaños, 2009).
Martínez et al (2005) definen la contaminación del suelo como la introducción de elementos
extraños al sistema del suelo o la existencia de un nivel inusual en el medio que, por su efecto
con los componentes, genera un efecto nocivo para los microorganismos del suelo, sus
consumidores o es susceptible de transmitirse a otros sistemas.
Los efectos desfavorables de los contaminantes en el ecosistema (Genou et al., 1992; Porta et
al., 1994) son: la destrucción de la autodepuración por procesos de regeneración biológica
normales, al haberse pasado el límite de aceptación del suelo. Por tanto se ven afectados los
ciclos biogeoquímicos y la función de biofiltro; disminución del crecimiento de los
microorganismos del suelo o bien la alteración de la diversidad de estos lo que hace alterar el
sistema: disminución en el rendimiento de los cultivos con posibles cambios en la composición
de los productos que resultan ser un peligro para la salud de los consumidores, al entrar en la
cadena trófica; contaminación de las aguas superficiales y freáticas por procesos de transferencia
ya que se alcanzan concentraciones superiores a la que son consideradas como aceptables.
4.2.1 Contaminación del aire.
Martínez et al (2004) definen a la contaminación del aire como la presencia de sustancias en
una cantidad que implican molestia o riesgo para la salud de las personas y los seres vivos. Los
principales mecanismos de contaminación del aire son los procesos industriales donde implican
la combustión, tanto de industrias como en automóviles y calefacciones residuales, que emiten
CO y CO2, óxidos de nitrógeno y azufre.
28
La contaminación atmosférica es todo cambio en el equilibrio de estos componentes, lo que
lleva a alterar las propiedades físicas y químicas del aire, es decir, cualquier cambio en la
naturaleza del aire que se produzca se denomina contaminación, estos cambios se generan por
agentes externos no naturales como: la combustión utilizada para obtener calor, generar energía
eléctrica o movimiento, ya que esta emite gases contaminantes siendo uno de los principales
contaminantes de atmósfera porque afecta el desarrollo normal de plantas y animales y afectan
negativamente la salud humana (Hernández, 2009).
Existen dos tipos de contaminantes del aire o atmosféricos: i) contaminantes primarios,
aquellos que se emiten directamente a la atmósfera como dióxido de azufre, que daña la
vegetación y generan irritación en los pulmones (AutoStanley, 2007) y ii) los contaminantes
secundarios, que se forman mediante los procesos químicos atmosféricos que actúan sobre los
contaminantes primarios o sobre especies no contaminadas. Dentro de estos contaminantes
sobresalen el ácido sulfúrico, el dióxido de nitrógeno y el ozono.
4.2.2 Contaminación del agua.
La contaminación del agua es la alteración de sus características naturales producida
principalmente por la actividad humana que la hace parcial o totalmente inadecuada para el
consumo humano o como el soporte para la flora y fauna. Como resultado de la contaminación,
las fuentes hídricas han sufrido cambios en su color y composición, esto generado por la basura
que llega a estas fuentes (desechos domésticos, detergentes, petróleo, pesticidas, entre otros).
Estos desechos generan alteraciones en el sabor, densidad y pureza. Existen diferentes
contaminantes del agua, algunas de ellas son las aguas residuales y los residuos provenientes de
las industrias (Peñaloza, 2012).
29
Al igual que los contaminantes del aire, los contaminantes del agua se generan a partir de
diversas fuentes, tanto naturales como antropogénicas. Debido a que el agua no tiene límites, los
contaminantes producidos en un lugar, frecuentemente, terminan en otro. Cada año se produce
millones de toneladas métricas de desechos considerados como peligrosos por estándares
estatales y federales. El 90% de estos desechos terminan en los cuerpos de agua, campos y aguas
subterráneas (Quintana et al., 2007).
En el agua se pueden presentar diferentes tipos de contaminantes como la eutrofización o
contaminación por nutrientes orgánicos e inorgánicos; por agentes infecciosos; compuestos
orgánicos tóxicos; compuestos inorgánicos tóxicos como el mercurio, nitratos y nitritos, sales y
cloruros; sedimentos y contaminación térmica. Los mayores contaminantes son los i) nutrientes
orgánicos, donde se generan en los campos fertilizados, de plantas de tratamiento de lodos
residuales y de las industrias. Estos sirven como un alimento para bacterias aeróbicas y provocan
la proliferación de las poblaciones acuáticas naturales de los microorganismos. La
descomposición de estos materiales por las bacterias genera la disminución del oxígeno disuelto
provocando efectos sobre los organismos acuáticos que necesitan del oxígeno; ii) los nutrientes
inorgánicos destacan el nitrógeno y el fósforo que también son considerados como
contaminantes antropogénicos importantes. Los fertilizantes inorgánicos y los detergentes para la
lavandería son la fuente principal, ambos generan un crecimiento excesivo de las plantas en el
agua; iii)los contaminantes orgánicos abarcan un gran número de compuestos, muchos de los
cuales no son biodegradables o su degradación es lenta y son carcinogénicos en humanos; iv) los
contaminantes inorgánicos abarcan compuestos como los metales, en particular el plomo y el
mercurio que son los principales contaminantes y las sales de diversas fuentes (Quintana, 2007).
30
4.2.3 Contaminación antropogénica
La contaminación humana o antropogénica se origina a parir de las actividades humanas que
se desarrollan cada día, como son las industriales, mineras, agropecuarias, artesanales y
domésticas que son más graves por la naturaleza y la gran variedad de moléculas nuevas que
generan (Garrido, 2000).
4.2.4 Contaminación emergente
Los contaminantes emergentes o llamados también micro contaminantes son compuestos
químicos producidos de las actividades humanas que hasta ahora no se habían considerado
perjudiciales para la salud humana, organismos y microorganismos del ecosistema. Estos
compuestos son liberados en pequeñas cantidades y con el tiempo y a su debido uso intensivo y
generalizado, se van acumulando en el ecosistema. Lo que genera mayor preocupación de estos
contaminantes es que a bajas concentraciones pueden traer efectos nocivos a los seres vivos,
sobre todo a largo plazo, llegando a acumularse en cuerpos de agua generando la pérdida de la
biodiversidad de ecosistemas acuáticos como también provocan la aparición de microorganismos
patógenos resistentes a antibióticos (Undiano, Arroyo y Ayala, 2017).
4.3 Tipos de contaminantes antropogénicos emergentes.
Los contaminantes emergentes abarcan una amplia variedad de productos de uso diario que
poseen diferentes estructuras, y diferentes aplicaciones domésticas e industriales como, por
ejemplo: productos industriales y de higiene personal, hormonas, fármacos y pesticidas, que en la
mayoría de los casos resultan ser tóxicos, persistentes y bioacumulables. En la tabla 1 se observa
la clasificación de algunos de los contaminantes emergentes.
31
Tabla 1. Clasificación de los contaminantes emergentes por familia.
Familia Compuesto
Pesticidas
Atrazina
Simazina
Terbutrina
Cianazina
Propazina
Diazinon
Dimetoato
Linuron
Fenitrotion
Alfa-endosulfan
Heptacloro y epóxido de heptacloro
Trifluralina
Compuestos industriales
Polibromodifenil éteres (PBDEs)
NP
OP
BPA
DEHP
Hormonas
17-alfa-etinilestradiol
17-beta-estradiol
Estriol
Estrona
Ethinil estradiol
Estradiol
32
Tabla 1. (Continuación) Clasificación de los contaminantes emergentes por familia.
Fármacos
Carbamazepina
Diclofenaco
Diazepan
Ibuprofeno
2-etildieno-1,5-dimetil-3,3-difenilpirrolidina (EDDP)
Acetaminofen
Ketoprofen
Atenolol
Popanolol
Sulbatamol
Metilparabeno
Productos de higiene personal
Etilparabeno
Propilparabeno
Butilparabeno
Triclosán
Fuente: Mayo, 2016b
4.3.1 Plaguicidas
Los plaguicidas son sustancias destinadas a prevenir, destruir o mitigar las plagas. Debido a la
regulación de la cual han sido objeto, se han estudiado durante años y por ello se tiene
conocimiento sobre su presencia y destino en el medio acuático. En los últimos años, la
preocupación por estos productos se centró en los metabolitos, productos de degradación que han
sido ignorados hasta la fecha y que se han visto que pueden ser mucho más tóxicos que los
compuestos a partir de los que se generan. Diferentes estudios han mostrado que los metabolitos
de los plaguicidas se detectan en aguas subterráneas y el suelo. La vida de los pesticidas varía
33
según el tipo de organismo presente en el suelo, la textura (arenoso, arcilloso o limoso), pH y
humedad, entre otros (Martínez et al., 2018)
4.3.2 Productos industriales
Estos productos se emplean en diferentes productos comerciales, tales como muebles,
plásticos, tejidos, pinturas, surfactantes, aparatos electrónicos, retardantes de llama en plástico o
espuma. Varias de estas sustancias son clasificadas como tóxicas para organismos acuáticos
(Meironyte et al., 1999). A su vez, son resistentes a la acción de microorganismos por lo cual son
altamente bioacumulables en los tejidos adiposos de los organismos vivos, la solubilidad de estos
puede variar dependiendo de la temperatura y el pH (Noren et al., 2000).
4.3.3 Hormonas
Las hormonas son compuestos que se encargan de controlar el sistema endocrino e
inmunológico. Existen dos clases de hormonas: naturales y sintéticas. Las hormonas naturales
son los andrógenos, corticoides y estrógenos y las sintéticas son fármacos estrogénicos,
principalmente xenosestrógenos sintéticos. Las hormonas de mayor uso son los anticonceptivos y
los esteroides. En particular los estrógenos son un grupo de esteroideos que tienen gran
importancia en la mujer y es el compuesto más excretado constantemente por las mujeres (Yan et
al., 2009). La presencia de hormonas esteroideas en el medio acuático está recibiendo gran
importancia ya que pueden interferir en el funcionamiento normal del sistema endócrino de los
seres humanos y los animales (Zhenget et al., 2008). Así mismo, se ha demostrado que están
asociados a diferentes enfermedades humanas y hermafrodismo en peces (Shao et al., 2005). En
el caso de los estrógenos son constantemente vertidos en el medio ambiente debido a la
eliminación incompleta en plantas de tratamiento de aguas residuales.
34
4.3.4 Compuestos farmacéuticos
Los fármacos son moléculas complejas que poseen diferentes propiedades fisicoquímicas y
biológicas, aunque algunas de estos compuestos son moléculas pequeñas que se caracterizan por
su elevada polaridad (Kummerer et al., 2009). En la actualidad los fármacos son considerados
como el grupo de contaminantes emergentes más significativos, debido al aumento del consumo
de estos y a la automedicación. Estos son incorporados en el medio acuático por la excreción de
humanos y animales, vertidos de industrias farmacéuticas, residuos hospitalarios y la eliminación
de productos no utilizados que alteran la actividad enzimática de los microorganismos, afectando
los procesos de biodegradación de la materia orgánica en el sistema acuático (Varo et al., 2016).
4.3.5 Productos de cuidado personal (PCP)
Estos productos son utilizados para el higiene personal diario como desinfectantes,
conservantes, perfumes, cremas de dientes, cremas de hidratación, jabones, champú,
bloqueadores solares, que por su uso constante son incorporados en el medio acuático. La
presencia de estos compuestos en los cuerpos de aguas ha generado afectaciones adversas en los
organismos vivos, por ejemplo, el triclosán puede ser degradado por bacterias o reaccionar con la
luz del sol, dando lugar a compuestos clorofenoles. Adicionalmente, la similitud de la estructura
química con las hormonas tiroideas, pueden afectar a la acción de esta hormona que desempeña
un papel importantes en el desarrollo de muchas especies, interfiriendo en la metamorfosis de los
anfibios (Shi, 2000).
4.4 Antibióticos.
Los antibióticos son medicamentos destinados al tratamiento de las infecciones generadas por
las bacterias. De igual forma al existir múltiples especies bacterianas que generas infecciones en
personas y animales también existen una amplia variedad de antibióticos que actúan con un
35
grado de selectividad frente a las bacterias. El objetivo de estos medicamentos es ayudar al
organismo a combatir a las bacterias causantes de la infección. Al existir una amplia variedad de
antibióticos, es importante que la selección de los antibióticos sea llevada a cabo por una persona
capacitada para tal fin (Portalfarma, 2018). Al hacer un uso indebido de los antibióticos como la
automedicación genera la contaminación y lo que es más grave promueve a la aparición de
bacterias resistentes a los antibióticos. Este hecho, de la automedicación se ve en diferentes
países; estudios llevados a cabo en Turquía, Jordania, Sudán, Litonia, Estados Unidos, México,
Finlandia y Palestina reportaron cifras de 45,8%, 40.7%, 48%, 39.9%, 43%, 5%, 28.1% y 19.9%
de automedicación por antibióticos respectivamente (Cagri et al., 2003; Awad et al., 2005;
Berzanskyte et al., 2006, Richman et al., 2001; Calva, 1996; Väänänen et al., 2006; Sawalha,
2008).
