Determinación de de la constante de Acidez del

2,6-Diclorofenol Indofenol, por electroforesis

capilar, voltamperometría cíclica y

espectrofotometría UV/Vis

INFORME DE PROYECTO TERMINAL

ALUMNO: RUSLÁN ÁLVAREZ DIDUK

LICENCIATURA EN QUÍMICA

MATRÍCULA: 203213175

ASESORA: DRA. MARÍA TERESA RAMÍREZ SILVA

Agradecimientos

Quiero agradecer a mi asesora y mejor amiga María Teresa Ramírez Silva por haberme motivado a la investigación y a la culminación de mi carrera, por hacer de mi una mejor persona cada día, por toda la paciencia que ha tenido conmigo, por los consejos. Por estar siempre cuando la necesito, por esos momentos batallando a última hora para obtener resultados, por ser una madre para mi, en fin, “Por salvarme la vida”. A mi padre Raúl Álvarez que aunque el no lo crea siempre me ha inspirado para lograr mis metas, me ha apoyado toda la vida y lo sigue haciendo, porque nunca se equivoca cuando me da un consejo, ha sido toda la vida el ejemplo a seguir … porque es el mejor padre del mundo. A mi madre Natalia Diduk que aunque esté lejos siempre procuró lo mejor para mi, que hizo que caer en la mediocridad no fuera una opción para su hijo, era un 10 o no era nada. A Annia Galano otra mamá que tengo que me soporta todas mis malcriadeces y tonterías, por las horas estudiando matemáticas, por estar siempre ahí para ayudarme académicamente o darme un consejo para la vida. A Montserrat Origel por ser esa persona especial que hizo que mi vida diera un giro de 180 grados. Porque hizo que me convirtiera en parte de lo que soy ahora, porque compartió conmigo muchos de los mejores momentos de mi vida, por ser esa mujer incondicional que da todo sin esperar nada a cambio, porque me conoce y me entiende, por esa hermosa sonrisa que me inspira, por amarme… A todos ustedes, no se si algún día pueda compensar todo lo que han hecho por mi, solo digo gracias por estar en mi vida ya sea porque le tocaba como mamá y papá o porque nos encontramos en algún momento del camino y lo más importante porque seguimos juntos compartiendo esto maravilloso que es la vida. Y a todas las personas que de alguna manera u otra compartieron conmigo a lo largo de la carrera momentos buenos, malos opiniones, consejos, fiestas, etc. A la Universidad Autónoma Metropolitana Unidad Iztapalapa, al área de Química Analítica, que me dio la bienvenida como uno más de los suyos desde el primer día

A México porque cambió enteramente mi vida y me acogió con los brazos abiertos y me dio la oportunidad de vivir en este hermoso país. Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por el apoyo financiero otorgado a través del proyecto 82932

Determinación de de la constante de Acidez del 2,6-Diclorofenol Indofenol, por

electroforesis capilar, voltamperometría cíclica y espectrofotometría UV/Vis y análisis

de la cinética de descomposición de la molécula.

Resumen

Se realiza la determinación de constantes de acidez de 2,6-Diclorofenol Indofenol por tres

métodos diferentes, obteniendo información relacionada con la estabilidad de la molécula

por diferentes métodos como son HPLC, electroforesis capilar y Resonancia Magnética

Nuclear.

Introducción

Desde 1937 el 2,6-Diclorofenol Indofenol (DCPI) ha sido utilizado para la determinación

de ácido ascórbico [1] . La importancia de este reactivo se ha ido incrementando a la fecha

ya que se han encontrado diversas aplicaciones para la determinación de antioxidantes en

vino[2], especies reducidas en cerveza [3] y determinaciones de diferentes especies

biológicas entre las cuales se encuentra el NADH (nicotinamida adenin dinucleótido) [4].

