Determinacion de Enfermedad Minima Residual en leucemia

7/24/2019 Determinacion de Enfermedad Minima Residual en leucemia

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Determinacin de Enfermedad MnimaResidual en Leucemias Agudas.

ARTICLE DECEMBER 2012

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Patricia Rubio

Paediatric Hospital Dr. Juan P. Garrahan

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Cristina Noemi Alonso



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Maria S Felice



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Jorge G Rossi



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Enfermedad mnima residual en leucemias 287

ACTUALIZACIONES

DETERMINACION DE ENFERMEDAD MINIMA RESIDUAL

EN LEUCEMIAS AGUDAS

Dres. E. Sajaroff, P. Rubio, A. Medina, M. Sanz, C. Alonso, A. Bernasconi, P. Zubizarreta,

M. S. Felice, J. Rossi

INTRODUCCION

Segn lo reportado en el Registro Oncopedi-

trico Hospitalario Argentino (ROHA) las leucemias

agudas representan el 37% de las enfermedades

neoplsicas peditricas1. En la actualidad, en Euro-

pa y Estados Unidos, aproximadamente el 80% de

los nios con leucemia linfoblstica aguda (LLA) lo-gran curarse con la administracin de un tratamien-

to adecuado. En nuestro Hospital, la probabilidad

de sobrevida libre de eventos (pSLE) alcanzada en

el ltimo estudio se encuentra en valores similares.

La remisin completa (RC) se define como la

presencia de menos de 5% de blastos o clulas

leucmicas a la observacin morfolgica por mi-

croscopa ptica, sin otra evidencia de compromiso

por la enfermedad. El 97% de los pacientes con

LLA alcanzan la RC luego de la fase de induccin.

Sin embargo, en aproximadamente un 20% de los

casos, el tratamiento fracasa. La principal causa de

fracaso del tratamiento es la recada de la enferme-dad, que se define como la reaparicin de la misma

luego de alcanzada la RC y que ocurre debido a la

persistencia y expansin de mnimas cantidades

de clulas leucmicas residuales, indetectables

por observacin en la microscopa ptica, conoci-

das como enfermedad mnima residual (EMR). La

importancia clnica de la cuantificacin de la EMR

ha sido ampliamente documentada en la literatura

cientfica internacional demostrando una correlacin

significativa entre la persistencia de EMR y el riesgo

de recada2,3,4.

Los protocolos basados en la estrategia del gru-

po BFM (Berln-Frankfurt-Mnster), que se aplican

en nuestro medio, estratifican las LLA peditricas

al momento del diagnstico de la enfermedad y

de acuerdo a la respuesta que presentan al trata-miento, en tres grupos de riesgo: estndar, inter-

medio y alto. Estos grupos de riesgo se determi-

nan de acuerdo a la probabilidad de presentar una

recada o reaparicin de la enfermedad y se basan

en factores biolgicos como la edad del pacien-

te, recuento de leucocitos en sangre perifrica y

la presencia de ciertas alteraciones citogenticas

y/o moleculares de los blastos. Tambin se basan

en la respuesta temprana al tratamiento conside-

rando el recuento absoluto de clulas leucmicas

en sangre perifrica en el da 8 de la terapia por

observacin morfolgica, lo que se conoce como

respuesta a la prednisona. En la dcada del 90,distintos centros comenzaron a evaluar la respuesta

al tratamiento con mtodos de mayor sensibilidad

y especificidad estudiando la EMR por tcnicas de

biologa molecular. Estos estudios revelaron que la

presencia de niveles mnimos de clulas leucmicas

remanentes en etapas especficas del tratamien-

to provee informacin pronstica muy importante.

En 1998 los grupos AIEOP (Asociacin Italiana de

Hemato-oncologa Peditrica) y BFM desarrollaron

un protocolo de tratamiento de LLA peditrica en

el cual definieron los grupos de riesgo teniendo en

cuenta la respuesta a la prednisona y los nivelesServicios de Inmunologa y Reumatologa, Hematologa yOncologa. Hospital de Pediatra Juan P. Garrahan

http://www.medicinainfantil.org.ar


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288 Medicina Infantil Vol. XIX N 4 Diciembre 2012

de EMR (determinada por biologa molecular) en la

semana 5 y 12 del tratamiento (final de la fase de

induccin y previamente a la fase de consolidacin

respectivamente).

