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VIABILIDAD Y CARGA PARASITARIA EN INFECCIÓN HUMANA CON Leishmania (Viannia) USANDO PCR EN TIEMPO REAL DE LA MOLÉCULA

7SL ARN

YAZMÍN SUÁREZ QUEVEDO

UNIVERSIDAD DEL TOLIMA

FACULTAD DE CIENCIAS MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS

IBAGUÉ – TOLIMA 2010

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VIABILIDAD Y CARGA PARASITARIA EN INFECCIÓN HUMANA CON Leishmania (Viannia) USANDO PCR EN TIEMPO REAL DE LA MOLÉCULA

7SL ARN

YAZMÍN SUÁREZ QUEVEDO

Trabajo de Grado presentado como requisito parcial para optar al titulo de Magíster en Ciencias Biológicas

DIRECTOR JAIR ALEXANDER TÉLLEZ, MsC.

CO-DIRECTOR GUSTAVO ADOLFO VALLEJO PhD.

UNIVERSIDAD DEL TOLIMA FACULTAD DE CIENCIAS

MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS IBAGUÉ – TOLIMA

2010

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AGRADECIMIENTOS A DIOS, por ser la luz de mí existir, por enseñarme y ayudarme siempre, por darme una nueva oportunidad, por enseñarme a soñar y a luchar por mis ideales. Por dibujar un nuevo horizonte en mi vida. A Jair Téllez por todas sus orientaciones a lo largo del desarrollo de este trabajo, por su excelente disposición, por su dedicación. Por su gran contribución durante este proceso de formación. Al Doctor Gustavo Vallejo, por todas sus orientaciones, por su gran disposición, por brindarme el privilegio de ser una de sus estudiantes, por su ejemplo de integridad y de amor por la ciencia, por su gran contribución al desarrollo científico de nuestra región. A la doctora Nancy Gore Saravia, por brindarme la oportunidad de realizar el trabajo de investigación en CIDEIM, por todas sus orientaciones, por ser ejemplo de perseverancia e integridad y por todos sus aportes al saber científico. A los pacientes que participaron en el estudio por su gran disposición y por su voluntaria colaboración con el estudio. A Fogarty y Colciencias por el apoyo financiero suministrado para la ejecución de este estudio. A Ibeth Romero por sus orientaciones y por su gran apoyo en la ejecución de este estudio, por su entrenamiento en PCR en tiempo real. A los doctores Julio Cesar Carranza y Concepción Judith Puerta por su asesoría y por su excelente disposición al momento de evaluar este trabajo. Al laboratorio de Inmunología y Biología Celular y al Banco de cepas de CIDEIM por la realización de las pruebas de luminometría y por el suministro de la cepa de referencia empleada en este estudio. A Mauricio Pérez y James Becerra por su excelente disposición, por toda su colaboración con los análisis estadísticos y con la base de datos empleada en este estudio. A la señora Beatriz Herrera por su gran disposición y por su oportuna colaboración en la consecución de literatura científica no disponible.

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A la Unidad de Bioquímica y Biología Molecular, a Jair, Ibeth, Rafael, Leyder, María Teresa, Roger, Cesar, Andrea, Dairo por todas sus contribuciones a este estudio, por trabajar en equipo, por su respaldo y colaboración. A todos los integrantes de CIDEIM por sus aportes a mi formación académica y personal, por sus enseñanzas y por dejar un grato recuerdo en mi mente A los integrantes del laboratorio de Investigaciones en Parasitología Tropical por su apoyo durante este tiempo, por sus enseñanzas, por los tiempos compartidos. A mis padres por su amor y apoyo incondicional, por todos sus días de esfuerzo y dedicación, por su deseo constante de bienestar para mi vida, por todas sus sabias y oportunas enseñanzas

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CONTENIDO

Pág.

INTRODUCCIÓN 10 OBJETIVOS

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1. MARCO TEÓRICO 13 1.1 ESTADO DEL ARTE 13 1.2 IDENTIFICACIÓN DE PARÁSITOS DE Leishmania 15 1.2.1 Métodos basados en la tecnología de PCR 15 1.2.2 PCR acoplado a Southern blot 16 1.2.2.1 ADN del kinetoplasto de Leishmania (kADN) como un blanco de alta sensibilidad

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1.2.3 Utilidad del PCR en el análisis de muestras clínicas 18 1.3 DETERMINACIÓN DE LA CARGA PARASITARIA DE Leishmania EN DIFERENTES TEJIDOS.

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1.4 HERRAMIENTAS EMPLEADAS EN LA DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE PARÁSITOS VIVOS.

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1.4.1 Tecnología con genes reporteros 20 1.4.2 Metodologías basadas en la amplificación de ácidos nucleicos 21 1.4.2.1 Gen 7SL ARN como blanco indicador de viabilidad

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2. METODOLOGÍA 26 2.1 DESCRIPCIÓN DEL ESTUDIO 26 2.1.1 Población 26 2.1.2 Consideraciones éticas 26 2.1.3 Diagnóstico. 27 2.1.4 Estrategia metodológica general 27 2.2. CONDICIONES DE AMPLIFICACIÓN, SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD DEL PCR DEL kADN

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2.3 DETERMINACIÓN DE LA INFECCIÓN POR kADN EN MUESTRAS CLÍNICAS

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2.3.1 Obtención y preservación de muestras 29 2.3.2 Extracción de ácidos nucleicos 30 2.3.3 PCR /Southern blot 30 2.4 CONDICIONES DE AMPLIFICACIÓN DEL GEN 7SL ARN POR PCR EN TIEMPO REAL.

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2.5 DETERMINACIÓN DE LA VIABILIDAD in vitro MEDIANTE LUMINOMETRÍA Y PCR EN TIEMPO REAL

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Pág.

2.6 DETERMINACIÓN DE LA VIABILIDAD EN MUESTRAS CLÍNICAS MEDIANTE PCR EN TIEMPO REAL

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2.7 DETERMINACIÓN DE LA CARGA PARASITARIA EN MUESTRAS CLÍNICAS

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2.8 ANÁLISIS DE DATOS

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3. RESULTADOS 34 3.1 CARACTERÍSTICAS DE LOS PACIENTES 34 3.2 ESPECIES DE Leishmania 34 3.3 DETECCIÓN DE Leishmania POR PCR DEL kADN EN MUESTRAS CLÍNICAS

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3.4 AMPLIFICACIÓN DE LA MOLÉCULA 7SL ARN MEDIANTE PCR EN TIEMPO REAL

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3.4.1 Viabilidad in vitro 41 3.4.2 Viabilidad en muestras clínicas 42 3.4.3 Determinación de la carga parasitaria en muestras clínicas

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4. DISCUSIÓN

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CONCLUSIONES

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REFERENCIAS

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ANEXOS 63

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LISTA DE FIGURAS Pág. Figura 1. Minicírculos y maxicírculos del ADN del kinetoplasto (kADN) de Leishmania.

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Figura 2. Esquema básico de la organización general de un minicírculo de Leishmania

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Figura 3. Partícula de Reconocimiento de Señales

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Figura 4. Estructura general del gen 7SL ARN en tripanosomátidos

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Figura 5. Diagrama PERT que resume las etapas y los pasos generales necesarios para el desarrollo de este estudio.

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Figura 6. Límite de detección del PCR del kADN en presencia de 10.000 monocitos (M∅).

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Figura 7. Amplificación específica del kADN de Leishmania mediante PCR convencional.

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Figura 8. PCR/Southern blot a partir de muestras de sangre

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Figura 9. PCR/Southern blot a partir de hisopo de amígdalas

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Figura 10. PCR/Southern blot a partir de aspirados de lesión

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Figura 11. Sensibilidad y especificidad del PCR en tiempo real del gen 7 SL ARN de Leishmania (Viannia) panamensis.

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Figura 12. Curva estándar para la cuantificación de Leishmania (Viannia) mediante PCR en tiempo real del gen 7SL ARN.

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Figura 13. Efecto dosis respuesta de amastigotes intracelulares de Leishmania (Viannia) panamensis transfectados con el vector pGL2-a NEO-a LUC expuesto a diferentes concentraciones de antimonio pentavalente SbV.

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Figura 14. Resultados comparativos obtenidos en el análisis por RT-qPCR y qPCR de diferentes tejidos de pacientes con leishmaniasis cutánea activa.

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LISTA DE TABLAS Pág.

Tabla 1. Características generales de los pacientes diagnosticados con leishmaniasis cutánea

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Tabla 2. Detección de Leishmania en muestras clínicas por PCR/Southern blot

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Tabla 3. Frecuencia de detección del kADN y 7SL ARN en sangre, hisopo de amígdalas, aspirado de piel sana y lesión de pacientes con leishmaniasis cutánea activa

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LISTA DE ANEXOS

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Anexo A. Comparación del número de copias del gen 7SL RNA de Leishmania (Viannia) obtenido mediante PCR en tiempo real en diferentes muestras de pacientes

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Anexo B. Comparaciones del número de copias del gen 7SL RNA de Leishmania (Viannia) por tipo de muestra para cada método (RT-qPCR: RNA y qPCR: DNA)

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Anexo C. Correlación entre el número de copias del gen 7SL RNA de Leishmania (Viannia) estimado por RT- qPCR (RNA) y por qPCR (DNA) para cada tipo de muestra

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Anexo D. Para cada método, correlación entre el número de copias del gen 7SL RNA de Leishmania por tipo de muestra (sangre, amígdalas, piel sana, lesión)

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Anexo E. Análisis de correlación de los datos obtenidos por RT-qPCR (RNA) y luminometria

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INTRODUCCIÓN La leishmaniasis es una patología endémica y re-emergente en 88 países del mundo convirtiéndose en un problema importante para la salud humana. El parásito Leishmania es el agente etiológico de esta enfermedad, cuyo mayor impacto se presenta en regiones tropicales y subtropicales. En Colombia, la enfermedad en humanos es producida principalmente por especies del subgénero Viannia, generando diferentes presentaciones clínicas dependiendo de la respuesta inmune del hospedero y de la especie infectante. En la última década se ha observado un incremento significativo en la incidencia de las enfermedades cutáneas y mucocutáneas en el país (Rojas, 2001; Armijos, Weigel, Izurieta, Racines, Zurita, Herrera, & Vega, 1997, Ampuero, Urdaneta, & Oliveira 2005). Esto se explica en parte por la expansión del parásito a otras zonas geográficas (a través de la migración, el desplazamiento forzado de la población) y a cambios en la dinámica de la transmisión. Por estas razones en la actualidad se plantea una tendencia hacia una transmisión peridomiciliar (Oliveira, Pirmez, Rangel, Schubach, & Grimaldi, 1988; Campbell, Dujardin, Martínez, Feliciangeli, Pérez, Marcelino, & Desjeux, 2001 Rojas, 1994). Esta dinámica conlleva a cambios en la epidemiología de la enfermedad y plantea nuevas dificultades para entender el papel de los humanos en la transmisión del parásito al vector (Davies, Reithinger, Campbell, Feliciangeli, Borges, & Rodriguez, 2000, Cuba, Miles, Vexenat, Barker, McMahon, Butcher, Barreto, & and Marsden, 1985). Aunque el hombre podría ser un reservorio secundario en el ciclo de transmisión de la enfermedad (Costa, Gomes, Silva, Garcez, Ramos, Santos, Shaw, David, & Maguire, 2000 Molina, Lohse, Pulido, Laguna, López & Alvar, 1999), no se ha esclarecido su participación en la transmisión de la leishmaniasis cutánea (Mendonça, Rodrigues, Bandeira, Jardim, and Abath, 2004). En este sentido, técnicas serológicas, inmunohistoquimicas y moleculares han aportado información acerca de la persistencia del parásito en biopsias humanas con diferentes grados de sensibilidad (Oliveira et al., 2003). En CIDEIM (Centro Internacional de Entrenamiento e Investigaciones Médicas) se demostró que es posible detectar la presencia de ADN de Leishmania en piel sana y leucocitos de sangre periférica en humanos tratados y diagnosticados parasitológicamente, mediante PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) del kADN (ADN del cinetoplasto) e hibridación siendo estas herramientas más sensibles que el Xenodiagnóstico (Vergel, Walker, & Saravia, 2005; Vergel, Palacios, Cadena, Posso, Valderrama, Perez, Walker, Travi, & Saravia, 2006). La persistencia del parásito en pacientes tratados indica la no eliminación de éste probablemente debido a la generación de una falla terapéutica o una respuesta inmune inadecuada (Aebischer, Moody, & Handman, Aragort, Rosell, & Rodríguez, 1993). Diversos blancos moleculares han sido utilizados para detectar Leishmania en humanos, los cuales se basan en la amplificación de ADN, pero no proveen

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información acerca de la viabilidad de los parásitos (Van der Meide, Schoone, Faber, Zeegelaar, Özbel, &. Lai A Fat, Coelho, Kassi, & Schallig, 2005), puesto que esta molécula no es degradada rápidamente y su detección implicaría la presencia de parásitos tanto vivos como muertos. Es por esto que ha surgido la necesidad de diseñar un PCR en tiempo real que amplifique ARN (Van der Meide et al., 2005) y permita la detección de parásitos vivos (Rolao, Cortes, Rodrigues, & Campino, 2004). El 7SL ARN, constituye un blanco potencial para la identificación de formas viables, ya que además de estar involucrado en una vía esencial para el parásito, por su naturaleza, no permanece largo tiempo en circulación sin ser degradado y por lo tanto permite detectar parásitos vivos. Este blanco presenta un alto número de copias a nivel de ARN (Michaeli, Podell, Agabian, & Ullu, 1992) y a nivel de ADN se estima que presenta una copia en al menos 5 cromosomas (www.genedb.com). La detección de parásitos vivos en sitios diferentes a la lesión genera información útil acerca de la dinámica epidemiológica de la enfermedad puesto que permite establecer una asociación más directa con la biodisponibilidad del parásito en el hospedero. En este sentido, este estudio pretende responder a las siguientes preguntas de investigación:

Pregunta 1 ¿Existen formas vivas de parásitos de Leishmania en lesión y en sitios aparentemente sanos de pacientes infectados con leishmaniasis cutánea? Pregunta 2 ¿En pacientes con leishmaniasis activa la presencia de kADN en la lesión, piel sana, sangre y amígdalas se correlaciona con parásitos vivos detectados por la amplificación del 7SLARN? Pregunta 3 ¿Cual es la carga parasitaria de Leishmania en lesión y en sitios aparentemente sanos de pacientes infectados con leishmaniasis cutánea?

