Dra. Padilla Chumacero Martha N.

DETECCiÓN DE BETA LACTAMASAS DE ESPECTRO EXTENDIDO (BLEE) ENESCHERICHIA COLI y KLEBSIELLA PNEUMONIAE MEDIANTE MÉTODO DE

JARLIER.

Autores:

Dra. Padilla Chumacero Marlha N. (1)

(1) Bacterióloga Hospital "Jaime Mendoza".Docente Titular de Bacteriología. Facultad de Medicina UMRPSFXCH.MS.c. Diagnóstico Laboratorial de Enfermedades Infecciosas.

Recepción: 30/Agosto/20 11

RESUMEN

Las BLEE son enzimas de configuración plasmídica,producidas por enterobacterias que hidrolízan losantibióticos betalactámicos, incluyendo los quecontienen el grupo oximino, como las cefalosporinasde tercera y cuarta generación y el aztreonam.Son producidas comúnmente por Klebsiella spp yEscherichia coli, pero pueden aparecen en otrosgramnegativos. Las fallas en su detección generanerrores terapéuticos en la práctica clínica, por ellolos laboratorios de bacteriología deben realizar la"lectura interpretada del antibiograma", donde sebusca fenotípicamente factores de resistencia.De 314 cepas estudiadas en el servicio deBacteriología del Hospital "Jaime Mendoza" de laciudad de Sucre, 45 corresponden a Escherichia colíy 26 a Klebsiella pneumoniae productoras de betalactamasa de espectro extendido.Respecto a la edad, personas de 61 años y másfueron las que presentaron mayor prevalencia deinfección por estas ceoes.Estas bacterias presentaron sensibilidad a imipenem,y en menor porcentaje a amikacina.

PALABRAS CLAVE:

Beta lactamasa de espectro extendido (BLEE).Escheríchia colí, Klebsiella pneumoniae

Aceptación: 30/Septiembre/2011

SUMMARY

The ESBL enzymes have plasmid configuration,are produced by enterobacteria that hydrolyzebeta-Iactam antibiotics, including those containingthe oxyimino group, such as cephalosporins ofthird and fourth generatíon, and aztreonam. Thisenzymes are produced commonly by Klebsiella sppand Escherichia colí, but may appear in other gram-negative bacteria. The failure detecting them hasgenerated therapeutic errors in clinical practice,so the bacteriology laboratories must perform the"interpretative reading of antibiogram" in order tosearch for phenotypic resistance factors.Of 314 strains tested in the service of BacteriologyHospital "Jaime Mendoza" of Sucre city, 45correspond to Escherichia coli and 26 correspondto Klebsiella pneumoniae producing enzymesextended-spectrum beta-Iactamase.Regarding age, persons aged 61 and over werethose that showed higher prevalence of infectíonwith these strains.These bacteria showed sensitivity to imipenem, andto a lesser percentage to amikacin.

KEYWORDS:

Extended Spectrum Beta Lactamase (ESBL),Escherichia coti, Klebsiella pneumoniae

Archivos Bolivianos de Medicina. Vol. 16. N° 84 • Julio - Diciembre 2011 • N° de Páginas 107 • ISSN 0004-05257

Detección de beta lactamasas de espectro extendido (BLEE) en escherichia coli y klebsiella pneumoniae mediantemétodo de [arlier,

INTRODUCCIÓN.-

La introducción de los antimicrobianos para eltratamiento de las enfermedades infecciosas,ha sido uno de los más beneficiosos avancesde la medicina moderna. Sin embargo, su usofavorece la selección de cepas resistentes que soncapaces de diseminarse rápidamente. Así pues,con el transcurso del tiempo aumentan las tasasde resistencia antimicrobiana y los antibióticospierden su eficacia. (7)

Resistencia bacteriana se define como aquelproceso por el cual las bacterias no se inhiben y/odestruyen en su interacción con los antimicrobianosa partir de su correspondiente dosificación y luegode su concentración fisiológica en el organismo yque obedece al establecimiento de por lo menos unmecanismo de resistencia generado cromosómicao extra cromosómicamente. (8)

El principal mecanismo de resistencia alos betalactámicos y aminoglucósidos enenterobacterias es el enzimático, dondedeterminadas enzimas bacterianas reconocen adeterminados betalactámicos o aminoglucósidos.(7)

La familia de los antibióticos betalactámicos sonun grupo de antibióticos más numerosos y másusados en la práctica clínica. A lo largo de los añosse han ido incorporando nuevas moléculas conmayor actividad frente a los bacilos gramnegativos,capaces de superar las resistencias adquiridasfrente a sus predecesores.