El grupo de tratamiento para LLA, ALLIC (Acute

Lymphoblastic Leukemia Intercontinental), dise el

protocolo ALLIC-02 basndose en la estrategia delgrupo BFM (Ver Figura 1).

Este protocolo defina que los pacientes que

presentaban una mala respuesta a la prednisona

(>1000 blastos/l en sangre perifrica) y/o alteracio-

nes genticas de mal pronstico como las t(9;22)/

BCR-ABL1 t(4;11)/MLL-AFF1, eran asignados al

grupo de riesgo alto (RA). Los pacientes que no

presentaban ninguna de estas caractersticas eran

asignados a los grupos de riesgo estndar (RE) o in-

termedio (RI) en base a la edad y al recuento inicial

de leucocitos: entre 1 y 5 aos de edad y con un

recuento de leucocitos


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- Discriminar entre clulas hematopoyticas nor-

males y patolgicas.

- Tener una sensibilidad de al menos 10-3, es de-

cir la sensibilidad suficiente para diferenciar al

menos una clula leucmica entre 1000 norma-

les, inclusive preferentemente de 10-4 a 10-6.

- Los marcadores especficos de la clula leuc-mica, tanto moleculares como inmunofenotpi-

cos en los que se base la tcnica deben ser es-

tables, con el objetivo de evitar falsos negativos

en caso que los mismos se modifiquen durante

el transcurso de la enfermedad.

- Permitir la cuantificacin de la EMR.

- Poseer alta reproducibilidad intra e interlabora-

torio.

- Ser de fcil estandarizacin.

- Obtener el resultado en un lapso adecuado se-

gn la necesidad clnica.

La determinacin de EMR para LLA en nuestro

hospital se realiza actualmente por citometra deflujo y por biologa molecular por PCR cuantitativa

para Ig/TCR y BCR-ABL1.

1. EMR por citometra de flujo (CF)

Esta metodologa se basa en el uso de anti-

cuerpos monoclonales que reconocen y se unen

especficamente a protenas o antgenos expresa-

dos en clulas que se encuentren en suspensin.

Los anticuerpos estn conjugados a fluorocromos,

molculas que al ser excitadas por el lser del ci-

tmetro emiten en una longitud de onda propia del

mismo que es detectada por el sistema ptico del

citmetro. Segn el diseo, el instrumento puede

detectar simultneamente distinto nmero de fluo-

rocromos (o colores como se denominan habitual-

mente) por clula.

El anlisis de EMR con equipos de cuatro o ms

colores brinda informacin precisa y sensible para

la determinacin de EMR y permite un uso eficien-

te de las clulas al reducir el nmero de tubos a

procesar por paciente7.

El citmetro brinda tambin informacin sobre

tamao y granularidad celular, y permite diferenciar

las distintas poblaciones leucocitarias as como dis-

criminar entre clulas viables y restos celulares o

debris. Es decir, en un instrumento de cuatro colo-

res se analizan seis parmetros: tamao, granulari-

dad, y la potencial expresin de cuatro marcadores

(antgenos de superficie o citoplasmticos).

El anlisis de toda la informacin multiparam-

trica registrada por el citmetro para cientos, miles

o millones de clulas, da como resultado la carac-

terizacin de la expresin antignica de una deter-

minada poblacin celular y es lo que se conoce con

el nombre de inmunofenotipo de dicha poblacin.

El uso de la CF para la deteccin y cuantifica-

cin de clulas leucmicas se basa en que las mis-

mas suelen expresar un inmunofenotipo aberrante

o diferente al de los precursores hematopoyticos

normales (inmunofenotipo asociado a leucemia).

Para su correcta identificacin es de suma impor-

tancia la correcta eleccin y combinacin de los

anticuerpos monoclonales a utilizar.

En la Tabla 1 se indica el panel de anticuerpos

monoclonales definidos para la determinacin deEMR en el protocolo ALLIC-2009.

