DETERMINACIÓN DE LAS MEJORES CONDICIONES DE HIDRÓLISIS ÁCIDA DE LA CÁSCARA DEL PLÁTANO

Villa-Vélez, H.A., Carvalho, G.R., Telis-Romero, J.*

Departamento de Engenharia e Tecnologia de Alimentos, Universidade Estadual Paulista - Campus São Jose do Rio Preto, Rua Cristóvão Colombo, 2265, 15055-300, A.A. 136,São

Paulo, Brasil.*E-mail: javier@ibilce.unesp.br

PALABRAS CLAVE Lignocelulosa, hidrólisis ácida, azúcar reductor, ANOVA. RESUMEN Los residuos lignocelulósicos son la mayor fuente de energía renovable y de fácil acceso en el mundo. Una manera de hacer uso de esta biomasa es hidrolizando sus componentes: celulosa, hemicelulosa y lignina. El objetivo del presente trabajo fue determinar las mejores condiciones de hidrólisis ácida para la cáscara de plátano (Musa acuminata AAA cv. Dwarf Cavendish). Para la determinación, fue realizado un diseño experimental central compuesto con tres variables independientes: temperatura, concentración de ácido sulfúrico y concentración de cáscara de plátano por volumen de ácido. Como variables de respuesta fueron utilizados elincremento de sólidos solubles (%), determinado por refractometría y la cantidad de azúcar reductor total producido en miligramos por mililitro, determinado por el método espectrofotométrico DNS (ácido 3,5-Dinitrosalicílico), empleando una curva estándar de glucosa con concentraciones entre 0.0 y 0.9 mg�ml-1. Todos los ensayos experimentales fueron realizados durante un tiempo de 2 horas y media. Como resultado de los ensayos de hidrolisis ácida para la cáscara de plátano seca fue encontrado que la temperatura y la concentración de cáscara de plátano fueron las variables que más influenciaron en el incremento de sólidos solubles y la cantidad de azúcar reductor total producido. INTRODUCCIÓN Un suministro sostenible para la producción de combustibles y de productos químicos requiere materias primas basadas en fuentes renovables como los materiales lignocelulósicos. La glucosa, molécula de azúcar de seis carbonos, abundante, de bajo costo y constituyente de la biomasa, es una materia prima potencial (Peng et al., 2012). Las cáscaras del plátano, que contienen carbohidratos, proteínas y fibras en forma significativa, pueden perfilarse como un sustrato ideal para la producción de biocombustibles de segunda generación (Velásquez-Arredondo et al., 2010). Estos residuos constituyen el 30% del peso total del fruto, con una humedad promedio de 15 a 20% y, dependiendo del modo de aprovechamiento de estos, es posible su aplicación a escala industrial (Oberoi et al., 2012). Por tanto, el pretratamiento del material lignocelulósico se convierte en la herramienta más importante para la práctica de procesos de conversión de celulosa. El objetivo del pretratamiento es romper el sello de lignina y perturbar la estructura cristalina de la celulosa. Actualmente, se ha considerado como una de las etapas más caras del procesamiento de la biomasa celulósica, llegando al valor 30 ¢ por galón de etanol producido (Mosier et al., 2005). El presente trabajo tiene como objetivo principal determinar las mejores condiciones de hidrólisis ácida del material lignocelulósico proveniente de la cáscara del plátano a fin de obtener un sustrato que pueda ser utilizado para la industria fermentativa.