Diversos autores han calculado el valor de la constante de acidez, por diferentes métodos,

Narayanaswamy y col. [5] consideran que la determinación depende de si la especie

química está inmovilizada o está en solución. Estos autores encontraron que inmovilizada

el valor de pKa es 7.01 y en solución de 5.7. Por otra parte, Florou y col. [6] presentan una

constante de 5.2 para la DCPI (ox) inmovilizada. En resumen, existen valores de pKa

reportados hasta con una unidad de diferencia. Debido a esta discrepancia y a la

importancia de las aplicaciones de esta especie química, en este trabajo se calcula la

constante de acidez de la molécula, por diferentes métodos y se analiza el comportamiento

químico de la DPCI en medio ácido.

Condiciones Experimentales

Preparación de muestras.

El 2,6-diclorofenol indofenol se preparó a partir del reactivo analítico Fluka. El NaCl,

NaOH y HCl fueron grado analítico marca Merck, se preparó el amortiguador Britton

Robinson (acetatos, boratos y fosfatos) para fijar los diferentes valores de pH, en todos los

casos se utilizó agua desionizada tipo 1(18.2 MΩ) libre de materia orgánica, obtenida de

US Filter Pure-LAB-PLUS UV.

Equipos.

Para el estudio electroquímico se utilizó un potenciostato galvanostato Autolab

(PGSTAT12), con un electrodo de trabajo de pasta de carbón, (EPC), un contraelectrodo de

platino y un electrodo de referencia de Ag/AgCl.

Para el estudio espectrofotométrico se utilizó el UV/vis Lambda 20 Perkin Elmer se

utilizaron celdas de cuarzo con una longitud de paso óptico de un centímetro.

Para la obtención de los cromatogramas se utiliza un Cromatógrafo de líquidos de alta

resolución Spectra System SCM 1000 Thermo Separation Products con un detector de

arreglo de diodos con una columna Phenomenex, 100 x 4.60 mm, 3µm ODS (3), la fase

móvil fue 80% Metanol grado HPLC Fluka y 20 % de agua desionizada, Para medir el pH

se utilizó un Potenciómetro Mettler Toledo MPC227 y un electrodo de vidrio combinado

Mettler Toledo Para el estudio de electroforesis capilar se preparó una solución 0.001 M de

DCPI. Se utilizó buffer de fosfatos, 50 mM, para cubrir todo el intervalo posible de valores

de pH, desde2 hasta 11, aproximadamente. La técnica utilizada fue CZE (electroforesis

capilar de zona), los experimentos se realizaron a 25ºC en un equipo P/ACE MDQ de

Beckman con detector de arreglo de diodos. La inyección de la muestra se hizo de forma

hidrodinámica a 1.0 psi/10 segundos, para cada valor de pH se hicieron dos repeticiones; se

aplicó un voltaje de 20 kV, con polaridad invertida para valores pH< 4. Se utilizó acetona

como marcador del flujo electroosmótico. El capilar usado tiene 50 µm de diámetro interno

con una longitud total de 50.2 cm y una longitud efectiva de 40 cm.

Resultados y Discusión

En la figura 1 se muestra la estructura del 2,6-diclorofenol indofenol, como puede

observarse tiene un grupo OH, que podría asociarse a un protón ácido, también el N que

está unido a los dos anillos puede protonarse y presentar una constante de acidez, A partir

de estas consideraciones se realizan estudios del comportamiento espectrofotométrico de la

molécula a diferentes valores de pH para determinar las constantes de acidez asociadas a

ésta.

Figura 1.Estructura del 2,6-Diclorofenol Indofenol

Espectrofotometría

En la figura 2 se muestra la familia de espectros de absorción obtenidos de una solución de

DCPI 4.45 x 10-5M en un intervalo de pH de 1.5 a 11.7, los espectros obtenidos presentan

los máximos de absorción en las siguientes longitudes de onda 600, 520, 310 y 270 nm,

como se puede observar en la figura a valores de pH ácido se encuentra el máximo en 510

nm y se observa una coloración roja, al incrementar el valor de pH desaparece esta banda

dando lugar a otra a 602 nm y un cambio de coloración de la solución a azul.

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

240 340 440 540 640 740

A

λλλλ/nm

11.7

1.5

pH

Figura 2. Espectros de absorción de una solución de DCPI 4.45 x10-5M a diferentes

valores de pH.

