DETERMINACIONFLUORIMETRICAD

E QUININA EN TONICA

Pablo Fernández López

¿QUE ES LA FLUORESCENCIA?

FLUORESCENCIA:

Absorción molecular de un fotón

Emisión una luminiscencia a mayor

Salto de Stokes

Toma su nombre de la fluorita

Extensión del sistema de electrones

Rigidez estructural

Impedimentos estéricos

Efecto de átomo pesado interno

Naturaleza de la transición

Formación de complejos organometálicos

Efectos de los sustituyentes

FACTORES ESTRUCTURALES

Extensión del sistema de electrones Extensión del sistema de electrones

Rigidez estructuralRigidez estructural

Impedimentos estéricosImpedimentos estéricos

cis 1,2-difenileteno trans 1,2-difenileteno

Efecto de átomo pesado internoEfecto de átomo pesado interno

F

Cl

Br

I

FLUORESCENCIARELATIVA

100%

7%

0.2%

<0.05%

Absortividad molar alta

Velocidad de fluorescencia elevada

nAbsortividad molar baja

Velocidad de fluorescencia pequeña

Naturaleza de la transición fluorescenteNaturaleza de la transición fluorescente

Formación de complejos organometálicosFormación de complejos organometálicos

Cambio en la naturaleza de la transición

n

-Análisis de metales

-Análisis de ligandos poco fluorescentes

Favorecer el cruzamiento entre sistemas

Efectos de los sustityentesEfectos de los sustityentes

Los electrodonadores: -NH2, -NHR, -NR2, -OH, y -OR

aumentan la eficacia de la fluorescencia,desplazándola a mayores

Los electroaceptores: -COOH,-COOR, -CHO, -COR y –NO2,reducen la eficacia de la fluorescencia al introducir una transición n- *.

Los halógenos producen efecto de átomo pesado interno

Los grupos sulfónicos no modifican significativamente la fluorescencia

FACTORES DEL MEDIO

Temperatura

Polaridad

Viscosidad

Atomo pesado externo

pH

Puentes de hidrógeno

Otros solutos: atenuación de la fluorescencia

2 8 0 3 2 0 3 6 0L o n g itu d d e o n d a e x c itac ió n (n m )

0

2 0 0

4 0 0

6 0 0

8 0 0

Inte

nsid

ad d

e fl

uore

scen

cia

K

I s

Ia

Fluorescencia de la orina

Fluorescencia del suero sanguíneo

Fluorescencia de la leche de vaca

ANALISIS CUALITATIVO

IDENTIFICACION EN EL ESPECTRO DE LAS DIFERENTES

BANDAS Y PICOS

Fluorescencia de la quinina

excitación

emisión

Flu

ore

scen

cia

Longitud de onda (nm)

Fluorescencia de la quinina

excitación

emisión

Flu

ore

scen

cia

Longitud de onda (nm)

Fluorescencia de la quinina

excitación

emisión

Flu

ore

scen

cia

Longitud de onda (nm)

Fluorescencia de la quinina

excitación

emisión

Flu

ore

scen

cia

Longitud de onda (nm)

Fluorescencia de la quinina

excitación

emisión

Flu

ore

scen

cia

Longitud de onda (nm)

Fluorescencia de la quinina

excitación

emisión

Flu

ore

scen

cia

Longitud de onda (nm)

Fluorescencia de la quinina

excitaciónemisión

Flu

ore

scen

cia

Longitud de onda (nm)

Máximo de excitación Máximo de emisión

Fluorescencia de la quinina

excitación emisión

Flu

ore

scen

cia

Longitud de onda (nm)

¿Esto que es?

¿Esto que es?

200 250 300 350 400 450 500

LO N GI T U D DE O N DA (nm)

0

1

2

3

4

5

6

7

INTE

NSI

DA

D

ESPECTRO DE EXCITACION SIN SELECCIONAR em.La dispersión ocurre a todas las longitudes de onda.

ESPECTRO DE EXCITACION A em = 450 nmResulta un pico de luz dispersa proveniente de la lámpara a ex = em = 450 nm.

200 250 300 350 400 450 500LO N GI T U D DE O N DA (nm)

0

1

2

3

4

5

6

7

INTE

NSI

DA

D

4 50 nm

Pico Rayleigh

ESPECTROS ANTERIORES SUPERPUESTOS

200 250 300 350 400 450 500LO N GI T U D DE O N DA (nm)

0

1

2

3

4

5

6

7

INTE

NSI

DA

D

4 50 nm

200 250 300 350 400 450 500LO N GI T U D DE O N DA (nm)

0

1

2

3

4

5

6

7

INTE

NSI

DA

D

4 50 nm

Pico Rayleigh

ESPECTRO DE EXCITACION A em = 450 nm.

