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Detección de la multi-resistencia bacteriana
Dr. Germán Bou, Jefe de Servicio de Microbiología del
Complejo Hospitalario Universitario A Coruña (CHUAC);
Director del Grupo de Investigación de Microbiología y
Enfermedades Infecciosas del Instituto de Investigación
Biomédica de la Coruña (INIBIC) en el Área de Genética,
Microbiología y Medicina Molecular; y Profesor Asociado de
Ciencias de la Salud, del Departamento de Microbiología y
Parasitología de la Universidad de Santiago de Compostela.
En el siglo XX, las muertes por enfermedades infecciosas descendieron (patrón
EEUU) debido a la combinación de mejoras en el desarrollo y en los sistemas de salud
como estándares de vida, saneamiento, agua potable, vacunas y medicamentos
antibióticos efectivos.
Los antibióticos ayudaron a mejorar el mundo. La penicilina aumentó la
supervivencia de enfermos con neumonia y bacteremia del 10% al 90%.
Pero un hecho
destacable de las bacterias en general es su rápida evolución a los antibióticos. Tal y
como se muestra en la figura de abajo, es notoria la aparición de un gran número de
enzimas tipo β-lactamasas identificadas tras la introducción de los primeros
antibióticos β-lactámicos. Este patrón evolutivo con semejante rapidez no se observa
en otros modelos biológicos.
Una preocupación especial, desde hace meses es la emergencia de cepas
resistentes a la colistina, único antibiótico que nos quedaba seguro frente a las
bacteria Gram negativas multirresistentes.
Paralelamente, el descubrimiento y desarrollo de nuevos antimicrobianos en los
últimos años ha tenido la evolución contraria. Muy pocos nuevos antibióticos han sido
aprobados en el actual siglo.
Por otro lado, la crisis de la RAM ha llegado ahora por diversas razones:
- Causas relativas a los microbios: evolución rápida - Causas humanas:
Población humana Sobreuso de los antibióticos
- Uso clínico Sobre prescripción Cursos de tratamiento extensos
- Percepción y comportamiento Almacenamiento Compras sin prescripción
- Aplicaciones en la agricultura/ganadería- Presiones comerciales- Reticencia a la vacunación
La RAM va a ser un problema de tremendas dimensiones. Las muertes atribuibles a la RAM para el año 2050 se estima en torno a los 10 millones como se puede ver en lafigura siguiente:
Según un informe de septiembre de
2016 del Banco Mundial (Drug
Resistant Infections. A Threat of Economic Future, World Bank Group) existe también
una repercusión económica importante relacionada las bacterias RAM: Pérdida en el
PIB, entre el 1,1 y el 3,8% (> 5% en los países con ingresos bajos), que conducirá a
28 M de personas a la pobreza, e incremento de los costes de la atención de salud de
$300M a $1000.000M, y afectación del desarrollo sostenible.
Hoy día se tiende a considerar el problema de la RAM, menos de manera médica
individual y más global, integrado, multisectorial, enfocado hacía la Salud, sobre todo
en lo que se refiere a la transmisión de los genes RAM, que afecta a bacterias
humanas, animales y de entornos naturales.
Para enfocar bien el problema, se ha llegando a acuerdos tripartitos como los de la
Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO), World Organization for
Animal Health (OiC) y World Health Oganization (WHO o OMS)
El plan Global de Acción de la OMS se puede resumir así: “mantener la capacidad
de prevenir y tratar infecciones con medicamentos seguros y eficientes … usados de
manera responsable y accesibles para todos"
(WHO, 2015. Global Action Plan on Antimicrobial Resistance.http :// apps.who.int/iris/bitstream/10665/193736/1/9789241509763_eng.pdf?ua=1)
El Grupo Especial de Coordinación Interagencial de la OMS, en mayo 2017,
reconocía que la RAM es compleja y que exige un enfoque multisectorial, y un marco
general de intervenciones, el vínculo entre la RAM y el Plan de Acción Mundial con los
ODS, la necesidad de mejores datos, pero también actuar sobre lo que ya se conoce,
el papel del medio ambiente en la aparición y propagación de la RAM, la necesidad de
investigación y desarrollo relacionada con la RAM, educación para profesionales
relevantes y público en general y participación de la comunidad social.