Segn las especificaciones del protocolo, deben

analizarse al menos 300.000 clulas nucleadas por

tubo y la poblacin identificada como EMR debe

contener al menos 30 clulas o eventos, de manera

de alcanzar una sensibilidad de 10-4 (una clula

patolgica en 10.000 normales). Otro requisito es

que en la muestra analizada se detecten al me-

nos 2% de eritroblastos, ya que la presencia de

un porcentaje menor sugiere la contaminacin de

la mdula sea con sangre perifrica (hemodilucin

de los blastos).

Aproximadamente en el 95% de las LLA los

blastos presentan por lo menos una alteracin feno-

tpica con respecto a las clulas normales (fenotipo

aberrante), por ejemplo la expresin de antgenos

de otro linaje, asincronismo madurativo, sub o so-

breexpresin antignica o ausencia de expresin

de un marcador dado.

La sensibilidad de la CF se basa fundamental-

mente en dos variables: en primer lugar el grado de

diferencia fenotpica y morfolgica entre los blastos

y los precursores hematopoyticos normales y en

segundo lugar en el nmero de clulas analizadas2,7.

En la Figura 2 podemos observar el patrn de

expresin antignica en las clulas B CD19+ en

mdula sea normal. En condiciones normales la

mdula sea est poblada de precursores linfoi-

TABLA 1: PANEL DE ANTICUERPOS A UTILIZAR PARA LA

DETECCION DE EMR SEGUN ALLIC-09.

LLA-T FITC PE PerCP-PerCPcy5.5 APC

TUBO 1 SYTO CD7 CD45 CD3

TUBO 2 CD99 CD7 CD5 CD3

TUBO 3 TdT CD7 CD3citoplasmtico CD3

TUBO 4** CD4 CD8 CD45 CD3

LLA-B FITC PE PerCP-PerCPcy5.5 APC

TUBO 1 SYTO CD10 CD45 CD19



TUBO 4* CD20+CD10 CD38 CD45 CD19

-



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des y mieloides en distintos estados madurativos,

cada uno caracterizado por un nivel de expresin

antignica constante que se refleja en la intensidad

de fluorescencia. En conjunto se define un perfil

madurativo normal de expresin antignica. Los

grficos de la Figura 2 A-B-C reflejan el inmunofe-

notipo normal de precursores hematopoyticosde linaje B, y los de la Figura 2 D-E-F y 2 G-H-I

corresponden al de los blastos B CD19+ de dos

pacientes con LLA-B.

Para detectar alteraciones fenotpicas es funda-

mental conocer el perfil de expresin antignica en

clulas hematopoyticas normales8, as como el in-

munofenotipo de precursores normales de mdulas

en regeneracin. Dado que en condiciones norma-

les los precursores linfoides T slo se encuentran

en timo, en el caso de las LLA precursor T (LLA-T),

el hallazgo de clulas con inmunofenotipo T inma-

duro en mdula sea o en sangre perifrica permite

definir estas clulas como blastos9. Considerando

que los precursores linfoides B normales en dis-

tintos estados de maduracin o hematogonias se

encuentran en la MO, el hallazgo de clulas con in-

munofenotipo B inmaduro no indica necesariamente

la presencia de EMR, por lo tanto, es fundamentalidentificar rasgos aberrantes en el inmunofenotipo

para poder definirlas con certeza como blastos9.

Es importante tener presente que, de acuerdo a lo

descripto por Campana y colaboradores, las he-

matogonias son extremadamente sensibles a los

corticoides y otras drogas utilizadas en la fase de

induccin del tratamiento. Por ello, el mero hallazgo

de clulas B inmaduras (CD19+CD10+ y/ CD34+)

en mdula sea de pacientes con LLA-B en el da

15 del tratamiento permitira identificarlas como

blastos10.

Figura 2: Perfil madurativo normal de clulas hematopoyticas en mdula sea. Comparacin con el inmunofenotipo de clulaspatolgicas en leucemia linfoblstica aguda precursor B.

Inmunofenotipo de clulas B de mdula sea (CD19+): Grficos A, B y C corresponden a precursores hematopoyticos normales.

Las flechas indican el camino normal de maduracin. Grficos D-I corresponden a clulas leucmicas de linaje linfoide B (marcadas

en negro) que se identifican por su fenotipo aberrante y se observan linfocitos B normales (marcados en gris).