RENDIJAS A 16 nm RENDIJAS A 2nm

ANCHURA DEL RAYLEIGH SEGUN RENDIJA

200 250 300 350 400 450 500LO N GI T U D DE O N DA (nm)

0

1

2

3

4

5

6

7

INTE

NSI

DA

D

450 nm480 nm

300 350 400 450 500 550 600LO N GI T U D DE O N DA (nm)

0

1

2

3

4

5

6

7

INTE

NSI

DA

D (n

m)

ESPECTROS DE EXCITACION A DOS em

RENDIJAS A 16 nm RENDIJAS A 2nm

POSICION DEL RAYLEIGH RESPECTO AL ESPECTRO

COMPARACION DE ESPECTROS

375 400 425 450 475 500 525 550 575 600

LO N GI T U D DE O N DA (nm)

0

1

2

3

4

5

6

7

INTE

NSI

DA

D (n

m)

PA T RO N DE Q UI N I N A

375 400 425 450 475 500 525 550 575 600

LO N GI T U D DE O N DA (nm)

0

1

2

3

4

5

6

7

INTE

NSI

DA

D (n

m)

DI S O LUCI O N DE T O N I CA

375 400 425 450 475 500 525 550 575 600LO N GI T U D DE O N DA (nm)

0

1

2

3

4

5

6

7

INTE

NSI

DA

D (n

m)

DI S O LUCI O N DE T O N I CA

PA T RO N DE Q UI N I N A

NORMALIZACION DE ESPECTROS

375 400 425 450 475 500 525 550 575 600LO N GI T U D DE O N DA (nm)

0

1

2

3

4

5

6

7

INTE

NSI

DA

D (n

m)

DI S O LUCI O N DE T O N I CA

PA T RO N DE Q UI N I N A

375 400 425 450 475 500 525 550 575 600LO N GI T U D DE O N DA (nm)

0

1

2

3

4

5

6

7

INTE

NSI

DA

D (n

m)

DI S O LUCI O N DE T O N I CAN O RM A LI Z A DO A LPA T RO N DE Q UI N I N A

PA T RO N DE Q UI N I N A

NORMALIZACION DE ESPECTROS

ANALISIS CUANTITATIVO

375 400 425 450 475 500 525 550 575 600

LO N GI T U D DE O N DA (nm)

0

1

2

3

4

5

6

7

INTE

NSI

DA

D (n

m)

100 ppb

375 400 425 450 475 500 525 550 575 600

LO N GI T U D DE O N DA (nm)

0

1

2

3

4

5

6

7

INTE

NSI

DA

D (n

m)

100 ppb200 ppb

375 400 425 450 475 500 525 550 575 600

LO N GI T U D DE O N DA (nm)

0

1

2

3

4

5

6

7

INTE

NSI

DA

D (n

m)

100 ppb200 ppb300 ppb

375 400 425 450 475 500 525 550 575 600

LO N GI T U D DE O N DA (nm)

0

1

2

3

4

5

6

7

INTE

NSI

DA

D (n

m)

100 ppb200 ppb300 ppb400 ppb

375 400 425 450 475 500 525 550 575 600

LO N GI T U D DE O N DA (nm)

0

1

2

3

4

5

6

7

INTE

NSI

DA

D (n

m)

100 ppb200 ppb300 ppb400 ppb500 ppb

375 400 425 450 475 500 525 550 575 600

LO N GI T U D DE O N DA (nm)

0

1

2

3

4

5

6

7

INTE

NSI

DA

D (n

m)

100 ppb200 ppb300 ppb400 ppb500 ppbT O N I CA

375 400 425 450 475 500 525 550 575 600

LO N GI T U D DE O N DA (nm)

0

1

2

3

4

5

6

7

INTE

NSI

DA

D (n

m)

100 ppb200 ppb300 ppb400 ppb500 ppbT O N I CA

ex = 350, em = 450 nm

[Quinina] (ppb)

Fluorescencia

100 1.19

200 2.38

300 3.49

400 4.53

500 5.93

tónica 3.770 100 200 300 400 500 600

CO N CE N T RA CI O N (ppb)

0 . 0

0 . 5

1 . 0

1 . 5

2 . 0

2 . 5

3 . 0

3 . 5

4 . 0

4 . 5

5 . 0

5 . 5

6 . 0

6 . 5

7 . 0

FLU

ORE

SCEN

CIA

A j uste linear , y=b* x + aY = 0. 01163 * X + 0. 0150002Coefi ciente de la determinación r^2 = 0. 9977

 PROCEDIMIENTO 1.- Preparar disoluciones de 100, 200, 300, 400 y 500 ppb a partir de una disolución de sulfato de quinina de 2.5 ppm y enrasar a 25 ml con H2SO4 0.1 N.

2.- Registrar los espectros de excitación y emisión de una de las muestras y medir la intensidad de fluorescencia a 350 nm de excitación y 450 nm de emisión de todas ellas para construir la recta de calibrado.  3.- Pasar el contenido de un agua tónica a un vaso de precipitado y agitar vigorosamente a temperatura ambiente durante 10 minutos. 4.- Tomar 1.0 ml y añadir la cantidad necesaria de H2SO4 concentrado (36 N) para que en un volumen final de

250 ml sea 0.1 N. 5.- Registrar los espectros de excitación y emisión, comprobando que en estas condiciones la fluorescencia del agua tónica es debida únicamente a la quinina. 6.- Medir la fluorescencia a 350 nm de excitación y 450 nm de emisión calculando la concentración de quinina en el agua tónica a partir de la recta de calibrado. 

