Diagnóstico temprano del retinoblastoma: importancia de la búsqueda de mutaciones en el gen RB1

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El retinoblastoma constituye el cáncer intraocular infantil más frecuente, conuna incidencia global entre 1/13.500 y1/25.000 nacimientos, sin que se hayandetectado diferencias significativas entresexos o razas1. El desarrollo tumoral pue-de afectar a ambos ojos (bilateral) o biensólo a uno (unilateral). Además, puedenprogresar uno o múltiples focos tumora-les en cada uno de los ojos afectados.Existen dos formas de la enfermedad: laesporádica y la familiar, que representaentre el 10 y el 15% de los pacientes conretinoblastoma. En estos casos la enfer-medad segrega como un carácter autosó-mico dominante, con un 90% de pene-trancia.Se ha estimado que el 60% de los casosson unilaterales y no hereditarios, debidosa dos mutaciones somáticas en una célu-la de la retina, el 25% corresponde a ca-sos bilaterales y hereditarios y el resto correspondería a casos unilaterales here-ditarios. En los casos hereditarios (40%),la enfermedad se debe a la conjunción deuna mutación germinal transmitida o sur-gida de novo y a una segunda mutaciónsomática ocurrida en una célula de la reti-na. Así pues, se requieren dos episodiosmutacionales que inactiven los dos alelosdel gen responsable para la manifestaciónde la enfermedad (hipótesis two-hits2). Laprimera copia del gen puede ser inactivadapor distintas mutaciones, detectables espe-cialmente en el área molecular, mientrasque la segunda copia se inactiva a travésde muy diferentes mecanismos, como faltade disyunción mitótica, recombinación mi-tótica, deleción, mutación puntual, conver-sión génica, etc. El análisis de tumores enpacientes con retinoblastoma ha permitidodemostrar que el 70% de los casos pre-sentan pérdida de heterocigosidad en laregión del gen RB1 por pérdida del alelonormal3; asimismo se ha determinado queel 90% de las mutaciones germinales de-tectadas en los casos esporádicos heredi-tarios tienen origen paterno4.Estudios epidemiológicos del retinoblasto-ma han demostrado que los pacientescon la forma hereditaria manifiestan la

ORIGINALES

Diagnóstico temprano del retinoblastoma:importancia de la búsqueda de mutaciones en el gen RB1

Carmen Nájera, Francisco Sánchez, Emilia Mateua, Félix Prietoa y Magdalena Beneytoa

Departamento de Genética. Facultad de Ciencias Biológicas. Universitat de Valencia. aUnidad de Genética y Diagnóstico Prenatal. Hospital La Fe. Valencia.

Correspondencia: Dra. C. Nájera.Departamento de Genética. Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad de Valencia.Dr. Moliner, 50. 46100 Burjassot. Valencia.Correo electrónico: [email protected]

Recibido el 14-6-2000; aceptado para su publicación el 13-2-2001

FUNDAMENTO: El retinoblastoma, cáncer intraocular infantil más frecuente, se presenta como es-porádico (unilateral o bilateral) o afectando a varios miembros de una familia. En los casos he-reditarios aparece por una mutación germinal transmitida o surgida de novo, mientras que enlos no hereditarios se debe a dos mutaciones somáticas en una célula de la retina. El presentetrabajo se planteó con objeto de analizar desde el punto de vista genético el gran número de fa-milias con algún miembro afectado de retinoblastoma, recopiladas en los últimos años, paraahondar en los mecanismos moleculares que inciden en este proceso patológico y ofrecerlesconsejo genético.PACIENTES Y MÉTODO: Se han analizado 59 familias con algún miembro afectado de retinoblasto-ma y se ha realizado un estudio citogenético, con marcadores polimórficos y de búsqueda demutaciones en el ADN de leucocitos y de los tumores disponibles.RESULTADOS: En 4 de los 5 casos familiares, se ha establecido la mutación asociada a la enfer-medad, al igual que en 9 de los 13 casos bilaterales esporádicos. En un 7% de los casos unila-terales esporádicos la mutación se encontraba en el ADN leucocitario. La pérdida de heteroci-gosidad como segundo episodio mutacional se debe principalmente a la recombinaciónmitótica.CONCLUSIONES: Entre las mutaciones contabilizadas en nuestra serie, se observa mayor frecuen-cia de mutaciones puntuales de carácter constitucional, que dan origen al primer aconteci-miento mutacional, mientras que la pérdida de heterocigosidad es el episodio mutacional de-tectado mayoritariamente en tumores.

Palabras clave: Retinoblastoma. Citogenética. ADN. Gen RB1.