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Gaipa y colaboradores demostraron que durante

las fases tempranas de los protocolos de trata-

miento del BFM se produce una modulacin en la

expresin antignica de los blastos. Sin embargo,

los autores destacan que siguiendo las pautas de

anlisis adecuadas la precisin para la deteccin

de EMR no se ve afectada11.

Ventajas de la CF

- Permite la cuantificacin directa de las clulas

leucmicas sobre el total de clulas nucleadas

viables, a travs del uso de colorantes que

se unen especficamente al ADN ntegro (por

ejemplo syto-16). De esta manera se restringe

la evaluacin al total de clulas nucleadas (ex-

cluyndose los eritrocitos y clulas en etapas

tardas de apoptosis). Adicionalmente, en base

al tamao y granularidad celular se pueden ex-

cluir del anlisis las clulas no viables y debris.

La importancia de esta diferenciacin radica enque las clulas irreversiblemente daadas por

la quimioterapia no proliferan, por lo tanto no

implican un riesgo potencial de recada, si bien

generan seal tanto en CF como en tcnicas ba-

sadas en biologa molecular. El uso del colorante

syto-16 tambin permite calcular el porcentaje

de eritroblastos, que aparecen como syto-16 (+)

y CD45 (-).

- Permite la evaluacin de la celularidad global de

la MO.

- En ms del 95% de las LLA el inmunofenotipo

aberrante de los blastos permite la deteccin de

EMR por CF con una sensibilidad de 10-4.

- Los resultados se obtienen en 24-48 hs de ex-

trada la muestra.

- Es un mtodo ms econmico y de mayor dis-

ponibilidad que la biologa molecular.

- Es un mtodo sensible, estandarizable y repro-

ducible.

Desventajas de la CF

- Frecuentemente las leucemias agudas pueden

presentar cambios en el inmunofenotipo durante

el transcurso de la enfermedad11. Por esta razn,

el anlisis debe basarse en varios marcadores

inmunofenotpicos aberrantes para evitar un

resultado falsamente negativo.

- Su sensibilidad es limitada con respecto a la

biologa molecular, aunque es suficiente para la

determinacin de EMR, especialmente en etapas

tempranas del tratamiento.

2. EMR por biologa molecular (BM)

Durante la ontogenia o desarrollo normal del li-

naje linfoide B (en mdula sea) y T (en el timo), se

producen cambios especficos en la estructura de

diversos genes. El primer cambio es la recombina-

cin somtica de fragmentos de los genes variables

(V), de diversidad (D) y de unin (J) de las inmuno-

globulinas (Ig) del receptor B y de las cadenas del

receptor T (TCR). En este proceso cada linfocito

adquiere una combinacin nica y especfica de

genes V-(D)-J la cual codifica para la zona variable

de las Ig o del TCR.

La disponibilidad de mltiples segmentos g-nicos V, (D) y J para cada una de las cadenas de

los receptores, junto con la delecin e insercin

aleatoria de nucletidos en los sitios de recombina-

cin, tienen como consecuencia una diversidad casi

ilimitada de posibles combinaciones entre ellos,

originando secuencias nucleotdicas nicas para

cada clon leucmico.

Ambos procesos determinan que dichas zonas

de unin sean secuencias tipo huella dactilar o

secuencias especficas de cada linfocito y por lo

tanto en el caso de las LLA, especficas de los

blastos de cada paciente.

Por otro lado, en las LLA tambin ocurren ciertastranslocaciones o aberraciones cromosmicas. Una

translocacin se produce cuando dos fragmentos

gnicos que normalmente se encuentran en dis-

tintos cromosomas se fusionan, dando lugar a un

gen quimera, constituido por dos fragmentos, uno

proveniente de cada cromosoma. En caso de que

este gen sea codificante, se genera un producto

de fusin (tanto a nivel del ARN mensajero como

proteico) que no est presente en las clulas nor-

males. Como parte del proceso leucemognico,

tambin pueden ocurrir inversiones entre fragmen-

tos gnicos de un mismo cromosoma o deleciones

intracromosmicas que resultan en la fusin de ge-

nes que en condiciones normales se encuentran

alejados. Un ejemplo claro de este tipo de blanco

para LLA es la deteccin de BCR-ABL1. Estos pro-

ductos de fusin pueden ser usados para detectar

y cuantificar las clulas leucmicas por PCR ya que

los mismos no se encuentran generalmente en las

clulas normales. A diferencia de la deteccin y

cuantificacin de los rearreglos de genes de las Ig

o del TCR que son marcadores o targets (blancos)

especficos de paciente, los productos de fusin

son targets especficos de leucemia6.