http:// www.who.int/antimicrobial-resistance/interagency-coordination-group/IACG-firstMtgReport.pdf?ua=1
Frente a este problema , las soluciones pueden ser múltiples y pasan por mejorar el
control d ela infección, planes de optimización del uso de antimicrobianos, protocolos
de seguimiento de microorganismos multirresistentes y optimizar la detección
temprana de los mismos a través de metodología del laboratorio.
Se contemplan y analizan varios métodos actuales y de futuro:
Métodos actualmente más utilizados
Pruebas fenotípicas automáticas y/o
manuales Pruebas proteómicas (MALDI-TOF MS) Técnicas moleculares basadas en ácidos
nucleicos (PCR sobre todo)
Pruebas proteómicas
En línea con las medidas de control, el Dr. Bou y su equipo tienen amplia
experiencia en la detección rápida de bacterias (RAM) con el sistema MALDI-TOF MS.
Algunos resultados a modo de resumen:
Detección de β-lactamasa(carbapenemasa) OXA-48
Desarrollaron un ensayo de espectrometría de masas con el MALDI-TOF MS,
rápido y sensible (100%) que los existentes, para detectar bacterias productores β-
latamasa tipo OXA-48 en 161 aislados clínicos previamente caracterizados. Se
controló el ertapenem para detectar resistencia a carbapenemes, y se incluyó la
temocilina como un marcador para las cepas productoras de OXA-48. Los datos de los
resultados se obtuvieron en un tiempo dentro de 60 min.
J
Clin Microbiol 2016; 54(3): 754–759. doi: 10.1128/JCM.02496-15.
Resistencia a carbapenémicos de bacilos Gram negativos de hemocultivos positivos
Otro nuevo método desarrollado, basado en el MALDI-TOF, fue para la detección
rápida y automática de Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa y Acinetobacter
baumannii productoras de carbapenemasas, directamente a partir de sangre de
hemocultivos positivos. La actividad de la carbapenemasas se determinó en 30
minutos midiendo la hidrólisis de imipenem (0,31 mg/ml) en hemocultivos enriquecidos
con una serie de 119 aislados previamente caracterizados, 81 de los cuales portaban
un tipo de carbapenemasa (10 blaKPC, 10 blaVIM, 10 blaNDM, 10 blaIMP , 26 blaOXA-48-tipo,
9 blaOXA-23, 1 blaOXA-237, 3 blaOXA-24 y 2 blaOXA-58). Este ensayo resultó simple de
realizar, económico, con ahorro de tiempo, universal para bacilos gramnegativos y
altamente confiable (sensibilidad y especificidad generales de 98% y 100%,
respectivamente). El tiempo total de 1 h, incluida la extracción, la incubación y el
análisis del MALDI-TOF.
El procedimiento empleado podría establecerse como un método estandarizado en
laboratorios clínicos ya que no requiere capacitación especializada en espectrometría
de masas.