Early diagnosis of retinoblastoma: usefulness of searching for RB1 gene mutations

BACKGROUND: Retinoblastoma, the intraocular malignancy most common in children, occurs inboth familial and sporadic (bilateral or unilateral). Hereditary predisposition is caused by agerm-line mutation while non-hereditary is due to two somatic mutations in a retinal cell. Thiswork was carried out in order to analyse genetically, the high number of families with some af-fected member and to go deep into the molecular mechanisms responsible of this pathology.PATIENTS AND METHOD: 59 families with one or more affected members were analysed. Cytogene-tics and with polymorphic markers studies were carried out and a search for mutations was per-formed in DNA from white cells and from available tumoral tissue.RESULTS: In four of the 5 familial cases, the responsible mutation was established, the same asin 9 of the 13 bilateral sporadic. In the 7% of the unilateral sporadic cases, mutation wasfound in leucocytary DNA. Lost of heterozygosity as a second mutational event was mainly dueto mitotic recombination.CONCLUSIONS: Among the mutations of our series, a higher frequency of punctual mutations, res-ponsible of the first mutational event, was observed at constitutional level. Lost of heterozygo-sity was the mechanism observed in the majority of the tumours.

Key words: Retinoblastoma. Genetics. DNA. RB1 gene.

Med Clin (Barc) 2001; 116: 365-372

enfermedad más tempranamente. La me-dia de diagnóstico se estima de 6 a 7 me-ses frente a los 24-30 meses de los casosno hereditarios5. Estos resultados han lle-vado a considerar la edad de diagnósticode la enfermedad como determinante delcarácter hereditario de los casos unilate-rales esporádicos. Sin embargo, este datono debe ser concluyente y, por otra parte,la existencia de penetrancia incompleta oexpresividad variable en algunas familias,junto con la existencia de mosaicismos3,6,tienen importantes repercusiones sobre elconsejo genético, ya que dificultan la va-loración del carácter hereditario de la en-fermedad.En 1980 Sparkers et al7 asignaron el gendel retinoblastoma (RB1) al cromosoma13q14, siendo clonado en 1986 porFriend et al8. El gen RB1 tiene un tamañode 180 kb y contiene 27 exones. Codificapara la proteína nuclear p110RB, que seexpresa en todos los tejidos y cuya fun-ción primordial es regular el crecimientoy diferenciación de muchos tipos de cé-lulas, controlando el ciclo celular a travésde distintas interacciones con otras pro-teínas celulares y virales. El gen RB1 seconsidera el prototipo de los genes su-presores de tumor.El desarrollo de numerosas técnicas derastreo de mutaciones durante los últimosaños y su aplicación al estudio del genRB19-15 han permitido identificar más de100 mutaciones diferentes causantes deretinoblastoma: grandes deleciones, dele-ciones exónicas, pequeñas deleciones oinserciones, sustituciones nucleotídicaspuntuales que provocan el cambio de unaminoácido, mutaciones puntuales queafectan al procesado de las secuenciasintrónicas o mutaciones puntuales queoriginan codones de parada prematura.Dado que el diagnóstico clínico presenta-ba importantes limitaciones a la hora dedeterminar el carácter hereditario de laenfermedad en los casos unilaterales es-porádicos, la incorporación del diagnós-tico genético ha permitido ayudar a de-terminar el carácter hereditario de la

enfermedad en este tipo de casos. Ade-más, en los pacientes en quienes se de-tecta una mutación en el ADN constitu-cional se puede establecer la existenciade portadores asintomáticos en la familia(penetrancia incompleta), así como llevara cabo el diagnóstico prenatal en estasfamilias.El desarrollo del proyecto de investigación«Predicción del riesgo de retinoblastomahereditario mediante análisis del ADN»,en el cual se incluye el presente trabajode investigación, surgió con la finalidadde dar respuesta desde el ámbito genéti-co a los numerosos casos de familias conalgún miembro afectado de retinoblasto-ma que, a lo largo de los últimos años, sehan recogido en diferentes hospitales,principalmente de la Comunidad Valen-ciana. Debido a la variabilidad mutacio-nal, la búsqueda de mutaciones en el genRB1 constituye una ardua tarea, dado elgran número de técnicas diferentes quese tienen que utilizar. Sin embargo, eldiagnóstico temprano de la enfermedades importante para preservar la visión delos ojos afectados, asegurar la superviven-cia del paciente y conocer la situación desus familiares.