Al haber un uso indebido de los antibióticos y al ser excretados en la orina en un 80% y en las
heces fecales en un 75% (Kemper, 2008), estos están apareciendo cada vez más en los cuerpos
de agua. Un estudio realizado por Roberts (1999), Dang (2007) y Shakil et al (2008) reportaron
que los antibióticos que destacan son la amoxicilina y el sulfametoxazol y entre los antibióticos
con mayor reporte en los cuerpos de agua están las tetraciclinas, los aminoglicósidos, los
macrólidos, los betalactámicos y la vancomicina.
4.4.1 Listado de antibióticos emergente
La tabla 2 se enumeran los antibióticos que puede considerarse de alta preocupación
ecotoxicológica. La selección de los mismos se dio por diferentes parámetros como los de mayor
consumo, detección frecuente en muestras ambientales, persistencia y efectos tóxicos detectados
en bajas concentraciones (Välitalo et al., 2017).
36
Tabla 2. Antibióticos de alta preocupación ecotoxicológica en cuerpos de aguas.
Familia de
antibióticos
Nombre de la
sustancia
Abreviación Tipo de agua
Quinolonas Enroflxacina ENR Efluente de gua de río
Ciproflaxacina CIP Efluente de gua de río
Norfloxacina OFL Efluente de gua de río
Sulfonamidas Sulfadiazina SDZ Agua de mar, efluente agua de río
Sulfapiridina SPY Efluente de gua de río
Sulfametazina SMN Efluente de agua
Sulfadimetoxina SDM Efluente de agua subterránea
Sulfameazina SMR Efluente de gua de río
Sulfamethoz SMX Efluente de gua de río, agua de mar y subterránea
Sulfametoxazol STZ Efluente de gua de río
Sulfaclorpiridazina SCP Efluente de gua de río
Trimetropina Trimetoprima TMP Efluente de gua de río y de mar
Macrolidos Claritromicina CLA Efluente de gua de río, agua de mar y subterránea
Eritromicina ERY Efluente de agua de río
Eritromicina-H2O ERY-H2O Efluente de agua de río
Azitromicina AZM Efluente de agua de río
Penicilina Amoxicilina AMOX Efluente de agua de río y de mar
Ampicilina AMP Efluente de agua de río
Tetraciclina Tetraciclina TCN Efluente de agua de río
Clortetraciclina CTC Efluente de agua de río
Doxiciclina OTC Efluente de agua de río
Doxiciclina DXC Efluente de agua de río
Nitroimidazoles Metronidazol MNZ Efluente de agua de río
37
Lincosamidas Licomisina LIN Efluente de agua de río
(Fuente: Välitalo et al., 2017)
4.5 Hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP)
Los HAP, son un grupo de sustancias compuestas por dos o más anillos aromáticos unidos
que se producen cuando la materia orgánica que contiene carbono e hidrógeno reacciona con el
oxígeno expuesto a temperaturas de más de 700˚C formándose CO2 y H2O; pese a que no hay
oxígeno suficiente, la combustión es incompleta, donde parte del combustible no reacciona con
el oxígeno y se forman productos secundarios como el CO y HAP, este proceso se le conoce
como pirólisis (Agudo, 2009). La presencia de estos contaminantes en las superficies de agua
proviene de diferentes fuentes como la deposición de la suspensiones en el aire por emisiones
industriales, aguas residuales municipales, corrientes de áreas de almacenamiento de carbón,
efluentes de plantas de tratamiento de madera, además, de los derramamientos accidentales de
crudo y los lixiviados generados en aguas superficiales y subterráneas durante las extracciones
del petróleo constituyen una fuente importante para la contaminación de aguas por HAP (Giger y
Blumer, 1974; Perwak et al., 1982). Otras fuentes son los gases de escape de los automóviles, el
desgaste de neumáticos y de asfalto, la irrigación de coque sobre efluentes, fugas o lixiviados en
tanques de almacenamiento que poseen problemas de corrosión (Schauer et al., 2003; Reyes,
2006; Che et al., 2008).
Existe evidencia de que los HAP presentes en aguas pueden causar deterioro reproductivo en
una variedad de organismos, incluidos los peces, a través de su capacidad para alterar la función
endocrina y sus efectos citotóxicos y mutagénicos en las células germinales (Logan, 2007) así
como la desaparición o inhibición de grupos microbianos clave en los procesos biológicos del
ecosistema. Todo esto se debe a que la regulación de estos contaminantes es escasa debido a que
38
no se conocen todas las especies químicas presentes y para su medición se utilizan herramientas
fisicoquímicas que solo mide los efectos que se generan en el cuerpo de agua y no mide el efecto
que estos tipos de contaminantes generan en las especies del ecosistema.
Figura 1. Principales estructuras aromáticas policíclicas considerabas como contaminantes por la EPA-US.
4.5.1 Listado de hidrocarburos aromáticos policíclicos prioritarios
En la tabla 3 se observa la lista de hidrocarburos aromáticos policíclicos prioritarios en las
aguas superficiales por la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos (EPA-US).
Tabla 3. Listado de PAH prioritarios en aguas superficiales por la EPA-US
Sustancias prioritaria
1,2-difenilhidrazina
2-cloronaftaleno
3.3’-diclorobencidina
3,4-benzofluoranteno
39
Tabla 3. (Continuación). Lista de PAH prioritarios en aguas superficiales por la EPA-US.
Acenafteno
Acenaftileno
Antraceno
Bencidina
Benzo (a) antraceno
Benzo (b) fluorantreno
Benzo (a) pireno
Benzo (b) fluoranteno
Benzo (ghi) perileno
Criseno
Dibenzo (a,h) antraceno
Fenantreno
Fluorantreno
Fluoreno
Indeno (1,2,3-cd) pireno
Naftaleno
Pireno
Fuente: CEPIS, 2001
4.6 Biomarcadores
Un biomarcador es definido como un cambio en la respuesta biológica, que va desde
respuestas celulares hasta las moleculares y las respuestas fisiológicas a los cambios de
comportamientos, que podrían estar relacionados con la exposición o los efectos tóxicos de lo
químicos ambientales (Peakall y Walker, 1994).
40
Los avances de la biología molecular y la biotecnología en la invención de instrumentos han
llevado al desarrollo de biomarcadores validados, novedosos y más sensibles a la exposición, a la
susceptibilidad de efectos adversos de los contaminantes terrestres y acuáticos (Galloway, 2006).
La validez de estos biomarcadores se ha probado en diferentes estudios tanto de laboratorio
como de campo; además, su uso sistemático de diferentes biomarcadores se ha encontrado útil
para evaluar los efectos de los contaminantes en el ecosistema (Peakall y Walker, 2006;
Tsangaris et al., 2010). En la figura 2 se puede observar las clases de biomarcadores que hay: de
exposición y de efecto con su utilidad en el monitoreo, evaluación y gestión ambiental.
Figura 2. Biomarcadores de la exposición y biomarcadores de los efectos: utilidad en el medio ambiente,
evaluación y gestión ambiental.
4.6.1 Clases de biomarcadores
Los biomarcadores se han clasificado según la medida en que reflejan la exposición a varios
factores estresantes ambientales o efectos adversos para la salud derivado de la exposición a
41
contaminantes. Algunos biomarcadores puede indicar la susceptibilidad a los resultados
negativos de los contaminantes ambientales, pero estos aún no han sido incorporados en el marco
de evaluación ecológica ya que para ello depende de las bases de datos genéticas y la
incorporación de estudios epidemiológicos, área de desarrollo futura. Sin embargo, los
biomarcadores que reflejan tanto la exposición como los efectos biológicos se han incorporado
en estudios de campo y de laboratorio, aunque estos son pocos (Taylor y Maher, 2010).
Diferentes estrategias para medir la presencia de los contaminantes expuestos en áreas
expuestas como la identificación de metabolitos derivados de los contaminantes por
biotransformación que ocurre dentro de la especie objetivo, la medición directa del contaminante
en tejidos, alteraciones celulares e histológicas y cambios moleculares son los que se han
descrito en experimentos. Para medir estos cambios, se han implementado herramientas
moleculares como qPCR, RT-qPCR, ADN, microchips de ARN y electroforesis en 2D para
poder cuantificar los cambios específicos en la expresión durante el estrés (Valdivieso y Zafra,
2016). Estas herramientas permiten identificar el cambio en la expresión de genes específicos
relacionados con la interferencia de las rutas metabólicas que resultan de alteraciones
fisiológicas. Además, estas herramientas pueden ser útiles cuando la información sobre especies
nativas no está disponible o poder dirigir la selección de nuevos genes objetivos para usar como
alertas tempranas (Asensio et al., 2013; Miao et al., 2015).
4.6.1.1 Biomarcadores de exposición
Los biomarcadores de exposición simples o múltiples con distintos modos de acción pueden
mostrar una respuesta temprana a los contaminantes presentes y son específicos para una sola
clase de contaminantes, como, por ejemplo, los compuestos fluorescentes biliares (FAC por sus
42
siglas en inglés), para la exposición de aceite, o la inducción de la proteína vitelogenina (vyG)
precursora de la yema de huevo para estrógenos ambientales (Broeg et al., 2005).
4.6.1.2 Biomarcadores de efecto
Los biomarcadores de efecto permiten la detección de alteración tempranas en el estado de la
salud del organismo, que, si se mantienen, pueden llegar a generar patologías (figura 2). Además,
los biomarcadores de genotoxicidad se consideran biomarcadores de efecto importantes para la
identificación de riesgo potencial y efectos adversos para la salud (Schettino et al., 2012)
43
5. MARCO REFERENCIAL
La contaminación antropogénica es aquella producida por los humanos, es decir, el daño
ecológico que se origina en las actividades que se desarrollan diariamente, como lo son las
artesanales, industriales, mineras, agropecuarias y domésticas. Sus productos generan
contaminación a los sistemas acuáticos. Un ejemplo de esto lo reporta Corona (2013) donde la
contaminación de la cuenca del Lago de Maracaibo estaba directamente vinculada con las
actividades humanas, entre las que destacan la descarga de aguas de origen doméstico e
industrial, en especial de la industria petroquímica, efluentes industriales con altas
concentraciones de metales pesados.
La Organización Mundial de la Salud (OMS), la Agencia de Protección del Medio Ambiente
(EPA) y la comisión europea muestran un marcado interés en el grupo de contaminantes
emergentes debido a que son compuestos de diferente origen y naturaleza química, que no están
incluidos en programas de control rutinarios, han sido descubiertos en diferentes ecosistemas
ambientales y potencialmente pueden causar efectos nocivos a la salud humana, al medio
ambiente, así como las especies que lo componen. Los productos farmacéuticos, en el que
resaltan los antibióticos y los productos de cuidado personal (parabenos, filtros solares,
perfumes, cosméticos, entre otros) encabezan la lista (Arbeláez, 2015). En una revisión llevada a
cabo por Ratola et al (2012) reportaron la aparición de 5 micro contaminantes emergentes del
proceso de tratamiento de aguas residuales: fármacos y productos del cuidado personal (PCP),
drogas ilícitas (DI), sustancias dopantes, retardantes de llama bromados (RLBs) y compuestos
fluorados (CFs). Estas sustancias son compuestos que probablemente han estado presente en las
44
aguas residuales durante décadas, pero hasta ahora la comunidad científica inició su estudio
durante los últimos años debido a que las metodologías empleadas no son lo suficientemente
eficientes para alcanzar un límite de detección (LOD, por sus siglas en inglés limit of detection)
alto o bajo o porque se tenía la impresión de que estos contaminantes eran fácilmente
biodegradables sin la necesidad de analizarlas en las estaciones depuradoras de agua residual
(EDAR). Shraim et al (2012) realizaron un estudio donde analizaron productos farmacéuticos en
aguas residuales municipales de Almadinah Almunawarah antes y después de ser tratadas y
encontraron que 5 fármacos (metformina, atenolol, cefalexina, acetaminofeno y norfluoxetina)
de los 19 analizados se encontraban, incluso, en mayor concentración después de haber sido
tratados en la planta de tratamiento de aguas residuales municipales (PTAR) indicando que estos
productos no son eliminados durante el proceso del tratamiento.