MATERIALES Y MÉTODOS Preparación de la muestra Para la hidrólisis ácida fueron utilizadas cáscaras de plátano maduro (Musa acuminata AAA cv. Dwarf Cavendish) adquiridas en la central de abasto (CEASA) de la ciudad de São José do Rio Preto, São Paulo. Las muestras fueron secadas en una estufa con circulación de aire forzado a una temperatura de 40 °C por 24 horas. Después del secado, las cáscaras secas fueron molidas empleando un molino de cuchillas (modelo MA 048, Marconi, Brasil) hasta obtener un polvo con un tamañode partícula entre 10 y 100 µm. Una vez molida, la muestra fue empacada en frascos de vidrio (capacidad de 300 ml) y almacenados bajo condiciones de humedad relativa y temperatura controladas para futuras experimentaciones. Procedimiento experimental Para determinar las mejores condiciones de hidrólisis ácida como una etapa de aplicación para el aprovechamiento de la cáscara del plátano en la industria fermentativa, fue realizado un diseño experimental central compuesto factorial 32, con 4 puntos axiales y 5 puntos centrales, totalizando 18 ensayos (tabla 1) (Oberoi et al., 2012; Sheskin, 2000). Las variables independientes envueltas en el proceso fueron: temperatura (°C), cantidad de cáscara molida (g) por 100 ml de ácido sulfúrico y concentración de ácido sulfúrico (%v/v). Todos los ensayos fueron realizados sobre agitación constante a 50 rpm por un tiempo de 120 min. Como variables de respuesta fueron establecidas el incremento de los sólidos solubles (%) y cantidad de azúcar reductor total producido (ART, mg�ml-1). Para el análisis estadístico fue implementada una análisis de varianza (ANOVA) a través del programa STATISTICA 7.0 (Statsoft ©, USA) (Jung et al., 2008). Los gráficos de superficie de respuesta y las ecuaciones derivadas de las tres variables para las respuestas máximas se obtuvieron empleando el paquete de optimización del mismo software.

Tabla 1: Diseño experimental central compuesto para tres variables independientes.

Ensayos Variables Variables codificadas T

(oC) mc/v (%)

[H2SO4] (%v/v)

T (oC)

mc/v (%)

[H2SO4] (%v/v) 1 31.8 4.0 1.1 -1 -1 -1

2 61.9 4.0 1.1 +1 -1 -1

3 31.8 12.1 1.1 -1 +1 -1

4 61.9 12.1 1.1 +1 +1 -1

5 31.8 4.0 2.9 -1 -1 +1

6 61.9 4.0 2.9 +1 -1 +1

7 31.8 12.1 2.9 -1 +1 +1

8 61.9 12.1 2.9 +1 +1 +1

9 30.0 8.0 2.0 -1.68 0 0

10 70.0 8.0 2.0 +1.68 0 0

11 50.0 1.3 2.0 0 -1.68 0

12 50.0 14.9 2.0 0 +1.68 0

13 50.0 8.0 0.5 0 0 -1.68

14 50.0 8.0 3.5 0 0 +1.68

15 50.0 8.0 2.0 0 0 0

16 50.0 8.0 2.0 0 0 0

17 50.0 8.0 2.0 0 0 0

18 50.0 8.0 2.0 0 0 0 T: temperatura experimental (oC); mc/v: gramos de cáscara en polvo por 100 ml de ácido sulfúrico (%); [H2SO4]: concentración de ácido sulfúrico (%). Durante cada ensayo, la respuesta incremento de sólidos solubles fue medida por refractometría, por medio de un refractómetro ABBE en intervalos de 15 minutos hasta completar el tiempo total de experimentación. Terminado cada ensayo, las muestras

hidrolizadas fueron recogidas en tubos de vidrio eppendorf de 200 ml y centrifugados a 40.000 rpm por 10 min en una ultracentrífuga (modelo CTE6, himac, Brasil) para separar el jarabe del material lignocelulósico. Luego de la separación, el jarabe fue utilizado para determinar el contenido de azúcar reductor total a través del método espectrofotométrico DNS (ácido 3.5-Dinitrosalicílico) a una longitud de onda (λ ) de 540 nm, empleando una curva estándar de glucosa de concentraciones entre 0.0 e 0.9 mg�ml-1 (figura 1), método modificado y estandarizado de la AOAC922.28 (1997).