Pacientes y método

Pacientes y muestras de ADN

El presente trabajo incluye el análisis de 67 pacientescorrespondientes a 59 familias con algún miembroafectado de retinoblastoma. La mayoría de casos pro-vienen de la Comunidad Valenciana y fueron diag-nosticados en los Servicios de Oftalmología y de On-cología Pediátrica del Hospital La Fe. Completada lahistoria clínica, se realizó un árbol genealógico decada familia y se les clasificó en diferentes categoríasde acuerdo con la manifestación de la enfermedad:casos familiares, 13 pacientes pertenecientes a 5 fa-milias; casos esporádicos bilaterales, 13; casos espo-rádicos unilaterales, 41 (fig. 1).De algunas de estas familias que habían sido diag-nosticadas con anterioridad al inicio de este trabajo,se contaba con muestra de tejido tumoral embebidoen parafina (27 casos). En algunos de los casos diag-nosticados durante el período de realización de estetrabajo (1992-1999) se pudo obtener muestra tumo-ral fresca (12 casos). De todos los pacientes y fami-liares cercanos se obtuvo ADN constitucional y, enlos casos en que fue posible, se obtuvo ARN total,

tanto de sangre periférica como de tejido tumoralpara la obtención de cADN.El ADN de leucocitos y tejido tumoral fresco se extra-jo utilizando procedimientos estándar16. El ADN detumores embebidos en parafina se extrajo siguiendoel método de Shibata et al17 modificado por Onadim yCowell18.

Análisis citogenético

El cariotipo constitucional fue realizado en los linfoci-tos de la sangre estimulados con fitohemoaglutini-na19. Los cromosomas se identificaron mediante ban-deo G y R20,21.

Hibridación con sondas de cADN

Se dirigieron con 80 U de la enzima de restricciónHindIII 10 ng de ADN extraído de leucocitos de san-gre periférica y de tejido tumoral fresco. Los fragmen-tos resultantes se separaron en gel de agarosa al 0,8%y se transfirieron a membrana de acuerdo con la téc-nica de Southern22. Los filtros se hibridaron con lasonda p4.95BT marcada con digoxigenina, y las ban-das se detectaron con un anticuerpo antidigoxigeninamarcado con fosfatasa alcalina y posterior utilizaciónde un sustrato quimioluminiscente23.

Análisis mediante marcadores polimórficos

En la tabla 1 se exponen las características de losmarcadores polimórficos utilizados en este estudio.La electroforesis del ADN se llevó a cabo, dependien-do del marcador, en geles de agarosa o poliacrilami-da, y la detección, mediante bromuro de etidio o tin-ción con plata24.

Análisis de mutaciones

La región promotora y los 27 exones del gen RB1, asícomo las secuencias intrónicas situadas hasta 50-60pb antes y después de cada exón, se amplificaronmediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR)utilizando los cebadores descritos por Hogg et al25,excepto los correspondientes a la región promotora yexones 5, 24 y 25, que originaban fragmentos dema-siado grandes para llevar a cabo el análisis mutacio-nal y fueron tomados de Shimizu et al26. La tempera-tura de reasociación varió entre 48 y 64 °C, y seemplearon enzimas de restricción en aquellos casosen los que el fragmento obtenido era superior a los300 pb. El análisis mutacional se llevó a cabo me-diante la técnica SSCP (polimorfismo de conformaciónde cadena sencilla)27, que permite observar variacio-nes en la movilidad electroforética de las cadenas sen-cillas del ADN provocadas por pequeños cambios enla secuencia nucleotídica.En los casos en los que la mutación detectada modi-ficaba un lugar de reconocimiento de alguna enzimade restricción, se utilizaron 15 µl de producto de laPCR y 10 U de la enzima, y las bandas se visualiza-ron en un gel de agarosa al 2%.

MEDICINA CLÍNICA. VOL. 116. NÚM. 10. 2001

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Marcador Tipo de polimorfismo Localización Método de detección Enzima Sonda

BamHI RFLP Intrón 1 PCR BamHI(posición 2300) Southern blot P123M1.8

Rbi2 o Microsatélite Intrón 2 PCRAFM058xd6 (repetición CA) (inicio en 14868)

KpnI RFLP Intrón 4 Southern blot KpnI P95HS0.5Rbi4 Microsatélite Intrón 4 PCR

(repetición TG) (inicio en 43218)XbaI RFLP Intrón 17 PCR XbaI P88R2.5

(posición 99426) Southern blotP68RS2.0 VNTR Intrón 17 Southern blot RsaI P68RS2.0

(inicio en 123912)Rb1.20 Microsatélite Intrón 20 PCR

(repetición CTTT) (inicio en 156895)RB1.26 RFLP Intrón 25 PCR DraI

(posición 174351)

TABLA 1

Relación y características de los marcadores polimórficos localizados en el gen RB1, utilizados en este estudio

RFLP: polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción; VNTR: variaciones en el número de repeticiones en tándem; PCR: reacción en cadena de la polimerasa.

Secuenciación

Los fragmentos de PCR que presentaron un patrónde SSCP anómalo se purificaron y secuenciaron enun secuenciador automático.

Resultados

Los resultados del análisis mutacional rea-lizado en el gen RB1 se presentarán agru-pados en tres apartados, dependiendo dela existencia de historia previa de la enfer-medad y de la forma de presentación deltumor.