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OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL Determinar la viabilidad y carga parasitaria de Leishmania en lesión y en sitios aparentemente sanos de pacientes infectados mediante PCR en tiempo real del gen 7SL ARN OBJETIVOS ESPECÍFICOS 1. Definir si la presencia de kADN en lesión, piel sana, sangre y amígdalas indica la presencia de parásitos vivos mediante la amplificación de 7SL ARN. INDICADORES Presencia del fragmento de 700 pb del kADN de Leishmania Viannia en

muestras de pacientes infectados con Leishmaniasis cutánea. Parásitos vivos en presencia de concentraciones variables de Antimonio.

Detección por luminometría y PCR en tiempo real del gen 7SL ARN. Parásitos vivos en lesión, sangre, piel sana y amígdalas de pacientes infectados

con leishmaniasis cutánea. 2. Evaluar la relación entre carga parasitaria y viabilidad de Leishmania a nivel de lesión, piel sana, sangre y amígdalas de humanos con enfermedad activa. INDICADOR Porcentaje de detección del gen 7SL ARN en los diferentes tejidos evaluados. Concentración de parásitos estimada por qPCR versus cantidad de parásitos

vivos en lesión y en tejidos aparentemente sanos.

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1. MARCO TEÓRICO 1.1 ESTADO DEL ARTE La leishmaniasis cutánea-mucosa es un problema prioritario de salud a nivel mundial (Desjeux, 2001). El parásito afecta aproximadamente a 12 millones de personas, con casos emergentes a una tasa de 2 millones de casos por año (Desjeux, 2001; Herwaldt, 1999). Leishmania causa un espectro de manifestaciones clínicas dependiendo de la especie del parásito, que abarca desde lesiones cutáneas de curación espontánea (LC), patologías mucocutáneas debilitantes (LMC) y una forma visceral que puede llegar a ser letal (LV) (Ashford,1992). En América Central y Suramérica, 39 millones de personas están en riesgo de ser infectados por parásitos del subgénero Viannia (principalmente L (V.) panamensis) que causa al menos 60.000 casos de leishmaniásis mucocutánea por año (Ashford et. al, 1992). Estos datos están subestimados debido al poco registro de los casos clínicos en esta región (Desjeux, 2001; Ashford et al.,1992). En Colombia, la leishmaniasis es una enfermedad endémica de importancia significativa en Salud Pública. La mayoría de los casos clínicos están asociados a Leishmania del subgénero Viannia responsable de las manifestaciones cutánea y mucocutánea, y en menor proporción de leishmaniasis visceral restringida a ciertos focos endémicos. Según reportes del Ministerio de Protección Social, la incidencia de leishmaniasis en el país es aproximadamente de 5000 casos anuales de las cuales el 95% son infecciones cutáneas. Así mismo, se registran en algunas regiones endémicas un alto número de personas infectadas alcanzando los 1.500 casos por cada 100.000 habitantes, y 60 casos por 100.000 habitantes para leishmaniasis visceral. En la última década se ha observado un incremento significativo en la incidencia de las enfermedades cutáneas y mucocutáneas en el país. Datos epidemiológicos muestran que en la década de los 90 se notificaban en promedio 6.500 casos nuevos de leishmaniasis cada año, cifra que aumentó progresivamente a mas de 18.000 casos en el año 2005, y se mantuvo entre 12.000-15.000 casos/año en 2006 y 2007. Para Junio de 2008 se estimaban más de 11 mil casos entre las fuerzas armadas y el sistema de salud pública (OMS/OPS, 2008). Esto se explica en parte por la expansión del parásito a otras zonas geográficas posiblemente asociada a la migración, el desplazamiento forzado de la población y a cambios en la dinámica de la transmisión. La leishmaniasis cutánea americana fue considerada por mucho tiempo una zoonosis selvática, donde los humanos eran hospederos accidentales y representaban un punto final en la diseminación de la enfermedad. Aunque el ciclo enzoótico silvestre de transmisión se mantiene exclusivamente en actividades

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como la extracción de madera, minería, la cacería, etc., en la actualidad se plantea una tendencia hacia una transmisión peridomiciliar (Oliveira-Neto et al., 1988; Campbell-Lendrum, 2001; Rojas, 1994). Las características de esta nueva forma de transmisión peridomiciliar donde los vectores y reservórios interactúan en gran proximidad con los humanos es producto de la intervención en los ecosistemas, las continuas migraciones y los cambios en el comportamiento humano (Lainson, 1988; Desjeux, 2004; Yadon et al., 2003). Los desplazamientos forzados o migraciones de grupos poblacionales (incluyendo animales domésticos) hacia zonas geográficas con condiciones ecológicas para la transmisión, generan un fuerte impacto en la epidemiología de la enfermedad basado principalmente en el riesgo de exposición de grandes grupos poblacionales al contacto entre insectos infectados y personas susceptibles. Este nuevo panorama en la epidemiología de la enfermedad requiere la resolución de interrogantes direccionados a conocer el papel que juegan los humanos y otros reservorios no confirmados, en la transmisión del parásito al vector (Davies et al., 2000; Cuba et al., 1985). En el viejo Mundo, se conoce que el hombre es el principal reservorio en la transmisión antroponótica cutánea causada por Leishmania trópica, adicionalmente se ha confirmado su participación como reservorio de leishmaniasis visceral por Leishmania donovani en la India (Ashford & Bettini., 1987; Rab et al., 1992). En las Américas, algunos estudios en leishmaniasis visceral han demostrado a través de xenodiagnóstico que el hombre podría ser un reservorio secundario en el ciclo de transmisión de la enfermedad y adquiere relevancia importante donde se presentan casos de coinfección con VIH (Costa et al., 2000; Molina et al., 1999). Pero su participación en la transmisión de la leishmaniasis cutánea a pesar de los estudios sobre la persistencia de parásitos, tanto en sangre como en cicatrices, no ha sido esclarecida (Mendonça et al., 2004; Vergel et al., 2006). La identificación de los reservorios del parásito es fundamental en el ciclo de transmisión, tanto en la adopción de medidas de control como en el entendimiento epidemiológico de la enfermedad. Metodologías como la microscopia para cuantificación de parásitos presentan baja sensibilidad, y no son confiables cuando los parásitos no están homogéneamente distribuidos (Costa et al.,1996). Pruebas serológicas o métodos como inmunohistoquímica se han utilizado para la detección de parásitos en biopsias de lesión de leishmaniasis cutánea y han arrojado resultados positivos en 42% y 66% respectivamente, en comparación a un 100% del PCR (Oliveira et al., 2003). Estudios realizados en CIDEIM, empleando una combinación de PCR específico del kADN con Southern blot, han permitido detectar ADN de Leishmania en humanos con diagnóstico confirmado. En piel sana se detectó el parásito en el 7,5 % de los pacientes pre-tratamiento y en el 13.6% de los pacientes post-tratamiento. De otra forma el 19,2% de los pacientes pretratamiento y el 17,4% presentó monocitos positivos (Vergel et al., 2005; Vergel et al., 2006).

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En otros estudios se ha reportado la presencia de Leishmania braziliensis en pacientes que recibieron inmunoterapia, en personas que nunca sufrieron la enfermedad pero que provenían de zona endémica, y en animales sanos de la misma zona (Guevara et al., 1994). Estos hallazgos en conjunto con otros reportados, favorecen la noción de que los humanos no eliminan el parásito, ya sea porque se da una falla al tratamiento, o por una respuesta inmune inadecuada que le permite al parásito persistir en un equilibrio con la célula huésped (Aebischer et al., 1993) Se ha planteado que la gran limitación de los blancos moleculares utilizados hasta el momento para la detección de parásitos, es que se basan en la amplificación de ADN y no proveen información de la viabilidad de los parásitos (van der Meide et al., 2005). Estudios en bacterias han mostrado que el ADN puede detectarse varias semanas después de que se eliminen (Josephson et al., 1993). No obstante se requiere aplicar técnicas moleculares que permitan detectar ARN del parásito para establecer de este modo, una medida de la viabilidad a partir de diferentes tejidos. Recientemente, se ha utilizado el gen 7SL ARN para la detección de Leishmania y diferenciación de los complejos Leishmania y Viannia por PCR en tiempo real (Zelazny et al., 2005). La molécula 7SL ARN fue descrita por primera vez en tripanosomátidos en 1992 para Trypanosoma brucei y hace parte de la Partícula de Reconocimiento de Señales (Signal Recognition Particle, SRP) (Michaeli et al., 1992). 1.2 IDENTIFICACIÓN DE PARÁSITOS DE Leishmania Primariamente, Leishmania ha sido dividida en diferentes especies sobre la base de criterios clínicos, biológicos, geográficos y epidemiológicos. Durante las dos ultimas décadas, características intrínsecas relacionadas con datos moleculares y bioquímicos han sido usados para la clasificación de diferentes aislados del parásito. En el presente, la electroforesis de isoenzimas ha sido ampliamente usada para la identificación de especies de Leishmania y actualmente es aceptada como una técnica de referencia. Los parásitos pueden ser identificados por su perfil enzimático y ser agrupados en unidades taxonómicas denominadas zimodemos. Sin embargo el análisis de isoenzimas consume largos periodos de tiempo, es laborioso y requiere de la obtención del perfil de 10 a 20 enzimas diferentes. Métodos moleculares como el Southern Blot y diferentes PCR han sido aplicadas ampliamente debido a que son menos laboriosas y presentan gran utilidad para el estudio de la variabilidad entre diferentes especies de Leishmania (Morales et al., 2001). 1.2.1 Métodos basados en la tecnología de PCR. Las metodologías rápidas basadas en el PCR han provisto herramientas muy valiosas para el estudio de la diversidad genética de Leishmania. La amplificación del ADN por PCR, a partir de un bajo número de parásitos en pequeños volúmenes de muestra, puede resolver las limitaciones de los cultivos in vitro de aislados clínicos o de campo, en cuyos

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casos se puede dar crecimiento selectivo de algunas cepas. Los métodos basados en PCR usados frecuentemente en genotipificación son: PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP), Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD), y Sequence-Confirmed Amplified Region Analysis (SCAR) (Bañuls y Prugnolle, 2007)

1.2.2 PCR acoplado a Southern blot. Uno de los primeros métodos de caracterización molecular usado fue el Southern Blot cuyo principio esta basado en el empleo de sondas de ADN. Este método es tedioso y requiere cultivo de promastigotes, extracción de ADN, electroforesis, transferencia e hibridación (Van Eys et al., 1989). Con frecuencia también se han empleado sondas derivadas a partir de diferentes secuencias de ADN nuclear. Las sondas de ADN, en concreto la pDK20, ha resuelto definitivamente la diferenciación ente L. donovani y L. infantum, que había sido señalada mediante tipificación isoenzimática, pero no confirmada por técnicas genotípicas (Lanotte, Rioux, Maazoun, Pasteur, Pratlong, & Lepart, 1981; Van Eys, Guizani, Ligthart, & Dellagi, 1991). De forma similar se han empleado sondas de ADN, como la LbJ38, para Leishmanias del Nuevo Mundo, más concretamente en la especie L. braziliensis (Rodríguez et al., 1997). Una sonda de cADN (ADN copia) que contiene múltiples copias de 60bp generada partir de una secuencia repetitiva ha sido empleada para la detección especifica de L. donovani (Howard et al., 1991). No obstante, las regiones más utilizadas para la hibridación con sondas han sido secuencias específicas de los minicírculos de kADN, puesto que contienen una región conservada y están altamente repetidos. En taxonomía, el uso de estas sondas ha permitido la separación de L. mexicana y L. braziliensis, y la inclusión de las especies L. braziliensis, L. guyanensis y L. panamensis en el subgénero Viannia (Barker & Butcher, 1983). Las sondas de kADN se siguen utilizando para comprobar que el producto amplificado corresponde a una determinada especie (Lambson et al., 2000). 1.2.2.1 ADN del kinetoplasto de Leishmania (kADN) como un blanco de alta sensibilidad. El kADN representa el ADN mitocondrial del orden kinetoplastida y constituye del 10 al 20% del ADN total (Simpson, 1987). El kADN es una red de ADN circular concatenado formado por dos tipos de moléculas: los maxicírculos (25-50 moléculas de 20 kb y los minicírculos (0,8 kb) los cuales pueden presentar alrededor de 10.000 copias. Los maxicírculos están implicados en la edición de residuos de uracilo dentro del mARN (ARN mensajero) y codifican para rARN (ARN ribosomal), para algunos ARN guías, y para proteínas (León et al., 1996). Los minicírculos codifican para ARNs guías (ARNg) involucrados en la edición del mARN de la subunidad III de la citocromo oxidasa (Sturm & Simpson, 1990). Algunos autores (Singh et al., 1999) han determinado la existencia de un marco de lectura abierto en la región variable de uno de los minicírculos de L. donovani, el cual puede ser transcrito y traducido a un producto proteico.