J Antimicrob Agents 2016; 48: 655-660. http://dx.doi.org/10.1016/j.ijantimicag.2016.08.024
Imipenem–avibactam: combinación para la detección rápida de carbapenemasasen Enterobacteriaceae y Acinetobacter baumannii por MALDI-TOF
En este estudio se propuso un novedoso método basado en MALDI-TOF MS para
detectar Enterobacteriaceae y Acinetobacter baumannii productoras de
carbapenemasas. Se analizaron una serie de 131 aislados. Entre ellos, un total de 115
Enterobacteriaceae: 79 con una carbapenemasa (15 blaKPC, 7 blaNDM, 11 blaIMP, 12
blaVIM y 34 blaOXA-48) y 16 aislados de A. baumannii: 15 con carbapenemasas (10
blaOXA-23, 2 blaOXA-58, 2 blaOXA-24 y 1 blaOXA-237). El resto de los aislados no eran
productores de carbapenemasas (controles negativos). Las bacterias se sometieron a
pruebas de sensibilidad usando una combinación de imipenem-avibactam y se
analizaron mediante el software MALDI-TOF Biotyper Compass (Bruker Daltonik,
Alemania). El ensayo mostró una sensibilidad y especificidad global para la detección
de carbapenemasas del 98% y del 100%, respectivamente. La combinación de
imipenem y avibactam mostró actividad contra Enterobacteriaceae productoras de
KPC y OXA-48, pero no proporcionó ningún beneficio sobre A. baumannii.
Diag Microbiol InfectDis 2016; 87: 129-132.
doi:http://dx.doi.org/10.1016/j.diagmicrobio.2016.10.016.
Detección rápida del determinante de resistencia a quinolonas condicionada porplásmido AAC(6 ')-Ib-cr en Enterobacteriaceae por análisis con MALDI-TOF MS
El objetivo del estudio fue la detección rápida del determinante de resistencia a
fluoroquinolonas condicionada por el plásmido AAC(6')-Ib-cr en Enterobacteriaceae
analizando por MALDI-TOF MS la actividad de la acetiltransferasa. La presencia de la
enzima se midió en una colección de 81 cepas de control isogénicas de Escherichia
coli [10 portanban AAC(6')-Ib-cr durante su exposición a ciprofloxacino, norfloxacino y
levofloxacino] y un análisis adicional de 36 aislados clínicos [25 con AAC(6')-Ib-cr,
además de diferentes combinaciones de mecanismos de resistencia a quinolonas]. El
efecto de la acetilación produce un aumento de 43 Da en la masa de ciprofloxacino y
norfloxacino, pero no de levofloxacino. Se encontró una clara diferenciación entre los
aislados productores de AAC(6')-Ib-cr- y los no productores, todo en un tiempo de
incubación de 30 minutos, tanto en las cepas de control isogénicas como en los
aislados clínicos. El levofloxacino se encontró intacto. Hubo un acuerdo del 100%
entre el ensayo basado en MALDI-TOF-MS y los resultados de la caracterización
molecular de los aislados analizados. Este método es fácil de realizar y no consume
mucho tiempo, ya que los resultados analíticos se pueden obtener en cuestión de
minutos.
J Antimicrob Chemother2017;
72: 1074-1080. doi: 10.1093/jac/dkw552
Detección directa rápida de Enterobacteriaceae productoras de carbapenemasas
en muestras clínicas de orina mediante análisis MALDI-TOF MS
Lo autores procesaron 3 041 muestras de orina mediante citometría de flujo, y se
utilizó un valor de corte de ≥1.5 ×105 bacterias/ml para seleccionar las muestras,
quedando 608 muestras para identificación bacteriana directa. La detección de la
actividad carbapenemasa por análisis con MALDI-TOF MS sólo se realizó después de
la identificación directa confiable de bacilos gramnegativos. Se desarrolló un nuevo
procedimiento para extraer bacterias de muestras de orina utilizando el Sepsityper Kit
(Bruker Daltonik, Alemania). La resistencia a carbapenem se detectó con imipenem
como marcador antibiótico y los resultados se interpretaron automáticamente
utilizando el módulo STAR-BL del software MALDI-TOF Biotyper Compass (Bruker
Daltonik, Alemania). Con el MALDI-TOF MS produjo una identificación directa
confiable de 91% (503/553) de las muestras. El ensayo mostró 100% de sensibilidad
(30/30) y especificidad (454/454) para detectar la actividad carbapenemasa dentro de
los 90 min de recepción de la muestra. Los aislados incluidos en el estudio se
caracterizaron además por PCR y secuenciación, y se detectó blaOXA-48 en todos los
aislados que dieron positivos con el MALDI-TOF MS. El método ahorra al menos 24-48
horas en relación con los métodos de habituales actuales.
