Diagnóstico rápido de virusen frutales de hueso mediante la técnicainmunoenzimática ELISA-DAS.

M. CAMBRA, G. LLÁCER, D. PÉREZ DE SAN ROMÁN, P. MORENO y V. DURBÁ.

La certificación de plantas frutales exige la realización de un gran número deensayos de diagnósticos virales en el menor tiempo posible. La puesta a punto, parafrutales de hueso, de la técnica del microinjerto de ápices caulinares in vitro, comométodo de obtención de plantas libres de virus, requiere asimismo una técnica dedetección rápida y fiable que pueda aplicarse muy precozmente. El método ELISAreúne todos estos requisitos.

En el presente trabajo se establecen las condiciones óptimas para la aplicacióndel método ELISA-DAS al diagnóstico de «prunus ring spot virus», «prune dwarf virus»y «chlorotic leaf spot virus» en frutales de hueso: dosis idóneas de tapizado y con-jugado, tampones de extracción, cepas de virus detectables, material vegetal y épocasde toma de muestras. A este respecto se ha comprobado la posibilidad de detectarvirus en ramos incluso en el invierno, lo que permite la realización de diagnósticosen cualquier época del año. Se discuten las ventajas de la técnica, en comparacióncon los métodos tradicionales de diagnóstico, para programas que requieren analizargran número de muestras en un periodo corto, y se expone la posibilidad de de-tectar cualquiera de los 3 virus (o mezcla de ellos) en un solo ensayo, utilizando unantisuero polivalente artificial.

M. CAMBRA, G. LLACER, C. PÉREZ DE SAN ROMÁN, P. MORENO y V. DURBÁ. Departa-mento de Portección Vegetal, CRIDA-07 (Levante), INIA. Moneada (Valencia).

INTRODUCCIÓN

Los frutales de hueso pueden estar afec-tados por distintos tipos de virus. El másimportante, a nivel europeo, es el virus dela sharka («plum pox virus» o PPV), quese transmite de forma natural por pulgo-nes y afecta al ciruelo, albaricoquero ymelocotonero en, al menos, 16 países(OEPP, 1974). El virus de la sharka no hasido detectado hasta el momento en Espa-ña (CAMBRA, LLÁCER y GELLA , 1981), pe-ro representa una amenaza constante de-bido a su presencia en Francia, Holanday otros países europeos con los que se

mantienen frecuentes intercambios de ma-terial vegetal.

Entre los virus más extendidos en Espa-ña se hallan los del grupo I LAR (isomé-tricos, lábiles, «ring spot»), que puedentransmitirse por semilla y polen y afectana todos los frutales de hueso. Sus repre-sentantes más característicos en Europason «prunus ring spot virus» (PRSV) y«prune dwarf virus» (PDV). Son virus típi-camente insidiosos, que no producen da-ños llamativos pero que reducen, a menu-do, el crecimiento y las cosechas en por-centajes nada despreciables (LLÁCER, 1978).

Otro virus muy extendido en España esel «chlorotic leaf spot virus» (CLSV) que,aunque muchas veces latente, es capaz deproducir enfermedades graves en las si-guientes especies y variedades (LLÁCER , 1978):

— Albaricoquero: «Viruela» de la varie-dad Búlida, «Roseta» de la variedadLuizet e incompatibilidades intraespe-cíficas sobre el patrón A-843.

— Melocotonero: Incompatibilidad en lacombinación Ribet/ciruelo de EnteGF-43.

— Ciruelo: «Falsa sharka» («pseudo plumpox») en diversas variedades y «Hendi-duras de la corteza» («bark split») enciruelo de Ente sobre todo.

Ante la ineficacia de los métodos direc-tos, la lucha contra los virus que afectana los árboles frutales se basa en multipli-car exclusivamente plantas sanas, previaeliminación de las contaminadas, para ase-gurar a viveristas y productores un mate-rial inicial sano. Estos programas de se-lección sanitaria exigen métodos de diag-nóstico fiables, sensibles, rápidos, económi-cos y capaces de ser utilizados a granescala. Los métodos tradicionales de diag-nóstico consisten fundamentalmente en lainoculación por injerto de plantas leñosas'indicadoras (LLÁCER, 1978). Aunque estosmétodos son bastante fiables y sensibles,poseen el gran inconveniente de ser lentos(de 2 meses a 3 años), caros y difícilesde emplear en gran escala (requieren, porlo general, importantes superficies de vi-vero e invernadero acondicionado y mu-chas operaciones manuales).

Entre las técnicas de diagnóstico recien-temente incorporadas a la patología vege-tal, el denominado «método inmunoenzi-mático», y abreviadamente ELISA («Enzyme-Linked Immunosorbent Assay»), ha venidoa perfeccionar o sustituir a otras técnicasmás tradicionales, gracias a su alta sensi-bilidad, especificidad, rapidez, economíay capacidad de ser usado sobre gran nú-

mero de muestras de una forma rutinariay objetiva (SÁNCHEZ-VIZCAÍNO y CAMBRA, 1981).

El primer estudio de aplicación del méto-do ELISA, en su variante de doble «sand-wich» de anticuerpos (ELISA-DAS), a ladetección de virus de vegetales fue publi-cado por VOLLER et al. (1976). A conti-nuación CLARK et al (1976), DUNEZ (1977),BARBARA et al (1978) y FLEGG y CLARK (1979)pusieron de manifiesto el evidente interésdel método ELISA para la detección devirus de frutales, concretamente el virus dela sharka, los virus ILAR y el CLSV.