También se ha estudiado el efecto de los productos farmacéuticos, en especial los antibióticos,
en las comunidades microbianas de los cuerpos de agua. Cabello (2006) estudió el efecto
intensivo del uso no restringido de antibióticos profilácticos en la acuicultura siendo un problema
para la salud humana, animal y para el medio ambiente, observando que los antibióticos al tener
acción bactericida pueden causar cambios en la composición de las comunidades microbianas
naturales al inhibir selectivamente las bacterias susceptibles. Además, observó que la exposición
de comunidades naturales a los antibióticos utilizados en la acuicultura podría llevar a la
aparición de bacterias resistentes, que posteriormente podrían transferir genes asociados a
resistencia a antibióticos a bacterias patógenas oportunistas del medio ambiente.
Al igual que los antibióticos, la presencia de HAP en cuerpos de agua han sido descritos en
cuerpos de agua superficiales ampliamente impactados por el hombre. Un estudio realizado por
Uher et al (2016) en el rio Sena reportó una fuerte descarga de HAP debido a la densidad
45
poblacional por el uso de la calefacción doméstica y al escurrimiento de agua, y la presencia de
una carretera junto a la cuenca.
En particular, en Colombia, se ha prestado poca atención a la contaminación de los ríos con
HAP, por ello Sarria-Villa et al (2016) realizaron un estudio de la presencia de HAP en el río
Cauca colombiano encontrando que la presencia de HAP ligeros predominaba en el agua
mientras que los HAP pesados estaban asociados principalmente a los sedimentos y que la
presencia de estos se debía por actividades antropogénicas como la quema de combustibles
fósiles en el interior del río, por diversos efluentes industriales, por la mala gestión de los aceites
de motor. Además, mostraron que la posible movilidad de los HAP está ligado a eventos de
inundación y a las fuertes lluvias generadas.
Estos compuestos de HAP presentes en los sistemas acuáticos puede traer consecuencias
adversas en las especies del ecosistema como la genotoxicidad con niveles de rotura de la hebra
de ADN en branquias de mejillones cebra (Michel et al., 2013), eclosión retrasada, anomalías del
desarrollo, ADN dañado en medaka japonés causado por fracciones de HAP pirolíticas y
petrogénicas (Le Bihanic et al., 2014); enfermedad del saco azul en peces salmónidos por la
mezcla de HAP pirolíticos de sedimentos contaminados en el río Sena (Cachot et al., 2007).
Los estudios realizados por Head et al (2006) y Yakimov et al (2007) mostraron que debido a
eventos de contaminación aguda por hidrocarburos se genera una reducción en la diversidad
microbiana a corto plazo. Esta reducción se debe principalmente a dos causas: la desaparición de
ciertos grupos de microorganismos como arqueas y cianobacterias y a la fuerte selección de
bacterias especializadas en la degradación de hidrocarburos que se vuelven predominantes. Sin
embargo, la diversidad microbiana es generalmente alta en ambientes contaminados con
hidrocarburos crónicos o a largo plazo.
46
Una de las formas de monitorear o medir la contaminación en los cuerpos de agua
superficiales generada por la presión antropogénica es mediante la biología molecular con el uso
de biomarcadores moleculares. Un biomarcador es una medida cuantitativa de cambios en
componentes funcionales, moleculares o celulares, procesos, estructuras y funciones que están
relacionadas con la exposición a sustancias químicas ambientales (He et al., 2012; Fasulo et al.,
2013). Existen diferentes biomarcadores que dependen del grado en el que se refleje la
exposición a factores estresantes ambientales o los efectos adversos para la salud de las
exposiciones a contaminantes (Van der Oost, Beyer y Vermeulen, 2003; Viarengo et al., 2007).
Compuestos como vitelogenina, compuestos aromáticos fluorescentes biliares, ARNm o la
proteína del citocromo P4501A, etoxi-resorofina hepática-Ola deetilasa (EROD) y las
metalotioneínas (MT) son ejemplos de biomarcadores de exposición. Además, existen
biomarcadores de efecto que se relacionan con alteraciones bioquímicas, fisiológicas u otras
alteraciones en los fluidos o tejidos corporales de un organismo que pueden asociarse a un
deterioro o enfermedad de la salud establecida o posible. Proteínas de choque térmico (HSP70 o
HSP90), marcadores de estrés oxidativo [superóxido dismutasa (SOD), glutatión, catalasa
(CAT), peroxidación lipídica (LPO)], el daño en el ADN y la acetilcolinesterasa (AChE) (que
indica tanto la exposición como los efectos) son ejemplos de biomarcadores de efecto biológico
(Hook, Gallagher y Batley, 2014). Sin embargo, existen otros tipos de biomarcadores que
integran tanto la exposición química como los efectos biológicos. En general, algunos
biomarcadores permiten la identificación específica de la exposición a una clase de xenobióticos
o alteraciones de la función fisiológica, pero la mayoría de los biomarcadores tiene la función de
monitorear una respuesta general a una perturbación (Trap et al., 2014). Aunque, se debe tener
en cuenta que algunos factores contaminantes pueden interferir con las respuestas de los
47
biomarcadores. Estos factores incluyen la salud de los organismos, el sexo, la edad, el estado
nutricional, la actividad metabólica, el comportamiento migratorio, el estado reproductivo y de
desarrollo y la densidad poblacional, así como las estaciones, la temperatura ambiente, la
heterogeneidad del contaminante en el ambiente, entre otros (Van der Oost et al., 2003).
48
6. HIPÓTESIS
Hipótesis de investigación: Existe una diferencia entre la amplificación de genes asociados a
contaminantes emergentes por antibióticos y contaminación por HAP con las actividades
antropogénicas en un cuerpo de agua de la ciudad de Bucaramanga.
Hipótesis nula: No existe una diferencia entre la amplificación de genes asociados a
contaminación emergente por antibióticos y contaminación por HAP con las actividades
antropogénicas en un cuerpo de agua de la ciudad de Bucaramanga.
Hipótesis alternativa: Existe una diferencia entre la intensidad del amplificado de los genes
asociados a contaminantes emergentes por antibióticos y contaminación por HAP con las
actividades antropogénicas en un cuerpo de agua de la ciudad de Bucaramanga.
49
7. OBJETIVOS
7.1 Objetivo general
Detectar la presencia de genes asociados al metabolismo bacteriano de
antibióticos y HAP como biomarcadores de contaminación antropogénica en un cuerpo de
agua superficial del área metropolitana de Bucaramanga.
7.2 Objetivos específicos
Identificar un cuerpo de agua superficial en el área metropolitana de Bucaramanga
que presente diferentes grados de presión antropogénica y seleccionar los mejores puntos de
muestreo.
Definir los genes bacterianos que servirán como biomarcadores de exposición de
microorganismos a antibióticos y HAP.
Definir las condiciones de amplificación para la detección de los genes
bacterianos asociados a presencia de antibióticos y degradación de HAP.
Detectar la presencia de los genes bacterianos en muestras de sedimentos y aguas
provenientes del cuerpo de agua superficial.
Identificar una posible asociación entre la presencia de los genes y el grado
presión antropogénica.
50
8. METODOLOGÍA
8.1 Selección del cuerpo de agua superficial y puntos de muestreo.
Se adaptó la metodología reportada por Ruminaite (2011), para lo cual se utilizó la
herramienta Google Maps (Versión 5.4.1, 2019) para identificar los cuerpos de agua
superficiales y determinar la influencia de los mismos por la presencia de construcciones urbanas
o industriales. Se seleccionaron los cuerpos de agua en los cuales se evidenció diferentes grados
de presión antropogénica representados como: urbanizaciones, colegios, industrias, estaciones de
servicios, centros hospitalarios. Adicionalmente, se tuvo en cuenta tres criterios para la selección
del cuerpo de agua y los puntos de muestreo: i) el cuerpo de agua debía ser de fácil acceso, así
como los puntos seleccionado para el muestreo, de tal manera que facilitara el transporte de los
equipos y los materiales de muestreo; ii) el o los cuerpos debían poder diferenciarse claramente
de acuerdo al grado de presión antropogénica; y iii) las condiciones meteorológicas y las
condiciones topográficas de cada punto de muestro no afectaran la integridad de las muestras
analizadas o presentaran riesgo a los investigadores para su toma.
8.2 Toma de muestras
Se tomaron muestras de sedimentos y de agua corriente. Para las muestras de sedimentos se
utilizó como referencia los manuales Methods for collection, Storage and Manipulation of
Sediments for Chemical and Toxicological Analyses; Technical Manual (EPA, 2001) y CERP
Quality Assurance Systems Requirements (CERP, 2009) de los cuales se tomó en cuenta los
instrumentos para la toma de sedimentos y las condiciones de la toma de muestras de las aguas
51
superficiales. El método para la toma de sedimentos se modificó utilizando mangueras de acuario
de 2,5 cm de diámetro y 11 de cm de largo. Para cada punto de muestreo se tomaron 5 muestras
para, finalmente, realizar una muestra compuesta. Cada una de las mangueras se hundieron de
forma perpendicular al suelo, a una profundidad de 8 cm en los sedimentos superficiales
alrededor de la quebrada donde hubiese menor flujo de agua. La distancia entre las mangueras
fue de aproximadamente 20 cm. Una vez obtenidas las 5 muestras por punto, las mangueras se
almacenaron en tubos Falcon estériles previamente rotulados con las características de cada
punto. Para las muestras de agua se usó el protocolo de muestreo, transporte y conservación de
muestras de agua con fines múltiples (INTA, 2011). Para ello se usaron tubos Falcon estériles de
50 ml previamente rotulados de acuerdo con cada punto que se muestreo. Se sumergió cada uno
de los tubos, contra corriente, hasta una profundidad de 15 a 30 cm hasta llenar completamente el
tubo Falcon. Posteriormente se cerraron los frascos y se almacenaron junto con las muestras de
sedimentos. Las muestras, tanto de agua como sedimentos, se transportaron en una nevera fría
hasta el laboratorio de la Universidad de Santander UDES para su posterior procesamiento.
8.2.1 Tratamiento de las muestras
8.2.1.1 Extracción de ADN a partir de las muestras de sedimentos.
La extracción de ADN de las muestras de sedimentos se realizó utilizando el kit Soil DNA
Isolation (NORGEN BIOTEK CORP), siguiendo las instrucciones del fabricante. Para cada
punto se tomó 0.25 gramos (g) a partir de cada manguera (submuestra) obteniendo finalmente
una muestra compuesta de 0,25 g, la cual fue homogenizada utilizando bajalenguas y vórtex. Los
0,25 g del homogenizado se depositaron en tubos con perlas y una solución de lisis para el
rompimiento de la pared celular de los posibles microorganismos presentes. Los contaminantes
52
fueron eliminados empleando resinas provistas por el kit y posteriormente, el ADN fue retenido
utilizando un filtro de sílica para facilitar el lavado del material genético. El ADN fue finalmente
eluído utilizando una solución de Tris-EDTA (TE) 1X. El ADN obtenido fue analizado
utilizando el espectrofotómetro Nanodrop para realizar la cuantificación de la concentración de
ADN en la muestra y la presencia de posibles contaminantes. La integridad del ADN fue
evaluada utilizando electroforesis en gel de agarosa y posterior a esto el ADN fue almacenado a -
20°C hasta su uso en las pruebas restantes.
8.2.1.2 Determinación del espectro de absorción de las muestras de agua
Se realizó la medición espectrofotométrica del agua colectada mediante dos tratamientos: i)
agitación mediante vórtex y ii) centrifugación. Esto con el fin de observar una diferencia de
turbidez entre los dos tipos de tratamientos usados y para retirar posible material particulado que
aportara ruido a las mediciones.
A partir del espectro de absorción obtenido (200 – 800 nm) (Andrew et al., 2001/2002) se
seleccionaron 4 longitudes de onda: 250, 254, 262 y 294 nanómetros (nm), las cuales se han
utilizado para estimar la presencia de compuestos aromáticos policíclicos (Vera-Ávila et al.,
2002, Chirino, Benzo y Fernández, 2015; Sarria, Cerón y Pérez, 2016). Para ello, las muestras de
aguas directas se agitó con vórtex antes de realizar la medición espectrofotométrica y para la
centrifugación de las muestras, se agitó con vórtex, se tomaron 1.5 mL de cada muestra de agua
y se resuspendieron en Eppendorfs de 1,6 mL; posteriormente se centrifugó a 10.000 RPM
durante 5 minutos, una vez terminada la centrifugación se tomó con una micropipeta 1 mL del
sobrenadante sin tocar el pellet y se agregó en una cubeta de plástico para la medición
espectrofotométrica, para ello se utilizó un espectrofotómetro Avantes (referencia Avaspec).