Casos familiares

De los 5 casos familiares existentes ennuestra serie, fue posible establecer lamutación asociada a la enfermedad a ni-vel constitucional en cuatro (80%), comose observa en la tabla 2.La variación encontrada en la familiafRB49 estaba presente en el ADN consti-tucional del paciente, de su madre noafectada y en el ADN tumoral de ambashermanas afectadas fallecidas (no se dis-ponía de muestra de ADN constitucionalde estas últimas).El análisis de marcadores intragénicos entodas estas familias ha permitido conocerel haplotipo con el que segrega la enfer-medad en cada una de ellas (fig. 2) y,por tanto, poder realizar también un diag-nóstico indirecto útil en el caso de no ha-ber podido detectar la mutación asociadaa la enfermedad, como sucede en la fa-milia fRB1 de nuestra serie, así como alconocimiento de portadores asintomáti-cos con riesgo de padecer la enfermedado de transmitirla.

C. NÁJERA ET AL.– DIAGNÓSTICO TEMPRANO DEL RETINOBLASTOMA: IMPORTANCIA DE LA BÚSQUEDA DE MUTACIONES EN EL GEN RB1

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fRB1 fRB17

fRB35

fRB36fRB49

Casos familiares

fRB9 fRB10fRB2

fRB26 fRB41

fRB5

fRB44

fRB22

fRB54fRB50

fRB32 fRB34 fRB39

Casos bilaterales esporádicos

fRB3 fRB6 fRB8 fRB11fRB7 fRB12

fRB13 fRB14 fRB19fRB18fRB16fRB15

fRB4

fRB20 fRB21 fRB23 fRB24 fRB25 fRB27

fRB28 fRB29 fRB30 fRB31 fRB33 fRB37 fRB38

fRB40 fRB42 fRB43

fRB52fRB51 fRB56

fRB46

fRB55fRB53fRB48

fRB45 fRB47

fRB57 fRB58 fRB59

Casos unilaterales esporádicosFig. 1. Árboles genealógicos de las familias estudiadas.

Casos esporádicos bilaterales

Nuestra serie contenía 13 casos bilatera-les. En la tabla 3 se exponen las caracterís-ticas de los casos en los que se encontró lamutación predisponente. En la figura 3 seobserva la mutación detectada en el ADNconstitucional y tumoral del paciente de lafamilia fRB34, así como el lugar de restric-ción que genera para la enzima DdeI.Así pues, del total de casos bilaterales, seencontró la mutación hereditaria causanteen 9 casos (69%). En las 4 familias res-tantes (fRB2, fRB5, fRB9 y fRB41) no seencontró la mutación constitucional pre-disponente, aunque en los pacientes co-rrespondientes a las familias fRB2 yfRB41 se detectó pérdida de heterocigosi-dad en células tumorales, siendo en elprimer caso el cromosoma perdido de ori-gen materno y, por tanto, el primer episo-dio mutacional debería proceder de víapaterna; en el segundo caso, por falta demuestra de ADN de los padres, no sepudo averiguar el origen parental, aun-que el análisis densitométrico de la mues-tra tumoral indicó que la pérdida de hete-rocigosidad se debía a la pérdida de uncromosoma y duplicación del otro.

Casos unilaterales esporádicos

De los 41 pacientes esporádicos unilate-rales, la mutación constitucional se en-contró en tres de ellos (7%), correspon-dientes a las familias fRB24, fRB33 yfRB59. En la tabla 4 se observan las ca-racterísticas de estas mutaciones.En cuanto al tumor, en el paciente de lafamilia fRB33 se observa, además, pérdi-


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N.º de familia Exón Dominio proteico Mutación Efecto Genera lugar de restricción para

fRB17 19 B Transversión Tyr606→Stop AluIfRB35 1 Aminoterminal Duplicación 23 pb Se altera la pauta de lectura produciendo

parada prematura en el exón 3fRB36 19 B Deleción G (617) Se altera la pauta de lectura produciendo

parada prematura en el exón 19 (622)fRB49 20 B Transversión G1n685→Pro Acil

A→C

TABLA 2

Mutaciones encontradas en los casos familiares de la serie estudiada

N.º de familia Exón Dominio proteico Mutación Efecto Genera lugar de restricción para

FRB10 20 B Inserción T Desplazamiento de la pauta de lectura creando codón de parada en exón 20

FRB44 20 B Transición G1n685→StopC→T

FRB22 Intrón Carboxiloterminal Transversión Se genera una secuencia aceptadora para MaeI23 T→A (-6) el procesado del intrón 23. Pérdida de

exones 24-27FRB34 18 Secuencia Transición Arg579→Stop DdeI

espaciadora C→TFRB54 10 A Deleción Desplazamiento de la pauta de lectura BclI

G (337) generando codón de parada en exón 10FRB32 Deleción intersticial Pérdida de un alelo constitucionalFRB39 Deleción intersticial Pérdida de un alelo constitucionalFRB50 Deleción intersticial Pérdida de un alelo constitucionalFRB26 Translocación

TABLA 3

Mutaciones en el ADN constitucional encontradas en los casos bilaterales de nuestra serie

Fig. 2. Árboles genealógicos de las familias de los pacientes con retinoblastoma familiar y haplotipos con losque segrega la enfermedad en estos casos.

