Determinación de quinolonas usando HPLC y un detector de fluorescencia (resumen)

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Universidad de ChileFacultad de CienciasDepartamento de QuímicaLicenciatura en Ciencias mención Química

Seminario

Validación de un método de cromatografía de líquidos-espectrometría de fluorescencia para la cuantificación de

cuatro quinolonas en músculos de pollo y cerdo,siguiendo las directrices de la norma europea

EC/657/2002

Autores: Álvaro EtcheverryMariana MontanaresDaniela BobadillaNicolás Farías

e-Mail: [email protected]@[email protected]@gmail.com



Fecha de entrega: 11/05/2012INTRODUCCIÓN

Las quinolonas son un grupo de compuestos estructuralmente relacionados con comprobadaactividad antimicrobiana1, ampliamente utilizados en la industria agropecuaria para disminuir lasinfecciones de origen bacterial en animales que son posteriormente utilizados en la producción dealimentos para el hombre. Poseen una alta actividad frente a bacterias Gram-negativas y Gram-

positivas, incluyendo a aquellas que ya presentan resistencia frente a otros antibióticos, como β-lactamas y sulfonamidas.

La administración de quinolonas, tales como pollos y cerdos que son criados para consumohumano, ha dado como resultado la presencia de residuos en los tejidos animales, lo que da comoresultado un potencial peligro para el consumidor. Específicamente, se ha reportado una fuerterelación entre el uso de quinolonas en la producción de salmón y el desarrollo de resistencia por

parte de la bacteria Campylobacter jejume, que causa infecciones en humanos2.

En base a esto, es que instituciones internacionales como la Agencia Regulatoria Japonesa yla Agencia Regulatoria Europea han establecido Límites Máximos de Residuos (LMR) para estoscompuestos, los que se indican en la Tabla N°13,4..

Tabla N°1: Límites máximos de residuos para cuatro quinolonas, según la norma europea y lanorma japonesa

CompuestoUnión Europea Japón

Pollo (mg/kg) Cerdo(mg/kg) Pollo (mg/kg) Cerdo(mg/kg)

Ciprofloxacina+

Enrofloxacina

0.1 para la suma de lasconcentraciones de

amboscompuestos.

La mismaque para el

pollo.

0.05 para la suma de lasconcentraciones deambos compuestos .

La mismaque para el

pollo.

Ácidooxolínico

0.1 0.1 0.03 0.02

Flumequina 0.4 0.2 0.5 0.5

Varios métodos de detcción, tales como ultravioleta (UV), fluorescencia o espectroscopía demasas (MS) son usados en combinación con cromatografía de líquidos (LC) para la determinaciónde quinolonas. Sin embargo, se intenta establecer un método analítico basado en LC combinado conun detector de fluorescencia (LC-FI), y su validación respectiva de acuerdo al esquema sugerido por la directriz de la Unión Europea EC/657/2002.

1 A. Posyniak, K. Mitrowska. Bulletin Veterinary Institute in Pulawy, 52, 427-430, (2008).2 S. Zhao, H. Jiang, X. Li, T. Mi, C. Li, J. Shen, Journal of Agricultural Food Chemistry, 55, 3829-3834, (2007).3 Council Regulation 37/2010 of European Communities.4 Maximum Residue Limits (MRLs) List of Agricultural Chemicals in Foods, The Japan Food Chemical Research

foundation. Ministry of Health, Labour and Welfare of Japan. 2



MÉTODO EXPERIMENTAL

Los reactivos y los productos químicos:

Las muestras estándares de matrices musculares de cerdo y pollo se utilizaron para la preparación de curvas de calibración en un intervalo de concentración de 0.025-0.2 mg/kg. Estos patrones de calibración se prepararon a partir de muestras de cerdo y pollo comprado en un mercadolocal en Santiago. Después de eliminar la grasa y el tejido conectivo se obtuvo una pasta homogéneade las matrices usando un procesador de alimentos. Al homogeneizado, se le añadieron cincoconcentraciones diferentes de la solución multi-estándar (0,025-0,2 mg kg-1). Las seis muestras decontrol fueron preparadas añadiendo a los homogeneizados de cerdo y pollo la solución de controlmulti-estándar con el fin de obtener un valor de concentración cerca del LMR de la Unión Europea(0.1 mg/kg) y otras 6 muestras de control fueron preparadas de forma similar a la mitad del LMR (0,05 mg/kg). Las muestras fortificadas se dejaron en reposo en la oscuridad durante 30 min a

temperatura ambiente antes de iniciar el procedimiento de extracción.

Instrumentación:

El aparato de HPLC comprendía una serie de cuatro bombas, un auto-inyector de Agilent(Santa Clara, CA, EE.UU.) equipado con un detector de fluorescencia y un detector UV-Vis DAD(arreglo de diodos), y los datos fueron obtenidos mediante un programa de análisis de datos"ChemStation". La separación cromatográfica se logró utilizando una columna X-Terra RP-18 (3.5μm, 150 x 4.6 mm) Waters (Milford, EE.UU.) y una pre-columna Waters RP-18 (3.5 μm, 3.9 x 20mm). La fase móvil consistió en una mezcla de un tampón fosfato de sodio 0.05 M a pH 3 (A) conacetonitrilo (B). Se utilizó una elusión en gradiente lineal de 82% A durante 5 min; 67% A durante10 minutos y finalmente 82% A durante 3 minutos adicionales, y un flujo de 1 mL/min.

