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Practica Nº4
DETERMINACIÓN DE BACTERIAS AEROBIOS MESÓFILOS
VIABLES
I. Introducción:
El análisis de los alimentos está catalogado por diversas técnicas y métodos
para determinar microorganismos que se encuentran viables en los alimentos ya
sean sólidos como las carnes, verduras y frutas, o líquidos ya sea leche y jugos
de frutas; entre estos métodos tenemos la numeración de microorganismos
aerobios mesófilos, la cual nos permite determinar cuántos microorganismos
contaminantes presenta un alimento sobre su superficie o en su interior. Según
la norma técnica Peruana para la leche cruda (NTP 202.086:2001) y la norma
técnica Peruana para jugos de frutas (NTP 203.002:1979) establecen que el numero
de microorganismos aerobios mesófilos y facultativos deben ser hasta un máximo
de 1000000 ufc/ml, para que puedan ser consumidos por la población.
Por otro lado las técnicas para poder encontrar la numeración de aerobios
mesófilos viables son: el recuento de colonias en placa por profundidad, superficie
o por goteo; otro el Método del número más probable (MPN) de gérmenes como
cálculo estadístico del número de células viables.
El recuento total de bacterias en placa es un método útil para obtener una
idea del grado de frescura o pronta alteración de los alimentos, dependiendo de
la cantidad de bacterias presentes. La mayoría de los alimentos deben ser
considerados como inadecuados para el consumo cuando contienen un gran
número de microorganismos, aun cuando estos microorganismos no sean
conocidos como patógenos y no hayan alterado de forma apreciable los
caracteres organolépticos del alimento. (Thatcher y Clark, 1973)
La presencia de microorganismos aerobios mesófilos en los alimentos puede
ser relacionada directamente con la manipulación, el estado de frescura o de
descomposición del producto y la temperatura de conservación del producto. Un
número relativamente bajo de estas bacterias no es sinónimo de buena calidad
bacteriológica del alimento, ya que puede contener microorganismos que
producen enterotoxinas o son patógenos. (Venegas y col., 1990).
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Practica Nº4
La aplicación de este método se basa fundamentalmente en que, si el
recuento es efectuado luego de un profundo conocimiento de la manipulación
antes del muestreo (temperatura, empaque y otros), puede proporcionar una
medida comparativa del grado general de contaminación bacteriana e higiene
aplicada (FAO, 1998).
En el grupo de los mesófilos aerobios se incluyen todas las bacterias, mohos
y levaduras capaces de desarrollarse a 30º C en las condiciones establecidas.
En este recuento se estima la microflora total sin especificar tipos de
microorganismos.
Refleja la calidad sanitaria de un alimento, las condiciones de manipulación,
las condiciones higiénicas de la materia prima.
Un recuento bajo de aerobios mesófilos no implica o no asegura la ausencia
de patógenos o sus toxinas, de la misma manera un recuento elevado no
significa presencia de flora patógena. Ahora bien, salvo en alimentos obtenidos
por fermentación, no son recomendables recuentos elevados.
Un recuento elevado puede significar: Excesiva contaminación de la materia
prima. Deficiente manipulación durante el proceso de elaboración. La
posibilidad de que existan patógenos, pues estos son mesófilos. La inmediata
alteración del producto.
El recuento de mesófilos nos indica las condiciones de salubridad de
algunos alimentos.
II. Objetivos:
Conocer el número de microorganismos aerobios mesófilos que contiene un
alimento
Familiarizarse con métodos directos para la obtención de microorganismos
utilizando el método de recuento de colonias en placa.
Determinar si el producto alimenticio que se analiza está en condiciones
aptas para el consumo humano.
Determinar cuántos microorganismos presenta la muestra que analizamos.
III. Materiales:
Material Biológico – muestra líquida:
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Jugo de Soya.
Material de laboratorio:
Medio de cultivo: Agar Plate Count
Diluyente: Agua peptonada 0.1 %
Pipetas: (1ml y 10 ml).
Micropipeta.
11 Placas Petri.
Ansa calibrada
Mechero.
Balanza.
Estufa (29º - 31 ºC).
Tubo de dilución.