Por lo tanto, distintos blancos de PCR pueden

ser utilizados para la determinacin de EMR en

LLA. Los tres principales son los rearreglos de los

genes de Ig/TCR, los transcriptos de fusin y/o las

regiones de ruptura y fusin gnicas y finalmente

los genes aberrantes o aberrantemente expresados.

En la Tabla 2 se encuentran resumidas las ventajas

y desventajas del uso de los distintos blancos para

la deteccin de EMR por BM. Esta determinacin se

realiza en clulas mononucleares de mdula sea al

final de las fases de induccin y de consolidacin

del tratamiento.

La deteccin de los sitios de fusin a nivel ge-

nmico es factible pero requiere de tcnicas muy



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laboriosas. Por esta razn, la EMR que detecta

productos de fusin utiliza como blanco los trans-

criptos de fusin y cuantifica el ARN mensajero de

los mismos luego de transformarlo a ADN copia

por medio de la reaccin de transcripcin reversa.

En cuanto a los genes aberrantes o aberrante-

mente expresados, algunos ejemplos claros seran

la cuantificacin de FLT3-ITD (duplicaciones inter-

nas en tndem de la regin de yuxtamenbrana del

receptor FLT3), de la sobreexpresin del gen WT1

(gen del tumor de Wilms), o de la expresin del gen

HOX11L2 en LLA-T12.

Deteccin de rearreglos de los genes

de las Ig/TCR

La identificacin de los rearreglos gnicos de Ig/

TCR ha sido estandarizada por grupos europeos en

estudios colaborativos BIOMED-1 y BIOMED-23,5,

en los cuales se establecieron los primers o inicia-

dores y las condiciones de PCR ptimas para su

deteccin.

Del mismo modo, el grupo de estudio europeo

para la deteccin de EMR en LLA (ESG-MRD-ALL)

ha organizado programas de control de calidad y

ha desarrollado guas para la interpretacin de los

resultados de EMR mediante PCR en tiempo real.

Estas guas contienen consideraciones de aplica-

cin prctica como la puesta a punto de la tcnica,

la definicin de rango cuantitativo y sensibilidad,

la definicin de EMR positiva y EMR negativa y la

cuantificacin del nivel de EMR en las muestras de

seguimiento. La aplicacin de estas guas permite

que los resultados de EMR puedan ser comparables

entre distintos laboratorios13.

Ventajas de la BM

- La sensibilidad es de una clula leucmica entre

10.000 a 100.000 clulas normales (10-4 a 10-

5) y depende del tamao y complejidad de la

regin de unin y del tipo de rearreglo.

- La deteccin de EMR en LLA mediante rearre-

glos de Ig/TCR es aplicable en aproximadamen-

te el 95 % de los casos, mientras que la cuan-

tificacin de los transcriptos de fusin lo es en

el 40-50 % de los pacientes12.

- En los casos en que se utiliza ADN como blan-

co, el hecho que exista una copia del rearreglo

estudiado por clula refleja fielmente el nmero

de clulas patolgicas en la muestra.

- Es un mtodo sensible, estandarizable y repro-

ducible.

Desventajas de la BM

- Debido a que estos genes pueden sufrir modifi-

caciones durante el transcurso de la enfermedad

pueden presentar resultados falsos negativos, y

por ello es necesario, seleccionar al menos dos

rearreglos distintos para evitar falsos negativos.

- La caracterizacin de la secuencia de los rearre-

glos, el diseo de los oligonucletidos (primers)

especficos del paciente y la evaluacin de su

sensibilidad y rango cuantitativo se realiza por

tcnicas muy laboriosas, que limitan su aplica-

cin en laboratorios de menor infraestructura.

- Los tiempos necesarios para su puesta a punto

impiden su aplicacin para las fases muy tem-

pranas del tratamiento (da 15).

