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Detección de Vibrio cholerae en Muestras Ambientales
Metodología de AnálisisTM. Lic Fabiola Rojas C.
Enero 2011
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Muestras para análisis• Matriz Alimento
Pescados y mariscos Vegetales Alimentos en general
• Matriz Agua
Mar Pozo Aguas servidas
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Metodología Microbiología tradicional
Referencias– Standard Methods for Examination of Water and Wastewater, 21 Ed. 2005.
– Bacteriological Analytical Manual Online, BAM Chapter 9 January 2004.
– Microbiology of food and animal feeding stuffs -- Horizontal method for the detection of potentially enteropathogenic Vibrio spp. -- Part 1: Detection of Vibrio parahaemolyticus and Vibrio cholerae ISO/TS 21872-1:2007
– NCh 2640 Of 2001:Productos hidrobiológicos- Detección de Vibrio cholerae.
– Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Food, 4 Ed. 2001.
– Laboratory Methods for the Diagnosis of Vibrio cholerae Centers for Disease Control and Prevention. V. Examination of Food and Environmental Samples.
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Metodología
Microbiología tradicional
• Detección• Aislamiento• Identificación• Confirmación
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Etapas
• Detección
Enriquecimiento Aislamiento en agar selectivo
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Etapas
• Identificación
Pruebas bioquímicas
Serología
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Etapas
• Confirmación
Envío al Centro de Referencia
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Consideraciones analíticas para matrices de alimento
• Aún no se ha desarrollado un buen caldo de enriquecimiento selectivo para V. cholerae.
• Debido a su rápido tiempo de generación, cortos períodos de incubación son efectivos.
• APA es un buen medio de enriquecimiento para períodos cortos de incubación, pero en ciertos tipos de muestras la flora competitiva de V. cholerae puede crecer en exceso por períodos más largos de incubación.
• Incubación de 18 a 24 h no es deseable pero se han aplicado para compatibilizar el análisis de las muestras con el horario de trabajo.
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Consideraciones analíticas para matrices de alimento
• Si el producto ha sido sometido a etapas de proceso como: calentamiento, congelación, deshidratación o bien una baja densidad del microorganismo es esperada, una incubación prolongada es recomendada para una buena resucitación de las células dañadas.
• Se recomienda la incubación de ostras crudas a 42ºC por ser efectiva para aislar V. cholerae.
• Algunos autores como Hwang y DePaola encontraron que la incubación del enriquecimiento por 18 a 21 h en lugar de 6 a 8 h permite una mayor recuperación de V. cholerae O1 cuando bajos inóculos son usados. Lo recomendado para ostras crudas es utilizar una proporción 1:100 de muestra:APA.
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Consideraciones analíticas para matrices de agua
• Vibrio cholerae serogrupo O1 y O139 colerágenos están asociados a los brotes epidémicos. Los serogrupos no O1 y no O139 no producen toxina, causan una forma leve de gastroenteritis, se asocian a casos esporádicos y se aislan normalmente de agua de estuarios y en muestras de mariscos y pescados.
• El aislamiento e identificación de V. cholerae en agua se basa en su rápido crecimiento en condiciones alcalinas en presencia de oxigeno. Normalmente en matrices de agua este microorganismo se encuentra en bajos niveles por lo que se recomienda utilizar técnicas de concentración.
• Se ha indicado que , en medio acuático, V. cholerae adopta un estado viable pero no cultivable, debido sobre todo a las bajas temperaturas.
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Consideraciones analíticas para matrices de agua
• La selección del método depende de la naturaleza de la muestra.
• Muestras de origen marino y estuario que contienen numerosos otros Vibrios se recomienda diluir y utilizar la técnica del Número Más Probable incubándose la muestra a 42ºC.
• Para muestras de agua claras, sin lodo o sedimento y que contienen una baja densidad de Vibrios se recomienda la técnica de Filtración por Membrana
• Un método para el aislamiento del Vibrio cholerae O1 a partir de aguas contaminadas es mediante el uso de una Tórula de Moore en un torrente de aguas servidas por un periodo de hasta 1 semana, seguido por una etapa de enriquecimiento y posterior identificación.