J Antimicrob Chemother 2017; 72: 1350–1354. doi:
http://doi.org/10.1093/jac/dkW579.
Hacia la detección temprana de Enterobacteriaceae productoras de β-lactamasas mediante análisis con MALDI-TOF MS
El método se evaluó en términos de sensibilidad, especificidad y tiempo de
respuesta con respecto al antibiótico utilizado (cefotaxima, ceftazidima, ceftriaxona,
cefpodoxima o cefepima) y el rendimiento del software MBT STAR-BL (Bruker Daltonik
GmbH, Alemania) relativo a interpretación cualitativa de los espectros para detectar
resistencia por β-lactamasa usando el MALDI-TOF MS (Bruker Daltonik) en una
colección de 11 cepas de control isogénicas de Escherichia coli que expresan
diferentes tipos de β-lactamasas. Para la validación clínica, se determinó la actividad
β-lactamasa en 100 aislados clínicos en condiciones evaluadas previamente,
caracterizados por PCR y secuenciación.
La validación clínica del ensayo mostró una sensibilidad y especificidad del 100%
para detectar la resistencia a los β-lactámicos en 30 minutos midiendo la hidrólisis de
ceftriaxona (0,50 mg / ml) con el software automático MBT STAR-BL. En cuanto a los
antibióticos evaluados, la ceftriaxona arrojó un 70% más de resultados positivos que la
cefotaxima, un 80% más que la ceftazidima y un 20% más que la cefpodoxima, con un
100% de especificidad. Cefepime reveló una sensibilidad del 100%, pero solo un 27%
de especificidad. Para el mismo tiempo de incubación, el software dió un promedio de
41% más de resultados positivos en relación con la detección de resistencia que la
interpretación cualitativa de los espectros.
Esta validación clínica del método demostró ser altamente confiable, simple de
realizar y de ahorro de tiempo, transformando la detección de resistencia a β-
lactámicos por MALDI-TOF MS en una técnica lista para usar en laboratorios clínicos.
J Antimicrob Chemother 2017; 72: 2259-2262. https//doi.org/10.1093/jac/dkx127.
Métodos moleculares
Estos métodos usados para la detección de bacterias RAM se resumen así:
‒ PCR simple o múltiple
‒ PCR en tiempo real (Sybr green, Taqman, Hybridization probes)
‒ PCR de hibridación inversa
‒ Micromarrays de DNA
‒ Amplificación basada en las secuencias de ácidos nucleicos (NASBA)
‒ Amplificación isotérmica de DNA (LAMP)
Evaluación de un nuevo procedimiento para la detección rápida de Enterobacteriaceae productoras de carbapenemasas (EPC) utilizando equipos de carbapenemasas modulares LightMix®
Los equipos (kits) modulares de PCR multiple dirigidos a la detección de genes de
resistencia los carbapenemes blaKPC, blaNDM, blaVIM, blaIMP y blaOXA-48- se
evaluaron en términos de sensibilidad y especificidad en un conjunto de 118 aislados
clínicos marcados. Entre estos, 96 fueron EPC genotípicamente caracterizados por
PCR y secuenciación. Los límites de detección se calcularon para los diferentes genes
de resistencia en términos de ufc/ml. Además, los kits se usaron para evaluar la
colonización de enfermos mediante EPC al comparar este ensayo con el kit Xpert®
Carba-R en 127 muestras rectales, perirrectales y faríngeas. También se evaluaron
hemocultivos de bacteriemias (4) y hemocultivos enriquecidos (23) con aislados
genotípicamente caracterizados.