Con la finalidad de observar el intervalo de pH en cual se encuentra la constante de

acidez de la DCPI en la solución se sigue el cambio de absorbancia en función del pH para

la λ de 602 nm asociado al color azul que presenta la molécula cuando se encuentra a

valores de pH básico, en la figura 3 se puede observar que le punto de inflexión se

encuentra en un pH de 577 y al realizar el cálculo de la Absorbancia total a 602nm se otiene

un buen ajuste de los valores de absorbancia para cada uno de los pH este comportamiento

muestra que a estas condiciones solamente se tendría un valor de pKa asociado a la DCPI.

0

0.2

0.4

0.6

0.8

0 2 4 6 8 10 12 14

602

Ajuste pKa 5.77

A

pH

Figura 3. El cambio de absorbancia en función del pH a una longitud de onda de 602nm

Para realizar el cálculo de la constante con mayor precisión se alimentan al

programa computacional SQUAD las absorbancias obtenidas a los diferentes valores de pH

para varias longitudes de onda. El valor que se obtiene con este programa es de

5.7579±0.0019.

Con los datos obtenidos por el programa se SQUAD se obtiene el diagrama de

distribución de especies químicas de la DCPI mostrado en la figura 4

0

0.5

1

0 5 10

fra

cció

n

pH

HDPCI DPCI

Figura 4. Diagrama de distribución de especies química de DPCI

En la figura 5 se presentan los coeficientes de absortividad molar de las especies

químicas HDCPI y DCPI a las diferentes longitudes de onda de trabajo, con los errores

asociados a cada uno de ellos, como puede observarse los errores son menores al 1%, con

estos valores, así como las fracciones de especies a cada valor de pH y las concentraciones

de trabajo se pueden reproducir los espectros de absorción a diferentes valores de pH y

compararlos con los obtenidos experimentalmente en la figura 6 se observa que los

espectros simulados reproducen perfectamente los resultados experimentales. Por lo que

consideramos con esta información que solo se puede obtener un valor de pKa.

0.00E+00

2.00E+03

4.00E+03

6.00E+03

8.00E+03

1.00E+04

1.20E+04

1.40E+04

1.60E+04

1.80E+04

2.00E+04

250 350 450 550 650 750

HDCPI

DCPI

ε/cm

-1M

-1

λ/nm

Figura 5. Coeficientes de absortividad dados por SQUAD para las especies químicas de

DCPI

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

250 350 450 550 650 750

2.01

5.69

6.24

6.62

10.37

2.01

5.69

6.24

6.62

10.37Ab

sorb

anc

ia

λ/nm

pH

Figura 6. Espectros de absorción simulados (línea continua) y experimentales

(marcadores) a diferentes valores de pH

Para validar el valor obtenido de pKa se realiza la determinación con otros

métodos.

Estudio Electroquímico

En la figura 7 se muestra el comportamiento electroquímico del DCPI a una concentración

de 4.14 x 10-5M . El estudio se inició en el potencial de corriente nula obtenido para cada

valor de pH y se inicia el barrido de potencial hacia valores de potenciales más negativos,

después se invierte el potencial de barrido y se puede observar que los voltamperogramas

obtenidos para la DCPI en todos los casos presenta un pico de reducción, y al invertir el

barrido de potencial un pico de oxidación, y conforme el valor de pH es más ácido ambos

potenciales se desplazan hacia valores positivos, además de que la diferencia de potencial

entre los picos se hace menor. A valores de pH básicos se puede observar en la oxidación la

presencia de un hombro después del pico de oxidación que podría estar asociado con la

adsorción de la molécula en la superficie del electrodo, en el caso de los valores de pH

ácido se puede observar en algunos casos otros picos de reducción. Considerando lo

anterior se decidió realizar un gráfico del cambio del potencial del pico de reducción en

función del pH para observar solo la reducción de la DCPI.