Beta lactamasas.- Aunque la resistencia alos belactámicos está definida por distintosmecanismos, el principal mecanismo de resistenciaa los betalactámicos en enterobacterias es elenzimático por producción de betalactamasas.Un ejemplo de esta situación constituye las cepasde Enterobacter, Escherichia coli y Klebsiellapneumoniae., donde existe una disminución de lapermeabilidad asociada a una hiperproducción debeta lactamasa plasmídica en Escherichia coli yKlebsiella pneumoniae. (5)

8Archivos Bolivianos de Medicina. Vol. 16. N° 84 • Julio - Diciembre 2011 • N° de Páginas 107. ISSN 0004-0525

Se conocen más de 50 beta-Iactamasas diferentes,la mayor parte producidas bajo el control deplásmidos bacferianos. Las cefalosporinasmás recientes pueden inducir la producción debetalactamasa. (3)

Las beta lactamasas de espectro extendido(BLEE), son actualmente las más importantes yestudiadas.

Beta lactamasas de espectro extendido (BLEE).-Las BLEE son enzimas de configuración plasmídica,producidas por enterobacterias que hidrolizan losantibióticos betalactámicos, incluyendo los quecontienen el grupo oximino, como las cefalosporinasde tercera y cuarta generación y el aztreonam, LasBLEE, no hidrolizan a las cefamicinas.

Las beta lactamasas de espectro extendidoderivan por mutación de las betalactamasas deamplio espectro, presentes en la mayor partede las enterobacterias y se encuentran conmayor frecuencia en Klebsiella pneumoniae yen Escherichia coii, aunque se han identificadotambién en otras especies.

Un estudio en el hospital Español de RosarioArgentina, muestra que los factores de riesgorelacionados con K. pneumoniae BLEE, fueronla adquisición nosocomial y el uso previo deciprofloxacina. (6)

Con frecuencia estas bacterias productoras deBLEE, expresan resistencia a otros grupos deantimicrobianos incluidos los aminoglucósidos,quinolonas y cotrimoxazol. (6)

Si una bacteria es productora de betalactamasade espectro extendido BLEE, se debe considerarcomo resistente a todas las cefalosporinas aexcepción de cefamicinas y monobactamas,manteniendo la sensibilidad a los inhibidores delas-beta lactamasas y a las carbapenemasas.Se evita el uso clínico de cefamicinas (cefoxitina)debido a que conlleva el riesgo de selección debecteries mutantes resistentes al antibiótico.

Dra. Padilla Chumacero Martha N.

La detección de las beta lactamasas de espectroextendido no siempre es fácil, y debe tenerseencuentra que pequeñas disminuciones desensibilidad observadas en el antibiograma, aCefalosporinas de tercera generación o presenciade sinergia entre Cefalosporinas de tercerageneración o Cefalosporinas de cuarta generacióny el ácido clavulánico, así como resistenciaasociadas especialmente a aminoglucósidos, sonindicativos de probable producción de BLEE. (5)

Lectura interpretada del antibiograma.- Elantibiograma tiene como objetivo evaluar en ellaboratorio la respuesta de un microorganismo a unoo varios antimicrobianos, traduciendo su resultadocomo factor predictivo de la eficacia clínica. En eltranscurso de los años, los laboratorios comenzarona analizar de manera sistemática los datos desensibilidad del antibiograma, esencialmente aantibióticos betalactámicos y aminoglucósidos,tratando de relacionar sus resultados con losposibles mecanismos de resistencia. Este análisispermitió detectar e identificar algunos mecanismosde resistencia, incluso antes de que éstos tuvieranverdadera trascendencia clínica. Este proceso sedenomino "lectura interpretada del antibiograma" yse fundamentó en el conocimiento molecular de losmecanismos de resistencia y en la interpretaciónterapéutica de las pruebas de sensibilidad in vitrocon el fin de mejorar la terapia antimicrobiana.

La lectura interpretada del antibiograma no debeconfundirse con el proceso de simple interpretaciónde los resultados de las pruebas de sensibilidadpor medio de los puntos de corte, debido a quela interpretación del antibiograma establece laprobabilidad de éxito o de fracaso terapéutico, quese deriva de la utilización de los antimicrobianosfrente a los microorganismos causantes deinfección y estudiados en el antibiograma. (1)

Esta lectura interpretada del antibiograma, esla que actualmente todos los laboratorios debacteriología realizan.