BamHIRbi2

P95HS0.5Rbi4Xbal

P68RS2.0RB1.20

P36R0.6R1.26

RBBamHIRbi2Rbi4Xbal

P68RS2.0RB1.20

R1.26

BamHIRbi2Rbi4Xbal

P68RS2.0RB1.20RB1.26

RBBamHIRbi2

P95HS0.5Rbi4Xbal

P68RS2.0RB1.20RB1.26

RBBamHIRbi2Rbi4

RB1.20RB1.26

fRB1 fRB17

fRB36

fRB49

fRB35

da de heterocigosidad, siendo el aleloperdido el de origen paterno, por lo que lamutación presente en el tejido constitu-cional se encuentra en el cromosoma ma-terno. La hermana no afectada, en la queno se encuentra la mutación, compartehaplotipo con la paciente, por lo que lamutación o bien ha surgido de novo oexiste un mosaico germinal en la madre.Esta paciente fue diagnosticada a unaedad muy tardía. En el paciente de la fa-milia fRB59, la pérdida del exón 5 no al-tera la pauta de lectura15, y en este casoel origen del cromosoma portador de lamutación es paterno, ya que en el tumorse observa la pérdida del alelo materno ylos estudios de dosis génica confirman laduplicación del paterno.En el tumor, además de los 2 casos ante-riores, se observa la pérdida de heteroci-gosidad en los pacientes esporádicos uni-laterales correspondientes a las familiasfRB42, fRB47, fRB51, fRB53 y fRB57.Asimismo, en el tumor del paciente de lafamilia fRB51 se observó la hipermetila-ción de la región promotora, por lo que selocalizaron las dos mutaciones tumorales,ausentes en el ADN constitucional, exclu-yendo la posibilidad de retinoblastomahereditario. En el paciente de la familiafRB47 se pudo realizar el análisis densito-métrico en el ADN tumoral y se observódoble dosis génica, lo que confirmabaque la pérdida de heterocigosidad se ori-ginaba por la pérdida de un cromosoma yla duplicación del otro.Tanto mediante las sondas de ADNccomo mediante marcadores intragénicosse pudo observar en el ADN tumoral delos pacientes correspondientes a las fa-milias fRB19, fRB27 y fRB30 la pérdidacasi total de ambas copias del gen. Estadeleción en homocigosis no se detectóconstitucionalmente, lo que descarta sucarácter hereditario. La existencia de se-ñales muy débiles de hibridación con al-guna sonda en fragmentos en los que seha detectado una deleción puede expli-carse por la presencia de células norma-les que contaminan la amplificación de lamuestra tumoral. En las dos últimas fami-lias, la utilización de marcadores extra-génicos permitió deducir que en estospacientes el primer acontecimiento muta-cional consistía en una deleción intersti-cial y el segundo en una recombinaciónmitótica que originó una duplicación dedicha deleción.

Los tumores de los pacientes correspon-dientes a las familias fRB52 y fRB55 presentaban cambios, en el primer caso debido a una transversión G→C, que ori-ginaba el cambio de Ala a Pro en el exón17, y en el segundo debido a una inser-

ción de una A en el exón 18 que altera lapauta de lectura originando un codón de parada en el exón 19. El hecho de nohaber detectado otro episodio mutacionaltumoral no permite descartar el carácterhereditario de la enfermedad en estas familias.

Discusión

El retinoblastoma es uno de los pocos tu-mores cuyo desarrollo depende única-mente de un gen. Por este motivo estegen fue el primer gen supresor de tumo-res identificado y el prototipo de estudiode esta clase de genes.


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N.º de familia Exón Dominio proteico Mutación Efecto

fRB24 14 A Transversión A→T Lys447→StopfRB33 8 Aminoterminal Transición C→T Arg117→StopfRB59 Intrón 5 Aminoterminal Transición G→A Altera el lugar de procesado

y provoca la pérdida del exón 5

TABLA 4

Características de las mutaciones encontradas en el ADN constitucional en tres pacientes esporádicos unilaterales

Fig. 3. Mutación detectada en uno de los casos de retinoblastoma esporádico bilateral (fRB34) que origina unpatrón anómalo en el ADN constitucional y tumoral (A) debido al cambio de arginina por codón de parada (B),que genera un lugar de restricción para la enzima DdeI (C).