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Figura 1. Minicírculos y maxicírculos del ADN del kinetoplasto (kADN) de Leishmania.

Fuente. Michéle M. Klingbeil, 2007 Debido a su carácter altamente repetitivo, el kADN ha sido principalmente usado como una herramienta de diagnóstico para detectar pequeñas cantidades de ADN del parásito en muestras biológicas (Barker, 1989; Wilson et al., 1995). El alto grado de heterogeneidad en las secuencias hace del kADN una herramienta de gran utilidad en aplicaciones genéticas y taxonómicas. Algunos estudios han mostrado que el kADN y especialmente las secuencias del minicírculo presentan grados significativos de polimorfismos con regiones altamente conservadas (McCann, Eresh, & Barker, 1999; Franco, 2000; Brewster & Barker, 2002) (Figura 2). Figura 2. Esquema básico de la organización general de un minicírculo de Leishmania Fuente: Epidemiología Molecular de la Coinfección por Leishmania -VIH, 2002

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Gracias a estas propiedades, el kADN también se ha usado como blanco para estudiar polimorfismos genéticos a nivel intra e interespecífico. Se han desarrollado dos tipos de aproximaciones: análisis del kADN por la técnica RFLP (Kapoor, 1998; Berzunza-Cruz, 2000; Rodriguez-Gonzalez, 2006); y amplificación del kADN usando iniciadores específicos que generan un patrón de bandeo para las especies de Leishmania y otros kinetoplastidos, seguido por hibridización de los productos de PCR con sondas específicas (Breniere et al., 1999). Los patrones de bandeo generalmente son heterogéneos y permiten la diferenciación de cepas estrechamente relacionadas. La combinación kADN-PCR fingerprinting e hibridización ha sido de gran utilidad para lograr una detección sensible y una identificación directa de los diferentes complejos de Leishmania (Breniere, S.F., et al., 1999). Algunos de los inconvenientes de estas técnicas es que son laboriosas, costosas y demandan gran cantidad de tiempo (Bañuls & Prugnolle, 2007). 1.2.3 Utilidad del PCR en el análisis de muestras clínicas. En los últimos años se han evaluado diferentes técnicas de PCR para efectuar la detección de ADN de Leishmania en una gran variedad de muestras clínicas como biopsias, sangre periférica, aspirados de médula ósea y de nódulo linfático. Varias secuencias blanco han sido usadas para el PCR. Una máxima sensibilidad puede ser producida a partir del uso de secuencias multicopia (Lachaud et al., 2002). Ejemplos de tales blancos son los genes de ARN ribosomales, el ADN del kinetoplasto, genes de ARN derivados del miniexon y las repeticiones genómicas (Osman, et al., 1998). La especificidad del PCR puede ser adaptada a una necesidad específica para regiones variables o conservadas. En esta vía es posible caracterizar el parásito a nivel de género, complejo, especie o aún a nivel de aislado. Para el diagnóstico de leishmaniasis visceral se han evaluado los aspirados de médula ósea y de nódulo linfático, así como muestras de sangre. Los aspirados de médula ósea a partir de pacientes parásitologicamente confirmados fueron siempre positivos por PCR en varios estudios (Mathis & Deplazes, 1995; Andres, 1997; Osman, 1997). En otros estudios la comparación del PCR de aspirados de médula ósea con examinación microscópica y cultivo para el diagnóstico de leishmanisis visceral en pacientes inmunosuprimidos, mostró que el PCR exhibió una mayor sensibilidad que la microscopia y el cultivo (Piarroux, Gambarelli, Dumon, Fontes, Dunan, Mary, Toga, & Quilici, 1994). En aspirados de nódulo linfático humano el ADN de Leishmania fue detectado por PCR en todas las seis muestras de un estudio (Andresen et al., 1997) y en 33/38 muestras en otro (Osman, Oskam, Zijlstra, Kroon, Schoone, Khalil, Hassan, & Kager, 1997). En general el PCR es el método más sensible para la detección de Leishmania en nódulo linfático y especialmente en aspirados de médula ósea de pacientes con leishmaniasis visceral. Esta tecnología ha mostrado una gran utilidad en la confirmación de casos donde se sospecha infección con leishmanisis visceral.

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Debido a que el nódulo linfático, el aspirado de bazo y médula ósea son dolorosos y pueden ser dañinos para el paciente, la sangre periférica puede ser usada para efectuar un escaneo inicial por PCR a las personas que se sospecha tienen leishmanisis vísceral. La sensibilidad del PCR para la detección del ADN de Leishmnia en muestras de sangre puede variar en un rango de 70% (Osman, et al., 1997. Adhya, S., et al., 1995) a 90% (Nuzum, White, 3rd. Thakur, Dietze, Wages, Grogl, & Berman, 1995) o ser mayor a este ultimo valor (Andresen, Gasim, Elhassan, Khalil, Barker, Theander, & Kharazmi, 1997, Salotra, Salotra, Sreenivas, Pogue, Lee, Nakhasi, Ramesh, & Negi, 2001). Si el PCR a partir de sangre es negativo, se podría realizar un PCR a partir de nódulo linfático y/o aspirado de médula ósea, ya que en estos materiales se ha registrado una mayor sensibilidad (Osman, et al., 1997). Los pacientes con leishmaniasis cutánea o mucocutánea frecuentemente presentan un bajo o indetectable número de anticuerpos contra Leishmania y por tanto los test serológicos arrojan continuamente resultados negativos. En este sentido el PCR se ha convertido en una importante herramienta para el diagnóstico de la leishmaniasis cutánea y mucocutánea. En un estudio, seis de diez biopsias de piel fueron positivas mediante PCR (Mathis, A. et al., 1995). Otro estudio revelo que 24 de 28 (86%) muestras tomadas a partir de pacientes fueron positivas por esta técnica, mientras que por microscopia se detectó el parásito tan solo en el 55% de las muestras de pacientes con LC (Andresen, K., et al., 1996). Estudios posteriores han demostrado que se pueden obtener resultados positivos por PCR en más del 90% de los casos de LC (Aviles, H., et al., 1999, Pirmez, C., et al., 1999). En cuanto a la leishmaniasis mucocutánea, un estudio permitió detectar parásitos en 17 de 24 pacientes (71%), mientras que el diagnóstico por técnicas convencionales confirmó la enfermedad en tan solo 4 de los 24 pacientes (17%) (Pirmez, da Silva Trajano, Paes-Oliveira, da-Cruz, Gonçalves-da-Costa, Catanho, Degrave, & Fernandes, Pirmez, 1999). La infección persistente en lesiones aparentemente sanas ha sido reportada en casos con LMC (Delgado, O., et al., 1996), además se ha reportado la presencia de L. braziliensis en pacientes curados por inmunoterapia o en diferentes etapas del tratamiento (Schubach, Haddad, Oliveira-Neto, Degrave, Pirmez, Grimaldi, & Fernandes, Schubach, 1998). 1.3 DETERMINACIÓN DE LA CARGA PARASITARIA DE Leishmania EN DIFERENTES TEJIDOS. El PCR cuantitativo ha sido de gran utilidad para la detección y cuantificación de la carga parasitaria de Leishmania en diferentes tejidos. La estimación del número de parásitos es de crucial importancia en todo el contexto epidemiológico de la enfermedad y además representa un importante punto de apoyo en casos donde se requiere una herramienta que permita el establecimiento de bajos límites de

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detección y por tanto un diagnóstico eficaz. Esta tecnología, ha permitido la detección del parásito aún en pacientes asintomáticos y también ha sido empleada con gran expectativa en el seguimiento y monitoreo post-tratamiento. Diversos blancos moleculares como el gen de la ADN polimerasa, la glucosa fosfato isomerasa (GPI) el ADN del kinetoplasto y el ADN ribosomal han sido empleados en la detección de Leishmania mediante PCR en tiempo real (Wortmann, G., et al., 2001). Algunas de estas pruebas diferencian entre grupos del parásito. Mediante el gen de la glucosa fosfato isomerasa, se diferenciaron 4 complejos de Leishmania (L. viannia, L. mexicana, L. donovani/infantum y L. major) a partir de promastigotes de cultivo y de biopsias de pacientes con leishmaniasis cutánea (Wortmann, G., et al., 2005). Se ha desarrollado un PCR en tiempo real que simultáneamente detecta, cuantifica y categoriza parásitos de Leishmania en tres grupos relevantes (L. donovani, L. braziliensis & otras especies) logrando un limite de detección de 94.1 parásitos/mL de sangre. La técnica mostró resultados reproducibles en muestras de sangre, medula ósea, hígado y piel de pacientes con leishmaniasis cutánea y visceral (Schulz, A., et al., 2003) Otros estudios han reportado seguimiento de la enfermedad en pacientes con leishmaniasis visceral provenientes de regiones mediterráneas. Mediante el PCR cuantitativo se logró la detección de Leishmania en 21 % de pacientes que no habían padecido la enfermedad. Además se estableció el seguimiento de la carga parasitaria en individuos asintomáticos y pacientes con reincidencia, obteniendo valores definidos del parásito en sangre (Mary, C., et al., 2006).

La distribución sistémica de Leishmania también ha sido evaluada. La prueba de PCR en tiempo real empleando como blanco el gen GP63 permitió cuantificar la carga parasitaria de L. major en ratones infectados experimentalmente y con antecedente de resistencia a esta especie. Mediante este estudio se estimó la carga parasitaria a nivel del sitio de inoculación, en nódulo linfático y bazo, corroborando la diseminación sistémica de esta especie en ratón (Tupperwar, Vineeth, Rath, & Vaidya, Tupperwar, 2008). 1.4 HERRAMIENTAS EMPLEADAS EN LA DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE PARÁSITOS VIVOS. 1.4.1 Tecnología con genes reporteros. Los genes reporteros son usados comúnmente en biología celular para estudiar la expresión de genes y otros eventos celulares relacionados, tales como: actividad de receptores, señales intracelulares de transducción, procesamiento de ARNm e interacciones de proteínas, entre otras (Naylor, L.H., 1999). La enzima luciferasa de la luciérnaga (Photynus pyralis) se ha usado ampliamente como gen reportero. Células transfectadas con vectores que contengan el gen que codifica para esta enzima pueden producirla constitutivamente. Al medir la actividad enzimática por

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luminometría, se puede obtener una estimación de la cantidad de células en una muestra (Roy, G., et al., 2000). El término gen reportero, usado para definir un gen con un fenotipo medible, puede ser distinguido fácilmente de un conjunto de proteínas endógenas (Naylor, L.H., 1999). Varios parásitos recombinantes poseen un gen reportero como una copia episomal o integrado en un locus definido. Generalmente los métodos que usan la tecnología de genes reporteros catalíticos como luciferasa, galactosidasa, lactamasa, son más sensibles que los métodos basados en proteínas fluorescentes y permiten la detección y cuantificación de parásitos vivos (Monte-Alegre, A., et al., 2006). 1.4.2 Metodologías basadas en la amplificación de ácidos nucleicos. La presencia de secuencias intactas de ADN fue usada inicialmente como un indicador de viabilidad celular asumiendo que este podría ser degradado en una célula muerta más rápidamente que otros componentes celulares (Jamil, S., et al., 1993). La detección de secuencias de ADN largas intactas se ha correlacionado de forma más directa con la viabilidad celular, que las secuencias cortas (McCarty, & Atlas, 1993). Sin embargo, otros estudios muestran que no existe una relación estrecha entre esta molécula y la detección de células vivas. La persistencia activa del ADN ha sido demostrada por PCR en células muertas por largos periodos de tiempo (Masters, C.I., et al., 1994), en cultivos ambientales negativos (Deere, Porter, Pickup, & Edwards, 1996) y en muestras clínicas (Hellyer, DesJardin, Teixeira, Perkins, Cave, & Eisenach, 1999). En diversos estudios se ha evaluado el ARN ribosomal (rARN) como un indicativo de viabilidad (McKillip, J.L., et al., 1999), (Villarino, A., et al., 2000) encontrando que puede ser considerado un buen indicador en algunos regimenes de muerte bacteriana (McKillip, J.L., et al., 1998). Sin embargo el mayor periodo de vida media del rARN (con respecto a otros ARNs) y su retención variable en diversos tratamientos de estrés bacteriano (Tolker-Nielsen, T., et al., 1997), hacen de esta molécula un menor indicador de viabilidad bajo ciertas condiciones (Keer, J.T. et al., 2003). De otra forma, se ha prestado atención al uso del mARN como indicador de viabilidad. Gracias a que esta es una molécula altamente lábil con un periodo corto de vida media (segundos) se asume que puede proveer una mayor información acerca de la viabilidad celular (Keer, J.T. & Birch, L. 2003). Las técnicas de amplificación usadas comúnmente para la detección de mARN son la PCR con transcriptasa reversa, RT-PCR y la amplificación basada en la secuencia del ácido nucleico, (NASBA: Nucleic Acid Sequence Based Amplification,) (Chan, A.B. et al., 1999), (Simpkins, S.A., et al., 2000). Estos métodos han sido aplicados en la determinación de la viabilidad bacteriana con resultados variables. Mas recientemente la técnica RT-SDA (reverse transcriptase-strand displacement amplification) ha sido usada como un indicador de viabilidad bacteriana (Hellyer, T.J. 2001).

