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Determinacin del espermatocrito y efecto del volumen de la dosis
seminante sobre la fertilidad en yam (Brycon amazonicus)Pablo E
Cruz-Casallas , MVZ, MSc, PhD; Yohana M Velasco-Santamara , MV;
Vctor M Medina-Robles , MVZ, cMSc1 1 1 1
Grupo de Reproduccin y Toxicologa de Organismos Acuticos GRITOX,
Instituto de Acuicultura, Facultad de Ciencias Agropecuarias y
Recursos Naturales, Universidad de los Llanos, A.A. 110,
Villavicencio, Meta - Colombia. [email protected] (Recibido: 18
abril, 2005; aceptado: 24 abril, 2006)
Resumen El yam (Brycon amazonicus Spix & Agassiz 1829) es un
pez omnvoro de rpido crecimiento y carne de alta calidad y
aceptacin comercial. Para estandarizar el espermatocrito (SPCTO),
23 muestras de semen fueron centrifugadas a 14000 g durante 1, 3,
5, 7 10 min. El tiempo de centrifugacin tuvo un efecto
significativo sobre el valor del espermatocrito (SPCTO) (p0.05).
Palabras clave: concentracin espermtica, dosis seminante,
espermatocrito, yam.
Introduccin Brycon es un gnero de carcidos neotropicales,
ampliamente distribuido en las aguas continentales desde Mxico
hasta Argentina (9). Brycon amazonicus (yam) es una especie nativa
de la cuenca del ro Orinoco de Colombia y Venezuela, de hbitos
alimenticios omnvoros, rpido crecimiento y carne de alta calidad,
la cual es actualmente considerada de importancia econmica para la
piscicultura suramericana (14). En todas las especies animales,
evaluar la calidad espermtica es requisito indispensable para
asegurar el xito de la inseminacin artificial y para monitorear los
procedimientos de manipulacin del material
seminal, tales como su almacenamiento en fresco y la
crioconservacin (5). Junto con la movilidad y el tiempo de
activacin, la concentracin espermtica (CE) es una de las variables
ms utilizadas para determinar la calidad seminal en peces (2, 10),
la cual consiste en la expresin del nmero de espermatozoides (sptz)
por L o mL. Varios procedimientos han sido utilizados para calcular
la CE (1, 13), siendo el ms comn la utilizacin del hemocitmetro o
cualquier otra cmara contadora de partculas. Sin embargo, este
proceso es laborioso y consume mucho tiempo, lo cual reduce su
practicidad cuando el resultado de varios reproductores debe ser
conocido en un corto periodo de tiempo.
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El SPCTO es un procedimiento alternativo para medir la CE, el
cual ha sido utilizado en peces (11, 13, 17). Varios autores han
reportado en algunas especies una relacin positiva y
estadsticamente significativa entre el SPCTO y la CE (4, 12); sin
embargo, dicha relacin no siempre es alta, debido especialmente a
una deficiente estandarizacin de las condiciones de centrifugacin
para la lectura del SPCTO o de la preparacin y montaje de la cmara
de Neubauer (6, 13). En yam, trabajos previos realizados en nuestro
laboratorio (6) mostraron una baja correlacin (r2= 0.30) entre el
SPCTO y la CE, por lo tanto es an necesario estandarizar las
condiciones de centrifugacin para obtener un empaquetamiento
espermtico eficiente y que permita establecer una mayor relacin
entre la CE y el SPCTO. Aunque varios trabajos han sido realizados
con el propsito de conocer la proporcin o nmero de sptz/ oocito
necesaria para una seminacin exitosa, la informacin disponible
sobre los efectos del volumen de la dosis seminante sobre la
fertilidad an no han sido suficientemente estudiados. Los objetivos
del presente trabajo fueron estandarizar la determinacin del SPCTO,
conocer la CE durante la estacin reproductiva y evaluar el efecto
del volumen de la dosis seminante sobre la fertilidad.