53
8.3 Determinación de condiciones de amplificación de genes blanco.
8.3.1 Selección de los genes blanco
Se realizó una revisión bibliográfica en un margen de corto tiempo entre los meses enero y
febrero del 2018, se seleccionaron artículos científicos y de revisión usando las palabras clave:
aguas superficiales, presión antropogénica, contaminación emergente, HAP, antibióticos, genes
de resistencia, genes de biorremediación de HAP, biomarcadores y biomarcadores no
destructivos, gen y PCR. No se tuvo en cuenta los artículos que nombraran el gen sin reportar la
secuencia de oligonucleótidos. Para este estudio se pretendía evaluar un máximo de 4 genes. Para
la selección de las secuencias de oligonucleótidos se tuvo en cuenta que los genes estuvieran
asociados a muestras ambientales de aguas y sedimentos y así mismo sirvieran como
biomarcadores genéricos para medir la presión antropogénica usando microorganismos como
especies objetivo (Ver anexo 1).
8.3.2 Selección de los microorganismos de referencia
Los microorganismos de referencia fueron donados por el cepario de Bacteriología de la
Universidad de Santander UDES (tabla 4). Las cepas de referencia se utilizaron como controles
positivos de amplificación de los genes en estudio (Cébron et al., 2008; Cébron et al., 2013;
Deng et al., 2015). Los microorganismos fueron mantenidos viables en el laboratorio por
subcultivo, en caldo nutritivo, cada 1 o 2 meses en caso de requerir mayor cantidad de material
genético.
54
Tabla 4. Microorganismos de referencia utilizados en este estudio utilizados como control de amplificación de
los genes blanco. Los microorganismos fueron mantenidos en caldo nutritivo líquido siguiendo las
recomendaciones de la ATCC.
MICROORGANISMOS CÓDIGO ATCC (n*)
Alcaligenes faecalis 35655
Burkholderia cepacia 25416
Pseudomona aeruginosa 27853
Pseudomona putida 49128
Pseudomona putida 13 -
Nota: *Todas las bacterias utilizadas en este estudio fueron Gram negativas.
8.3.3 Extracción de ADN de microorganismos de referencia.
La extracción de ADN de los microorganismos de referencia se realizó mediante el método de
salting-out descrito por Casañas et al (2001) con modificaciones. Se tomaron 3 mL de un cultivo
de 24 horas en caldo nutritivo fue centrifugado durante 4 minutos (8.000 rpm), el sedimento se
lavó con PBS pH=7.2 y se centrifugo nuevamente. Posteriormente se adicionó 600 µl de buffer
de lisis (EDTA 0.5M, Tris-HCl 1M, NaCl 1M) suplementado con 10 µl de proteinasa K (20
mg/mL) y 10 µl de dodecil sulfato de sodio al 10% (SDS), se dio vórtex por 30 segundos y se
incubó a 56°C por 1 hora. Pasado este tiempo de incubación se agregó 150 µl de acetato de
sodio 5M para precipitar las proteínas, se mezcló en vórtex y se incubó a 4°C por 5 minutos;
posteriormente, se centrifugó la mezcla por 10 minutos (13.000 rpm). El sobrenadante se
transfirió a un nuevo vial de 1.5 ml y se añadió 600 µl de isopropanol frío a -20°C, la mezcla se
homogenizó por inversión para permitir la precipitación de ADN y posteriormente se centrifugó
durante 4 minutos (4000 rpm) para permitir la precipitación del ADN. Se descartó el
sobrenadante y se agregó 500 µl de etanol al 70%, para lavar y se volvió a centrifugar en las
55
condiciones descritas anteriormente. El sobrenadante fue descartado por inversión y el tubo se
dejó a temperatura ambiente por 1 hora para permitir la evaporación del etanol residual. El ADN
se resuspendió en 50 µl de buffer TE 1X (Tris-HCl 1 M, 10M NaOH, EDTA 0.5M). En el Anexo
2 y 3 se observa la preparación de los reactivos utilizados para la extracción. El ADN obtenido
fue analizado utilizando el espectrofotómetro NanoDrop para realizar la cuantificación de la
concentración de ADN en las muestras y la presencia de posibles contaminantes. La integridad
del ADN fue evaluada utilizando electroforesis en gel de agarosa y posterior a esto el ADN fue
almacenado a -20°C hasta su uso en las pruebas restantes.
8.3.4 Amplificación de genes blanco utilizando la reacción en cadena de la polimerasa
(RCP)
La amplificación para los genes blanco y el límite de detección se realizaron tomando como
base las siguientes condiciones, las cuales se realizaron en tubos de 0.2 ml. Para la amplificación
de los genes blanco se usó una polimerasa con un sistema convencional 2X (5 µl) que contenía
MgCl2 y dNTPS, 10 µM (0.4, 0.2 y 0.125 µl) de oligonucleótidos F y oligonucleótidos R y agua
libre de nucleasas (3.2 µl, 3.6 µl y 3.75 µl). Para el límite de detección se usó dos tipos de
polimerasas, la primera, con un sistema convencional 2X y la segunda, una polimerasa unida a la
proteína Sso7D. Las condiciones de ampliación fueron las utilizadas para la detección de genes
blanco. Por último, luego de haber servido la mezcla en tubos de 0.2 µl se agregó 1 µl de ADN
(10 ng/ µl) de cepas de referencia para un volumen final en todas las reacciones de 10 µl. Las
mezclas se homogenizaron por vórtex y finalmente las reacciones de RCP se colocaron en un
termociclador Thermo Cycler Biorad® model T100 usando un programa de amplificación con
una temperatura inicial de 95°C (5 min.), seguida de una segunda temperatura de 95° (30 seg.),
luego una temperatura de 72°C (5 min.) y finalmente una temperatura de 72°C (5 min.). Para la
56
identificación de la mejor temperatura de anillamiento de los 3 genes estudiados, se realizaron
curvas melting donde se manejó un rango de temperaturas de 50 a 75°C; el rango se movió entre
3 y 4 grados según la conveniencia del investigador. Para el límite de detección se tuvo en cuenta
la temperatura de anillamiento de los oligonucleótidos utilizados.
Los productos de PCR (amplicones) se analizaron en geles de agarosa al 2% teñidos con el
colorante SafeViewTM Classic (abm Technologies) usando buffer TAE 1X. Se cargaron 10 µL
de cada amplicon más 2 µL de Gel Loading Dye Blue (6X Thermo Fisher Scientific); las
electroforesis se desarrollaron en cámaras horizontales (Sub-Cell® GT Cell) a 60V durante 2 h
para su posterior visualización bajo luz UV en un transiluminador Gel Doc XR+System
(BioRad).
8.3.5 Límite de detección de los genes blanco
La amplificación para el límite de detección se realizó usando dos polimerasas diferentes. La
primera fue el sistema convencional 2X (Biolines) que es una polimerasa convencional con
sistema de inicio en caliente (hot-start). La segunda correspondía a un sistema todo en uno que
contenía una polimerasa de alta fidelidad con las proteínas Sso7D que permite una mejor
adherencia de la polimerasa a la cadena de ADN doble formada por el oligonucleótido cebador,
lo cual aumenta la procesividad de la polimerasa y por tanto su sensibilidad. Adicionalmente,
este segundo sistema viene con aditivos que inhiben diferentes moléculas interferentes con la
reacción de polimerización. Los dos sistemas fueron utilizados para la identificación del límite
de detección de los tres genes blanco utilizando las condiciones de amplificación definidas
previamente. La prueba se llevó a cabo utilizando el ADN de Burkholderia cepacia y
Pseudomona putida a los cuales se le realizaron 13 diluciones seriadas desde 1X102 nanogramos
57
(ng) hasta 1 ng y desde 1X101 ng hasta 1 ng respectivamente. Los resultados se reportaron con la
menor concentración de ADN a la cual se observa amplificación en el gel de agarosa.
8.3.6 Detección de los genes de interés en muestras agua y ADN obtenido de sedimentos.
Las amplificaciones para los genes de interés en las muestras de ADN obtenido de sedimentos
y las aguas directas se realizaron tomando como base las siguientes condiciones definidas para
cada uno de los genes adicionando 1 µl de ADN de sedimentos y 1 µl de aguas directas para un
volumen final de todas las reacciones de 10 µl. Las mezclas se homogenizaron por vórtex y
finalmente las reacciones de RCP se colocaron en un termociclador
Thermo Cycler Biorad® model T100 usando el programa definido para cada gen (Ver anexo 7).
Los productos de PCR (amplicones) se analizaron en geles de agarosa al 2% teñidos con el
colorante SafeViewTM Classic (abm Technologies) usando buffer TAE 1X. Se cargaron 10 µL
de cada amplicon más 2 µL de Gel Loading Dye Blue (6X Thermo Fisher Scientific); las
electroforesis se desarrollaron en cámaras horizontales (Sub-Cell® GT Cell) a 60V durante 2 h
para su posterior visualización bajo luz UV en un transiluminador Gel Doc XR+System
(BioRad).
8.4 Asociación entre la presencia de los genes y el grado de presión antropogénico
A partir de las fotografías obtenidas de los geles de agarosa en los cuales se encontraban los
productos de amplificación para cada uno de los genes en estudio y para cada una de las
muestras analizadas, se realizó el análisis de la intensidad de las bandas obtenidas utilizando el
software de acceso libre Photocapt MW (versión 10.01). Con el resultado de la amplificación de
los genes de estudio y teniendo en cuenta la presión antropogénica alrededor del cauce de la
58
Quebrada Aguablanca, se construyó una tabla donde se identificó la posible asociación de la
presencia del gen inlt1 y la presencia de los genes asociados al PAH-RHDαGN.
59
9. RESULTADOS
9.1 Selección del cuerpo de agua superficial
Se identificaron al menos 3 sistemas de agua superficial en el área metropolitana de
Bucaramanga como se muestra en la figura 3. De todos ellos se seleccionó el sistema de agua
superficial Quebrada Aguablanca ya que los otros sistemas de aguas superficiales no cumplían
con los parámetros de selección para este estudio como el crecimiento paulatino de la presión
antropogénica y los otros sistemas presentaban la presión antropogénica en un sitio puntual y no
en todo su cauce. La quebrada Aguablanca es un curso de agua ubicado en el departamento de
Santander, en la parte noroeste del país. Tiene su nacimiento aguas arriba del Km 19 vía
Bucaramanga-Berlín atraviesa los municipios de Bucaramanga, Floridablanca y Girón que hacen
parte del área metropolitana de Bucaramanga.
En la figura 3 se observa el nacimiento de la quebrada Aguablanca, atravesando el municipio
de Floridablanca hasta llegar al municipio de Girón, donde la quebrada Aguablanca tiene su
confluencia con el Rio de Oro y Rio frío. Esta microcuenca conforma, junto con otras
microcuencas, áreas de interés público por su función ecosistémica en cuanto la oferta de
recursos hídricos para el abastecimiento de los municipios por donde esta atraviesa, por tanto, es
una microcuenca con un alto grado antropogénico (Alcaldía Municipal de Floridablanca, SF).
Adicionalmente, cumple con diferentes parámetros necesarios para llevar a cabo este estudio, ya
que esta quebrada inicia en una zona de poca presión antropogénica y a medida que recorre su
cauce la presión antropogénica va aumentando paulatinamente con la fuerte presencia de
urbanizaciones, estaciones de servicios, centros hospitalarios, fábricas dedicadas a la producción
60
de concreto, de textiles, avícolas, entre otras actividades que favorecen a la presión
antropogénica; adicionalmente, esta quebrada recorre su cauce por la planta de tratamiento de
aguas residuales (PTAR Rio Frío).
Figura 3. Comparación de cuerpos de aguas superficiales encontrados en el área metropolitana de
Bucaramanga. Se muestra el río del Hato (A) que atraviesa el municipio de Piedecuesta, el río de Oro (B) pasa por
el municipio y Girón y la quebrada Aguablanca (C) atraviesa los municipios de Bucaramanga, Floridablanca y
Girón. (D) Se presenta las características relevantes para el presente estudio. La información fue tomada de
Google Maps. (Ver Anexo 4 para una mayor resolución de los mapas).
9.2 Puntos de muestreo.
A partir del mapa de la quebrada Aguablanca (figura 3 y anexo 4) se seleccionaron 6 puntos
de muestreo, y dos puntos adicionales como controles de contaminación, es decir, que ayuden a
saber si la presencia de la actividad humana influye en el problema de polución, teniendo en
ID Sistema Extensión
(Km2)
Características
antropogénicas.
A Río del Hato 468 *Zona urbana
Zona rural
B Río de Oro 75
*Zona rural
*Zona urbana
*Colegios
C Quebrada
Aguablanca 22
*Zona rural
*Zona urbana
*Zona industrial.
*Hospitales
*Colegios.
*PTAR
A
B
C
D
61
cuenta la ubicación de las diferentes características antropogénicas tales como: urbanizaciones,
colegios, estaciones de servicio, la planta de tratamiento de aguas residuales (PTAR) y
hospitales. Los puntos de muestreo van desde el punto 1 al punto 8. Las muestras se dividieron
en dos, las de sedimentos identificados con el código PS y las de aguas identificadas con el
código PA y las muestras de control se identificaron con el código PSC y PAC
Figura 4. Mapa de la Quebrada Aguablanca del área Metropolitana de Bucaramanga. Puntos seleccionados
para el muestreo de sedimentos y aguas. Mapa adaptado de Google Maps.