Es importante destacar que la determinacin de

EMR por CF es ideal en las fases tempranas del

tratamiento donde hay ausencia o escasa presencia

de precursores hematopoyticos normales. Cuando

los blastos presentan un inmunofenotipo similar al

de los precursores normales o pierden sus rasgos

aberrantes, la sensibilidad de su deteccin por CF

se vera comprometida. En etapas posteriores del

tratamiento la deteccin por biologa molecular es

TABLA 2: VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LA DETECCION DE ENFERMEDAD MINIMA RESIDUAL POR TECNICAS DE BIO-

LOGIA MOLECULAR BASADA EN DISTINTOS BLANCOS.

Blanco

Ventajas

Desventajas



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ms sensible, ya que la presencia de precursores

normales no altera la capacidad de deteccin de

los blastos15.

3. Aplicaciones clnicas de la EMR:

Valor pronstico de EMR en LLA

El algoritmo para la estratificacin en gruposde riesgo del protocolo AIEOP-BFM-ALL 2000 se

bas fundamentalmente en parmetros clnicos,

(edad, RGB, respuesta a la prednisona, presencia

de ciertas alteraciones citogenticas y/o molecu-

lares) y la evaluacin morfolgica de la MO. Este

protocolo introdujo por primera vez la EMR por BM

basada en la identificacin y cuantificacin de al

menos dos rearreglos de los genes de las Ig/TCR

al fin de la induccin (da 33) y previamente a la

fase de consolidacin (da 78). En base al anlisis

de los datos surgidos de dicho protocolo, la de-

terminacin de EMR basada en la evaluacin de

al menos dos rearreglos de los genes de Ig/TCRcon una sensibilidad de al menos 10-4 en los das

mencionados, segn lo reportado por Conter15, es

estadsticamente mejor predictor de pronstico que

los factores clsicos de riesgo. En estas condicio-

nes la EMR por BM permite definir tres grupos de

riesgo: estndar (RE), intermedio (RI) y alto (RA) que

difieren significativamente en su sobrevida libre de

eventos (pSLE) y en la incidencia acumulada de

recadas a 5 aos.

Ratei y colaboradores16 evaluaron por CF los

blastos al diagnstico y la EMR por CF en muestras

de MO y sangre perifrica en distintos momentos

de la fase de induccin del tratamiento (da 8 y 15),

en los pacientes enrolados en el protocolo AEIOP

2000. Su objetivo fue determinar qu parmetros

(blastos en el momento del diagnstico y EMR por

CF al da 8 y 15 en sangre perifrica y mdula sea

en valor porcentual y absoluto) poseen mejor po-

der predictivo del estado de remisin al da 33. Su

conclusin fue que el predictor ms robusto fue el

valor absoluto de blastos en MO por CF al da 15.

Basso et al17 tambin public los resultados

obtenidos sobre el mismo protocolo analizando la

EMR por CF en mdula sea al da 15, con el ob-

jetivo de evaluar el impacto pronstico de la EMR

por CF en ese momento del tratamiento. La con-clusin es que el valor de la EMR por CF al da

15 tambin permite definir tres grupos de riesgo

(estndar, intermedio y alto), en base a la pSLE y

a la incidencia acumulada de recadas a 5 aos.

En el anlisis multivarianza, un valor de EMR por

CF al da 15 10% result ser un factor de riesgo

de recada independiente an en los pacientes que

haban sido estratificados en base a la EMR por

BM al da 33 y 78.

Comparando los resultados obtenidos por Con-

ter y Basso (ver Tabla 3) se puede observar que los

grupos de riesgo definidos por ambas metodologas

en distintas fases del tratamiento definen poblacio-nes de grupos de riesgo similares en los pacientes

enrolados en el mismo protocolo.

Basso y colaboradores17 refieren tambin las

ventajas que tendra el uso combinado de ambas

metodologas, dado que la CF en las fases bien

tempranas (da 15) brinda informacin sobre la ra-

pidez de la respuesta al tratamiento y la EMR por

BM proporciona informacin sobre la calidad de la

remisin ms tardamente.

El grupo ALLIC incorpora en su ltimo proto-

colo (ALLIC-2009) la EMR por CF al da 15 como

parmetro para la revaloracin del grupo de riesgo

asignado inicialmente y con los valores de corte

mencionados.

Es fundamental la estandarizacin correcta y es-

tricta de los protocolos para la realizacin de EMR

como demostraron Dworzak y colaboradores con

los resultados de la evaluacin comparativa de la

determinacin de EMR por CF en cuatro centros 18.