RB-192 RB-193 RB-194 RB-195

RB-196 RB-197

RB-198 RB-198T

fRB34

RB-196 RB-197 RB-198 RB-198T

221 pb

121 pb

97 pb

M RB-196 RB-197 RB-198

A B

C

Con objeto de detectar el desarrollo denuevos tumores y llevar a cabo un diag-nóstico temprano de la enfermedad, lospacientes con retinoblastoma y sus her-manos son sometidos durante los prime-ros 3 a 5 años de vida a revisiones oftal-mológicas periódicas que no resultanconcluyentes en cuanto a la determina-ción del carácter hereditario o no del tu-mor, debido a la existencia de portadoressanos de una mutación en el gen RB1,de mutaciones con reducida expresividady de mosaicismo mutacional. El análisisgenético sería, en principio, la única he-rramienta que puede permitir esta dife-renciación.El tamaño del gen RB1, unido a la dife-rente naturaleza de las mutaciones cau-santes, hace necesaria la utilización deun amplio abanico de técnicas de análisisgenético, sin que ello comporte la seguri-dad de detectar todas las mutaciones. Lasmutaciones puntuales y pequeñas dele-ciones/inserciones constituyen el tipo deanomalías más frecuentemente encontra-do como origen del desarrollo del retino-blastoma3,10,28. Sin duda, el método máseficaz para detectar mutaciones puntua-les asociadas a una determinada enfer-medad es la secuenciación directa delgen, aunque cuando se analiza un gencomo RB1, que se extiende a lo largo de200 kb, la aplicación de esta metodologíaresulta ardua, laboriosa y económica-mente gravosa. Por esta razón, durantelos últimos años se han desarrollado dife-rentes métodos que permiten detectarmutaciones puntuales y pequeñas dele-ciones/inserciones de forma rápida y sen-cilla. La técnica de SSCP, utilizada ennuestro estudio, es buen ejemplo.En nuestra serie, en los casos familiaresfRB17 y fRB36, al igual que en los casosbilaterales esporádicos fRB10, fRB34,fRB44 y fRB54, y en los unilateralesfRB24 y fRB33, la presencia de mutacio-nes que generan una señal de paradaprematura confirma su carácter oncogé-nico. Las mutaciones detectadas en lospacientes de las familias fRB33 y fRB34consisten en cambios C→T en el codónCGA (Arg). El 70% de los cambios pun-tuales se localizan en los 14 codonesCGA que codifican para arginina existen-tes en el gen RB1 y originan codones deparada10,28.El paciente de la familia fRB22 presentaconstitucionalmente una mutación pun-tual localizada en el extremo 3’ de la se-cuencia intrónica 23 (posición –6), nodescrita con anterioridad. En la secuenciaconsenso de procesado de secuencias in-trónicas, existe una secuencia altamenteconservada de polipirimidinas. El cambionucleotídico detectado en este pacientese localiza dentro de esta secuencia.Además, dentro de la secuencia acepto-ra, la posición (–6) está conservada en un

91%, lo que indica que este cambio po-dría afectar el procesado del intrón 23 yprovocar la síntesis de una proteína alte-rada. Aunque este cambio sólo afectaríaal final de la proteína, en el exón 25 se lo-caliza la secuencia de 17 aminoácidosdenominada NLS (secuencia de localiza-ción nuclear)29, encargada de transportarla proteína pRB hasta el núcleo, por loque el paciente de esta familia podría te-ner problemas para desplazar la proteínapRB hasta el núcleo.Otro aspecto de interés que debe tenerseen cuenta se refiere a los casos de pene-trancia incompleta o expresividad varia-ble9,30-32, o casos en los que la baja pene-trancia y la reducida expresividad son unreflejo de la existencia de mosaicismo,como sucede en algunas de nuestras fa-milias (fRB17, fRB35 y fRB49), en lasque se plantean serios problemas a lahora de establecer un consejo genéticopor la existencia de mutación constitucio-nal en pacientes no afectados. La familiafRB17 corresponde a un caso de expresi-vidad reducida en el padre (unilateral),probablemente debido a una mutaciónde novo en una etapa tardía de su desa-rrollo embrionario, o a que, por azar, elsegundo acontecimiento mutacional ne-cesario para iniciar el desarrollo tumoralno se produjo en el ojo no afectado. Latransición T→A detectada en esta familiase había descrito previamente33 en uncaso bilateral esporádico.En el caso de la familia fRB35, 2 niñosrelativamente alejados en el árbol genea-lógico fueron diagnosticados de tumorunilateral. Aunque en principio se pensóque pudiera tratarse de un caso de seu-dobaja penetrancia34 en el que, por azar,se habrían producido dos mutaciones norelacionadas en individuos de la mismafamilia, entrevistas con algunos miem-bros de la familia permitieron conocer laexistencia de una prima del abuelo deuno de los afectados que fue enucleada.Este dato, unido a la detección en ambospacientes de una misma mutación en elexón 1, hizo pensar que se podía tratarde un caso de penetrancia incompleta,ya que la mutación y el haplotipo asocia-do con la enfermedad eran compartidospor al menos cuatro familiares asintomá-ticos. Sin embargo, esta mutación originaun codón de parada en el exón 3, por loque generaría una proteína afuncional.Onadim et al9 describieron un caso simi-lar, y el análisis detallado de la secuencianucleotídica cercana a la posición de lamutación detectada indicó la posibilidadde que el cambio nucleotídico detectadogenerase una secuencia de procesado deintrones alternativa a la secuencia nor-mal. Otra hipótesis podría ser la presen-cia de una segunda mutación adicional(inserción o deleción) en la secuencia delADN anterior al codón de parada prema-