En la tabla 5, se observa la descripción de los 6 puntos de muestreo seleccionados y de 2
puntos como controles, siendo el primer punto de muestro de baja contaminación y el último de
alta contaminación antropogénica, adicionalmente se muestran las coordenadas de donde se
tomaron las muestras de sedimentos y de aguas y el municipio al cual corresponde a cada
punto, además de la descripción de la actividad antropogénica teniendo en cuenta la
urbanización y las industrias por Km2
62
Tabla 5. Puntos seleccionados para el estudio teniendo en cuenta las coordenadas, el municipio, la
urbanización e industria por Km2.
Punto Coordenadas/Mun
icipio
Urbanización
Km2 Industria Km2
PS01/PA01
7°12’12.5"N 73°
04’88.8"W
/Bucaramanga
29 casas -
PS02/PA02
7°11'01.2"N
73°05'15.7"W/
Bucaramanga
30 casas 2 centros de recreación
1 establecimiento comercial
PS03/PA03
7°06'61.1"N
73°08'44.5"W/Flori
dablanca
>50 casas
4 centros hospitalarios
12 instituciones educativas
4 estaciones de servicio
automovilístico
1 empresa de transporte de
alimentos
PS04/PA04
7°06'47.4"N
73°10'29.0"W/
Floridablanca
>50 casas
2 clínicas veterinarias
3 estaciones de servicio.
8 instituciones educativas
3 centro comerciales
PS05/*(n)PA0
5
7°06'49.0"N
73°12'54.4"W/Giró
n
>50 casas
2 cementerios
1 avícola
1 fábrica de construcción en
cemento
1 fábrica de concentrado
1 fábrica de muebles
1 industria de plástico
1 industria de asfaltos
Planta de tratamiento de aguas
residuales (PTAR)
63
Tabla 5. (Continuación) Puntos seleccionados para el estudio teniendo en cuenta las coordenadas, el municipio,
la urbanización e industria por Km2.
*(n)PS06/PA0
6
7°06'50.2"N
73°16'51.3"W/Girón
>50 casas
1 centro hospitalario
4 instituciones educativas
3 estaciones de servicio
automovilístico
1 local de servicio eléctrico
automotriz
1 taller de autos
1 avícola
*(n)PAC07 7°06'50.2"N
73°16'51.3"W/ Girón Control de alta contaminación antropogénica
*(n)PSC08/P
AC08
7°11'06.67"N
73°05'20.56"W/Buca
ramanga
Control de NO contaminación
Nota (n): *PS: Punto sedimento; *PA: Punto agua, *PAC: Punto agua control, *PS(A)C: Punto sedimento (agua)
control.
Idealmente las muestras fueron definidas para tomarse el mismo día, pero debido a la
presencia de lluvias en la época de la toma de muestras los puntos PS01/PSA01, PS02/PSA02 y
PSC08/PAC08 se tomaron con diferencia de 38 días a los puntos PS03/PA04, PS04/PA04,
PS05/PA05, PS06/PA07 y PA07. Las lluvias aportan un efecto diluyente para los contaminantes
y cambia las condiciones (Tonevi et al., 2014) (Ver anexo 6).
En la figura 5 mediante la herramienta de Google Maps, se observa la presión antropogénica
ejercida alrededor del cauce de la quebrada Aguablanca de cada punto muestreado por Km2. Por
otro lado, en la figura 6 se observa cada uno de los sitios seleccionados para la toma de muestras
de sedimentos y de aguas para su posterior análisis.
64
Figura 5. Puntos de muestreo de la Quebrada Aguablanca mediante Google Maps por Km2. (A) PS01/PA01
libre de contaminación industrial a sus alrededores. (B) PS02/PA02 aumento paulatino de presión antropogénica
urbanística e industrial. (C) PS03/PA03 fuerte crecimiento urbanístico y de industrias hospitalarias, automotrices,
alimentaria, educativa (D) PS04/PA04 aumento de la presión antropogénica urbanística e industria por
veterinarias, centros educativos y comercio. (E) PS05/PA05 la presión antropogénica se ve reflejada en el aumento
de la industria de asfaltos, avícolas, cementerios y con una PTAR. (F) PS06/PA06 el asentamiento urbanístico
alrededor del cauce aumenta significativamente como la industria. (G) PAC07 control de alta contaminación
antropogénica. (H) PSC08/PAC08 control de no contaminación antropogénica.
E) F)
G) H)
A) B)
C) D)
65
Figura 6. Fotografías correspondientes a los sitios de toma de muestra en las respectivas zonas de muestreo
seleccionadas. Sitios de muestreo seleccionado para el presente estudio desde el primer punto del Km 19 vía
Bucaramanga-Berlín del municipio de Bucaramanga hasta el municipio de Girón en la estación EDS El Carmen.
66
9.3 Extracción de ADN genómico y de cepas de referencia
Se logró extraer ADN genómico bacteriano de las cepas de referencia y de las muestras de
sedimentos superficiales mediante los protocolos de extracción empleados. Las concentraciones
de ADN obtenidas fueron moderadamente altas (>100 ng/µL) para el caso de las cepas de
referencia a excepción de Pseudomonas putida 13 que se obtuvo una concentración <20 ng/µL.
Para el caso de los sedimentos superficiales se obtuvo bajas concentraciones de ADN que no
superaban los 10 ng/ µL (tabla 6).
Tabla 6. Cuantificación de ADN genómico de microorganismos de referencia y ADN genómico de sedimentos
superficiales mediante el equipo NanoDrop.
Tipo de muestra Identificación [ADN] (ng/µL) OD
260/230
OD
260/280
Microorganismos
Pseudomonas aeruginosa 114,06 1,18 2,09
Pseudomonas putida 40,44 0,613 1,95
Alcaligenes faecalis 288,91 1,64 2,13
Burkholderia cepacia 109,35 1,15 2,09
Pseudomonas putida 13 14,03 1,11 1,94
Sedimentos
PS01 8,74 0,27 1,78
PS02 5,82 0,30 1,93
PS03 3,46 0,35 2,03
PS04 8,97 0,68 1,61
PS05 5,4 0,19 1,98
PS06 6,96 0,31 1,69
PSC08 6,01 0,40 1,68
67
9.4 Determinación del espectro de absorción de las muestras de agua
En la figura 7 se observa el espectro de absorción de las muestras de aguas con los dos
tratamientos utilizados: agitación por vórtex y centrifugación. Se observa una diferencia en
ciertos puntos de los espectros de absorción de las aguas agitadas y las aguas centrifugadas,
donde el punto PA01 y PA02 presentan valores de absorbancia superiores a 1.5, y para el caso
del punto PA03 se obtuvo valores de absorbancia de 0.5; a comparación en los valores de las
aguas centrifugadas, donde en los mismos puntos, de las aguas agitadas, se observa una
disminución en los valores de absorbancia, hecho que se debe a que en el proceso de la
centrifugación se está eliminando sólidos suspendidos o contaminantes que interfieran en la
lectura de la densidad óptica.
Por otro lado, para el caso de los otros puntos, en ambos tratamientos se obtuvo valores de
absorbancia similares por lo que no se observa diferencias entre estos puntos.
Adicionalmente, a través de esta técnica y para este estudio, no podría ser usada para suponer
el grado de contaminación por la presión antropogénica de la quebrada Aguablanca ya que, para
ambos tratamientos, las absorbancias fueron mayores, donde era casi nula la presión
antropogénica por urbanización e industrias, mientras que aquellos puntos donde era más fuerte
el impacto antropogénico de las industrias y la urbanización se obtuvieron valores menores a 1, a
pesar de que en el momento de tomar las muestras de aguas a simple vista se observó mayor
turbidez en los últimos puntos en comparación con los primeros puntos muestreados.
68
Figura 7. Espectro de absorción desde 200 a 800 nm usando dos tratamientos (A) agitación por vórtex y (B)
centrifugación de las muestras de aguas seleccionadas.
A partir del espectro de absorción obtenido de ambos tratamientos (agitación y
centrifugación) se seleccionaron 4 longitudes de onda: 250, 254, 262 y 294 nm (figura 8 y Anexo
5). Estas longitudes se seleccionaron de acuerdo con la literatura que relaciona estas medidas con
compuestos de hidrocarburos aromáticos policíclicos en aguas superficiales. A una longitud de
onda 262 nm se pude detectar HAP como naftaleno, acenafteno, acenaftileno, fluoreno,
fenantreno, pireno y criseno; por otro lado, a 254 nm se puede llegar a detectar
benzo(a)fluoranteno, benzo(k)fluoraneno, benzo(a)pireno, dibenzo(a, h)perileno (Vera-Ávila et
al., 2002, Chirino, Benzo y Fernández, 2015; Sarria, Cerón y Pérez, 2016).
A)
0
0,5
1
1,5
2
2,5
200 350 500 650 800
Ab
sorb
an
cia
Longitud de onda (nm)
PA01A PA02A PA03A
PA04A PA05A PA06A
PAC07A PAC08A
B)
0
0,5
1
1,5
2
2,5
200 350 500 650 800
Ab
sorb
an
cia
Longitud de onda (nm)
PA01C PA02C PA03C
PA04C PA05C PA06C
PAC07C PAC08C
69
Figura 8. Espectro de absorción de las longitudes de onda seleccionadas: 250, 254, 262 y 294 nm de las (A)
aguas agitadas por vórtex y de las (B) aguas centrifugadas de los puntos seleccionados de la Quebrada Aguablanca
(C) densidades ópticas de cada punto de muestreo.
9.5 Genes blanco y productos de la amplificación.
Para este estudio se seleccionaron tres genes blanco. Para la detección de los HAP se
utilizaron oligonucleótidos capaces de identificar una secuencia conservada en enzimas
dioxigensa de anillos hidroxilados que codifica para los genes nahAc, nahA3, nagAc, ndoB,
ndoC2, pahAc, pahA3, phnAc, phnA1, bphAc, bphA1, dntAc y arhA1 como lo describió Cébron
et al (2008). Para el presente trabajo nos referimos a ellos como PAH-RHDα-GN. La presencia
de fármacos (antibióticos) se utilizó como marcador del gen intll dado que este gen está
fuertemente unido a otros genes necesarios para la resistencia a antibióticos siendo un marcador
de mayor cobertura que investigar los genes de resistencia por separado. Además, por la
abundancia de este en aguas abajo de las plantas de tratamiento de agua residual, por su baja
abundancia en ambientes menos afectados y por tener una secuencia de ADN uniforme y
conservada para la detección de este en muestras ambientales, se considera un excelente
marcador para el seguimiento de la influencia humana (Gilling et al., 2015). El tercer gen
A)
0
1
2
3
250 261 272 283 294
Ab
sorb
an
cia
Longitud de onda (nm)
PA01A PA02A PA03A
PA04A PA05A PA06A
PA07A PA08A
B)
-1
0
1
2
3
250 261 272 283 294
Ab
sorb
an
cia
Longitud de onda (nm)
PA01C PA02C PA03C
PA04C PA05C PA06C
PAC07C PAC08C
70
seleccionado fue el codificante para el segmento 16S rRNA que es la macromolécula más
utilizada en estudios de filogenia y taxonomía bacteriana (Rodicio y Mendoza, 2004). La
incorporación de este gen en este estudio tuvo una doble función identificar la presencia de ADN
bacteriano presente en las muestras para poder disminuir la tasa de posibles falsos negativo a
causa de contaminantes en el ADN molde para la RCP y segundo, para permitir estimar la
calidad del ADN amplificado debido a que el fragmentos amplificado es de mayor tamaño que
los dos genes mencionados anteriormente. En la tabla 7 se muestran los blancos génicos
seleccionados en este estudio con sus respectivas secuencias de oligonucleótidos, temperatura de
anillamiento (Tm) y el peso esperado de los amplificafos (pb).
Tabla 7. Genes blanco utilizados para el estudio con sus respectivas secuencias de oligonucleótidos,
temperatura de anillamiento y tamaño de banda esperado.
Blanco génico Secuencias de oligonucleótidos (n*) Tm Tamaño pb, referencia.
16S rDNA
17AF 5’-TGCCAGCAGCCGCGGTA-3’ 980, Widmer et al, 1998
18AR 5’-GACGGGCGGTGTGTACAA-3’
Intl1
Intl1F165 5’-
CGAACGAGTGGCGGAGGGTG-3’
74.4°C
312, Gillings et al., 2015;
Lupan et al., 2017 Intl1R476 5’-
TACCCGAGAGCTTGGCACCCA-3’
73°C
nahAc-,
nagAc-, pahAc- y
phnAc-
PAH-RHDα-GNF 5’-
GAGATGCATACCACGTKGGT-3’
62.6°C
306, Cébron et al., 2008
PAH-RHDα-GNR 5’-
AGCTGTTGTTCGGGAAGAYW-3’
68°C
Nota: * Las secuencias de l1os oligonucleótidos se muestran en sentido 5’-3’. Tm: temperatura de anillamiento.