respectivamente. Para determinar el volumen total de semen, el
material seminal fue recolectado directamente en tubos de vidrio
aforados. Para conocer el peso del desove, los oocitos se
colectaron en recipientes plsticos limpios y secos, los cuales
fueron inmediatamente pesados en una balanza digital (Scout Pro,
Ohaus Corporation, Pine Brook NJ. USA). Previo a la obtencin de los
gametos, los animales fueron tranquilizados por inmersin en una
solucin de 300 ppm de 2- fenoxietanol (Sigma Co, St Louis,
Missouri), durante 3 a 5 minutos. Inmediatamente despus de perdido
el eje de nado, fueron retirados de la solucin anestsica, secados
cuidadosamente en la regin abdominal y aplicada una leve presin
para provocar la expulsin de orina, heces o bilis, para reducir el
riesgo de contaminacin de los gametos. El trabajo comprendi tres
experimentos: en el primero se determin el tiempo de centrifugacin
necesario para obtener lecturas estables del espermatocrito,
efectuando la medicin de la proporcin del volumen celular empacado
con relacin al volumen total de la muestra de semen, despus de 1,
3, 5, 7 10 min de centrifugacin, conservando una fuerza centrfuga
constante de 14000 g (12000 r.p.m., Microcentrfuga Ebba 12,
Hettich, Tuttlingen, Alemania). Para este propsito, se utilizaron
23 muestras de semen y tubos microcapilares de 75.0 mm de longitud
y 1.1 mm de dimetro interno (Brand, Alemania), los cuales fueron
llenados (ca. 90%) con semen y uno de los extremos sellado con
plastilina e inmediatamente sometido a centrifugacin, de acuerdo
con el protocolo descrito anteriormente. En el segundo experimento
se estudi la relacin entre el espermatocrito y la concentracin
espermtica, as como el valor de estas variables durante la estacin
reproductiva. El espermatocrito se obtuvo con base en los
resultados del primer experimento, centrifugando la muestra de
semen a 14000 g durante 5 min. El tiempo de cinco minutos de
centrifugacin fue elegido teniendo como criterio la presencia de
menos de 5 espermatozides por campo microscpico (40X) en una
muestra tomada de la columna de plasma seminal. La concentracin
espermtica fue calculada mediante la cmara de Neubauer (Bright
Line, Optik Labor, Alemania), contando los sptz presentes en 0.02
mm3, previa dilucin (1:1200) de la muestra con solucin salina
fisiolgica (0.9% NaCl). Previo al conteo de las clulas, la cmara de
Neubauer fue mantenida durante 10 min en una atmsfera hmeda. El
recuento de las clulas espermticas fue realizado con la ayuda de
un
Materiales y mtodos Fueron utilizados individuos adultos de yam
de tres aos de edad, sexualmente maduros, criados y mantenidos en
la estacin pisccola del Instituto de Acuicultura (IALL) de la
Universidad de los Llanos (UNILLANOS), con un peso corporal de 2.0
y 1.7 kg y una longitud total de 52.0 y 49.4 cm, hembras y machos
respectivamente. En las hembras la maduracin final y la ovulacin
fueron inducidas mediante la administracin intramuscular (IM) de
5.75 mg kg-1 de peso corporal de extracto de hipfisis de carpa
(EHC, Stoller Fisheries, USA) distribuida en tres aplicaciones a
las 0 (0.25 mg.kg-1), 24 (0.5 mg.kg-1) y 36 (5.0 mg.kg-1) horas. La
espermiacin fue estimulada administrando 4.0 mg.kg -1 de EHC, en
una sola inyeccin IM, aplicada simultneamente con la segunda
inyeccin de las hembras. La extraccin de los gametos fue realizada
mediante masaje crneo-caudal del abdomen, 6 a 7 horas y 18 a 24
horas despus de la ltima inyeccin de la hormona, en hembras y
machos,
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microscopio ptico (40X). Para cada muestra, la dilucin fue
preparada por duplicado y para cada una efectuados dos recuentos,
el promedio de las cuatro lecturas se utiliz para los clculos
subsecuentes. La concentracin espermtica fue expresada en millones
de sptz por mililitro. Para determinar la eventual variacin
estacional, los datos obtenidos fueron clasificados de acuerdo con
el mes de muestreo, el cual comprendi el periodo desde marzo hasta
mayo de 2003. El tercer experimento evalu el efecto del volumen de
la dosis seminante sobre la fertilidad de oocitos de yam. Para este
propsito, 2 g de oocitos (ca. 2800) fueron seminados con cinco
volmenes diferentes de semen fresco diluido (n= 12), as: 3, 15, 45,
90 y 180 L, cuya concentracin espermtica fue ajustada para mantener
una relacin de nmero de sptz/oocito (50000:1) constante en todos
los casos. Para ajustar la concentracin espermtica fue utilizado
plasma seminal de la misma especie, libre de sptz, el cual se
obtuvo por centrifugacin de muestras de semen a 2430 g (5000
r.p.m.) durante 10 min. La activacin espermtica fue inducida
adicionando a la mezcla de semen y oocitos 5 mL de agua corriente.
Despus de hidratados, los oocitos seminados se incubaron en
recipientes plsticos de 2.0 L con flujo ascendente. La fertilidad
fue evaluada seis horas postseminacin y expresada en porcentaje,
calculado a partir del nmero de oocitos fertilizados (fase de
cierre del blastoporo) sobre un total de 100. Los porcentajes de
fertilidad y de espermatocrito fueron transformados en arcoseno.
Los resultados de esta ltima variable y la concentracin espermtica
fueron sometidos a anlisis de regresin lineal. Diferencias entre el
espermatocrito y la concentracin espermtica durante la estacin
reproductiva y en los tiempos de centrifugacin fueron determinadas
por anlisis de varianza de una va (ANOVA). Los resultados son
mostrados como media error estndar de la media (SEM). p