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NASBA: Amplificación basada en la secuencia del acido nucleico. La tecnología NASBA para la amplificación de secuencias específicas de ARN ha mostrado ser una herramienta altamente sensible y especifica en el diagnóstico microbiológico (Compton, J., 1991). Esta herramienta se ha aplicado en la detección de HIV, papiloma virus humano, Mycobacteria, Plasmodium falciparum y ha permitido la detección de parásitos vivos de Leishmania a partir de biopsias de pacientes infectados con leishmaniasis cutánea. La técnica NASBA, tiene varias ventajas sobre el PCR convencional: detecta ARN en presencia de ADN y puede medir el número de parásitos viables; la reacción que se establece dentro de esta metodología es isotérmica (no se requiere termociclador) y puede durar alrededor de 90 minutos, es específica y sensible; en una reacción pueden ser amplificados entre 10 y 100 moléculas blanco. Mediante esta metodología es posible cuantificar los niveles de ARN y por tanto obtener cantidades precisas del agente infeccioso (Schoone, Oskam, Kroon, Schallig, & Omar, 2000). El análisis cuantitativo de los niveles de ARN después del tratamiento podría ser utilizado como una herramienta para determinar la eficacia del los tratamientos antileishmania. Sin embargo, una de las desventajas de esta técnica esta relacionada con que los procesos asociados a los mecanismos de detección pueden ser largos y dispendiosos. El tiempo de duración de la técnica y un manejo dispendioso constituye una dificultad cuando se requieren diagnósticos rápidos de la infección en pacientes con leishmaniasis cutánea (van der Meide, W., et al., 2008).

RT-SDA. Recientemente la técnica RT-SDA (Reverse Transcription Strand Displacement Amplification) ha sido usada como un indicador de viabilidad bacteriana. La técnica esta basada en la habilidad de la enzima Hinc II para cortar la hebra retrasada y en la habilidad exonucleasa para extender el extremo 3´ corriente arriba de la hebra de ADN. Este método permite la amplificación isotérmica de secuencias de ARN, con un rendimiento de aproximadamente 1010

veces la cantidad inicial de blanco en periodos de 15 min. La naturaleza isotérmica de la reacción ofrece varias ventajas que están asociadas con el costo y la simplicidad de la instrumentación, sin embargo, la generación del fragmento a partir del corte con enzimas de restricción presenta limitaciones prácticas (Walker, Little, Nadeau, & Shank, 1992). PCR en tiempo real. La técnica de PCR en tiempo real ha hecho posible la detección de Leishmania mediante diferentes blancos de ADN, en tejidos de humanos que padecen la enfermedad y de animales experimentalmente infectados. Se han incluido secuencias tanto nucleares como extracromosomales, siendo el kADN el de mayor escogencia (Mary, Faraut, Lascombe, & Dumon, 2004, Mary, Faraut, Drogoul, Xeridat, Schleinitz, Cuisenier, & Dumon, 2006; Bretagne, Durand, Olivi, Garin, Sulahian, Rivollet, Vidaud, & Deniau, 2001, Francino, Altet, Sánchez-Robert, Rodriguez, Solano-Gallego, Alberola, Ferrer, Sánchez, & Roura, 2006). Sin embargo poco se ha explorado en torno a blancos moleculares basados en ARN, que podrían dar información acerca de la viabilidad del parásito. Al evaluar biopsias de lesión de pacientes con leishmaniasis cutánea

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se encontró una alta sensibilidad y reproducibilidad en los ensayos de PCR en tiempo real del gen 18S ARN (Van der Meide, W., et al., 2008). Los resultados obtenidos permitieron detectar entre 5-109,000 parásitos/biopsia. El límite detección alcanzado en sangre correspondió a 100 parásitos/ml. Estos resultados revelan las ventajas del empleo de PCR en tiempo real para la detección de parásitos vivos con una alta sensibilidad y especificidad, además de otras ventajas asociadas con el ahorro de tiempo, eliminación de los procedimientos post-amplificación y disminución de los problemas de contaminación. Tales ventajas hacen del PCR en tiempo real una herramienta eficaz para abordar la viabilidad de Leishmania a partir de blancos basados en el ARN. 1.4.2.1 Gen 7SL ARN como blanco indicador de viabilidad. El 7SL ARN hace parte de la Partícula de Reconocimiento de Señales (Signal Recognition Particle, SRP). El SRP (figura 3) es un complejo ribonucleoprotéico esencial, compuesto por 6 proteínas y un ARN (Walter, P. et al., 1982). El SRP reconoce secuencias señalizadoras de ciertas cadenas de proteínas nacientes que salen del ribosoma, y las lleva a componentes de reconocimiento específicos localizados en la cara citoplasmática del retículo endoplasmático, para que se de la translocación de proteínas de membrana o proteínas secretoras (Koch, H.G., et al., 2003) Figura 3. Partícula de Reconocimiento de Señales

Fuente. Murray, 2006

La molécula de 7SL ARN, que tiene 273 nucleótidos, está presente en al menos 5 copias a nivel de ADN (www.genedb.com) y en cerca de 200 a 300 copias a nivel de ARN (Michaeli et al., 1992). Esta compuesta por 4 dominios, y tiene una

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similitud general del 60% con la humana (Michaeli, S., et al., 1992), aunque la mayor similitud se encuentra en el domino IV con un 75% de semejanza. Tiene un dominio I truncado más corto que en los humanos, el dominio tARN (Ben-Shlomo, H., et al., 1997). Adicionalmente en los tripanosomátidos presenta un dominio II y III centrales divergentes (figura 4). Sondas de hibridación se han diseñado satisfactoriamente sobre el dominio II para identificar únicamente la molécula de Leishmania mediante PCR en tiempo real (Zelazny, Fedorko, Li, Neva, & Fischer, 2005), obteniendo un valor agregado para diferenciar los complejos Leishmania y Viannia debido a que este dominio posee un 81-99% de similitud intercomplejos (Zelazny, A.M., et al., 2005). La presencia de parásitos vivos en tejidos aparentemente sanos, podría ser sustentada mediante la utilización de blancos moleculares como el 7SL ARN. Estudios recientes han mostrado la implicación de este gen en los mecanismos de infección. Macrófagos a los que se les inhibió parcialmente el gen del 7SL ARN, paralizaron sus funciones inmunes debido a la reducción en el transporte vesicular de proteínas (Misra, Tripathi, & Chaudhuri, 2005). Por tales razones y debido a que el gen 7SL ARN hace parte del SRP (una vía esencial en todos los organismos examinados hasta el momento, a excepción Saccharomyces cerevisae) (Hann, & Walter, 1991), esta molécula, representa una nueva alternativa para la detección de parásitos vivos en sitios diferentes a la lesión.

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Figura 4. Estructura general del gen 7SL ARN en tripanosomátidos

Figura No. 4 Estructura general del gen 7SL ARN en tripanosomátidos Fuente:Ben-Shlomo et. al. J Biol Chem. 1999 Sep 3;274(36):25642-50

Fuente. Ben – Shlomo, 1999.

7SL ARN en Trypanosomatidos:

•Dominio I y IV son muy conservados

PForward

PReverse

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2. METODOLOGÍA 2.1 DESCRIPCIÓN DEL ESTUDIO En el presente estudio se evalúo la presencia de ADN y ARN en muestras de pacientes con leishmaniasis cutánea confirmada. Se tomaron muestras de aspirados de lesión y además se examinaron tejidos aparentemente sanos como piel, sangre y amígdalas. Para detectar el parásito en las diferentes muestras mencionadas se amplificó el kADN de Leishmania Viannia por PCR convencional acoplado a Southern Blot. Las muestras positivas por esta técnica fueron analizadas por PCR en tiempo real empleando como blanco de amplificación el ADN (qPCR) y el ARN (RT-qPCR) del gen 7SLARN para determinar la carga parasitaria y la viabilidad respectivamente. La detección por RT-qPCR en un ensayo dosis respuesta de L. Viannia frente a antimonio fue validada a través de la detección de parásitos vivos por luminometria. Adicionalmente se compararon los resultados de viabilidad y carga parasitaria para analizar la disponibilidad del parásito en tejidos diferentes a la lesión. 2.1.1 Población. Para cumplir con los objetivos de este estudio se tomaron muestras a partir de 30 pacientes con leishmaniasis cutánea o mucocutánea. Los criterios de inclusión a través de los cuales los pacientes fueron vinculados al estudio fueron los siguientes: edad mayor o igual a dieciocho años, diagnóstico parasitológico de leishmaniasis cutánea o mucocutánea, ausencia de cualquier tipo de tratamiento contra leishmaniasis, firma del consentimiento informado. No se incluyeron dentro del estudio menores de edad ni mujeres embarazadas. A los pacientes se les tomo cuatro tipos de muestra (aspirado de lesión, aspirado de piel sana, sangre e hisopo de amígdalas). Los procedimientos se llevaron a cabo por personal profesional calificado bajo condiciones de asepsia y antisepsia para disminuir los riesgos. Los pacientes fueron referenciados a lo largo del estudio con una codificación consecutiva de D1001 a D1030 2.1.2 Consideraciones éticas. A cada uno de los pacientes incluidos dentro del estudio se le hizo lectura del consentimiento informado previamente autorizado por el Comité de Ética de CIDEIM. La participación de los pacientes fue totalmente voluntaria. Las actividades del proyecto se ajustan a las Guías Internacionales para Investigación Biomédica en Humanos, Helsinki, enmienda 2002, ICH– Buenas Prácticas Clínicas, las "Normas Científicas, Técnicas y Administrativas para la Investigación en Salud" establecidas en la Resolución No. 008430 de 1993 del Ministerio de Salud y la Ley 29 de 1990. El protocolo fue revisado y aprobado por el Comité Institucional de Ética de Investigación en Humanos.

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2.1.3 Diagnóstico. El diagnóstico parasitológico fue realizado mediante la evaluación microscópica de láminas obtenidas a partir del aspirado de líquido tisular tomado del borde de lesión o mediante la evaluación histopatológica de biopsia de la lesión mucosa. En total 28 pacientes presentaron leishmaniasis cutánea y 2 mucocutánea. 2.1.4 Estrategia metodológica general. Este estudio fue desarrollado en dos etapas, una correspondiente a la fase de estandarización de las condiciones de amplificación de los blancos moleculares (kADN y 7SL ARN) y otra relacionada con la determinación de la viabilidad y la carga parasitaría de L. Viannia en lesión, sangre, piel sana y amígdalas de pacientes infectados (Figura 5).

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Figura 5. Diagrama PERT que resume las etapas y los pasos generales necesarios para el desarrollo de este estudio.

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Metodología Objetivo 1 1.Definir si la presencia de kADN en lesión, piel sana, sangre y amígdalas indica la presencia de parásitos vivos mediante la amplificación del gen 7SL ARN. 2.2. CONDICIONES DE AMPLIFICACIÓN, SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD DEL PCR DEL kADN Para llevar acabo los ensayos in vitro se empleó la cepa silvestre de Leishmania panamensis código 1126, cedida por el Banco de Cepas de CIDEIM. Con el objetivo de definir el limite de detección de la prueba, y el grado de sensibilidad en presencia del ADN del hospedero, se realizaron diluciones seriadas (1.000, 100, 10 y 1 parasito por reacción) de promastigotes de L. panamensis en presencia de una cantidad fija de monocitos de la línea celular U937. También se evaluó la amplificación del ADN a partir de una cantidad definida de parásitos (100 células) en presencia de diferentes concentraciones de monocitos (5.000, 10.000, 50.000 y 100.000 por reacción). Una vez se efectuaron las diluciones se procedió a hacer extracción de ADN para su posterior amplificación por PCR empleando los iniciadores LV-B1. La extracción de ADN se realizó con el estuche comercial All Prep (Qiagen), siguiendo las especificaciones del fabricante. La amplificación del kADN con los iniciadores LV-B1 se efectuó de acuerdo a las condiciones establecidas por Vergel et al., 2005 y Figueroa et al.,2009. Para evaluar la especificidad de la prueba, se realizó extracción de ADN de humano, hámster, perro y Lutzomyia y se sometió a PCR usando los iniciadores LV-B1. Adicionalmente para confirmar que los iniciadores no anillan con secuencias de organismos genéticamente relacionados con Leishmania, se empleo ADN total de cepas de T. cruzi y T. rangeli, y se sometió a la reacción de PCR con los mismos iniciadores y bajo las mismas condiciones. 2.3 DETERMINACIÓN DE LA INFECCIÓN POR kADN EN MUESTRAS CLÍNICAS 2.3.1 Obtención y preservación de muestras. Se tomó un aspirado del borde de la lesión y uno de piel sana (aproximadamente a 10 cm a la lesión), una muestra de sangre venosa (10mL) y una muestra de amígdalas usando escobillón bucal. Todas las muestras recolectadas fueron almacenadas a -70°C en TRIzol (Invitrogen) o RNA later hasta su procesamiento Se tomaron 10 mL de sangre, se centrifugaron a 1200 rpm durante 10 minutos y posteriormente se extrajo la interfase con una pipeta Pasteur, obteniendo un volumen aproximado de 300 μL. Los monocitos fueron aislados y purificados empleando el sistema Nycoprep (1.068 g/mL; Axis Shield) siguiendo el protocolo del fabricante. Las muestras se almacenaron hasta iniciar la extracción de ácidos