Grupo riesgo Da 15 Da 33 Da 78 pSLE 5a (%) Proporcin (%) IAR 5a (%)

BM

CF

TABLA 3: CUADRO COMPARATIVO DE LOS GRUPOS DE RIESGO DEFINIDOS EN BASE AL NIVEL DE ENFERMEDAD MINI-

MA RESIDUAL EN MEDULA OSEA POR CITOMETRIA DE FLUJO AL DIA 15 Y POR RQ-PCR AL DIA 33 Y 78 DEL TRATAMIEN-

TO DEL PROTOCOLO AIEOP-BFM-2000.



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La estandarizacin propuesta inclua el manteni-

miento y calibracin ptima del equipamiento, el

monitoreo de calidad, el entrenamiento del perso-

nal, protocolo de marcacin y procesamiento de

las muestras. La mayor discrepancia se observ

en muestras con niveles bajos de EMR (


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Como mencionamos anteriormente, el Hospital

Garrahan cuenta con la metodologa para realizar

la EMR tanto por CF como por BM. Como uno de

los objetivos del protocolo piloto mencionado fue

tambin comparar ambos mtodos en muestras del

da 33 y da 78, en los casos que hubo suficiente

material, las muestras fueron procesadas en para-lelo y bajo la modalidad de doble ciego.

Se evaluaron 152 muestras por ambos mtodos

y considerando un valor de corte de 0,01% para

definir EMR positiva o negativa, la concordancia fue

del 84% mientras que tomando al tomar el valor

de corte en 0,1% de blastos, la concordancia fue

del 95%.

La concordancia observada en nuestra pobla-

cin coincide con los datos publicados en la litera-

tura19-22. El anlisis ms detallado sobre la compa-

racin entre ambos mtodos excede el propsito

de esta publicacin.

Perspectivas futuras

Como mencionamos actualmente en nuestro

hospital estamos aplicando la determinacin de

EMR para la estratificacin en grupos de riesgo

del tratamiento de las LLA, pero esta estrategia

podr tambin aplicarse en el futuro al seguimien-

to de leucemias mieloblsticas agudas, linfomas,

leucemias linfoblsticas en recadas, etc.

CONCLUSIONES

Para la correcta realizacin e interpretacin de

estudios de EMR es indispensable contar con ins-

trumentos adecuados, personal entrenado as como

cumplir con las pautas establecidas de control de

calidad interno y externo.

Como observamos, en nuestra poblacin un

20% de los pacientes fueron reasignados a un gru-

po de mayor riesgo slo por el valor de EMR por CF

al da 15, permitiendo as que los mismos reciban

un tratamiento adecuado a su respuesta individual.

En resumen, la incorporacin de la EMR a los

protocolos de tratamiento actuales es un requisito

indispensable para la administracin de tratamien-

tos cada vez ms personalizados, considerando la

respuesta individual de cada paciente a la terapia

instaurada.

REFERENCIAS1. Moreno F. Registro Oncopeditrico Hospitalario Argentino (ROHA).

Resultados 2000-2008. Tercera Edicin 2011 (www.roha.org.ar).

Editado por Fundacin Kaleidos.

2. Campana D. Advances in the immunological monitoring of child-

hood acute lymphoblastic leukaemia. Best Practice and Research

Clinical Haematology 2002; 15: 1-19.

3. Szczepanski T. Why and how to quantify minimal residual disease

in acute lymphoblastic leukemia? Leukemia, 2007; 21: 622-626.

4. Campana D. Should minimal residual disease monitoring in acute

lymphoblastic leukemia be standard of care? Curr Hematol Malig

Resp 2012; 7: 170-177.

5. Szczepanski T, Orfao A, van Dongen JJM. Minimal residual disease

in leukaemia patients. Lancet Oncology 2001; 2: 409-417.

6. Campana D. Progress of minimal residual disease studies in chil-

dhood acute leukemia. Curr Hematol Malig Rep 2010; 5: 169-176.

7. Campana D, Coustain-Smith E. Minimal residual disease studies

cytometry in acute leukemia. Am J Clin Pathol 2004; 122(1): 547-

557.