tura que permita restablecer la pauta delectura.En la familia fRB49, la mutación estáasociada a una aparición temprana de laenfermedad y a una progresión grave deldesarrollo tumoral en las 2 hijas, lo queprovoca la muerte tras el desarrollo de tu-mores secundarios. Además, la mutaciónhabía sido descrita con anterioridad porBlanquet et al33 asociada a un caso bila-teral esporádico. Sin embargo, la madrecorresponde a un caso de portadora nopenetrante, lo que puede atribuirse aque, por azar, el segundo episodio muta-cional necesario para inactivar el alelonormal remanente no se haya produ-cido35, aunque también podría ser unejemplo de la implicación de otros facto-res, independientes de la localización onaturaleza de la mutación, implicados enel desarrollo tumoral.El hecho de no haber encontrado la mu-tación causante en el quinto caso familiar(fRB1) no descarta la posibilidad de queésta esté localizada fuera de la regiónamplificada, o bien provoque únicamenteun cambio conformacional débil, tal vezpor su situación dentro de una regiónpoco sensible a los cambios conforma-cionales. Por ejemplo, en el gen de la he-mofilia A la mitad de las mutaciones selocalizan en regiones intrónicas alejadasdel exón36. Además, algunos de los traba-jos publicados sobre el retinoblastomadescriben que ciertas mutaciones se handetectado únicamente a través de la se-cuenciación directa de cada uno de losexones del gen RB110. Así, Lohmann etal10, utilizando esta técnica directa, de-tectaron la mutación germinal en el 83%de sus pacientes con retinoblastoma fa-miliar o bilateral, mientras que Blanquetet al33, empleando la técnica de gradien-tes desnaturalizantes (DGGE), sólo la de-tectaron en el 22%. La detección ennuestra serie supone el 80% de los casosfamiliares y el 69% de los bilaterales, loque significa un 72% en el total de am-bos. Esto hace pensar que el estudio molecular de los casos familiares y bilate-rales esporádicos constituye una herra-mienta eficaz para llevar a cabo el diag-nóstico genético de la enfermedad, conimportantes repercusiones en el consejogenético y el diagnóstico prenatal.El análisis de marcadores polimórficos intragénicos permitió detectar en otros 3 pacientes con retinoblastoma bilateralesporádico la pérdida constitucional dealelos correspondientes a una de las doscopias del gen RB1 y, por consiguiente,establecer el carácter hereditario de laenfermedad. En estos 3 casos, el cromo-soma portador de la mutación que pre-dispone es el cromosoma de origen pa-terno. Estos resultados están de acuerdocon las observaciones de otros autores4,37.Esta preferencia en el origen paterno de