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nucleicos. Los aspirados de piel sana y de lesión se colectaron con jeringa insulínica en un volumen de 100 µl de PBS más 10.000 Unidades de Penicilina/estreptomicina. Inmediatamente el contenido de las jeringas se depositó en TRIzol. Los aspirados de piel sana fueron obtenidos a ≥10 cm de la lesión cutánea. Para tomar la muestra en amígdalas se emplearon hisopos sintéticos estériles, (BuccalAmp kit; Epicentre Biotechnologies), efectuando un frotis suave sobre el tejido glandular. Una vez se tomó la muestra, el hisopo se deposito en 300 μL de RNA later. Antes de iniciar la extracción de ácidos nucleicos se realizo un lavado del hisopo con 500 μL de PBS centrifugando por 10 min a 13000 revoluciones por minuto. 2.3.2 Extracción de ácidos nucleicos. La extracción de ARN y ADN de pacientes infectados se realizó con el estuche comercial All Prep DNA/RNA (Qiagen) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Se realizaron controles negativos de extracción, para garantizar que el área y los reactivos estuvieran libres de contaminación. Las extracciones se llevaron a cabo individualmente a partir de las muestras que fueron preservadas en Trizol o en RNA later. Las muestras procesadas con Trizol se mezclaron con cloroformo y se centrifugaron para obtener los ácidos nucleicos a partir del sobrenadante. A los tejidos preservados en RNA later se les efectuaron 2 lavados con PBS antes de iniciar la extracción. El ADN aislado fue empleado en los ensayos de PCR/Southern-blot y PCR cuantitativo (qPCR) para la determinación de la carga parasitaria. El ARN tratado con DNasa I (Qiagen) fue utilizado en los ensayos de PCR cuantitativo con retrotranscripción (RT- qPCR) para determinar viabilidad. 5µl del RNA extraído fueron sometidos a transcripción reversa empleando la enzima SuperScript III (Invitrogen) e iniciadores aleatorios para obtener 20 µl de cADN. Se emplearon controles negativos tanto para la síntesis de cDNA como para el PCR en tiempo real. 2.3.3 PCR /Southern blot. En el presente estudio se evaluó el ADN extraído de las muestras de aspirados, sangre, piel sana e hisopo de amígdalas mediante PCR convencional del kADN. Para cumplir con este fin se emplearon los iniciadores LV (5'-ATTTTTGAACGGGGTTTCTG 3') (Vergel, 2005); B1 (5'-GGG GTT GGT GTA ATA TAG TGG 3') (Brujin y Barker, 1992) y las condiciones de amplificación descritas por Vergel 2005 y Figueroa 2009. La mezcla de reacción presentó los siguientes componentes: buffer 10X; dNTPs 10Mm; MgCl2 25Mm; Taq Polimerasa 5U/uL; iniciadores 5pmol/ul. El perfil térmico consistió en aplicar una temparatura inicial de 95ºC 5 min seguida de 35 ciclos que presentaron las etapas de denaturación a 92ºC por 1 min, anillamiento a 66ºC por 40 seg, y extensión a 72ºC por 30 seg seguidos de un extensión final de 72ºC por 1 min.

Con el propósito de incrementar la sensibilidad obtenida por PCR convencional y de verificar los resultados obtenidos a partir de pacientes infectados, se aplicó la técnica Southern Blot. Para ello, se emplearon las muestras que fueron sometidas a PCR LV/B1 y visualizadas en geles de agarosa al 1%. El ADN fue

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transferido del gel a una membrana de Nylon. Para desarrollar esta técnica se empleó el estuche The Amersham AlkPhos Direct Labelling Reagent siguiendo las instrucciones del fabricante y usando como sonda el fragmento de 700 pb del kADN de Leishmania clonado en el vector TOPO TA 2.0. Las muestras que arrojaron resultados positivos por esta técnica (lo cual indica presencia de Leishmania Viannia) se analizaron por PCR en tiempo real empleando como blanco molecular el gen 7SL ARN.

2.4 CONDICIONES DE AMPLIFICACIÓN DEL GEN 7SL ARN POR PCR EN TIEMPO REAL. En los ensayos de PCR en tiempo real se amplificó un fragmento de 173 pb de la molécula 7SL RNA específico para Leishmania usando como plantilla ADN y ARN. Las amplificaciones a partir de ADN permitieron determinar la carga parasitaria, mientras que el ARN se empleo como un blanco indicador de viabilidad. A lo largo de este estudio se abordaran las denominaciones qPCR para referirse al PCR cuantitativo (ADN) y RT-qPCR en el caso del PCR cuantitativo con retrotranscripción (ARN). La amplificación del fragmento se efectuó utilizando los iniciadores TRY7SL.For.1 (5´-TGC TCT GTA ACC TTC GGG GGC T -3´) y TRY7SL.Rev.1 (5´-GGC TGC TCC GTC GCC GGC CTG ACC C -3´) diseñados sobre los dominios I y IV de la molécula; dos sondas de hibridación con diferente reportero (Fluoresceína FITC y Light Cycler Red 640 LCRED640) fueron diseñadas (7SL for 43-65 FITC 5´ TGC TGC GTT GAC GTG GTG CTC TG 3´ y 7SL for 67-91 LCRED640 5´ TTG GCT GTG TGT CGG TGT GGC CTG C 3´). Para la reacción de amplificación, 3 µl de ADN/cADN fueron adicionados a 20 µl de reacción conteniendo 4µl de 5X LightCycler FastStart DNA MasterPLUS HybProbe master mix (Roche Applied Science), 0.8 ul de cada iniciador 25uM, 0.2µl de cada sonda 20uM y 11µl de agua grado PCR. Las condiciones térmicas fueron las siguientes: 95 °C por 6 minutos seguido de 50 ciclos de 95 °C por 5 segundos, 60°C por 10 segundos, 72°C por 5 segundos y un ciclo de enfriamiento a 40°C por 30 segundos. La amplificación se efectuó bajo las siguientes condiciones: Cuantificación absoluta con curva estándar externa

PCR dos etapas Tiempo de corrido aproximado: 45 min Curva estándar a partir de diluciones seriadas del plásmido TOPO TA 2.1

(Invitrogen) que contiene el gen 7SL ARN clonado.

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Análisis de los valores de Cp (crossing point) mediante el software versión 4.1 del LightCycler®

La cuantificación absoluta del número de copias del gen se derivó de una curva estándar externa. La curva se construyó a partir de la amplificación de diluciones seriadas en un rango de 106 -102 copias del gen 7SL ARN inserto en el vector pCR2.1 TA-TOPO (Invitrogen). Los procedimientos de clonación y amplificación se efectuaron según instrucciones del fabricante. Los valores Cp (crossing point) fueron determinados automáticamente por el software (versión 4.1) del LightCycler 2.0 (Roche Applied Science). La cuantificación de Leishmania se hizo extrapolando el valor Cp obtenido para cada muestra contra el Log de las concentraciones a partir de la curva estándar. La eficiencia de cada ensayo fue calculada mediante la fórmula E = 10−1/m, donde m (pendiente), es obtenida a partir de la regresión linear de la curva estándar. Todas las muestras fueron evaluadas por duplicado en corridos diferentes. 2.5 VIABILIDAD in vitro MEDIANTE LUMINOMETRÍA Y PCR EN TIEMPO REAL Los ensayos experimentales se realizaron de acuerdo a la metodología descrita por Romero et al 2005. Se utilizaron macrófagos humanos de la línea celular U937 infectados con promastigotes de L. panamensis, en una relación parasito-célula hospedera 20:1. Se utilizó la cepa MHOM/CO/86/1166 sensible a antimonio pentavalente (SbV) y transfectada con el gen de la luciferasa. Los macrófagos infectados fueron expuestos a diferentes dosis del SbV (32, 16, 8, 4, 2ug/mL y un control sin droga) durante 72 horas. Los amastigotes intracelulares viables fueron determinados mediante un ensayo de luminometría en el que la actividad de la enzima luciferasa es evaluada como indicador de viabilidad celular (Romero et al 2005). Replicas intra-ensayo recolectadas y almacenadas a -70°C en TRIzol (Invitrogen) fueron utilizadas para determinar viabilidad mediante RT-qPCR de la molécula 7SLRNA. 2.6 VIABILIDAD EN MUESTRAS CLÍNICAS MEDIANTE PCR EN TIEMPO REAL Se evaluó la viabilidad de Leishmania a partir de las muestras de aspirado de piel sana, sangre, hisopo de amígdalas y aspirados de lesión que fueron positivas por kADN. Se tuvieron en cuenta las condiciones de amplificación por RT-qPCR descritas en el capítulo 2.4 “Condiciones de amplificación del gen 7SL ARN por PCR en tiempo real”. Se efectuaron 2 corridos por muestra incluyendo 2 replicas en cada corrido. El número de copias del gen se calculó con base en el volumen de extracción de la muestra (20 µL). La estimación del número de parásitos vivos se efectuó teniendo en cuenta que una célula presenta aproximadamente 250 copias de del gen 7SL ARN a nivel de ARN (Michaeli et al., 1992), por tanto se dividió el

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número de copias del gen calculado por el equipo en 250 para determinar el número de parásitos por muestra. Metodología Objetivo 2 2. Evaluar la relación entre carga parasitaria y viabilidad de Leishmania a nivel de lesión, piel sana, sangre y amígdalas de humanos con enfermedad activa. 2.7 DETERMINACIÓN DE LA CARGA PARASITARIA EN MUESTRAS CLÍNICAS Para determinar la carga parasitaria de Leishmania (mediante amplificación del ADN del parásito) en las muestras de lesión, piel sana, sangre y amígdalas se tuvieron en cuenta las condiciones de amplificación expuestas en la fase de estandarización para el qPCR. Se efectuaran 2 corridos por muestra incluyendo 2 replicas en cada corrido. Las muestras que presentaron una sola amplificación se consideraron negativas. El número de copias del gen se estimó con base en el volumen de extracción de la muestra (40 µL). La determinación de la carga parasitaria se efectuó teniendo en cuenta que el 7SL ARN a nivel de ADN presenta aproximadamente 5 copias distribuidas en cromosomas diferentes (www.genedb.com), por tanto el número de copias del gen calculado por el equipo se dividió en 5 para obtener el número de parásitos en la muestra. 2.8 ANÁLISIS DE DATOS El número de copias del gen 7SL ARN a nivel de ADN y ARN se calculó directamente mediante el análisis de cuantificación absoluta generado por el Software versión 4.0 Roche en el equipo Light Cycler 2.0 a partir de los valores de la curva estándar. Para efectuar el análisis también se tuvieron en cuenta los valores de eficiencia, Cp y concentración arrojados por el equipo. El coeficiente de correlación (valor r2) fue calculado para cada curva estándar usando un análisis de regresión lineal. La diferencia en el número de copias obtenido por RT-qPCR y por qPCR fue analizada usando los test no paramétricos de Kruskal-Wallis y Mann-Whitney. Se consideraron diferencias significativas cuando el valor p< 0 ,05.

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3. RESULTADOS 3.1 CARACTERÍSTICAS DE LOS PACIENTES Se incluyeron 30 pacientes entre 19 y 74 años de edad, 27 hombres y 3 mujeres (Tabla 1) quienes presentaron lesiones con un tiempo de evolución comprendido entre 1 y 12 meses, solo el paciente D1019 presentó una lesión activa con compromiso mucoso de 8 años de evolución. 21 (70%) de 30 pacientes presentaron lesiones en un solo sitio (cabeza, brazo, pierna, tórax o cuello), 8 (27%) de 30 pacientes presentaron lesiones en dos sitios diferentes (Cabeza y cuello, brazo y cuello, brazo y tórax, brazo y pierna) y un paciente mostró lesiones en tres sitios distintos (Cabeza, tórax y Septum) (Tabla 1). 3.2 ESPECIES DE Leishmania Para efectuar la caracterización de las especies de Leishmania se tomó una muestra de aspirado de lesión y a partir de esta se aisló el parásito en cultivo, posteriormente se analizó mediante la técnica de anticuerpos monoclonales para diferenciar a nivel de género. También se utilizó la técnica de isoenzimas para diferenciar especies de Leishmania. Esta caracterización se llevó a cabo por parte de personal experto perteneciente a la Unidad de Inmunología y Biología Celular de CIDEIM. Se logró aislar diferentes especies de Leishmania en 23 (77%) de los 30 pacientes diagnosticados con leishmaniasis cutánea o mucocutánea activa. 17 aislados (74%) correspondieron a L .panamensis, 4 (17%) a L. braziliensis y 2 (9%) a L. guyanensis (Tabla 1).

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Tabla 1. Características generales de los pacientes diagnosticados con leishmaniasis cutánea

Característica Rango Edad 19-74 años Tiempo de evolución de la lesión

<1 mes - 8 años

Número de lesiones 1 - 6

Frecuencia

(%) N % Sexo Femenino 3 10 Masculino 27 90 Ubicación de las lesiones Cabeza 10 48 Cuello 1 5 Tórax 1 5 Brazo 5 23 Pierna 4 19 Cabeza y cuello 2 25 Brazo y cuello 1 13 Brazo y tórax 3 37 Brazo y pierna 2 25 Cabeza, tórax, septum 1 3 Especie de Leishmania L. panamensis 17 74 L. braziliensis 4 17 L. guyanensis 2 9

3.3 DETECCIÓN DE Leishmania POR PCR DEL kADN EN MUESTRAS CLÍNICAS El ensayo de sensibilidad para PCR del kADN permitió detectar un rango mínimo de 100 parásitos en presencia de 10.000 monocitos (Figura 6). La evaluación de la especificidad mostró que los iniciadores LV-B1 anillan directamente con el kADN de Leishmania (Viannia) y no con otros microorganismos (Mycobacterium tuberculosis), otras especies (L. chagasi, L. mexicana, L. amazonensis) u otros géneros relacionados (T. cruzi y T. rangeli); igualmente no se observó amplificación con ADN de humano, perro, hámster o insectos vectores (Figura 7).

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Figura 6. Límite de detección del PCR del kADN en presencia de 10.000 monocitos (M∅). 1 y 11: Marcador de peso 1Kb; 2: Control negativo de PCR; 3: Control positivo (L. panamensis); 4: Control negativo de PCR (DNA reemplazado por agua en la mezcla de reacción); 5: Control negativo de extracción (se aplicó el protocolo de extracción a una muestra de agua); 6: M∅ + 1parásito; 7: M∅ + 10 parásitos; 8: M∅ + 100 parásitos; 9: M∅ + 1000 parásitos; 10: Control positivo de extracción.