8. Van Lochem E.G, van der Velden VHJ, Van Dongen JJM, et al.

Immunophenotypic differentiation patterns of normal hematopo-yiesis in human bone marrow: reference patterns for age related

changes and disease-induced shifts. Cytometry part B (Clinical

Citometry) 2004, 60B: 1-13.

9. van der Velden V, Jacobs D, Wijkhuijs A, Comans-Bitter WM, et

al. Minimal residual disease levels in bone marrow and peripheral

blood are comparable in children with T cell acute lymphoblastic

leukemia but not in precursor B-acute lymphoblastic leukemia.

Leukemia 2002; 16: 1432-1436.

10. Coustan Smith E, Ribeiro R, Campana D et al. A simplified flow

cytometric assay identifies children with acute lymphoblastic leu-

kemia who have a superior clinical outcome. Blood 2006; 108:

97-107.

11. Gaipa G, Basso G, Maglia O, et al, on behalf of the I-BFM-ALL-

FCM-MRD-Study Group. Drug induced immunophenotypic modu-

lation in childhood ALL: implications for minimal residual disease

detection. Leukemia 2005; 19: 49-56.

12. van der Velden VHJ, Hochhaus A, Cazzaniga G, et al. Detection of

minimal residual disease in hematologic malignancies by real-time

quantitative PCR: principles, approaches, and laboratory aspects.

Leukemia 2003; 17: 1013-1034.

13. van der Velden VHJ, Cazzaniga G, Schrauder A, et al, on behalf

of the European Study Group on MRD detection in ALL (ESG-

MRD-ALL). Analysis of minimal residual disease by Ig/TCR gene

rearrangements: guidelines for interpretation of real-time quanti-

tative PCR data. Leukemia 2007; 21: 604-611.

14. Dworzak M, Froschl G, Gadner H et al. Prognostic significance and

modalities of flow cytometric minimal residual disease detection in

childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood 2002; 99: 1952-

1958.

15. Conter V, Bartram C, Valsecchi MG, et al. Molecular response to

treatment redefines all prognostic factors in children and adoles-

cents with B cell precursor acute lymphoblastic leukemia: results

in 3184 patients of the AIEOP-BFM ALL 2000 study. Blood 2010;

115: 3206-3214.

16. Ratei R, Basso G, Dworzak M, et al. Monitoring treatment respon-

se of childhood precursor B-cell lymphoblastic leukemia in the

AIEOP-BFM-ALL 2000 protocol with multiparameter flow cyto-

metry: predictive impact of early blast reduction on the remission

status after induction. Leukemia 2009; 23: 528.

17. Baso G, Veltroni M, Valsecchi MG, et al. Risk of relapse of child-

hood acute lymphoblastic leukemia is predicted by flow cytometric

measurement of residual disease on day 15 bone marrow. J Clin.

Oncol. 2009; 27: 5168-5174.

18. Dworzak M, Gaipa G, Basso G et al. Standarization of flow cyto-

metric minimal residual disease evaluation in acute lymphoblastic

leukemia: multicentri assessment is feasible. Cytometry Part B

2008, 74B: 331-340.

19. Kerst G, Kreyenberg H, Roth C, et al. Concurrent detection of

minimal residual disease (MRD) in childhood acute lymphoblastic

leukaemia by flow cytometry and real time PCR. Br. J. Haematol

2005; 128: 774-782.

20. Malec M. van der Velden VHJ, Bjorklund B, et al. Analysis of

minimal residual disease in childhood acute lymphoblastic leuke-

mia: comparison between RQ-PCR analysis of Ig/TcR gene rea-

rrangements and multicolor flow cytometric immunophenotyping.

Leukemia 2004; 18: 1630-1636.

21. Gaipa G, Cazzaniga G, Valsecchi G, et al. Time point dependent

concordance of flow cytometry and RQ-PCR in minimal residual

disease detection in childhood acute lymphoblastic leukemia. He-

matologica 2012; 97,10: 1582-1593.

22. Thorn I, Forestier E, Botling J, et al. Minimal residual disease as-

sessment in childhood acute lymphoblastic leukaemia: a Swedish

multi-centre study comparing real-time polymerase chain reaction

and multicolour flow cytometry. Br J Haematol 2011; 152: 743-753.


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Determinacion de Enfermedad Minima Residual en leucemia