Determinación de la susceptibilidad antimicrobianaen el laboratorio (antibiograma).-

Para realizar el antibiograma, se siguen las reglasde CLSI 2011 (Clinical and Laboratory StandardsInstitute).El uso de más de una cefalosporina de tercerageneración y aztreonam en el test, aumenta laprobabilidad de detección de BLEE.

1.- El test inicial de tamizaje indica que halosmenores o iguales a 27 mm en cefotaxima, 25mm para ceftriaxona o a 22 mm para Ceftazidima,sugiere producción de BLEE. (2)

En el antibiograma se prueba la sensibilidad de otrosantibióticos como quinolonas, aminoglucósidos,cotrimoxazol e imipenem, para ver opciones detratamiento antimicrobiano.

2. - El test de Jarlier, test confirmatorio de BLEE(Comité de la Sociedad Francesa de Microbiología),utiliza la técnica del efecto de doble disco paradetectar esta enzima.

Para realizar el test de Jarlier, se inoculó una placade agar Muller Hinton con la cepa sospechosa,con una turbidez similar a la suspensión de 0,5de Mc Farland, se colocó un disco de amoxicilina/ácido clavulánico (20/10 mcg) en el centro delagar y alrededor a 20 mm de distancia, discos deCeftazidima (30mcg) y Cefotaxima (30 mcg), seincubó 24 horas a 37 DC. La presencia de BLEEse manifestó por el efecto sinérgico del inhibidory los discos de cefalosporinas. Esta sinergia,es llamada "efecto huevo" o cola de pez (test deJarlier). (4)

OBJETIVO GENERAL.-

- Determinar la prevalencia de cepas deEscherichia coli y Klebsiella pneumoniaeproductoras de BLEE, aisladas en el servicio deBacteriología del Hospital "Jaime Mendoza" deSucre, durante el año 2010.

OBJETIVOS ESPECíFICOS.-

- Determinar la cantidad de cepas productoras yno productoras de BLEE.

- Establecer una relación con la edad

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Detección de beta lactamasas de espectro extendido (BLEE) en escherichia coli y klebsiella pneumoniae mediantemétodo de Jarlier.

- Determinar la sensibilidad y resistencia delas cepas productoras de beta lactamasade espectro extendido a otros antibióticos:Cotrimoxazol, amikacina, ciprofloxacina,gentamicina e imipenem.

MATERIAL Y MÉTODOS.-

Se revisaron los informes de los resultados de loscultivos realizados en el servicio de Bacteriologíadel Hospital "Jaime Mendoza" dependiente dela Caja Nacional de Sucre, donde se aislaron endistintas muestras de pacientes hospitalizados,cepas de Escherichia coli y Klebsiella pneumoniaeproductoras o no de beta lactamasa de espectroextendido.Todas estas cepas fueron sometidas a test deJarlier (discos de cefotaxima, ceftriaxona oRESULTADOS.-

Ceftazidima colocadas a 20 mm alrededor deldisco deAmoxicilina/ácido clavulánico o ampicilina/sulbactam), para observar la producción de betalactamasa de espectro extendido (BLEE), ademásse probó en el antibiograma la susceptibilidad aotros antibióticos por ser opciones de tratamiento:Amikacina, Cotrimoxazol, Ciprofloxacina,Gentamicina e Imipenem, siguiente las reglas delLaboratorio de Referencia Internacional (CLSI)y del Laboratorio Nacional de Referencia enBacteriología Clínica (INLASA)El control de calidad, se realizó medianterecomendaciones de CLSI e INLASA, con cepasATCC.Se estudiaron un total de 314 cepas, de las cuales45 cepas de Escherichia coli y 26 de Klebsiellapneumoniae produjeron la enzima beta lactamasade espectro extendido.

Cuadro N° 1Cepas de Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae

productoras y no productoras de BLEEBacteria BLEE positivas BLEE negativas

N° % N° %Escherichia 45 63.4 269 85,7coliKlebsiella 26 36.6 45 14,3pneumoniaeTOTAL 71 100 314 100

Gráfico N° 1Número de cepas de Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae

productoras o no de BLEE300

250

200---

150---

--100

50

oE.coli

El cuadro y gráfico N° 1, muestran que existen deun total de 314 cepas estudiadas; 45 cepas deEscherichia coli (63.4%) y 26 cepas de Klebsiella10

Klebsiella TOTAL

pneumoruee (Jb.b%), son productoras de BLEE,con un total de 71 cepas. Las restantes cepas, noson productoras de esta enzima.