-7.50E-06

-5.50E-06

-3.50E-06

-1.50E-06

5.00E-07

2.50E-06

4.50E-06

6.50E-06

-150 -50 50 150 250 350 450

I/A

E/mV

1.5271.7832.2012.4392.633.1473.5313.7613.9854.2984.6494.9945.2555.465.6925.9386.246.4476.827.0487.2917.6697.961

pH

Figura 7. Voltamperogramas cíclicos del DCPI 4.14 x 10-5 M a diferentes valores de pH

en NaCl =0.1M

A partir de los potenciales del pico de reducción se traza la gráfica de Epc=f(pH) donde se

aprecian los cambios asociados a los valores de pKa de la molécula (figura 8), a diferencia

de los métodos anteriores, aquí se observan dos cambios de pendiente asociados a la DCPI

oxidada, el que se ve en 5.8 se asocia a la constante de acidez y el otro cambio a pH más

ácido con los resultados presentados hasta este momento no puede ser asignado a algún

proceso fisicoquímico. Además se presenta otro cambio de pendiente en un valor de pH de

4.5 que podría asociarse a un proceso químico de la DCPI reducida.

-400

-200

0

200

400

0 5 10 15

pH

E/m

V

Figura 8. Potencial del pico de reducción del DCPI en función del pH

Los resultados obtenidos por esta técnica confirman el valor de constante de acidez

en 5.8 aproximadamente, pero da información adicional sobre la especie reducida, la cual

puede presentar también un valor de constante de equilibrio probablemente de acidez a un

valor de 4.5, el cambio de pendiente en el valor de pH 3, puede ser asociado a la

protonación del grupo N de la molécula, sin embargo, pueden ocurrir otros fenómenos que

den este cambio de pendiente ya que se observa un cambio de coloración que indica una

pérdida de la especie ácida, este comportamiento químico no se estudia en este trabajo.

Para analizar las cargas que tienen las especies químicas que se tienen a los

diferentes valores de pH se realiza un estudio por electroforesis capilar de zona.

Electroforesis Capilar

Se utiliza la técnica CZE, con acetona como marcador del flujo electroosmótico. En la

figura 9 se muestra un electroferograma obtenido a pH 6.94, con la señal de la DPCI y la

acetona. Realizando los ajustes estadísticos de las curvas de movilidad electroforética como

función de pH (figura 10) y con ayuda del programa SQUAD, a temperatura de 25oC y

fuerza iónica de 0.05M, se obtuvo pKa1 = 5.819 ± 0.022. Aquí se observa que cuando la

especie predominante es el anión, a valores altos de pH, la movilidad es prácticamente

constante. Cuando se acerca el pH al primer valor de pKa, esta empieza a cambiar debido a

que ya no predomina una sola especie sino que se tiene un promedio entre ambas que afecta

la movilidad efectiva hasta hacerse prácticamente constante a un valor de 0 lo que nos

indica que la especie que se tiene a valores de pH menor a 5.8 es una especie neutra, lo que

confirma que la desprotonación se lleva a cabo en el grupo OH y dando una especie

aniónica y que a el grupo N no se encuentra protonado

Figura 9. Electroferograma obtenido de una solución de DCPI 1 x 10-3M a pH 6.94,

utilizando acetona como marcador del flujo electrosmótico

-2.50E-08

-2.00E-08

-1.50E-08

-1.00E-08

-5.00E-09

0.00E+00

2.00 4.00 6.00 8.00 10.00

pH

u eff (m

2/V

s)

Ueff(exp) Ueff(sim)

Figura 10. Movilidad efectiva (ueff) como función del pH

CONCLUSIONES

Con los resultados anteriores se puede concluir que el pKa del DCPI es 5.7579±0.0019, fue

calculado por tres métodos diferentes dando resultados similares.

Referencias

1. M. H . Menaker, N. B. Guerrant, Ind. Eng. Chem. Anal. 10 (1938) 25.

2. X. Durliat, M. Comtat; Anal. Chim. Acta 545 (2005) 173

3. R.M. Sobiech, R. Neumann, D. Wabner, Electroanalysis 10 (1998) 969

4. A. B. Florou, M. I. Prodromidis, M. I. Karayannis, S. M. Tzouwara-Karayanni,

Electroanalysis 10 (1998) 1261.

5. R. Narayanaswamy, F. Sevilla III, Anal. Chim. Acta 189 (1986) 365.

6. A. B. Florou, M. I. Prodromidis, M. I. Karayannis, S. M. Tzouwara-Karayanni,

Electroanalysis 12 (2000) 361.