Figura 1: curva estándar de glucosa para el método DNS.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN El estudio de las mejores condiciones de hidrolisis ácida para cáscara de plátano en polvo fue realizado según el diseño experimental central compuesto, con 18 ensayos, teniendo como variables independientes la temperatura, cantidad de cáscara adicionada por 100 ml de ácido sulfúrico y concentración de ácido sulfúrico. Los resultados estadísticos de variancia ANOVA para las respuestas incremento de sólidos solubles y producción de azúcar reductor total (ART) son mostrados en las tablas 2 y 3 respectivamente. En el análisis estadístico del diseño experimental, fueron evaluados todos los efectos de los factores lineares, cuadráticos e de interacción sobre las respuestas. También fueron estimados los errores experimentales, el coeficiente t y la significancia estadística (p). El valor del coeficiente t indica cuanto el efecto de la variable es mayor que el desvío estándar, luego, cuanto mayor sea el valor de t, menor será el valor de p y consecuentemente mayor la posibilidad de la variable ser estadísticamente significativa. A través de la variancia ANOVA se evaluó numéricamente la significancia y la falta de ajuste de la regresión de los factores, empleando el test F con un 95% de confianza (p≤ 0.05). Así, en la tabla 2 se observó que la variable cantidad de cáscara adicionada por 100 ml de ácido sulfúrico tiene un efecto significativo sobre la respuesta incremento de sólidos solubles, siendo que su coeficiente de correlación (R2= 0.686) indica la existencia de variabilidad en los datos experimentales con un p≤ 0.05. Para la tabla 3, fue observado que tanto la variable temperatura como la variable cantidad de cáscara adicionada por 100 ml de ácido sulfúrico, tienen un efecto significativo sobre la respuesta producción de azúcar reductor totalcon un R2= 0.967 y p ≤ 0.05. Para la variable concentración de ácido sulfúrico (H2SO4, %) no fue encontrado un efecto significativo sobre las respuesta, sin embargo, la variable mc/v está sujeta a la concentración de ácido sulfúrico donde fue observado una fuerte influencia sobre las respuestas.

Tabla 2: Análisis de variancia para la respuesta incremento de sólidos solubles.

ANOVA 2R = 0.686

VARIABLES SQ GL MQ F p

(1) T (L) 0.919 1 0.919 2.036 0.191

T (Q) 0.746 1 0.746 1.654 0.234

(2)mc/v(L) 3.386 1 3.386 7.503 0.025

mc/v(Q) 0.174 1 0.174 0.386 0.551

(3) [H2SO4](L) 0.229 1 0.229 0.508 0.496

[H2SO4](Q) 1.180 1 1.180 2.615 0.144

1L x 2L 0.368 1 0.368 0.817 0.392

1L x 3L 0.031 1 0.031 0.069 0.799

2L x 3L 0.291 1 0.291 0.645 0.445

Erro puro 3.610 8 0.451 Total 11.511 17

SQ : suma de los cuadrados; GL : grados de libertad;MQ : media cuadrática; (L): linear; (Q):

cuadrático. T: temperatura experimental (oC); mc/v: gramos de cáscara en polvo por 100 ml de ácido

sulfúrico (%) ; [H2SO4]: concentración de ácido sulfúrico (%). Valores tabulados de F a 0.05p ≤ .

Tabla 3: Análisis de variancia para la respuesta azúcar reductor total.

ANOVA 2R = 0.967

VARIABLES SQ GL MQ F p

(1) T(L) 77.688 1 77.688 8.708 0.018

T(Q) 0.518 1 0.518 0.058 0.815

(2) mc/v(L) 1978.399 1 1978.399 221.751 0.000

mc/v(Q) 28.394 1 28.394 3.183 0.112

(3) [H2SO4](L) 0.633 1 0.633 0.071 0.797

[H2SO4](Q) 19.548 1 19.548 2.191 0.177

1L x 2L 0.380 1 0.380 0.043 0.842

1L x 3L 2.422 1 2.422 0.271 0.616

2L x 3L 36.176 1 36.176 4.054 0.078

Erro puro 71.374 8 8.922

Total 2201.142 17

SQ : suma de los cuadrados; GL : grados de libertad;MQ : media cuadrática; (L): linear; (Q):

cuadrático; T: temperatura experimental (oC); mc/v: gramos de cáscara en polvo por 100 ml de ácido

sulfúrico (%) ; [H2SO4]: concentración de ácido sulfúrico (%). Valores tabulados de F a 0.05p ≤ .