La sensibilidad y especificidad global del ensayo de PCR múltiple fue del 99% y del
100%, respectivamente. El límite de detección para blaKPC, blaVIM, blaIMP y blaOXA-
48 es de 60 ufc/ml y para blaNDM 500 ufc/ml. Los estudios de colonización y
bacteriemia revelaron un acuerdo del 100% entre los resultados obtenidos por este
ensayo y los obtenidos por GeneXpert®.
Los autores concluyen que los equipos de carbapenemasas modulares LightMix®
son ensayos altamente confiables y utilizables para enfermos colonizados y sépticos, y
pueden ayudar a mejorar el control de la infección. Su diseño modular facilita la
detección rentable de EPC en entornos hospitalarios.
J Antimicrob Chemother 2016; 71: 3420-3423. doi:10.1093/jac/dkw356.
Conclusiones de los métodos fenotípicos, proteómicos y moleculares
Métodos fenotípicos
Pros ContrasBaratosFáciles de usar
Requiere aislamiento bacteriano24-48 horas de incubaciónTiempo total lento 24-48 horas
Métodos proteómicos
Pros ContrasBajos costos de operaciónIdentificación rápidaFácil de manejar Solo se necesita una colonia Excelente identificación de bacterias
Altos costos iniciales Base de datos incompleta todavíaPoca experiencia aún en detección de RAMNo se aplica a muestras clínicas, excepto muestras de orina y hemocultivos positivosSe necesita más automatización
Métodos moleculares
Pros ContrasRapidezDetección de bacterias exigentesDetectan pequeñas cantidades de bacteriasDetectan genes RAMÚtiles para vigilancia epidemiológica
Interpretación de resultados (colonización vs. Infección, calidad de la muestra, no detección de nuevos patógenos)Coste eficienciaSolo se encuentran los genes que sebuscan
Vacunas
El desarrollo de vacunas, es buena arma frente a los microorganismos patógenos, y
ahora una prioridad para la salud mundial debido a la creciente resistencia a múltiples
fármacos en las bacterias. El Dr. Bou y su equipo también están trabajando en este
campo.
Diseño de vacunas bacterianas atenuadas vivas basadas en la auxotrofia de D-glutamato
La síntesis de D-glutamato es esencial para la formación de la pared celular
bacteriana. El Dr. Bou comenta un artículo publicado en Nature Communication por él
y su equipo una estrategia para generar vacunas eficaces de células enteras
auxotróficas para D-glutamato. Generaron vacunas auxotróficas D-glutamato para tres
patógenos principales, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa y
Staphylococcus aureus. Estas vacunas bacterianas muestran atenuación de virulencia
y crecimiento autolimitado en ratones, y provocan anticuerpos funcionales y de
reactividad cruzada, e inmunidad celular. Estas respuestas se correlacionan con la
protección contra la infección letal aguda con otras cepas de la misma especie,
incluidos clones resistentes a múltiples fármacos, virulentos y/o de alto riesgo, como A.
baumannii AbH12O-A2 y Ab307-0294, P. aeruginosa PA14, y S. aureus USA300LAC
resistente a la meticilina adquirido en la comunidad. Este enfoque puede aplicarse
potencialmente para el desarrollo de vacunas vivas atenuadas para prácticamente
cualquier otro patógeno bacteriano, y no requiere la identificación de determinantes de
virulencia, que a menudo son específicos de patógenos.
Se produce respuesta inmune humoral hasta 293 días post-vacunación, celular
condicionada por IFN-g, IL-4 y IL-17 contra cepas no relacionadas incluyendo MDR, y
clones de alto riesgo internacionales y altamente virulentos, incluídos los veterinarios.
La vacuna protege frente a infecciones agudas letales causadas por A. baumannii, P.
aeruginosa y S. aureus.
Nature Communications 8, Artículo número 15480 (2017). doi:10.1038/ncomms15480
El grupo tecnológico empresarial de las
ciencias de la vida de Galicia (BIOGA) premió
este proyecto como “Mejor Idea Empresarial
Biotech 2016”, y también recibió el premio
Caixa Impulse.