Espátula de Drigalsky
IV. Procedimiento:
a) Preparación de la muestra:
i) Si es muestra liquida se deberá guardar en refrigeración antes de el análisis correspondiente, para disminuir el metabolismos bacteriano. Y se deberá medir en mililitros.
ii) Si a muestra es solida o semisólida y está congelada, debemos esperar a que se descongele a medio ambiente.
iii) Si la muestra solida o semisólida se encuentra a Tº ambiente, se procederá con el análisis.
iv) Para diluir las muestras solidas es necesario licuarlas, tal es el caso de las verduras. Y luego se pesara.
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v) Las diluciones se deberán preparar de la siguiente manera:
Para muestras liquidas:
De la muestra madre sacar 3 ml y diluirlos en 27 ml de agua
Peptonada.
Luego pasar un 1 ml a cada tubo con 9 ml de agua Peptonada,
hacer progresivamente hasta llegar a la dilución 10-6.
b) Técnicas empleadas:
i) Método de placa vertida - Profundidad:
Primero se diluye la muestra a analizar.
Luego se saca con una pipeta 1 ml de todas las diluciones y se vierten en
dos placas por dilución.
Después de esto rápidamente agregamos el Agar Plate Caunt,
homogenizamos con 5 movimientos lentos de arriba hacia abajo y de
derecha – izquierda.
Para fines de la práctica solo trabajaremos con la dilución 10 -3. Por lo
que solo utilizaremos 6 placas.
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10-310-210-1
9 ml DAP 9 ml DAP
1mL 1mL3 ml de jugo de soya + 27 ml de Agua Peptonada al 0.1%
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1mL 1mL
B 10-
1A 10-
1
B 10-
2A 10-
2B 10-
3A 10-
3
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3 ml de jugo de soya + 27 ml de Agua Peptonada al 0.1%
Agregamos el Agar Plate Count, sobre el mililitro y homogenizamos
B 10-
1A 10-
1
B 10-
2A 10-
2B 10-
3A 10-
3
Procedimiento del método a Profundidad
Placas con Agar Plate Count, con las diluciones de 10-1 has 10 a la10-
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10-310-210-1
9 ml DAP 9 ml DAP
1mL 1mL3 ml de jugo de soya + 27 ml de Agua Peptonada al 0.1%
ii) Método de Superficie:
De la dilución 10-¹, sacamos 1 ml y hacemos las diluciones hasta 10-6.
Luego en una placa servida con Agar Plate Count, agregamos 1 ml sobre
la superficie.
Inmediatamente procedemos a expandir el mililitro sobre la superficie con
la espátula de Drigalsky.
Con fines de la practica solo se trabaja hasta la dilución 10-3 y con tan
solo 1 placa por dilución
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Se extiende el mililitro sobre la superficie de la placa con la espátula de Drigalsky A 10-
1
B 10-
2 C 10-
3
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Procedimiento del método a Profundidad
De la dilución 10-¹ sacamos 1 ml y lo pasamos al tubo siguiente
Del tubo con la dilución 10--2
sacamos 1 ml y lo pasamos al tubo siguiente
Hasta la dilución 10--3
Dilución 10--3
Agregamos 1ml de cada dilución a sus respectivas placas coma Agar plate
count.
Con la espátula de Drigalsky extendemos la
muestra sobre toda la superficie de la placa
A 10-
1
B 10-
2 C 10-
3
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iii) Método de Goteo:
Con una micropipeta sacamos 20 ul, y dejamos caer a manera de
gota sobre un lado de la placa con Agar Plate Caunt. Este
procesdimiento se realiza dos veces en la misma placa en lados
opuestos.
Para fines del curso solo otilizaremos las soluciones 10-2 y 10-3.
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V. Resultados:
MÉTODO
CONTEO x TIEMPO
24 H 48 H
TotalPromedi
oTotal Promedio
En Profundidad
10-1 A Incontable ------
Incontable ------
10-1 B Incontable Incontable
10-2 A Incontable ------
Incontable ------
10-2 B Incontable Incontable
10-3 A 154 138 146135
198 170 184189
10-3 B 140 105 123 220 165 193
Por Goteo
10-2 160 160 198 198
10-3 140 140 188 188
Por superficie
10-1 Incontable----------
Incontable----------
10-2 Incontable Incontable
10-3 111 118 115 143 150 147
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De los resultados obtenidos se interpretó de la siguiente. manera:
Para el método de conteo por profundidad:
Como se puede observar en el cuadro solo se pudo realizar el conteo
en la dilucion10-3, de las diluciones se sacó el promedio por horas y
cuadrantes.