MATERIALES PRODUCTOS

- Espectrofluorímetro- Matraces de 25 ml.- Pipetas graduadas.- Vaso precipitado.- Agitador magnético con núcleo.

- Agua tónica- H2SO4

- Bisulfato de quinina 

PRÁCTICA Nº 1DETERMINACIÓN ESPECTROFLUORIMÉTRICA DE QUININA EN AGUA TÓNICA

1. Componentes principales de un espectrofluorímetro. Función principal de cada uno de ellos.

2. En los espectros que se han dado en la práctica se muestra el espectro de excitación y de emisión de fluorescencia de quinina. Comentarlos brevemente, es decir:

a) Identificar cada uno de los espectrosb) Localización de los máximos. Número de bandas que

presenta cada espectroc) Señalar los máximos de intensidad. ¿Conviene realizar el

calibrado a dichos máximos? ¿Por qué?d) Encontramos alguna simetría entre ambos espectros. ¿Por

qué?e) En excitación encontramos más de una banda de

fluorescencia. Si se pretende evitar interferencia en la medida por parte de otras sustancias que puedan estar presentes en la muestra, ¿Qué banda se debería elegir para la determinación de quinina en tónica?

PREGUNTAS DE LA PRÁTICA PARA EL CUADERNO

PREGUNTAS DE LA PRÁTICA PARA EL CUADERNO3. En espectrofotometría, los espectros son de excitación mientras que en espectrofluorimetría estos son de emisión y de excitación, es decir tridimensionales. Ventajas e inconvenientes (al menos 3)

4. ¿Coincide un espectro de excitación de fluorescencia con uno de absorbancia (espectrofotometría)? ¿Por qué? Explicarlo en términos de transiciones electrónicas.

5. ¿Cómo se relaciona la señal instrumental que se mide en fluorescencia y en espectrofotometría respecto a la intensidad de la radiación incidente? ¿Es ésta monocromática o policrómática? Explique la respuesta

6. Dibuja un posible espectro de excitación de fluorescencia de la clorofila sabiendo que absorbe en las regiones visibles del azul y del amarillo. Dibuja igualmente su espectro de emisión fluorescente.

PREGUNTAS DE LA PRÁTICA PARA EL CUADERNO

7. Una muestra problema ofrece un espectro de absorbancia en el que se observan tres máximos claramente definidos ¿Qué puede deducirse al respecto?

8. La muestra anterior ofrece un espectro de emisión de fluorescencia en el que se observan dos máximos claramente definidos. ¿Qué puede deducir en este caso? Dibujar este espectro y su correspondiente de excitación de fluorescencia (téngase presente tanto los valores de longitud de onda como de intensidad).

9. Proponga una estrategia para detectar el pico de luz dispersa (pico Rayleigh) en un espectro de emisión de fluorescencia.

10. Resultados obtenidos: recta de calibrado y concentración de quinina en la tónica.

La quinina, C20H24N2O2 es un alcaloide natural, blanco y cristalino, con propiedades antipiréticas, antimalaria y analgésicas. Fue el principal compuesto empleado en el tratamiento de la malaria ya que resulta tóxico para el plasmodium, el parásito que infecta los glóbulos rojos. Actualemente, ha sido sustituida por otros medicamentos sintéticos más eficaces. Se puede utilizar todavía en el tratamiento de la malaria resistente, los calambres nocturnos en las piernas y en la artritis. Sin embargo, su usoa dosis terapéuticas puede provocar cinchonismo; en dosis altas o casos raros, puede ser incluso letal, debido a un edema pulmonar agudo y fulminante. El dosis muy elevadas puede provocar aborto o defectos de nacimiento (especialmente sordera) si es tomada por mujeres durante el embarazo. La quinina se extrajo por primera vez de la corteza de la quina, un árbol presente naturalmente en Sudamérica. Fue aislada y bautizada así, en 1820, por los investigadores franceses Pelletier y Caventou. La quinina se usa como potenciador del sabor en el agua tónica, confiriéndole su característico sabor amargo. Debido a los efectos secundarios de altas dosis de quinina, su concentración se ha limitado por la FDA estadounidense a un máximo de 83 ppm. Este valor es aproximadamente un cuarto del empleado terapéuticamente.

¿QUE ES LA QUININA?

ESTRUCTURA MOLECULAR

Quinina Número CAS [130-95-0]

Fórmula química C20H24N2O2

Peso molecular 324.42

Propiedades físicas

Punto de fusión 177°C (descompone ligeramente)

Punto de sublimación 180°C (en alto vacío)

Densidad 1.293 g/cm3

Solubilidad en agua

1 gramo/1900 mL, pH de la disolución saturada: 8,8, también soluble en etanol (1 g/0,8 mL), 4 g/l (éter anhidro), benceno (1 g/80 mL), cloroformo (1 g/1,2 mL), glicerol (50 g/L)

Fluorescencia Azul, se intensifica en ácido sulfúrico