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las mutaciones de novo podría explicarsepor la mayor mutabilidad que implicaríael mayor número de mitosis que tienenlugar en la espermatogénesis respecto ala oogénesis, y porque el genoma de lascélulas germinales femeninas está alta-mente hipometilado en relación con lasmasculinas38. Esto posibilita la apariciónde mutaciones debidas a la desamina-ción de la 5-metilcitosina en células ger-minales masculinas, lo que origina transi-ciones C→T39.Entre los pacientes con retinoblastomaunilateral esporádico de nuestra serie, seha detectado una mutación germinal enun 7%, porcentaje muy similar al descritoen otras series33,40. Sin embargo, dadoque una pequeña parte de las mutacio-nes no son detectadas, se duda de la efi-cacia del análisis molecular en estos pa-cientes. Cabe destacar el paciente de lafamilia fRB24 al que se le diagnosticó la enfermedad a los 8 años de edad. Loscasos unilaterales esporádicos no heredi-tarios suelen diagnosticarse a una edadmás avanzada que los hereditarios, loque se utiliza en el diagnóstico clínicopara señalar su carácter hereditario o no.Cowell et al41 propusieron que la búsque-da de mutaciones en casos unilateralessólo debería llevarse a cabo, en principio,en aquellos de edad de diagnóstico tem-prana. Sin embargo, Lohmann et al3 noencuentran diferencias significativas enla edad del diagnóstico entre pacientescon mutaciones constitucionales y conmutaciones somáticas. Nuestros resulta-dos confirman que la edad de diagnósti-co no puede considerarse un parámetrodiscriminatorio para determinar el carác-ter hereditario de los casos unilaterales.Debido a que en el ADN tumoral debe-rían estar presentes los dos aconteci-mientos mutacionales, la disponibilidadde tejido tumoral y la exclusión de uno uotro acontecimiento en el ADN constitu-cional ofrecerían mayor garantía a la horade confirmar o descartar el carácter here-ditario. Hoy día, debido a los tratamientoscada vez más conservadores, en muchoscasos no puede plantearse el estudio delADN tumoral, con la consiguiente reper-cusión en la interpretación de los resulta-dos. Entre las muestras tumorales de quese disponía para la realización de este es-tudio, 12 eran tumores frescos y, de los27 incluidos en parafina, sólo fue posiblela amplificación en 10 de ellos. El segun-do suceso mutacional implicaba pérdidade heterocigosidad en 12 tumores: nuevefrescos y tres incluidos, lo que representaun 54,5%, aunque este porcentaje seelevaría al 75% considerando sólo los tu-mores frescos, porcentaje similar al des-crito por otros autores42,43, y se reduciríaal 30% para los incluidos en parafina,posiblemente porque en el proceso deseparación de la muestra tumoral inclui-

da se pudo arrastrar parte de tejido ocu-lar normal, produciendo contaminaciónde la muestra que pudo enmascarar lapérdida de alelos. Por otro lado, en 3 pa-cientes con retinoblastoma unilateral he-mos detectado deleciones en homocigo-sis en muestras de tejido tumoral fresco,no detectadas constitucionalmente, queapuntan al carácter no hereditario de laenfermedad y, por tanto, a la eliminacióndel riesgo por parte de hermanos y des-cendientes y de las revisiones periódicasen los mismos.El mecanismo fundamental de pérdidade heterocigosidad como segundo episo-dio mutacional se debe en nuestra serie,principalmente, a la recombinación mitó-tica, aunque se detectó también algúncaso de no disyunción mitótica con o sinduplicación. Si bien la recombinación mi-tótica es un proceso frecuente en célulasnormales, la inestabilidad genética cons-tituye una de las características de lascélulas neoplásicas que podría venir de-terminada por un descontrol en los me-canismos de entrecruzamiento genético,lo que explicaría la mayor frecuencia derecombinación mitótica en las células tu-morales44-46.En cuanto al hecho de si la pérdida deheterocigosidad tiene relación con el fe-notipo, existen resultados contradictorios.Así, Kato et al47 observaron que la edad aldiagnóstico en pacientes con retinoblasto-ma hereditario cuyo tumor presentabapérdida de heterocigosidad era significati-vamente más alta que la edad al diagnós-tico de aquellos pacientes cuyos tumoresno presentaban dicha pérdida. Por elcontrario, Munier et al48 observaron en loscasos hereditarios de la enfermedad quela presencia de pérdida de heterocigosi-dad estaba asociada de forma preferentecon una edad al diagnóstico significativa-mente más temprana. En nuestra serie, lamedia de edad al diagnóstico entre lospacientes que tienen pérdida de heteroci-gosidad (32,2 meses) no difiere signifi-cativamente de la media de edad de los pacientes que no la presentan (29,2 meses).Entre las mutaciones contabilizadas ennuestra serie, es destacable la mayor fre-cuencia de mutaciones constitucionalespuntuales detectadas (11/15) y que cons-tituyen el primer episodio mutacional,frente a las mutaciones detectables portécnicas de citogenética y análisis demarcadores polimórficos. Por el contrario,son estas últimas técnicas las que detec-tan la mayor parte de las mutaciones queconstituyen el segundo acontecimientomutacional, ya que la pérdida de hetero-cigosidad es el episodio mutacional mayo-ritariamente localizado en el tumor. Estosresultados permiten ahondar en los me-canismos causantes de la enfermedad,así como conocer las limitaciones de las

técnicas utilizadas y sus posibilidades deaplicación en el ámbito asistencial, con elfin de proporcionar un adecuado consejogenético a las familias afectadas de reti-noblastoma.

AgradecimientoEste trabajo ha sido financiado por la CICYT(SAF 92/0206). F. Sánchez ha sido beneficia-rio de una beca de la Conselleria de Educa-ción y Ciencia de la Comunidad Valenciana.Nuestro agradecimiento a las Dras. VictoriaCastell e Inmaculada Serra por proporcionar-nos los pacientes clínicamente diagnosticados,así como al Dr. Miguel Hernández por sumi-nistrarnos las muestras tumorales.

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Diagnóstico temprano del retinoblastoma: importancia de la búsqueda de mutaciones en el gen RB1