El ADN obtenido a partir de las cepas de referencia permitió la amplificación de los genes
16S rDNA, intl1 y PAH-RHDαGN utilizando los oligonucleótidos 17AF y 18Ar, IntlF165 y
71
IntlR476 y PAH-RHDαGNR y PAH-RHDαGNR, respectivamente. Para el gen 16S se obtuvo
una banda de aproximadamente 980 pb que amplificaron el ADN de la cepa de referencia de
Pseudomona aeruginosa con una temperatura de anillamiento de 73°C para el gen intl1 se
obtuvo una banda de aproximadamente 312 pb que amplificaron en el ADN de los
microorganismos Alcaligenes faecalis y Burkholderia cepacia con una temperatura de
anillamiento de 75°C. Y para los genes de PAH-RHDαGN se obtuvo una banda de
aproximadamente 306 pb que amplificaron en el ADN de la cepa de referencia Pseudomona
putida 13 con una temperatura de anillamiento de 53.1°C (figura 9, Anexo 7).
Figura 9. Amplificación de las condiciones de los genes blanco utilizando el ADN genómico de los
microorganismos de referencia. (A) Amplificación del gen 16S rDNA PM: peso molecular de 100 pb. Carril 1:
Pseudomona aeruginosa. Carril 2: P. putida. C-: control negativo. (B) Amplificación del gen intl1. PM: peso
molecular 100 pb. Carril 1: P. putida. Carril 2: A. faecalis. Carril 3: B. cepacia. C-: control negativo. (C)
Amplificación de los genes PAH-RHDαGN. PM: peso molecular de 100 pb. Carril 1: P. aeruginosa. Carril 2: P.
putida. Carril 3: P. putida 13. Carril 4: B. cepacia.
17 20
PM 1 2 C-
1000 pb
500 pb
980 pb
A)
1 2 3 C- PM
1000 pb
500 pb
312 pb
B)
1 2 3 4 PM
1000 pb
500 pb 306 pb
C)
72
9.6 Límite de detección de genes blanco
Se obtuvo los límites de detección de los genes 16S rDNA, intl1 y PAH-RHDαGN donde una
vez cuantificado el ADN genómico de las cepas de referencia se ajustó la concentración de ADN
a 1X102 (100) ng para B. cepacia para los genes 16S e intl1 y 1X101 (10 dag) para P. putida
para los genes PAH-RHDαGN. Se observó que la concentración mínima para detectar la
presencia del gen 16S rDNA fue de 1X10-3 (0,001 µg) utilizando una polimerasa con un sistema
convencional 2X SensiFAST. (figura 10A). El límite de detección del gen intl1 se llevó acabo
usando dos polimerasas con características distintas. Se observó que usando la polimerasa
convencional 2X SensiFAST solo se logró detectar una concentración mínima de 1 µg (figura
10B) a diferencia de la polimerasa con el sistema Sso7D, donde se logró la amplificación de
todas concentraciones evaluadas hasta 1X10-8 ng. La utilización del sistema Sso7D se realizó
únicamente para el gen intl1 debido a que en este trabajo se avanzó en la identificación del
potencial del uso de este sistema para amplificación directa de genes a partir de aguas
superficiales (figura 10C). Finalmente, se obtuvo el límite de detección de los genes PAH-
RHDαGN con una concentración mínima de 1X10-1 decigramo (0.01 dg) con una polimerasa
convencional 2X (figura 10D).
73
Figura 10. Límite de detección para el (A) gen 16S rDNA utilizando un sistema convencional 2X. PM: peso
molecular de 100 pb. Control positivo: A. faecalis. Carriles de 2 al 11 diluciones del ADN de B. cepacia en base 10
desde 100 hg hasta 1 ng. Límite de detección del gen intl1 utilizando un (B) sistema convencional 2X y (C) un
sistema de amplificación acoplado a la proteína Sso7d. PM: peso molecular de 100 pb. Control positivo: A.
faecalis. Carriles 2 a 11 diluciones del ADN de B. cepacia en base 10 desde 100 ng hasta 1 ng. Límite de detección
de (D) los genes PAH-RHDαGN utilizando un sistema convencional 2X. PM: peso molecular de 100 pb. Control
positivo: P. putida 13. Carriles 2 al 11 diluciones de ADN de P. putida en base 10 desde 10 dag hasta 1 ng.
9.7 Detección de los genes 16S, intl1 y PAH-RHDαGN.
La detección del gen 16S rDNA en el ADN obtenido a partir de las muestras de sedimento y
de las muestras de aguas directas recolectadas se observa en la figura 11 donde este gen se
detectó en 6 de las 7 muestras de sedimentos y 5 de las 8 muestras de aguas utilizando la
polimerasa 2X SensiFAST probe No-Rox One-Step Kit, esto probablemente se deba porque la
técnica utilizada (PCR) no fue lo eficiente para poder amplificar los genes de interés en todos los
punto, dado que se presentaron inhibidores que imposibilitaron la amplificación de los genes.
(B)
C+ 1 2 3 4 5 PM 6 7 8 9 10 11 C-
(C)
C+ 1 2 3 4 5 PM 6 7 8 9 10 11 C-
C+ 1 2 3 4 5 PM 6 7 8 9 10 11 C-
(A)
C+ 1 2 3 4 PM 5 6 7 8 9 C-
(D)
74
Figura 11. Productos de amplificación de la detección del gen 16S rDNA utilizando el ADN genómico de las
muestras de sedimento y muestras de agua directa de la Quebrada Aguablanca mediante el sistema convencional
2X. Los carriles 1 al 7 corresponde a la amplificación del ADN obtenido de las muestras de sedimentos así: Carril
1: PS01. Carril 2: PS02. Carril 3: PS03. Carril 4: PS04. Carril 5: PS05. Carril 6: PS06. Carril 7: PSC08. Los
carriles 8 al 15 corresponden a la amplificación directa de las muestras de agua así: Carril 8: PA01. Carril 9:
PA02. Carril 10: PA03. Carril 11: PA04. Carril 12: PA05. Carril 13: PA06. Carril 14: PAC07. Carril 15: PAC08.
Control positivo: P. putida. PM: peso molecular de 100 pb. Control negativo: agua.
Adicionalmente se observa las diferentes intensidades de las bandas obtenidas lo que se asocia
con la concentración de ADN. A pesar de que las concentraciones obtenidas en la extracción
fueron bajas se pudo obtener bandas con intensidades altas, lo que se podría relacionar con la
cantidad de bacterias presentes en los puntos analizados, posiblemente en los puntos donde el
amplificado se ve con mayor intensidad se relacionada con la abundancia de microorganismos,
por tanto, a comparación de aquellos amplificados que presentaron bajas intensidades se podría
relacionar con la baja concentración de microorganismos presentes.
El gen intl1 se detectó en 6 de las 7 muestras de sedimentos de ADN genómico y en 5 de las
8 muestras de aguas directas usando la polimerasa 2X SensiFAST probe No-Rox One-Step Kit.
1 2 3 4 5 6 7 PM 8 9 10 11 12 13 14 15 C+ C-
Muestras de sedimentos Muestras de agua directa
75
La presencia del gen intl1 posiblemente se deba a que en estos puntos había la presencia de
contaminantes asociados a los antibióticos. En los puntos en los que no hubo amplificación del
gen intl1, da la posibilidad de que en esas muestras no haya la presencia de contaminantes en la
superficie del agua o posiblemente los contaminantes se encuentran en la profundidad de la
quebrada o están retenido o adheridos en las partículas de los sedimentos, lo que genera la
amplificación del gen intl1 en todas las muestras de sedimentos de este estudio (figura 12).
Además, se hace una correlación entre la presencia del gen intl1 y la presencia del gen 16S ya
que en los puntos donde no hubo amplificación del gen 16S, tampoco se observó la
amplificación del gen intl1. Esto puede deberse a que como el agua es un vehículo para
movilizar las partículas y en estas hay presencia de corrientes lo que genera que las bacterias no
puedan hacer una acumulación de las mismas y sean transporta por todo el cauce del río. Así
mismo, ocurre con el gen intl1, al no haberse observado la amplificación en ciertos puntos se
deba a que, por medio de las corrientes del agua, las partículas de los contaminantes de
antibióticos fueron movilizadas, por tal motivo, no hubo la amplificación del gen en los puntos
muestreados. También se observa que las bandas de los puntos PS06 de sedimentos y PA06 de
aguas directas, que corresponden a los puntos después de la planta de tratamiento de aguas
residuales (PTAR), tienen una mayor intensidad lo que confirma lo descrito por Gillings et al
(2015) que los tratamientos de la PTAR son ineficientes y no eliminan del todo las partículas de
los antibióticos, por lo contrario, aumentan más la presencia de ese tipo de contaminantes.
76
Figura 12. Productos de amplificación de la detección del gen intl1 utilizando el ADN genómico de las muestras
de sedimento y muestras de agua directa de la Quebrada Aguablanca mediante el sistema convencional 2X. Los
carriles 1 al 7 corresponde a la amplificación del ADN a partir de las muestras de sedimento así: Carril 1: PS01.
Carril 2:PS02. Carril 3: PS03. Carril 4: PS04. Carril 5: PS05. Carril 6: PS06. Carril 7: PSC08. Los carriles 8 al
15 corresponden a la amplificación directa de las muestras de agua. Carril 8: PA01. Carril 9: PA02. Carril 10:
PA03. Carril 11: PA04. Carril 12: PA05. Carril 13: PA06. Carril 14: PAC07. Carril 15: PAC08. Control positivo:
B. cepacia. PM: peso molecular de 100 pb. Control negativo: agua.
Los genes asociados al sistema enzimático de hidroxilación-dioxigenasa (RHD) de la unidad
α (PAH-RHDαGN) se detectaron en 5 muestras de las 7 muestras de sedimentos y en 5 muestras
de las 8 muestras de aguas directas analizadas en este estudio usando la polimerasa 2X
SensiFAST probe No-Rox One-Step Kit. En la figura 13 se observa la amplificación de múltiples
bandas con diferentes pesos moleculares, esto se debe a que los oligonucleótidos utilizados en el
presente estudio son degenerados, es decir, que dentro de su secuencia pueden presentar
múltiples variaciones disminuyendo su especificidad y por tanto, aumentando la probabilidad de
unión a regiones con un alto grado de similitud y que no son propias de los genes codificantes
para genes tipo hidroxilasa de anillos aromáticos (Cébron et al., 2008).
Muestras de sedimentos Muestras de agua directa
1 2 3 4 5 6 7 PM 8 9 10 11 12 13 14 15 C+ C-
77
Figura 13. Productos de amplificación de la detección del gen RHDαGN utilizando el ADN genómico de las
muestras de sedimentos y muestras de agua directa de la Quebrada Aguablanca mediante el sistema convencional
2X. Los carriles 1 al 7 corresponde a la amplificación del ADN obtenido a partir de las muestras de sedimentos
así: Carril 1: PS01. Carril 2: PS02. Carril 3: PS03. Carril 4: PS04. Carril 5: PS05. Carril 6: PS06. Carril 7:
PSC08. Los carriles 8 al 15 corresponden a la amplificación directa de las muestras de agua. Carril 8: PA01.
Carril 9: PA02. Carril 10: PA03. Carril 11: PSA04. Carril 12: PSA05. Carril 13: PA06. Carril 14: PAC07. Carril
15: PAC08. PM: peso molecular. Control positivo: P. putida. Control negativo: agua.
9.8 Asociación de la presencia de los genes y el grado de la presión antropogénica.
Cuando se realizó el análisis de las intensidades obtenidas de las fotografías de las
electroforesis (EF) para cada uno de los genes se pudo evidenciar una aparente asociación entre
la intensidad de la banda obtenida para los marcadores 16S e intl1 y el grado de presión
antropogénica presente en el área ya que se observa que al haber mayor actividad por el hombre
alrededor de la quebrada se ve la influencia que estos ocasionan a la misma. Para visualizar
mejor esta relación se estableció un patrón de calificación de la presión antropogénica (tabla 8)
con el fin de conferir un valor basado en las observaciones de los mapas. Para el análisis se tuvo
en cuenta la presión antropogénica acumulada teniendo en cuenta que los puntos de muestreo son
consecutivos. El análisis de la intensidad de cada uno de los fragmentos amplificados permitió la
Muestras de sedimentos Muestras de aguas directas
1 2 3 4 5 6 7 PM 8 9 10 11 12 13 14 15 C+ C-
78
estimación de tres parámetros, el volumen, la altura y el área como se observa en la figura 14
dependiendo de los pixeles de cada amplificado el cual da una valor para saber el volumen,
altura y área de los amplificados. Esto se hizo para establecer gráficamente una correlación lineal
entre la variable presión antropogénica y las unidades arbitrarias de intensidad obtenida por el
programa Photocapt MW.