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Dra. Padilla Chumacero Martha N.

Cuadro N° 2Relación entre las cepas de Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae

productoras de BLEE y la edad

Bacterias producto- EDAD (años)ras de BLEE 0-20 21- 40 41- 60 61 Ymás

N° % N° % N° % N° %Escherichia O O 3 50 7 46,7 45 63,4coliKlebsiella 3 100 3 50 8 53,3 26 36,6pneumoniaeTOTAL 3 100 6 100 15 100 71 100

El cuadro N° 2, muestra que el mayor númerode cepas productoras de beta lactamasa deespectro extendido, fueron aisladas de pacientes

comprendidos entre 61 años y más, con un valor,para Escherichia coli de 45 y para Klebsiellapneumoniae de 26.

Cuadro N° 3Sensibilidad y resistencia a otros antibióticos en cepas de

Escherichia coli productoras de BLEE

Porcentaje de sensibilidad y resistencia a otros antibióticosEscherichia coli Amikacina Ciprofloxacina Cotrimoxazol Gentamicina Imipenem

Sensible 75.6 O 15.6 15.6 100Resistente 24.4 100 84.4 84.4 O

El Cuadro N° 3, muestra que no existe resistenciade las cepas de Escherichia coli a imipenem,la resistencia a Amikacina fue de 24,4%, a

ciprofloxacina del 100%, de cotrimoxazol ygentamicina deI84,4%

Cuadro N°4Sensibilidad y resistencia a otros antibióticos en cepas de

Klebsiella pneumoniae productoras de BLEE

Porcentaje de sensibilidad y resistencia a otros antibióticosKlebsiella Amikacina Ciprofloxacina Cotrimoxazol Gentamicina Imipenem

pneumoniaeSensible 53.8 30.8 23.1 23.1 96.2Resistente 46.2 69.2 76.9 76.9 3.8

El cuadro N° 4, muestra que existe una resistenciade Klebsiella pneumoniae a imipenem del 3,8%,

a .amikacina del 46.2%, ciprofloxacina 69,2%,cotrimoxazol y gentamicina del 76,9%.

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Detección de beta lactamasas de espectro extendido (BLEE) en escherichia coli y klebsiella pneumoniae mediantemétodo de Jarlier.

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES.-

- En el Hospital "Jaime Mendoza", existeninfecciones causadas por Escherichia coli yKlebsiella pneumoniae productoras de BLEE.

- Imipenem y amikacina, son opciones detratamiento según antibiograma. Se debe hacernotar, que el uso de Imipenem, favorecerála aparición de cepas productoras decarbapenemasas.

- Los laboratorios de bacteriología deben buscartodos los mecanismos de resistencia fenotípicaposibles, para evitar fracasos terapéuticos, esdecir, realizar un antibiograma interpretado.

Las siguientes fotos, muestran el efecto sinérgico(efecto huevo) entre amoxicilina/ácido clavulánicoo ampicilina/sulbactam y discos de Ceftazidima ocefotaxima,

BIBLlOGRAFIA.-

Efecto sinérgico. Servicio de Bacteriología. Hospital "Jaime Mendoza".

Archivos Bolivianos de Medicina. Vol. 16. N° 84 • Julio - Diciembre 2011 • N° de Páginas 107. ISSN 0004-0525

1.-Canton R. Lectura Interpretada delAntibiograma:¿ejercicio intelectual o necesidadclínica? Servicio de Microbiología. HospitalRamón y Cajal. Madrid, España: Enferm. Infecc.Microbiol. Clin. 2002; 20(4). 176-86. p. 48-50.

2.- CLSI. Clinical and Laboratory Standards Institute.Performance Standards for Antimicrobialsusceptibility Testing; twenty -first InformationalSupplement .M100-s21. Vol. 31. N° 1. ReplacesM100-S20. Vol. 30 N° 15. January 2011.

3.-Jawetz, Melnick, Adelberg. Microgiolobía Médica.19 a edición. Organización Panamericana de laSalud. 2008. p. 186.

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12

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8.- Trigoso C. Curso: Mecanismos Básicos de. Resistencia en Patógenos Intrahospitalarios.