Figura 7. Amplificación específica del kADN de Leishmania mediante PCR convencional. 1: Marcador de peso; 2: Control negativo de PCR; 3: Control (+) L. panamensis; 4: ADN de hámster; 5: ADN de perro; 6: ADN de humano; 7: ADN de Lutzomya sp

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Se detectó un fragmento de 700 pb mediante PCR/Southern blot, correspondiente al kADN de L. Viannia tanto en tejidos extralesionales como en lesiones de pacientes con leishmaniasis cutánea y mucocutánea (Figuras 8, 9, 10). 22 (73%) de 30 pacientes fueron positivos en tejidos extralesionales. De estos pacientes 14 (64%) presentaron positividad en al menos dos tejidos (sangre, piel sana y/o amígdalas). La sangre fue la muestra que presentó mayor positividad con 19 (68%) de 28, seguida por el hisopo de amígdalas con 13 (46%) de 28 y el aspirado de piel sana con 11(37%) de 30. Por su parte, en el aspirado de lesión se encontró kADN en 26 (87%) de las 30 muestras de pacientes evaluados. Los pacientes D1017 y D1019 presentaron aspirados de lesión negativos, sin embargo, en ellos se detectó kADN de Leishmania en sangre y amígdalas respectivamente. El análisis por Southern Blot logró incrementar la sensibilidad obtenida por PCR convencional hasta en un 20%, detectando el kADN en tejidos extralesionales de 6 pacientes adicionales (Tabla 2). Figura 8. PCR/Southern blot a partir de muestras de sangre (CN: Control negativo; CP:Control positivo; 4:D1001; 5:D1002; 6:D1003; 7:D1005; 8:D1006; 9D1007; 10:D1008; 11:D1009; 12:D1010).

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Figura 9. PCR/Southern blot a partir de hisopo de amígdalas (CN: Control negativo; CP: Control positivo; 6:D1002; 7:D1003; 8:D1005; 9D1006; 10:D1007; 11:D1008; 12:D1009; 13:D1010). Figura 10. PCR/Southern blot a partir de aspirados de lesión (CN: Control negativo; CP: Control positivo; 4:D1001; 5:D1002; 6:D1003; 7:D1004; 8:D1005; 9:D1006; 10:D1007; 11:D1008; 12:D1009; 13:D1010).

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Tabla 2. Detección de Leishmania en muestras clínicas por PCR/Southern blot

ND: no determinado 3.4 AMPLIFICACIÓN DE LA MOLÉCULA 7SL ARN MEDIANTE PCR EN TIEMPO REAL Para determinar la especificidad de la prueba se amplificó el ADN y el ARN extraídos a partir de cultivos de L. panamensis, monocitos humanos, T. cruzi y Mycobacterium tuberculosis. El gen 7SL ARN y su transcrito fueron amplificados exclusivamente en las muestras de Leishmania. La amplificación de la molécula

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7SL ARN por RT-qPCR y qPCR a partir de diluciones seriadas de promastigotes de L. panamensis reveló un límite de detección de 1x102 parásitos (Figura 11A). Los valores Cp y la concentración de ADN Y ARN mostraron una relación inversa (Figura 11B). Para efectuar la detección y cuantificación de Leishmania bajo condiciones in vitro e in vivo se partió de una curva estándar preparada a partir de ADN plasmídico. La curva mostró una relación inversa entre los valores Cp y el logaritmo de la concentración. El rango de detección varió de 1x106-1x102 copias del gen/µL, con una eficiencia de 1,97 y un coeficiente de regresión de 0,998 (Figura 12). Figura 11. Sensibilidad y especificidad del PCR en tiempo real del gen 7 SL ARN de Leishmania (Viannia) panamensis. A: Plot de amplificación de diluciones de parásitos y controles negativos señalados con asterisco (PCR sin cADN, controles negativos de extracción y de retrotranscripción, macrófagos sin infectar, monocitos de donantes sanos, cADN de T. cruzi). B: Cp comparativo de ADN y ARN obtenidos a partir de diluciones seriadas de parásitos: 1x106-1x102 (corridos por duplicado)

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Figura 12. Curva estándar para la cuantificación de Leishmania (Viannia) mediante PCR en tiempo real del gen 7SL ARN. Diluciones seriadas a partir de 1x107- 1x102 copias del plásmido/µL. 3.4.1 Viabilidad in vitro. La molécula 7SL ARN permitió la detección de amastigotes vivos de Leishmania panamensis a partir de macrófagos infectados y expuestos a diferentes dosis de antimonio pentavalente. La amplificación del 7SL ARN se relacionó inversamente con la concentración de la droga y coincidió con los resultados de la actividad luciferasa obtenidos en la línea de L. panamensis sensible al antimonio (Anexo E). En este sentido el número de copias del gen 7SL ARN fue proporcional al número de parásitos vivos en la prueba de citotoxicidad dosis respuesta. El análisis de la viabilidad mediante los ensayos de luminometría mostró amastigotes vivos en las dosis de 0, 2, 4 y 8 µg/mL de SbV con un porcentaje de viabilidad de 100, 4.5, 3.0 y 1.3% respectivamente (Figura 13).

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Figura 13. Efecto dosis respuesta de amastigotes intracelulares de Leishmania (Viannia) panamensis transfectados con el vector pGL2-a NEO-a LUC expuesto a diferentes concentraciones de antimonio pentavalente SbV. Los cuadros indican el porcentaje de viabilidad detectado por RT-qPCR y los círculos representan al porcentaje de viabilidad medido por luminometría 3.4.2 Viabilidad en muestras clínicas. La presencia de Leishmania en tejidos extralesionales detectada por kADN fue confirmada mediante la amplificación del gen 7SL RNA, los análisis de esta molécula por medio de RT-qPCR permitieron la detección de parásitos vivos en los tejidos extralesionales evaluados; el porcentaje de positividad fue mayor en sangre 13(68%) de 19 muestras, seguido por el hisopo de amígdalas 5(42%) de 12 y por el aspirado de piel sana 4(36%) de 11. De 25 aspirados de lesión que fueron positivos por kADN, 22 (88%) presentaron parásitos vivos mediante la amplificación del 7SL ARN (Tabla 3).

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kDNAPCR/Southern

Blot ADN ARN

Sangre 19/28 (68) 15/19 (79) 13/19 (68)Hisopo de amigdalas 13/28 (46) 12/13 (92) 5/12 (42)Aspirado de piel sana 11/30 (37) 8/11 (73) 4/11 (36)Aspirado de lesión 26/30 (87) 24/26 (92) 22/25 (88)

Muestra 7SL ARNFrecuencia (% positivos)

Tabla 3. Frecuencia de detección del kADN y 7SL ARN en sangre, hisopo de amígdalas, aspirado de piel sana y lesión de pacientes con leishmaniasis cutánea activa

3.4.3 Determinación de la carga parasitaria en muestras clínicas. La amplificación del gen 7SL ARN permitió la detección de Leishmania (Viannia) en la mayoría de muestras que fueron positivas por el kADN. A diferencia de los análisis de PCR/ Southern blot y RT-qPCR, el hisopo de amígdalas fue el tejido extralesional más frecuentemente positivo 12 (92%) de 13, seguido por la sangre 15 (79%) de 19 y el aspirado de piel sana 8 (73%) de 11 (Tabla 3). Por su parte, el porcentaje de positividad mas alto se presentó en los aspirados de lesión 24 (92%) de 26. Un análisis comparativo del número de copias del 7SL ARN de Leishmania amplificado a partir de las muestras analizadas indicó que existen diferencias en la cantidad de ARN y ADN para los 30 pacientes evaluados por RT-qPCR (p=0,045) y por qPCR (p=0,08) respectivamente (anexo A, B). Adicionalmente no se encontró correlación en el número de copias obtenido por los dos métodos para cada una de las muestras (anexo C). Al relacionar las muestras analizadas solo se obtuvo una correlación de 1 entre las muestras de sangre y piel cuando se evaluó el número de copias de ARN (anexo D). El análisis del número de copias del 7SL ARN en hisopo de amígdalas y sangre reveló una concentración significativamente mayor (p=0,02) del ADN del parásito comparada con el ARN (figura 14, anexo A). En hisopo de amígdalas y en sangre una mediana de 321.933 y 34.980 copias del 7SL ARN (rango 38.9401-28´600.000 y 8.080-772.000) fue detectada a nivel de ADN respectivamente. De otra forma un bajo numero de copias fue detectado a nivel de ARN a partir de hisopo de amígdalas y de sangre, con una mediana de 6.830 y 6.510 (rango 3.130 -78.867 y 1.150-1´505.333) respectivamente.

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Figura 14. Resultados comparativos obtenidos en el análisis por RT-qPCR y qPCR de diferentes tejidos de pacientes con leishmaniasis cutánea activa. Los cuadros blancos y azules corresponden a la mediana del número de copias de ARN y ADN de la molécula 7SL ARN respectivamente. Las barras representan el rango mínimo y máximo del número de copias del 7SL ARN. Las diferencias significativas son asignadas con asterisco, p=0,02

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4. DISCUSIÓN

La evaluación de la presencia y viabilidad de Leishmania a partir de muestras clínicas constituye una necesidad de primer orden que debe ser resuelta para evaluar el estado de la infección, monitorear la eficacia de los tratamientos y dilucidar patrones de diseminación y biodisponibilidad. En este sentido, la amplificación de la molécula 7SL ARN por RT-qPCR mostró ser una herramienta apropiada para la detección de parásitos vivos en tejidos diferentes a la lesión como sangre, piel sana e hisopo de amígdalas. Este hallazgo respalda la hipótesis de que existe un comportamiento diseminativo del parásito en pacientes con lesión activa (Vergel, C., et al., 2006, Van Eys, G., et al., 1991, Walter, P. et al., 1982) y sugiere una mayor biodisponibilidad del parásito hacia el vector. En este estudio la presencia de Leishmania en tejidos diferentes a la lesión, fue detectada mediante PCR/southern blot del kADN de parásitos, los resultados mostraron que el 73% de los pacientes con leishmaniasis activa presentaron evidencia molecular de parásitos en sangre, hisopo de amígdala y piel sana. Estos hallazgos corroboran los descritos previamente por Vergel y colaboradores en el 2006, en los cuales el kADN de Leishmania fue detectado en sangre y piel sana de pacientes antes y después del tratamiento con glucantime con un porcentaje de positividad de 19.2 y 7.5% respectivamente (Vergel, C., et al., 2006). Estos porcentajes fueron menores que los descritos en este estudio. Así mismo en tejidos mucosos (mucosa nasal y conjuntiva) de pacientes con leishmaniasis activa, el kADN fue detectado en 23 (82%) de los 28 pacientes evaluados, de los cuales solo 2 presentaron lesiones mucosas (Figueroa, R.A., et al., 2009). La presencia y aún más la persistencia del parásito en tejidos como sangre, piel sana, médula ósea de pacientes con enfermedad activa, al igual que en cicatriz de pacientes tratados y en resolución clínica ha sido previamente evidenciada mediante la detección de ADN (Schubach, A., 1998, Schulz, A., 2003, Mendonça, 2004); sin embargo debido a su estabilidad, ésta molécula no siempre provee información acerca de la viabilidad de los microorganismos; en bacterias como Escherichia coli, Listeria monocytogenes y Mycobacterium tuberculosis, la detección de ADN puede persistir en células muertas aún por periodos largos de tiempo (Masters, C.I., et al., 1994, Hellyer, T.J., et al., 1999). El principal hallazgo de este trabajo es la detección de parásitos vivos mediante la evaluación por RT-qPCR de la molécula 7SL ARN; los resultados de viabilidad in vitro obtenidos muestran una disminución marcada en el número de copias de ARN de este gen a medida que se incrementó la concentración de antimonio pentavalente, demostrando un efecto dosis respuesta similar al encontrado por luminometría; estos resultados se correlacionan con los hallazgos obtenidos en CIDEIM, durante la evaluación de viabilidad de promastigotes de L. panamensis expuestos a miltefosina 256 µM por varios periodos de tiempo (0, 24, 72 y 168h) en donde, el número de copias de ARN de la molécula 7SLRNA disminuyó