De acuerdo con las investigaciones realizadas por Vélasquez-Arredondo et al., (2010) y Brent-Hammond et al., (1996), quienes determinaron los requerimientos energéticos y la influencia de los nutrientes en la producción de etanol a partir de los residuos del plátano por hidrólisis enzimática y ácida respectivamente, es necesario emplear y optimizar tratamientos mas blandos de hidrólisis para este tipo de materiales, a fin de reducir costos con el tratamiento de afluentes y ofrecer un ambiente mas apropiado para que las levaduras puedan actuar sin necesidad de ajustar nuevamente el pH del medio. La figura 2 muestra los valores de los resultados obtenidos experimentalmente de las respuestas: incremento de sólidos solubles (a) y producción de azúcar reductor total (b), en

donde se observa que las mejores condiciones para aumentar la eficiencia en el proceso de hidrólisis ácida, ocurre en temperaturas altas y bajas y concentraciones de materia seca por 100 ml de ácido sulfúrico alrededor del 8%. Algunos estudios indican que en temperaturas por encima a la de esterilización, los materiales lignocelulósicos producen diversos compuestos, entre los cuales se encuentran los Furfuranos e Hidroximetilfurfuranos, que son llamados de inhibidores de la fermentación y, dependiendo de la concentración de estos residuos en el material, el proceso puede volverse inviable para futuras etapas de procesamiento, como por ejemplo, obtención de bioetanol (Baig et al., 2004; Hendriks et al., 2009; Liu et al., 2012).

Figura 2: Superficie de respuesta de las respuestas: incrementos de sólidos solubles (%) (a) y

producción de azúcar reductor total (ART, mg�ml-1) (b) en función de la variables independientes Temperatura (◦C) y cantidad de cáscara en polvo por 100 ml de ácido sulfúrico mc/v (%).

Los modelos matemáticos codificados obtenidos a partir de la regresión no-linear de las figuras 2 (a) y 2 (b) son representados por las ecuaciones 1 y 2 respectivamente:

INCREMENTO DE SÓLIDOS SOLUBLES = 2.9307 - 0.1259 × T + 0.001718 × T 2 +

0.124435 × mc/v+ 0.007169×mc/v2 + 0.969482 × [ ]2 4

H SO -0.386177 × [ ]2 4H SO 2 -

0.005901 × T × mc/v+ 0.005901 × T × [ ]2 4H SO + 0.052901 × mc/v× [ ]2 4

H SO

(1)

ART = - 3.58543 + 0.20339 × T - 0.00143 × T 2 + 3.04042 × mc/v- 0.09149 ×

mc/v2 - 0.81744 × [ ]2 4

H SO - 1.57176 × [ ]2 4H SO 2 + 0.00452 × T × mc/v+ 0.05195 ×

T × [ ]2 4H SO + 0.58994 × mc/v× [ ]2 4

H SO

(2)

En las ecuaciones anteriores se observó que los efectos cuadráticos son significativos. Los modelos presentan una regresión significativa con un nivel de confianza del 95%, con un alto valor de F para las variables independientes que influyeron en las respuestas.

CONCLUSIÓN Con base en los resultados obtenidos, se puede decir que el proceso de hidrólisis ácida puede ser una buena alternativa en la obtención de ART y posterior obtención de alcohol, siendo que de estos estudios previos surgirán otros estudios, como la caracterización de cada azúcar obtenido en el proceso de hidrolisis por HPLC en función del estado de maduración del plátano (Lohani et al., 2004). AGRADECIMIENTOS Los autores agradecen a la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP, Proc. No. 2010/20402-8 por el soporte financiero. REFERENCIAS

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