Tabla 8. Asignación de costos de presión antropogénica para cada uno de los puntos. A cada uno de los
indicadores observados se les asignó un valor arbitrario depresión entre 1 y 5, siendo 1 la menor influencia y 5 la
máxima. Se tuvo en cuenta la rotación de personas en cada establecimiento.
Punto
Costo 1 2 3 4 5 6
Variable
Un
d
Cost
o
Un
d
Cost
o
Un
d
Cost
o
Un
d
Cost
o
Un
d
Cost
o
Un
d
Cost
o
De 1 a 49 casas x km2 1 1 1 1 1 0 0 0 0
Más de 50 casas x km
cuadrado
3 0 0 1 3 0 0 0
Centros de recreación 1 0 2 2 0 0 0 0
Establecimientos
comerciales
2 0 1 2 0 3 6 0 0
Cementerios 4 0 1 4 0 0
Hospitales 5 0 0 4 20 0 0 1 5
Clínicas veterinarias 2 0 2 4 0 0
Centros educativos 3 0 0 12 36 8 24 0 4 12
Bombas de servicio
automóvil
4 0 0 4 16 3 12 0 4 16
PTAR -1 0 1 -1 0
79
Figura 14. Análisis de intensidades de las bandas obtenidas en la electroforesis luego de la amplificación por
RCP para cada punto utilizando el marcador 16S. (A) se muestra un análisis para el punto 4 de los sedimentos
comparado con (B) el punto 5 de sedimentos que tuvo una mayor amplificación. Puede observarse las diferencias
en los tres parámetros, volumen, altura y área entre los dos puntos.
Con los resultados obtenidos del análisis de las intensidades de las bandas y el valor de la
presión antropogénica acumulada se realizó una gráfica para estimar el índice de correlación
como se muestra en la figura 15 y 16 para el marcador 16S e intl1 respectivamente. Este análisis
no se realizó para el marcador PAH-RHDαGN debido a la presencia de bandas interferentes en la
electroforesis.
Fabricas e industrias 5 0 0 1 5 2 10 4 20 2 10
TOTAL 1 5 80 60 19 43
Acumulado 1 6 86 146 165 208
(A) (B)
80
Figura 15. Relación entre la presión antropogénica acumulada y las variables de intensidad de banda obtenidas
en la RCP 16S para (A) sedimentos y (B) aguas en cada punto. Se observa una mejor correlación cuando se utiliza
una muestra de agua en comparación con el ADN de los sedimentos. La mejor correlación (0,95) se obtuvo cuando
se evaluó los valores obtenidos del área de las bandas en muestras de agua.
Figura 16. Relación entre la presión antropogénica acumulada y las variables de intensidad de banda obtenidas
en RCP intl1 para (A) sedimentos y (B) aguas en cada punto. Se observa una mejor correlación cuando se utiliza
muestras de agua que de los sedimentos. La mejor correlación (0,87) se obtuvo cuando se evaluó los valores
obtenidos del área de las bandas de las muestras de agua.
Se puede observar que existe una tendencia a aumentar la amplificación obtenida para los
marcadores 16S e intl1 a medida que aumenta la presión antropogénica acumulada. También
81
puede observarse una mejor correlación de los resultados cuando se utiliza muestra de agua
directa en comparación con el ADN obtenido de los sedimentos, lo que representa facilidad en la
manipulación y análisis técnico de los datos.
82
10. DISCUSIÓN
Las bajas concentraciones de ADN obtenidas de los sedimentos (<10 ng/µl) probablemente se
puede deber a que las muestras obtenidas no fueron lo suficientemente representativas para
obtener mayores concentraciones de ADN, a diferencia de Castañeda et al (2004) que a partir de
muestras ambientales logró obtener concentraciones de hasta 845 ng/µl. En cuanto a la pureza
del ADN para las cepas de referencia fue pureza media, con valores de Abs 260/280 entre 1.90 y
2,13 lo cual corresponde teóricamente a un 90 a 100% de pureza para las cepas P. putida y P.
putida 13, mientras que para las cepas P. aeruginosa, A. faecalis, B. cepacia se obtuvo valores
superiores de 2.0 lo cual indica que hay un exceso de ARN. En cuanto a la relación de Abs
260/230 se indicaron valores cercanos o inferiores a 2.0, para el cual indica la presencia de
carbohidratos, proteínas o hay degradación de las moléculas. Para el caso de la pureza de los
ADN genómicos de los sedimentos, la relación de Abs 260/280 se obtuvo valores entre 1,7-2.03
indicando una pureza del 90 al 100% para la mayoría de las muestras de sedimentos, por otro
lado, con respecto a la relación de Abs 260/230, sus valores fueron bajos para todas las muestras
indicando la presencia de carbohidratos, proteínas o fenoles (Del Valle, Rodríguez y Espinoza,
2004; Schultz et al., 1994).
La turbidez del agua se podría asociar con la presencia de contaminantes como los materiales
particulados o hidrocarburos, ya que, en el caso de los petróleos estos tienen color; se han visto
petróleos crudos negro, marrón, rojo, marrón amarillento o incluso verde. En el caso de medir la
densidad óptica de los petróleos crudos sin estar suspendidos en un medio líquido se obtienen
valores de densidades ópticas superiores a 3 con longitudes de onda 500 nm hasta 2500 nm.
83
Adicionalmente, se puede utilizar las mediciones de densidad óptica para cuantificar la
contaminación por hidrocarburos, donde se debe distinguir la región de absorción de dos tipos de
hidrocarburos: aromáticos complejos y alifáticos saturados, donde el pico de los hidrocarburos se
da entre las longitudes de onda 2300 a 2500 nm para estos compuestos (Andrew et al.,
2001/2002).
Por lo tanto, si los hidrocarburos se encuentran en concentraciones traza y disueltas en un
medio líquido, se podrían observar a longitudes mucho más pequeñas a las estudiadas por
Andrews et al (2001/2002) como se observó en este estudio. Sarria et al (2016) logró analizar
HAP en muestras de aguas, mostrando que HAP como el fenantreno se podía observar a 250 nm,
Benzo(a)pireno a 294.2 nm, comparando estos datos con los resultados obtenidos se podría decir
presuntivamente que las muestras de agua se encontraban estos tipo de HAP como el fenantreno,
antraceno e incluso el benzo(a)pireno que está presente en compuestos que hacen parte de
productos del cuidado personal como perfumes, cosméticos, labiales, entre otros, los cuales no
tienen una buena disposición de sus residuos al finalizar su vida útil.
El límite de detección de los genes del presente estudio se realizó mediante el uso de
diferentes polimerasas. Por un lado la polimerasa convencional 2X que cuenta con una ADN
polimerasa de inicio caliente (hot-start system) mediada por anticuerpos que apoya la
amplificación altamente específica cuando esta se activa después de calentar a 95°C durante 2-3
minutos para evitar una amplificación inespecífica que incluye la formación de dímeros de
cebadores lo que a su vez mejora la sensibilidad del ensayo y el rango dinámico. También cuenta
con un inhibidor de RiboSafe que garantiza la protección de las dianas de ARN de la
degradación de ARNasa (Bioline, SF). Esta polimerasa no fue tan sensible ya que amplificó
hasta cierta concentración de ADN mientras que la polimerasa BioRad (Sso7d) amplificó todas
84
la concentraciones de ADN trabajadas. Esto se debe porque está polimerasa cuenta con una
proteína de fusión Sso7d de un peso de 7kD, que se une a la plantilla de ADN sin ninguna
preferencia por secuencias específicas y lo que hace es estabilizar la asociación que se está
dando. Esta estabilización de la fusión Sso7d evita que la polimerasa se disocie durante el
proceso de amplificación, aumentando la capacidad de procesamiento de la polimerasa, y, por
tanto, aumentando la eficiencia de la reacción de la RCP, además esta proteína tiene una mayor
tolerancia a los inhibidores que se puedan presentar en la RCP, donde inhibidores como la sal, en
particular, podría generar una desestabilización en el complejo de polimerasa-ADN, por lo que la
fusión Sso7d es capaz de tolerar altas concentraciones de sal que una polimerasa Taq, pfu sin la
fusión e incluso de una polimerasa con un sistema convencional 2X (Wang et al., 2004).
El gen 16S es considerado como marcador universal debido a que se encuentra en todos los
microorganismos conocidos (Valenzuela-Gonzáles, 2015). Esto se compara con un estudio
realizado por Wildmer et al (1998) donde detectó genes 16S rRNA mediante una RCP altamente
selectiva en géneros de Pseudomonas sp a partir de muestras ambientales con el fin de entender
la importancia ecológica de los microorganismos en los diferentes ambientes. Adicionalmente
Woese et al (1990) propuso esta macromolécula como un cronómetro molecular ya que es una
molécula muy antigua, presente en todas las bacterias actuales, por lo tanto, constituye una diana
universal para la identificación en todos los microorganismos. En la mayoría de los puntos de
sedimentos y de aguas directas se detectó el gen 16S rDNA. La ausencia del gen 16S en algunos
de los puntos de sedimentos se relaciona con la pureza del ADN de sedimentos, en los puntos
donde no hubo presencia del gen la pureza del ADN posiblemente era muy baja debido a la
presencia de inhibidores que al momento de amplificar las muestras afectaron en el resultado de
amplificación. Para el caso de las aguas directas, al no haber una purificación de la muestra a
85
amplificar los posibles contaminantes presentes inhibieron la reacción de amplificación por lo
que no hubo presencia del gen en las muestras de aguas.
Los integrones son genes antiguos que se encuentran en los genomas bacterianos, donde
usualmente residen en los cromosomas (Gillings, 2014a). Existen diferentes tipos de integrones,
pero el más relacionado con la presencia de antibióticos en muestras ambientales es el gen
integron integrasa de clase 1 (intl1) nombrado así por ser el primero en ser descubierto. El gen
intl1 es considerado como biomarcador ya que es el gen más común que confiere resistencia a
los antibióticos, desinfectantes y metales pesados (Liebert et al., 1999; Patridge et al., 2001).
Además, por su abundancia puede cambiar rápidamente como respuesta a presiones ambientales,
ya que el gen intl1 reside en bacterias que poseen rápidos tiempos de generación y por su
localización a menudo en elementos móviles genéticos que se puede transferir entre bacterias
(Gilling, 2015). La presencia del gen intl1 en la mayoría de las muestras de sedimentos y de
aguas se puede deber a la presencia de antibióticos, además la intensidad de la amplificación es
mayor en los puntos que se encuentran antes y después de la planta de tratamiento de aguas
residuales (PTAR) confirmando que los procesos de eliminación de contaminantes como los
antibióticos no son lo suficientemente efectivos para su completa eliminación y promueven a una
mayor presencia de estos genes en el ambiente (Gilling, 2015). También una serie de estudios
realizados en las aguas residuales de las PTAR determinó que los microorganismos presentes en
el ecosistema acuático son más resistentes a los antibióticos de lo normal y eventualmente estos
han mutado, exponiendo a los seres vivos a microorganismos resistente, generando una
problemática sanitaria grave (Mompelat, Le Bot y Thomas, 2009).
Los genes que codifican las enzimas que están involucradas en las vías metabólicas de la
degradación de HAP se encuentra en diferentes bacterias Gram negativas (GN) y Gram positivas
86
(GP) (Habe y Omor, 2003). Por tanto, para este metabolismo, el primer paso ocurre mediante la
incorporación de oxígeno molecular en el núcleo aromático mediante un sistema enzimático de
hidroxilación-dioxigenada (RHD) de anillo aromático multicomponente. Este sistema se divide
en dos subunidades, la subunidad grande α y la subunidad pequeña β (Kauppi et al, 1998). La
subunidad α contiene dos regiones conservadas: el centro [Fe2S2] Rieske y el dominio catalítico
que contiene hierro mononuclear. Una de las dioxigenasas de PAH más estudiada (PAH-RHDα)
es la naftaleno-1,2-dioxigenassa de P. putida. Así mismo, PAH-RHDα abarca múltiples genes
asociados a los HAP nahAc, nahA3, nagAc, ndoB, ndoC2, pahAc, pahA3, phnAc, phnA1,
bphAc, bphA1, dntAc y arhA1pertenecientes a bacterias Gram Negativas. El uso de
oligonucleótidos degenerados que abarcan los genes anteriormente mencionados
presuntivamente se pudo amplificar en este estudio, obteniendo múltiples bandas de diferentes
pesos moleculares; esto se comprobó por un estudio llevado a cabo por Cébron et al (2008)
donde usaron los mismos oligonucleótidos de este estudio para detectar diferentes genes de
bacterias tanto Gram positivas como negativas de muestras de sedimentos y suelos donde
posiblemente existía la presencia de contaminantes por HAP y que estuviera asociado a la
degradación de los PAH mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo
real (RCP-TR) donde cuantificó el porcentaje de HAP biodegradados en muestras de sedimentos
contaminados con HAP.