La longitud de onda de excitación de fluorescencia se encontraba en 280 nm y la longitud deonda de emisión en 450 nm durante los primeros 9 minutos del análisis y en 310 nm y 360 nm de9 a 27 min.

RESULTADOS

Curvas de calibración:

Las curvas de calibración obtenidas en tres días diferentes para las cuatro quinolonas fueronlineales en el rango de concentración de 0.005-0.200 mg/kg, lo que incluye la mitad del LMR yLMR. En todos los casos las pendientes e intersecciones de cada compuesto en cada matriz eranesencialmente las mismas.

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Valores promedio y coeficientes de variación:

Tabla N°2: Valores promedio (μg/kg) y coeficientes de variación de las muestras.

Analito Día

Promedio (μg/kg) (CV%)

½ LMR LMR

Cerdo Pollo Cerdo Pollo

Enrofloxacina

1 39.95 (5.7) 44.42 (2.6) 81.85 (7.3) 87.34 (4.4)

2 40.71 (1.8) 44.10 (3.5) 88.62 (2.2) 88.96 (3.1)

3 42.56 (4.4) 41.28 (7.5) 87.31 (3.4) 82.92 (4.2)

Ciprofloxacina

1 43.69 (5.5) 50.23 (3.3) 90.53 (6.2) 97.70 (3.4)

2 44.73 (1.1) 47.19 (4.2) 95.33 (2.5) 95.90 (3.3)

3 47.50 (4.5) 47.11 (3.8) 96.16 (2.6) 95.15 (5.0)

Ác. Oxolínico

1 43.00 (9.1) 40.77 (3.8) 80.60 (8.9) 80.90 (4.3)

2 42.18 (5.6) 41.35 (3.5) 88.99 (3.3) 81.51 (4.4)

3 34.95 (14.4) 39.21 (8.4) 81.64 (5.7) 81.72 (2.6)

Flumequina

1 39.24 (4.1) 44.37 (2.3) 76.83 (11.4) 91.74 (4.1)

2 40.21 (2.1) 41.87 (3.8) 88.10 (2.0) 82.81 (4.7)

3 41.43 (4.5) 42.30 (6.1) 87.43 (6.8) 87.56 (4.5)

Evaluación de los límites de detección (LD) y cuantificación (LC):

El límite de detección se define como la cantidad mínima de sustancia que puede ser detectada en un límite de confianza dado (generalmente 95%) pero no necesariamente cuantificadacon precisión. En general, se informo de una concentración o cantidad de sustancia y que se derivade la señal más pequeña que se puede detectar con una certeza razonable de un método analítico

particular.El límite de cuantificación se define como la cantidad de analito que puede determinarse

cuantitativamente con un nivel aceptable de exactitud y precisión de repetitividad. En el presenteestudio los valores de LD y LC se estimaron a partir del análisis de 9 muestras en blanco de músculo

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de cerdo y el pollo, la evaluación de la desviación estándar de las señales de la media en los tiemposde retención de cada una de las quinolonas. Los valores obtenidos se resumen en la Tabla N°3.

Tabla N°3: Límites de detección y límites de cuantificación para las cuatro quinolonas en

el detector de fluorescencia.

Analito

Cerdo Pollo

LD(μg/kg)

LC(μg/kg)

LD(μg/kg)

LC(μg/kg)

Enrofloxacina 1.3 4.3 1.2 2.0

Ciprofloxacina 1.1 3.8 2.7 5.3

Ác. Oxolínico 4.1 13.5 13.0 18.4

Flumequina 2.4 8.0 13.2 17.0

Como se esperaba, los límites de detección y cuantificación determinados para elácido oxolínico y la flumequina son superiores a los obtenidos para la enrofloxacina yciprofloxacina ya que muestran una respuesta instrumental menor que los del grupo de lasfluoroquinolonas. La diferencia entre el LD y el LC de ácido oxolínico y flumequina en ambasmatrices podría explicarse por el hecho de que el procedimiento de eliminación de impurezas en lamatriz de cerdo es más eficiente que la matriz de pollo.

CONCLUSIONES

• Es posible identificar y cuantificar simultáneamente cuatro quinolonas presentes en losmúsculos de pollo y cerdo, mediante una metodología utilizando HPLC y un detector defluorescencia.

• El método utilizado provee resultados satisfactorios en cuanto al rango de trabajo,recuperación, precisión e incerteza.

• El método es adecuado para análisis de rutina en pruebas de campo, tomando en cuenta que puede ser llevado a cabo durante un día de trabajo.

• Para la ciprofloxacina y la enrofloxacina no se cumple la norma europea ni la norma japonesa. Para el ácido oxolínico sólo se cumple la norma europea. Mientras que para laflumequina se cumple tanto la norma europea como la norma japonesa.

BIBLIOGRAFÍA

- VASQUEZ-MARTINEZ, Y. “et al”. Validation of a liquid chromatography-fluorescencespectrometric method for the quantification of four quinolones in pig and chicken musclefllowing the european unión gudieline EC/657/2002. Journal of Chilean Chemical Society.56 (1): 554-558, 2011.

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