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notoriamente comparado con el control de parásitos sin miltefosina (dato no publicado). En contraste con el ADN, el ARN por su vida media más corta (Villarino, Bouvet, Regnault, Martin-Delautre, & Grimont, 2000, Keer, & Birch, 2003) no permanece intacto por periodos largos de tiempo en ausencia de microorganismos vivos, además la presencia de ARN intacto es un signo de metabolismo activo lo que hace de esta molécula un buen indicador de viabilidad. Estudios en bacterias han permitido establecer una relación entre viabilidad y detección de ARN, en Mycobacterium smegmatis y Mycobacterium tuberculosis expuestos a drogas, los niveles de RNA (tanto rRNA como mRNA) detectado decrecen pero el ADN se mantiene constante (Hellyer, T.J., et al., 1999, Van der Vliet, G.M.E., et al., 1994). Nuestros resultados de viabilidad respaldan la hipótesis que el ARN es un buen indicador de viabilidad y que la molécula 7SL ARN representa una alternativa para la detección de parásitos vivos en tejidos diferentes a la lesión, ya que participa en procesos celulares fundamentales que sugieren la presencia de metabolismo activo y que permite por tanto medir indirectamente la viabilidad. Estudios recientes muestran que una inhibición parcial en la biosíntesis del 7SL ARN puede reducir la provisión de SRP desde el núcleo y paralizar el transporte vesicular de proteínas (Misra, S., et al., 2005). La PCR en tiempo real de la molécula 7SLARN desarrollada en este estudio, constituye una herramienta molecular rápida y sencilla para la detección y cuantificación de parásitos vivos a partir de muestras clínicas en comparación con otros métodos disponibles. En algunos estudios se ha logrado detectar parásitos vivos mediante el aislamiento en cultivo o inoculación en animales experimentales que pueden desarrollar la enfermedad (Vergel, 2006, Schubach, 1998, Mendoça, 2004), sin embargo estas metodologías suelen ser dispendiosas y requieren de mayor tiempo. De otra forma el aislamiento y cultivo de parásitos tiende a presentar una baja sensiblidad y en algunas ocasiones exhibe una alta variabilidad (Herwaldt, 1999) ya que depende del número y dispersión de los parásitos en las muestras, del procedimiento empleado en la toma de muestra y de las habilidades técnicas del personal (Reithinger y Dujardin, 2007). Adicionalmente esta metodología esta sujeta a riesgo de contaminación bacteriana. En este sentido los métodos moleculares para la detección de parásitos vivos representan una buena alternativa, que podría ser empleada en zonas endémicas. Recientemente se han descrito métodos moleculares como el QT-NASBA, para determinar la presencia de parásitos vivos de Leishmania en biopsias de lesión empleando como blanco el gen 18S RNA; en este estudio se lograron detectar hasta 2 parásitos por biopsia en pacientes con leishmaniasis cutánea (Van der Meide, W.F., et al., 2005). Asumiendo que a nivel de ARN la molécula 7SL ARN presenta aproximadamente 250 copias (Michaeli, S., et al., 1992), nuestros resultados muestran una detección hasta de 10 parásitos en aspirado de lesión; igualmente es importante destacar que esta herramienta basada en RT-qPCR permite detectar parásitos vivos en muestras diferentes a la lesión como sangre,

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donde el límite de detección fue de 5 parásitos. A pesar de que mediante la QT-NASBA se logran límites de detección menores comparados con PCR en tiempo real, este método molecular requiere mayor tiempo y es de mayor complejidad (Van der Meide, W., et al., 2008). De los tejidos diferentes a la lesión, los monocitos de sangre periférica presentaron mayor positividad tanto por kADN como por RT-qPCR, lo cual indica la existencia y circulación de parásitos vivos en este tejido. Estos hallazgos respaldan la idea de que Leishmania puede diseminarse, multiplicarse y perpetuarse en monocitos de sangre periférica (Murray, H.W., 1994) sugiriendo que estas células pueden albergar especies dermotrópicas de Leishmania y servir como vehículos para su preservación y desarrollo dentro del humano (Ramírez, J.L. et al., 1997) . Probablemente la capacidad de persistencia de Leishmania en monocitos explique el alto número de parásitos vivos (5 - 6029 parásitos por muestra) encontrado en este tejido y corrobore la idea que el humano juega un papel importante en la transmisión (Aebischer, 1993, Aragort de Rossell, 1993, Mendoça, 2004) dada la disponibilidad del parásito en la circulación sanguínea. Los análisis mediante PCR del kADN y RT-qPCR del 7SLRNA permitieron detectar parásitos vivos en hisopos de amígdalas de pacientes con leishmaniasis activa con un porcentaje mayor a 40% de positividad; de los cuales un paciente presentaba compromiso mucocutáneo. Estos hallazgos respaldan la hipótesis de una posible diseminación del parásito hacia mucosas y corroboran los resultados obtenidos a partir de hisopo nasal y de conjuntiva en estos mismos pacientes (Figueroa, R.A., et al., 2009). Adicionalmente la eficiencia de recuperación y detección de parásitos vivos a partir de hisopos de tejidos mucosos plantea una posibilidad de diagnóstico y evaluación de la infección con compromiso mucocutáneo empleando métodos menos invasivos (Figueroa, R.A., et al., 2009). La persistencia de parásitos vivos en tejidos como sangre y amígdalas, así como la ausencia de parásitos en la lesión de los pacientes D1017 y D1019, puede estar relacionada con una rápida diseminación del parásito hacia estos tejidos y con una disminución de la carga parasitaria en el sitio de inoculación, tal como se ha reportado en otros estudios donde la disminución de la carga en lesión puede deberse a la activación de la respuesta inmune frente al patógeno (Tupperwar, N., et al., 2008, Nicolás, L., et al., 2000). En este sentido nuestros resultados de RT-qPCR respaldan la hipótesis de diseminación del parásito por vía sanguínea y posiblemente linfática. En este estudio desarrollamos un ensayo altamente específico, rápido, confiable y reproducible para la cuantificación de parásitos de Leishmania a partir de muestras clínicas. La determinación de la carga parasitaria mostró valores significativamente mayores a los obtenidos a partir de la estimación de parásitos vivos por ARN. Igualmente mayores frecuencias de positividad se encontraron mediante la estimación de la carga parasitaria en las muestras evaluadas. Este

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hecho puede deberse en parte, a la mayor estabilidad del ADN comparada con la mayor labilidad del ARN (Keer, J.T. et al., 2003). Adicionalmente, este estudio constituye uno de los primeros reportes de cuantificación de parásitos en tejidos diferentes a la lesión como amígdalas, monocitos de sangre y piel sana en pacientes con leishmaniasis activa. Al amplificar el 7SL ARN por qPCR, las amígdalas presentaron las mayores frecuencias de detección seguidas por sangre y aspirados de piel sana. El alto número de pacientes que presentaron amígdalas positivas por kADN fue el 46%, de los cuales el 92% fue positivo por qPCR, lo que sugiere una alta prevalencia de Leishmania en la población de estudio, al menos en este tipo de tejido. Asumiendo que a nivel de ADN la molécula 7SLARN presenta aproximadamente 5 copias por genoma del parásito (www.genedb.com), nuestros resultados muestran que las amígdalas presentaron el mayor número de parásitos con un rango de detección entre 7788 y 5´720.000 parásitos. En conjunto con lo encontrado por kDNA y RT-qPCR, los resultados de carga parasitaria soportan la idea de que existe diseminación del parásito, ya que algunos pacientes con alta carga parasitaria en amígdalas, presentaron trayecto linfático y linfoadenopatias sugiriendo una posible diseminación linfática. Este hecho se relaciona con lo reportado en otros estudios (Schubach, A., et al., 1998). Un aporte del presente estudio se basa en la determinación de la carga parasitaria en tejidos extralesionales del hospedero. En este sentido, la cuantificación del parásito en el humano puede ser altamente relevante para el monitoreo de la progresión de la enfermedad y para el éxito de la terapia antileishmania, por ejemplo en el caso de pacientes coinfectados con VIH (Bossolasco, Gaiera, Olchini, Gulletta, Martello, Bestetti, Bossi, Germagnoli, Lazzarin, Uberti-Foppa, Cinque, 2003) o de pacientes curados de leishmanasis cutánea pero que presentan riesgo de desarrollar la patología muco cutánea (Mary et al., 2004). La detección de la carga parasitaria en los tejidos evaluados en este estudio confirma la capacidad de la piel sana, amígdalas y sangre para generar información útil acerca del estado de la infección en pacientes con leishmaniasis cutánea. Adicionalmente, representa una herramienta que puede ser usada en estudios epidemiológicos para determinar el papel de los hospederos y reservorios y de esta forma entender la dinámica de dispersión del parásito en su ciclo natural. Aunque sólo fue posible identificar especies de Leishmania en 22 de 30 (73%) de los pacientes, L. panamensis fue la especie más predominante, lo que concuerda con lo descrito sobre Leishmaniasis cutánea del nuevo mundo (Saravia, N.G., et al., 2002). La carga parasitaria relativa determinada en los pacientes que presentaron infección con L. panamensis presentó una alta variabilidad, con valores entre 103 y 106 parásitos en los tejidos diferentes a la lesión. Estos resultados apoyan lo encontrado a nivel de carga parasitaria en otras especies de Leishmania, donde también se ha demostrado una amplia variabilidad en el

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número de parásitos (Moreno Castilho, Aranha Camargo, McMahon-Pratt, Jon Shaw, & Floeter-Winter, 2008). La evaluación de la viabilidad y la carga parasitaria por PCR en tiempo real mediante la utilización del 7SL ARN como blanco molecular, permite avanzar en el conocimiento de la historia natural de la enfermedad. Nuestros hallazgos respaldan la hipótesis de que existe diseminación de Leishmania hacia tejidos diferentes a la lesión en el hospedero humano y sugieren que este puede participar en el ciclo de transmisión de la enfermedad con disponibilidad de parásitos vivos en tejidos accesibles al vector. Adicionalmente, la implementación de estas herramientas moleculares permite la evaluación, detección y cuantificación de especies de Leishmania en tejidos aparentemente sanos así como en la lesión.

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CONCLUSIONES

El efecto dosis respuesta observado mediante el 7SL ARN en la determinación de la viabilidad in vitro se correlaciona directamente en el ensayo de luminometria, sugiriendo que este blanco constituye un indicador de viabilidad.

La amplificación del gen 7SL ARN mediante PCR en tiempo real permitió la

detección de parásitos vivos en muestras clínicas de pacientes con leishmaniasis cutánea y confirmó la detección del parásito basada en el kDNA.

El hallazgo de parásitos en los tejidos diferentes a la lesión (Sangre, amígdalas

y piel sana) fortalece la hipótesis de diseminación y disponibilidad del parásito en tejidos diferentes a la lesión.

La presencia de parásitos vivos en hisopos de amígdalas representa una

posibilidad de evaluación de la infección a partir de métodos menos invasivos. La tecnología desarrollada en este estudio permitió detectar viabilidad y carga

parasitaria simultáneamente en muestras clínicas, representando una aproximación al diagnóstico parasitológico y al seguimiento terapéutico.

Estos resultados constituyen una evidencia de la capacidad de L. panamensis,

L. guyanensis y L. braziliensis de invadir tejidos diferentes a la lesión. Los resultados obtenidos en este estudio constituyen un aporte al conocimiento

de los mecanismos de diseminación y disponibilidad de Leishmania en tejidos diferentes a la lesión.

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62

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63

ANEXOS

64

Anexo A. Comparación del número de copias del gen 7SL RNA de Leishmania (Viannia) obtenido mediante PCR en tiempo real en diferentes muestras de pacientes Test Mann-Whitney aplicado al número de copias promedio del gen 7SL RNA estimado por RT-qPCR (RNA) y qPCR (DNA) en muestras de sangre, amígdalas, piel sana y aspirado de lesión. Rango promedio y suma de rangos obtenidos para cada una de las muestras evaluadas.

Muestra Método N Rango promedio

Suma de rangos

1 Sangre 1 RNA 13 10,62 138,00

Promedio №

copias 2 DNA 15 17,87 268,00

Total 28

2 Hisopo Amígdalas 1 RNA 5 3,60 18,00

Promedio №

copias 2 DNA 12 11,25 135,00

Total 17

3 Piel Sana 1 RNA 4 8,25 33,00

Promedio №

copias 2 DNA 8 5,63 45,00

Total 12

4 Aspirado Lesión 1 RNA 22 21,86 481,00

Promedio №

copias 2 DNA 24 25,00 600,00

Total 46

65

Parámetros estadísticos obtenidos mediante el Test Mann-Whitney al emplear como variable de agrupamiento el método: RT-qPCR (RNA) y qPCR (DNA)

Muestra Promedio № copias

1 Sangre Mann-Whitney U 47,000 Wilcoxon W 138,000 Z -2,326 Asymp. Sig. (2-tailed) 0,20 Exact Sig. [2*(1 -tailed Sig.)) ,019a 2 Hisopo Amígdalas Mann-Whitney U 3,000 Wilcoxon W 18,000 Z -2,846 Asymp. Sig. (2-tailed) ,004 Exact Sig. [2*(1 -tailed Sig.)] ,002a 3 Piel Sana Mann-Whitney U 9,000 Wilcoxon W 45,000 Z -1,189 Asymp. Sig. (2-tailed) 0,234 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] ,283a 4 Aspirado Lesión Mann-Whitney U 228,000 Wilcoxon W 481,00 Z -.792 Asymp. Sig. (2-tailed) ,429 a: valores no corregidos para grupos

66

050

0000

1.0e

+06

1.5e

+06

Muestra de sangre RNA Muestra de sangre DNA

Número de copias del gen 7SL RNA encontrado en muestras de sangre

Comparación del número de copias del gen 7SL ARN en muestras de sangre de los pacientes D1001- D10030 calculadas mediante RT-qPCR (empleando ARN) y qPCR (empleando ADN). Los puntos que se encuentran por fuera de las cajas representan los valores atípicos encontrados en cada una de las distribuciones

67

020

,000

40,0

0060

,000

80,0

0010

0000

excludes outside values

Muestra de sangre RNA Muestra de sangre DNA

Análisis de la distribución del número de copias del gen 7SL ARN en muestras de sangre de los pacientes D1001- D10030 calculadas mediante RT-qPCR (empleando ARN) y qPCR (empleando ADN). En este análisis se excluyeron los valores atípicos de la distribución

68

01.

0e+0

72.

0e+0

73.

0e+0

7

Hisopo Amígdalas RNA Hisopo Amígdalas DNA

Número de copias del gen 7SL RNA encontrado en muestras de amígdala

Comparación del número de copias del gen 7SL ARN en muestras de amígdalas de los pacientes D1001- D10030 calculadas mediante RT-qPCR (empleando ARN) y qPCR (empleando ADN). Los puntos que se encuentran por fuera de las cajas representan los valores atípicos encontrados en la distribución

69

01.

0e+0

62.

0e+0

63.

0e+0

64.

0e+0

65.