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Procedimiento Detección en AlimentosBAM online
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Procedimiento Detección V. cholerae en aguas residuales: Tórula de Moore
Esquema confección Tórula de Moore
Base 10 cm
Largo total 36 cm (doblado 5 veces)
Ancho 24 cm
Cortes de 4 cm
Argolla de alambre
Forma final de gasa
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Técnica aislamiento V. cholerae en matriz agua : Tórula de Moore y Tórula de Spira
• Tórula de Moore ( aguas residuales)
Tórula de Spira (filtrar gran volumen de agua)
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Procedimiento Detección V. cholerae en aguas
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Medio de cultivo de Enriquecimiento y de Aislamiento
MEDIOS DE ENRIQUECIMIENTO
Agua Peptonada Alcalina
•La viabilidad de Vibrio spp. se mantiene intacta a pH alcalino y el uso de agua peptonada alcalina ha sido recomendado para incrementar la recuperación de Vibrio spp. de materia fecal y de otras muestras.
•El medio contiene peptona de carne, cloruro de sodio y el pH final es de 8.6 ± 0.2 a 25ºC. Se incuba 6 a 8 horas y se siembra en los medios de cultivo.
Formulación
l literAgua destilada
10 gNaCl
10 gPeptona
Ajustar pH de manera de obtener 8.5 ± 0.2 después de de esterilizar.Dispensar en tubos/frascos tapa roscaAutoclavar por 10 min a 121ºC
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Medio de cultivo de Enriquecimiento y de Aislamiento
MEDIOS DE CULTIVO DE AISLAMIENTO
Agar TCBS ( Tiosulfato-citrato-bilis-sacarosa-agar)
•Es un medio selectivo para el aislamiento de Vibrio cholerae.
•El medio contiene: peptona de caseína, peptona de carne, extracto de levadura , citrato de sodio, citrato de fierro, cloruro de sodio, tiosulfato de sodio, sales biliares y sacarosa y estádisponible comercialmente.
•Se prepara según las indicaciones del fabricante. No se debe autoclavar.
•pH 8,6± 0,2 a 25ºC
•Por su doble indicador (azul de timol y azul de brotimotimol) vira al amarillo con pequeñas variaciones de pH por la acidificación de la sacarosa.
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Medio de cultivo de Enriquecimiento y de Aislamiento
MEDIOS DE CULTIVO DE AISLAMIENTO ADICIONAL
Agar CHROMagar Vibrio
Alcance: detección y aislamiento de V. parahaemolyticus, V. vulnificus, V. cholerae
Apariencia en el agar:
V.parahaemolyticus → malva
V.vulnificus / V.cholerae → verde-azul; azul- turquesa
V.alginolyticus → sin color
Formulación en g/L Agar 15,0 Peptona y extracto de levadura 8,0Sales 51,4 Mezcla cromogénica 0,3 pH : 9,0 ± 0,2
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Medio de cultivo de Enriquecimiento y de Aislamiento
Agar TCBS
Enterobacterias y otros
Pseudomonas, Aeromonas y otros
Vibrio alginolyticus
Vibrio parahahemolyticus
Vibrio cholerae
Microorganismos
Pobre/ ninguno
Pobre/ ninguno
Muy Bueno
Muy Bueno
Muy Bueno
Desarrollo
Muy pequeñas y translúcidas
Azules
Largas y amarillas
Pequeñas, azul-verdoso
Planas 2 a 3 mm de diámetro , amarillas
Apariencia de colonias
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Confirmación bioquímica
• Batería tradicional
• Kit identificación rápida
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Confirmación bioquímica
Batería tradicional:
Perfil bioquímico
• Oxidasa• String test• AGS• Tolerancia escala de sal• MIO• TSI• LIA• Indol
Serología
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Confirmación bioquímica
Oxidasa + String test +
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Confirmación bioquímica
KIA K/K -,- / TSI A/A -,- Tolerancia sal 1% +, 3% +, 6%-
LIA K/K -,-
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Confirmación bioquímica Kit comercial
PRUEBAS POSITIVAS
Reacción positiva
PRUEBAS NEGATIVAS
Reacción negativa
API 20 E
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Confirmación bioquímica
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Confirmación bioquímica Kit comercial test suplementarios
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Confirmación bioquímica Kit comercial
Nota. Suspender la cepa sospechosa de Vibrio en solución salina al 0,85%
IDENTIFICACION PRESUNTIVA
Nota
5 3 4 6 1 2 4 5 7 Perfil
API 20 E V4.1 Galería
0.9899.6Vibrio cholerae
Pruebas en contraT% IDTaxón significativo
0.50.2Vibrio mimicus
Pruebas en contraT% IDTaxón siguiente
0%SAC
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Caracterización bioquímica
Ref: BAM online
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Caracterización bioquímica
100+Desarrollo en NaCl 1%
99.1c/0d+Desarrollo en caldo triptona al 1% b
100+Desarrollo en NaCl 0%
75 e+/-Voges Proskauer a
100+Sacarosa (producción de ácido)
0-Glucosa (producción de gas)
100A/A, no gas, no H2STSI
100+Glucosa (producción de ácido)
100+String test
100K/A, no gas, no H2SKIA
a Con NaCl 1%b Sin NaClc V. cholerae (y V. mimicus)d V. parahaemolyticus e La mayoría de V. cholerae O1 biotipo El Tor son positivas a VP, mientras que las cepas del biotipo Clásico son negativas.