A su vez existe una relación entre la presencia de los antibióticos generada por los HAP, por
lo cual se acepta la hipótesis de investigación donde sí existe una diferencia entre la
amplificación de genes asociados a los contaminantes en estudio de un cuerpo de agua
superficial de la ciudad de Bucaramanga, así como también se acepta la hipótesis alterna donde
la intensidad del amplificado se relaciona con la polución de los contaminantes por la actividad
87
antropogénica. Esta relación se llevó a cabo por un estudio realizado por Wang et al (2017)
donde mostró la que dos tipos hidrocarburos aromáticos policíclicos (naftalina y fenantreno)
aceleran la propagación de genes de resistencia a antibióticos en comunidades microbiana de
aguas costeras, donde la presencia de 100 mg/L de naftalina o 10 mg/L de fenantreno
aumentaban significativamente la abundancia del gen integron integrasa clase I (intl1), el gen de
resistencia a la sulfanilamida (sull) y el gen de resistencia a los aminoglucósidos (aadA2),
demostrando también que la transferencia génica horizontal aumentó la abundancia de genes
resistentes a antibióticos (GRA) principalmente por la transferencia mediada por intl1.
88
11. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
Los contaminantes como los antibióticos y los HAP cada vez más están presentes en cuerpos
de agua, lo que se refleja por la detección de genes asociados a estos tipos de contaminantes en
este estudio. La presión antropogénica, en este caso, podría ser responsable de la presencia de los
contaminantes y se logra ver que en áreas donde hay poca actividad llevada a cabo por el hombre
se ve nula la presencia de estos genes, pero a medida que la presión antropogénica empieza a
aumentar, se logra observar la presencia de los contaminantes y por ende los genes es mucho
más fuerte por la intensidad de las bandas amplificadas obtenidas. Adicionalmente, la presencia
de centros hospitalarios, estaciones de servicio automovilísticos favorecen al incremento de la
presencia de los antibióticos y los hidrocarburos aromáticos policíclicos.
A partir de parámetros arbitrarios se permite hacer una estimación mucho más efectiva del
efecto de la RCP para identificar la presión antropogénica. Por lo tanto, la técnica de RCP con el
gen intl1 permite identificar una relación (con una correlación de 0.95) entre el grado de presión
antropogénica con la intensidad de la banda obtenida en las muestras de aguas y sedimentos, a
diferencia de con los genes de PAH-RHDαGN que no se pudo obtener una asociación ya que se
obtuvo múltiples amplificados que imposibilitaban obtener un buen análisis.
Se recomienda realizar estudios posteriores incluyendo técnicas más sensibles como la qPCR
a la par con mayor cantidad de muestras o muestreo en diferentes tiempos para validar la
información obtenida en este estudio.
89
12. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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107
13. ANEXOS
13.1 Anexo 1. Revisión bibliográfica de blancos génicos
Biomarcador Símbolo Proceso biológico Referencia
Citocromo Eucariota
P450
CYP1A
Biotransformación de
compuestos aromáticos y
organoclorados
Costa et al., 2012
Proteína de choque
térmico 70
HSP70
Producida por una respuesta
química o un estresor físico Lehnert, 2014
Vitelogenina VTG
Alteración o ruptura del eje
hormonal por mimetismo
Dos Anjos et al.,
2011 Citocromo P450
aromatasa
CYP19A
Integron Integrasa Clase I intl1 Transferencia de resistencia Gilling et al., 2015
Hidroxilasa-dioxigenasa
PAH-
RHDαGN
Biorremediación de
compuestos aromáticos Cébron et al., 2008
108
13.2 Anexo 2. COMPOSICIÓN DE REACTIVOS DE EXTRACCIÓN DE ADN
En las tablas (9 a la 14) se muestran las composiciones de cada reactivo usado en la etapa
de extracción de ADN genómico.
Tabla 9.
Composición buffer de lisis.
COMPUESTO CONCENTRACIÓN (M)
EDTA 0,5
TRIS-HCl 1
NaCl 1
Tabla 10.
Composición proteinasa K.
COMPUESTO CONCENTRACIÓN
Glicerol -
Proteinasa K 0,008 g
Tabla 11.
Composición PBS 1X.
COMPUESTO CONCENTRACIÓN (g/L)
NaCl 8
109
KCl 0,2
Na2HPO4 1,44
0,24 KH2PO4
Tabla 12.
Composición Buffer TE 1X.
COMPUESTO CONCENTRACIÓN (M)
Tris-HCl 1
EDTA 0,5
Tabla 13.
Composición SDS 10%.
COMPUESTO CONCENTRACIÓN (g/L)
SDS 100
Tabla 14.
Composición acetato de sodio 5M.
COMPUESTO CONCENTRACIÓN (g/L)
Acetato de sodio 410
Todas las soluciones son preparadas en agua destilada, a excepción del Buffer TE 1X que se
preparó con agua desionizada. Los pH fueron ajustados con HCl o NaOH según lo requerido.
110
13.3 Anexo 3. PROTOCOLO DE EXTRACCIÓN SALTING OUT PARA CEPAS
DE REFERENCIA.
1. Se cultivaron células en un medio líquido fresco (caldo nutritivo) de cada uno de
los microorganismos y se tomó de cada uno 1 mL y se resuspendieron en un vial
estéril y se centrifugó a 10.000 RPM/ 1 minuto, posteriormente se descartó el
sobrenadante sin perder el pellet y se repitió el mismo procedimiento dos veces
para obtener la mayor biomasa posible.
2. Terminado el primer paso se descartó el sobrenadante y se agregó 600 µL de
buffer de lisis.
3. Se agregó 10 µL de proteinasa K y 10 µL de SDS 10%. Se mezcló por vórtex y se
incubó a 56°C en un baño termostático.
4. Una enfriada la mezcla se añadió 150 µL acetato de sodio M, se mezcló usando el
vórtex por 30 segundos y se incubó durante 5 minutos a 4°C.
5. Se centrifugó a 13.000 RPM durante 10 minutos y se transfirió el sobrenadante a
un nuevo vial estéril, si haber removido el pellet formado.
6. Se añadió al sobrenadante 600 µL de isopropanol a -20°C y se mezcló por
inversión durante 30 segundos.
7. Posteriormente se centrifugó a 4000 RPM por 4 minutos y se eliminó el
sobrenadante sin eliminar el pellet obtenido.
8. Se agregó 500 µL de etanol al 70%, se centrifugó a 4000 RPM durante 4 minutos
y se eliminó el sobrenadante. Se escurrió la boca del vial en un papel absorbente
limpio y se dejó el vial abierto para evaporar completamente el etanol.
111
9. Una vez evaporado el etanol, se agregó 50 µL de buffer TE 1X pH 7.5 estéril y se
incubó por 60 minutos.
10. Pasado el tiempo de incubación se dejó enfriar y se almacenaron los viales con el
ADN a -20°C.
112
13.4 Anexo 4. SELECCIÓN DE RÍOS Y QUEBRADAS COMO OBJETO DE ESTUDIO.
Figura 17. Mapa del rio del Hato del área Metropolitana de Bucaramanga. Este río atraviesa solo el municipio de Piedecuesta.
113
Figura 18. Mapa del Río de Oro del área metropolitana de Bucaramanga. Este río atraviesa los municipios de Girón y Piedecuesta.
114
Figura 19. Mapa de la Quebrada Aguablanca del área Metropolitana de Bucaramanga, empezando su cauce desde el municipio de Bucaramanga y finalizando en
el municipio de Girón.
115
13.5 Anexo 5. DENSIDADES ÓPTICAS DE LAS MUESTRAS DE AGUAS
AGITADAS Y CENTRIFUGADAS DE LA QUEBRADA AGUABLANCA.
Tabla 15
Densidades ópticas de las muestras de aguas agitadas y centrifugadas a diferentes
longitudes de onda: 250, 254, 262 y 294 nm.
PUNTOS
AGUAS AGITADAS
LONGITUDES DE ONDA
250 nm 254 nm 262 nm 294 nm
PA01 1,3061 ± 0,7544 0,6145 ± 0,4218 0,0867 ± 0,1015 2,2361 ± 0,0959
PA02 0,6635 ± 0,0031 0,4402 ± 0,5290 0,3305 ± 0,2162 2,2132 ± 0,1710
PA03 0,2715 0,7024 ± 0,4480 0,6961 ± 0,1002 2,1901 ± 0,0579
PA04 0,0078 ± 0,0694 0,0747 ± 0,0055 0,086 ± 0,0025 0,5954 ± 0,012
PA05 0,0694 ± 0,0021 0,1064 ± 0,0032 0,1153 ± 0,0006 0,1109 ± 0,0017
PA06 0,1003 ± 0,0029 0,1179 ± 0,0056 0,1277 ± 0,0036 0,1395 ± 0,0038
PA07 0,1132 ± 0,0024 0,085 ± 0,0030 0,0966 ± 0,0020 0,1468 ± 0,0019
PA08 0,0777 ± 0,0048 0,7225 ± 0,0044 0,1492 ± 0,0065 0,1228 ± 0,0059
AGUAS CENTRIFUGADAS
PA01 0,4891 ± 0,5038 0,3736 ± 06871 0,294 ± 02579 1,5335 ± 1,4754
PA02 0,1966 ± 0,1705 0,4024 ± 0,3863 0,4243 ± 0,3668 2,1962 ± 0,0244
PA03 0 ± 0 0 ± 0 -0,1995 0,1413 ± 0,0411
PA04 0,0978 ± 0,0013 0,1056 ± 0,0009 0,1124 ± 0,0003 0,1125 ± 0,0009
PA05 0,0539 ± 0,0007 0,0621 ± 0,0014 0,0725 ± 0,0032 0,1001 ± 0,0019
PA06 0,0449 ± 0,0040 0,515 ± 0,003 0,0634 ± 0,0022 0,0888 ± 0,0014
PA07 0,0682 ± 0,0021 0,0734 ± 0,0019 0,0844 ±0,0006 0,1068 ± 0,0013
PA08 0,0355 ± 0,0011 0,0426 ± 0019 0,0544 ± 0,0019 0,0858 ± 0,0010
116
13.6 Anexo 6. FECHAS DE TOMA DE MUESTRAS
Tabla 16.
Fechas de recepción de muestras de sedimento y de agua.
FECHA MUESTRA
27 – Jun PS01/PA01
27 – Jun PS02/PA02
4 – Ago PS03/PA03
4 – Ago PS04/PA04
4 – Ago PS05/*PA05
4 – Ago *PS06/PA06
4 – Ago PAC07
27 – Jun *PSC08/*PAC08
*PS: Punto sedimento; *PA: Punto agua, *PSC: Punto sedimento control, *PAC: Punto
agua control.
117
13.7 Anexo 7. CONDICIONES Y PROGRAMAS DE AMPLIFICACIÓN DE LOS
BLANCOS GÉNICOS.
Tabla 17.
Condiciones de amplificación de los blancos génicos del presente estudio.
GEN REACTIVOS CONCENTRACIONES VOLÚMENES
16S rRNA
Buffer SensiFAST 1X 5 µl
H20 - 3.75 µl
17AF 0.125 µM 0.125 µl
18Ar 0.125 µM 0.125 µl
ADN 10 ng 1 µl
Intl1
Buffer SensiFAST 1X 5 µl
H20 - 3.6 µl
IntlF165 0.2 µM 0.2 µl
IntlR476 0.2 µM 0.2 µl
ADN 10 ng 1 µl
PAH-RHDαGN
Buffer SensiFAST 1X 5 µl
H20 - 3.2 µl
PAH-RHDαGNF 0.4 µM 0.4 µl
PAH-RHDαGNR 0.4 µM 0.4 µl
ADN 10 ng 1 µl
118
Tabla 18.
Programas de amplificación de los blancos génicos del estudio.
Oligonucleótidos 16S
rRNA
Oligonucleótidos intl1
Oligonucleótidos PAH-
RHDα-GN
95°C
4:00
min
95°C
5:00
min
95°C 5:00
min
94°C 40 seg
40
ciclos
95°C 30 seg
30 ciclos
95°C 30 seg
40
ciclos
73°C 30 seg 71,9°C 30 seg
53,1°
C
30 seg
72°C
2:00
min 72°C
5:00
min
72°C 30 seg
72°C
5:00
min
12°C ∞
72°C 5:00
min
8°C ∞ 12°C ∞