0e+0

6

excludes outside values

Hisopo Amígdalas RNA Hisopo Amígdalas DNA

Comparación del número de copias del gen 7SL ARN en muestras de amígdalas de los pacientes D1001- D10030 calculadas mediante RT-qPCR (empleando ARN) y qPCR (empleando ADN). Los puntos que se encuentran por fuera de las cajas representan los valores atípicos. En este análisis se excluyeron los valores atípicos de la distribución.

70

Número de copias del gen 7SL RNA encontrado en aspirados de piel sana

010

0000

2000

0030

0000

4000

0050

0000

Piel Sana RNA Piel Sana DNA

Comparación del número de copias del gen 7SL ARN en aspirados de piel sana de los pacientes D1001- D10030 calculadas mediante RT-qPCR (empleando ARN) y qPCR (empleando ADN). El punto que se encuentran por fuera de las cajas representa valores atípicos encontrados en la distribución

71

010

0000

2000

0030

0000

4000

0050

0000

excludes outside values

Piel Sana RNA Piel Sana DNA

Comparación del número de copias del gen 7SL ARN en aspirados de piel sana de los pacientes D1001- D10030 calculadas mediante RT-qPCR (empleando ARN) y qPCR (empleando ADN). En este análisis se excluyeron los valores atípicos de la distribución

72

Número de copias del gen 7SL RNA encontrado en aspirados de lesión

05.

0e+0

71.

0e+0

81.

5e+0

8

Aspirado Lesión RNA Aspirado Lesión DNA

Comparación del número de copias del gen 7SL ARN en aspirados de lesión de los pacientes D1001- D10030 calculadas mediante RT-qPCR (empleando ARN) y qPCR (empleando ADN). Los puntos que se encuentran por fuera de las cajas representan valores atípicos encontrados en la distribución

73

050

0000

1.0e

+06

1.5e

+06

2.0e

+06

excludes outside values

Aspirado Lesión RNA Aspirado Lesión DNA

Comparación del número de copias del gen 7SL ARN en aspirados de lesión de los pacientes D1001- D10030 calculadas mediante RT-qPCR (empleando ARN) y qPCR (empleando ADN). En este análisis se excluyeron los valores atípicos de la distribución.

74

Anexo B. Comparaciones del número de copias del gen 7SL RNA de Leishmania (Viannia) por tipo de muestra para cada método (RT-qPCR: RNA y qPCR: DNA) Rangos promedio obtenidos mediante la prueba de Kruskall-Wallis al comparar el número de copias del gen 7SL RNA estimado por RT-qPCR (RNA) y qPCR (DNA) en sangre, amígdalas, piel sana y lesión

Ranks

Método Muestra N Rango promedio 1 RNA 1 Sangre 13 15,31

Promedio № copias 2 Hisopo Amígdalas 5 17,60

3 Piel Sana 4 27,25 4 Aspirado Lesión 22 27,00 Total 44 2 DNA 1 Sangre 15 22,30

Promedio № copias 2 Hisopo Amígdalas 12 42,25

3 Piel Sana 8 20,38 4 Aspirado Lesión 24 31,90 Total 59

Método Promedio № copias 1 RNA Chi-Square 8,050

df 3 Asymp. Sig. ,045

2 DNA Chi-Square 11,924 df 3

Asymp. Sig. 0,008 a. Test de Kruskal Wallis b. Variable de agrupamiento

75

RNA: A un nivel de significancia de 0.05 el Procedimiento Dunn no detecta diferencias. A un nivel de significancia de 0.10: DUNN Comparaciones Lambda Decisión

3 Grupo 1 Grupo 4 -2,60 Diferentes 1 Muestra de sangre 4 Aspirado Lesión

DNA: DUNN Comparaciones Lambda Decisión

1 Grupo 1 Grupo 2 -3,00 Diferentes 1 Muestra de sangre 2 Hisopo Amígdalas

4 Grupo 2 Grupo 3 2,79 Diferentes 2 Hisopo Amígdalas 3 Piel Sana

76

Número de copias del gen 7SL RNA de Leishmania (Viannia) calculado mediante RT-qPCR

02.

0e+0

64.

0e+0

66.

0e+0

68.

0e+0

61.

0e+0

7

Muestra de sangre RNA Hisopo Amígdalas RNAPiel Sana RNA Aspirado Lesión RNA

Análisis del número de copias del gen 7SL RNA (estimado con base en el número de copias de RNA, RT-qPCR) de Leishmania (Viannia) presente en diferentes muestras de los pacientes D1001-D1030. Los puntos que se encuentran por fuera de las cajas representan valores atípicos encontrados en la distribución.

77

050

0000

1.0e

+06

1.5e

+06

2.0e

+06

excludes outside values

Muestra de sangre RNA Hisopo Amígdalas RNAPiel Sana RNA Aspirado Lesión RNA

Análisis del número de copias del gen 7SL RNA (estimado con base en el número de copias de RNA, RT-qPCR) de Leishmania (Viannia) presente en diferentes muestras de los pacientes D1001-D1030. En este análisis se excluyeron los valores atípicos de la distribución

78

05.

0e+0

71.

0e+0

81.

5e+0

8

Muestra de sangre DNA Hisopo Amígdalas DNAPiel Sana DNA Aspirado Lesión DNA

Análisis del número de copias del gen 7SL RNA (estimado con base en el número de copias de DNA, qPCR) de Leishmania (Viannia) presente en diferentes muestras de los pacientes D1001-D1030. Los puntos que se encuentran por fuera de las cajas representan valores atípicos encontrados en la distribución.

79

01.

0e+0

62.

0e+0

63.

0e+0

64.

0e+0

65.

0e+0

6

excludes outside values

Muestra de sangre DNA Hisopo Amígdalas DNAPiel Sana DNA Aspirado Lesión DNA

Análisis del número de copias del gen 7SL RNA (estimado con base en el número de copias de DNA, qPCR) de Leishmania (Viannia) presente en diferentes muestras de los pacientes D1001-D1030. En este análisis se excluyeron los valores atípicos de la distribución

80

050

0000

1000

000

1500

000

Mue

stra

de

sang

re R

NA

0 200000 400000 600000 800000Muestra de sangre DNA

Anexo C. Correlación entre el número de copias del gen 7SL RNA de Leishmania (Viannia) estimado por RT- qPCR (RNA) y por qPCR (DNA) para cada tipo de muestra Valores del coeficiente de correlación de Sperman´s obtenidos al comparar los métodos RT- qPCR (RNA) y qPCR (DNA) para calcular el número de copias del gen 7SL RNA en muestras de sangre

Promedio - 1 Promedio - 2PCR TIEMPO PCR TIEMPO

REAL: REAL:Muestra de Muestra desangre RNA sangre DNA

Spearman's rho Promedio - 1 PCR Coeficiente de correlación 1,000 0,067TIEMPO REAL: Muestra Sig. (2-tailed) . 0,855

de sangre RNA N 13 10Promedio - 2 PCR Coeficiente de correlación 0,067 1,000

TIEMPO REAL: Muestra Sig. (2-tailed) 0,855 .de sangre DNA N 10 15

81

020

000

4000

060

000

8000

0H

isop

o Am

ígda

las

RN

A

0 10000000 20000000 30000000Hisopo Amígdalas DNA

Valores del coeficiente de correlación de Sperman´s obtenidos al comparar los métodos RT- qPCR (RNA) y qPCR (DNA) para calcular el número de copias del gen 7SL RNA en amígdalas

Promedio - Promedio -PCR TIEMPO PCR TIEMPO

REAL: REAL:Hisopo Hisopo

Amígdalas AmígdalasRNA DNA

Spearman's rho Promedio - PCR Coeficiente de Correlación 1,000 -0,300TIEMPO REAL: Hisopo Sig. (2-tailed) . .624

Amìgdalas RNA N 5 5Promedio - PCR Coeficiente de Correlación -0.300 1,000

TIEMPO REAL: Hisopo Sig. (2-tailed) ,624 .Amìgdalas DNA N 5 12

82

010

0000

2000

0030

0000

4000

0050

0000

Piel

San

a R

NA

0 100000 200000 300000 400000Piel Sana DNA

Valores del coeficiente de correlación de Sperman´s obtenidos al comparar los métodos RT- qPCR (RNA) y qPCR (DNA) para calcular el número de copias del gen 7SL RNA en piel sana

Promedio -5 Promedio -6PCR TIEMPO PCR TIEMPO

REAL: REAL:Piel Sana Piel Sana

RNA DNASpearman's rho Promedio - PCR Coeficiente de Correlación 1,000 -,500

TIEMPO REAL: Piel Sana Sig. (2-tailed) . ,667RNA N 4 3

Promedio - PCR Coeficiente de Correlación -,500 1,000TIEMPO REAL: Piel Sana Sig. (2-tailed) ,667 .

DNA N 3 8

83

020

0000

040

0000

060

0000

080

0000

010

0000

00A

spira

do L

esió

n R

NA

0 50000000 1.000e+08 1.500e+08Aspirado Lesión DNA

Valores del coeficiente de correlación de Sperman´s obtenidos al comparar los métodos RT- qPCR (RNA) y qPCR (DNA) para calcular el número de copias del gen 7SL RNA en lesión

Promedio -7 Promedio -8PCR TIEMPO PCR TIEMPO

REAL: REAL:Aspirado Lesión Aspirado Lesión

RNA DNASpearman's rho Promedio - 7 PCR Coeficiente de Correlación 1,000 0,162

TIEMPO REAL: Aspirado Lesión Sig. (2-tailed) . 0,494RNA N 22 20

Promedio - PCR Coeficiente de Correlación 0,162 1,000TIEMPO REAL: Aspirado Lesión Sig. (2-tailed) 0,494 .

DNA N 20 24

84

Anexo D. Para cada método, correlación entre el número de copias del gen 7SL RNA de Leishmania por tipo de muestra (sangre, amigdalas, piel sana, lesión) Análisis de correlación de Spearman´s para determinar si existe dependencia en el número de copias del gen 7SL RNA de Leishmania (Viannia) calculado mediante RT-qPCR (RNA) en muestras de sangre, amígdalas, piel sana y lesión

Promedio - 1 Promedio -3 Promedio - 5 Promedio - 7PCR TIEMPO PCR TIEMPO PCR TIEMPO PCR TIEMPO

REAL : Sangre REAL: Hisopo Amídgalas REAL : Piel Sana REAL: Aspirado Lesión RNA RNA RNA RNA

Spearman's rho Promedio - 4 PCR Coeficiente de correlación 1,000 0,200 1,000 -0,418TIEMPO REAL: Muestra Sig. (2-tailed) . 0,800 . 0,201

de sangre RNA N 13 4 2 11Promedio - 3 PCR Coeficiente de correlación 0,200 1,000 -1,000 0,300

TIEMPO REAL: Hisopo Sig. (2-tailed) 0,800 . 1,000 0,624Amígdalas RNA N 4 5 2 5

Promedio - 5 PCR Coeficiente de correlación 1,000** -1,000 1,000 0,000TIEMPO REAL: Piel Sig. (2-tailed) . 1,000 . 1,000

Sana RNA N 2 2 4 4Promedio - 7 PCR Coeficiente de correlación -0,418 0,300 0,000 1,000TIEMPO REAL: Sig. (2-tailed) 0,201 0,624 1,000 .

Aspirado Lesión RNA N 11 5 4 22**. Correlación significativa con un nivel de 0,01 (2- tailed)

85

Análisis de correlación de Spearman´s para determinar si existe dependencia en el número de copias del gen 7SL RNA de Leishmania (Viannia) calculado mediante qPCR (DNA) en muestras de sangre, amígdalas, piel sana y lesión

Promedio - 2 Promedio - Promedio - Promedio -PCR TIEMPO PCR TIEMPO PCR TIEMPO PCR TIEMPO

REAL: REAL: Hisopo Amígdalas REAL : Piel REAL: Aspirado sangre DNA DNA Sana DNA Lesión DNA

Spearman's rho Promedio- 2 PCR Coeficiente de correlación 1,000 0,257 0,100 0,104TIEMPO REAL: Muestra Sig. (2-tailed) . 0,623 0,873 0,734

de sangre DNA N 15 6 5 13Promedio - 4 PCR Coeficiente de correlación 0,257 1,000 0,400 0,567

TIEMPO REAL: Hisopo Sig. (2-tailed) 0,623 . 0,600 0,112Amígdalas DNA N 6 12 4 9

Promedio - 6 PCR Coeficiente de correlación 0,100 0,400 1,000 0,029TIEMPO REAL: Piel Sig. (2-tailed) 0,873 0,600 . 0,957

Sana DNA N 5 4 8 6Promedio - 8 PCR Coeficiente de correlación 0,104 0,567 0,029 1,000TIEMPO REAL: Sig. (2-tailed) 0,734 0,112 0,957 .

Aspirado Lesión DNA N 13 9 6 24

86

Anexo E. Análisis de correlación de los datos obtenidos por RT-qPCR (RNA) y luminometria Aplicación de las pruebas de Kolmogorov-Smirnov y Shapiro-Wilk para determinar si los datos obtenidos a partir del RTq-PCR y la técnica de luminometria se ajustan a una distribución normal

Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk Statistic df Sig. Statistic df Sig. RNA 0,407 15 0,000 0,589 15 0,000 Luminometria 0,285 15 0,002 0,664 15 0,000 a. Corrección de la significancia de Lilliefors

Resultados obtenidos a partir de la prueba de Spearman´s para determinar si existe correlación entre el número de copias del gen 7SL RNA calculado por RT-qPCR y por luminometria

RNA LuminometriaSpearman's rho RNA Coeificiente de correlación 1,000 0,914**

Sig. (2-tailed) . 0,000N 15 15

Luminometria Coeificiente de correlación 0,914** 1,000Sig. (2-tailed) 0,000 .

N 15 15