98.9+L-ornitina decarboxilasa a
0-L-arginina dehidrolasa a
100+L-lisina decarboxilasa a
100+Oxidasa
100+Bacilo Gram-negativo, no esporulado
PorcentajeReacción positiva
Número mínimo de características necesarias para identificar cepas V. cholerae
Ref: Laboratory Methods for the Diagnosis of Vibrio cholerae Centers for Disease Control and Prevention
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Caracterización bioquímica
Ref: Laboratory Methods for the Diagnosis of Vibrio cholerae Centers for Disease Control and Prevention
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Confirmación SerológicaFlujograma de Serotipificación para Vibrio cholerae
Cepa con características bioquímicas de Vibrio cholerae
Estría en T1N1
Aglutinación con solución salina 0,85%
Negativa Positiva
Aglutinación con Polivalente O1 Cepa rugosa
Negativa Positiva
Vibrio cholerae no O1 Vibrio cholerae O1
Aglutinación con O139 Aglutinación con Inaba Aglutinación con Ogawa
Negativa Positiva Positiva Positiva
V. cholerae no O1,no O139 V. cholerae O139 V.cholerae O1, Inaba V. cholerae O1,Ogawa
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Confirmación Serológica
Aglutinación antisuero polivalente O1
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Clasificación general
A veces produce otro tipo de toxinaProductor toxina de cólera CT (factor de virulencia)
Toxina
Los 3 serotipos no son aplicable para cepa No O1
Inaba, Ogawa, Hikojima (raro)Serotipos
No aplicable para cepas No O1Clásico, El Tor (más frecuente)Biotipos
No –O1O1Serogrupos
No asociado a epidemiaAsociado a EpidemiaClasificación
Ref: Laboratory Methods for the Diagnosis of Vibrio cholerae Centers for Disease Control and Prevention
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Clasificación general
Características de los serotipos de V. cholerae O1
Ref: Laboratory Methods for the Diagnosis of Vibrio cholerae Centers for Disease Control and Prevention
InabaOgawa
Principales Factores O presentes
Aglutinación
++A,B,CHikojima
+-A,CInaba
-+A,BOgawa
Serotipo
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DIFERENCIACIÓN ENTRE LOS BIOTIPOS EL TOR Y CLÁSICO
•El biotipo Clásico es raramente encontrado, los siguientes ensayos opcionales son para diferenciarlo del biotipo El Tor:
Beta- hemólisis:
El medio más común de diferenciar los biotipos del V. cholerae O1 y tal vez la más fácil es determinar la capacidad de producir β- hemólisis sobre placa de agar sangre de cordero.
Las cepas del biotipo El Tor son β- hemolíticas, mientras que el biotipo Clásico no produce una hemolisina.
Sembrar el cultivo a ensayar en cuña y superficie en placas de agar sangre de cordero incubar a 18-24 horas a 35 ºC± 2ºC. La β- hemólisis puede ser determinada por una zona clara alrededor del cultivo.
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DIFERENCIACIÓN ENTRE LOS BIOTIPOS EL TOR Y CLÁSICO
Sensibilidad a la Polimixina B:
Sembrar profusamente un cultivo sospechoso en una placa seca de agar T1N1.
Poner un disco de 50 unidades de polimixina B sobre la superficie.
Las cepas del biotipo Clásico son sensibles (una zona de >12 mm); las cepas del biotipo El Tor son resistentes. Si el cultivo sospechoso crece sobre agar mCPC, el cual contiene polimixina B, se considera que se trata del biotipo El Tor.
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http://www.ispch.cl/colera
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Gracias