En la dilución 10-3 se obtuvo (en promedio) a las 24 h. 135 colonias y
a las 48 h. 189 colonias.
Ufc/gr de
muestra
= Nº de
colonias
x Factor de
dilución
Ufc/gr de
muestra
= 189 x 103 = 19 x 104
ufc/gr
El recuento de bacterias aerobias mesófilas viables es igual de 19 x
104ufc/gr en la muestra liquida de jugo de soya.
Para el método de conteo por Goteo.
Se realizo el conteo en las dos diluciones 10-2 y 10-3, de los cuales se
obtuvo el promedio por horas.
En la dilución 10-2 se obtuvo (en promedio) a las 24 h. 160 colonias
y a las 48h. 198 colonias.
En la dilución 10-3 se obtuvo (en promedio) a las 24 h. 140 colonias y
a las 48 h. 188 colonias.
Para que los resultados de las diluciones estén bien la dilución menor
debe contener a la mayor en 2 veces, así que dividimos:
A las 24 h. A las 48 h.10-2 → 160
= 1.1510-2 → 198
= 1.0510-3 → 140 10-3 → 188
La solución más cercana a 2 es la de 24h, y se tomaría la dilución
más alta (10-2 ). Entonces el número de UfC/ ml de muestra es: 160 x
10-2 = 16 x 10-3. ufc/ml
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Por lo tanto el número de M.O aerobios mesófilos viables de jugo de
soya es: 16 x 10-3.ufc/ml.
Para el método de Superficie:
En este método se obtuvo que a las 24 horas se contaron un promedio de 115
colonias y a las 48 h un promedio de 147.
El promedio de ambos conteos es de 131. Entonces el numero de UFC/ml de
muestra es 13 x 10- 4. ufc/ml.
Por lo tanto el número de microorganismos aerobios mesófilos obtenidos por
este método equivale a 13 x 10- 4. ufc/ml de muestra de jugo de soya adquirida
en el Mercado Modelo de Chiclayo.
VI. Conclusiones:
VII. Cuestionario:
a. ¿Qué otras sustancias se utilizan como diluyentes para realizar los análisis
microbiológicos en alimentos?
Además del Agua de Peptona Tamponada (BPW), es muy
común el uso del Diluyente Agua de Triptona (Tryptone Water: TW)
y la Solución Tinger ¼, cuyas composiciones son las siguientes:
Tryptone Water Solución Tánger ¼ BPW
Triptona 10 g Cloruro sódico 9 g Peptona 10 g
Cloruro de
sodio
5 g Cloruro cálcico
anhidro
0.42 g Cloruro sódico 5 g
Agua destilada 1 000 mL Hidrógeno
carbonato sódico
0.20 g Fosfato sódico 9 g
Agua destilada 1 000 mL Fosfato potásico 1.5 g
Agua destilada 1 00
0
m
L
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También se podría usar el Solución Salina Fisiológica (SSF) como
diluyente, esta solo contiene 0.900 g de cloruro de sodio para 100 mL de
agua destilada.
b. ¿Por cuánto tiempo y a cuántas revoluciones por minuto se debe tratar una
muestra sólida para ser homogenizada?
Para tratar una muestra sólida hay que licuarla o triturarla en
un vaso esterilizado de licuadora a una velocidad aproximada de
14.000 rpm y en un tiempo medio de 60-90 segundos.
c. ¿Cuáles son las ventajas y desventajas de los tres métodos usados?
Ventajas:
Se obtienen resultados rápidos de un día para otro.
Hace un recuento “total” que incluye todas las bacterias, mohos y
levaduras capaces de desarrollarse a 30 ºC en las condiciones
establecidas, además refleja la calidad sanitaria de un alimento,
las condiciones de manipulación y las condiciones higiénicas de
la materia prima.
Se puede aplicar para productos sólidos como carnes, verduras,
mariscos.
Desventajas
solo son susceptibles del contaje aquellos microorganismos
capaces de crecer en las condiciones establecidas, además se
estima la microflora total sin especificar los tipos de
microorganismos y por último, si tener un recuento bajo de
aerobios mesófilos eso no nos asegura la ausencia de patógenos
o sus toxinas; de la misma manera que un recuento elevado no
significa presencia de flora patógena.
No diferencia microorganismos patógenos de la flora común.
El procedimiento está sujeto a error.
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