La aparición en España de la reglamen-tación del Ministerio de Agricultura, regu-lando la certificación de plantones de fru-tales, exigirá la realización de un gran nú-mero de ensayos de diagnóstico viral en elmenor tiempo posible. Por otra parte, enel CRIDA-07 (Levante) del INIA se estátrabajando en la puesta a punto de la téc-nica del microinjerto de ápices caulinaresin vitro para frutales de hueso (NAVARROet al, 1980 y 1982) como método de obten-ción de plantas libres de virus, lo que re-quiere asimismo una técnica de detecciónrápida y fiable que pueda aplicarse muyprecozmente. El método ELISA era el quemejor parecía reunir todos estos requisitos,por sus características y por la posibilidadteórica de utilizarlo con antisueros poliva-lentes artificiales que permitiesen detectarla presencia de cualquiera de los virus ci-tados en un solo análisis, como a continua-ción se describe.

El presente trabajo tiene por objeto ex-poner también los estudios realizados sobrelas condiciones de aplicación del métodoal diagnóstico de los virus ILAR y CLSVen frutales de hueso en España, compa-rando sus resultados con las técnicas con-vencionales y estudiando el tipo de mate-rial vegetal y la época idónea de recolec-ción del mismo para realizar la técnicacon máxima fiabilidad. Todos estos datosson necesarios para aplicar el método a

gran escala y no habian sido abordadosanteriormente.

MATERIAL Y MÉTODOS

Material vegetal

Para la puesta a punto de la técnicainmunoenzimática ELISA se utilizó unacolección de melocotoneros, variedadesCardinal y Dixired, injertados sobre me-locotonero de semilla Nemaguard e ino-culados por injerto, en septiembre de 1978,con distintas cepas de los virus PRSV,PDV y CLSV. Estos melocotoneros se cul-tivaron en macetones situados en un re-cinto al aire libre protegido por mallaanti-pulgón.

Posteriormente se ensayó la técnica conotros materiales frutales, entre los que po-demos destacar los siguientes: ciruelos eu-ropeos e híbridos naturales almendro Xmelocotonero de colecciones de la EstaciónExperimental de Aula Dei (Zaragoza) delCSIC y clones de melocotonero Cofrentes,albaricoquero Búlida y ciruelo Pollizo deMurcia preseleccionados en el Centro deLevante (CRIDA-07) del INIA.

Antisueros y cepas de virus

Los antisueros brutos de PRSV y PDVfueron suministrados por el Dr. Fulton,del Department of Plant Pathology de laUniversidad de Wisconsin-Madison (USA),y los de CLSV se recibieron del Dr. Du-nez, de la Station de Pathologie Végétale,Centre de Recherches Agronomiques deBordeaux (Francia), y del Dr. Clark, dela East Mailing Research Station, Maids-tone (Gran Bretaña).

Los sueron anti-PRSV y anti-PDV seensayaron frente a las siguientes cepas devirus ILAR: «Prunus ring virus», «Necro-

tic ring spot virus», «Necrotic ring virus»,«Necrotic ring mottle virus», «Rugose mo-saic virus», «Almond calico virus», «Chloro-tic ring virus», «Chlorotic necrotic ringvirus» y «Sour cherry yellows virus».

Los sueros anti-CLSV se ensayaron, a suvez, frente a las cepas: «In 21» (Prunussalicina), «bark split virus», «pseudo plumpox virus» y «butteratura».

Todas las cepas de virus citadas hastaahora estaban inoculadas sobre la colec-ción de melocotoneros descrita en el apar-tado de material vegetal y procedían de laStation de Recherches d'ArboricultureFruitiére de la Grande Ferrade del INRAde Burdeos (Francia).

Los sueros anti-CLSV se ensayaron ade-más frente a cepas de «Viruela» presentesen albaricoqueros Búlida y ciruelos Pollizosde Murcia.

Preparación de reactivos

La purificación de inmunoglobulinas serealizó a partir de los antisueros brutossiguiendo la técnica descrita por CAMBRA,MORENO y NAVARRO (1979) con ligeras mo-dificaciones. El antisuero se diluyó 1/10 enagua destilada estéril y se precipitaron susinmunoglobulinas con una solución satura-da de sulfato de amonio añadida volumena volumen. Tras reposo de 30 minutos a4o C se centrifugó 20 minutos a 20.000 gy el precipitado fue resuspendido en 2 mi.de agua fisiológica tamponada (AFT),0,1 M, pH 7,2 (0,8 por 100 CINa, 0,04por 100 PO4H2Na.2H2O, 0,27 por 100PO4HNa2.12H20, 0,02 por 100 NsNa) di-luida 1/2. La solución fue dializada a 4o Ccon el mismo tampón utilizando una célu-la de ultrafiltración molecular AMICONprovista de una membrana XM100 A y, acontinuación, en dosis de 2 mi. fue pasadapor una columna de DEAE-Sephacel celu-losa. El eluato se impulsó mediante unabomba peristáltica a través de una célula

de lectura ISCO conectada a un registra-dor. Se recuperó la primera fracción conabsorbancia a 280 nm. Esta fracción, quecorresponde a inmunoglubulinas, fue con-centrada por ultrafiltración utilizando unacélula AMICON 12 provista de membranaXM100 A. La solución resultante fue este-rilizada por filtración a través de unamembrana MILLIPORE de 0,45 \¿ y al-macenada a —18° C en frascos de vidrio.

La preparación de los conjugados inmu-noglobulina-enzima se realizó según el mé-todo descrito por CLARK y ADAMS (1977)utilizando 5 mg. de fosfatasa alcalina SIG-MA tipo VIL La solución de enzima secentrifugó durante 10 minutos a 20.000 gy el precipitado fue resuspendido con unasolución de 2 mg. de inmunoglubilinas.Tras dializar a 4o C contra tampón AFT1/2, se añadió glutaraldehido purificadohasta una concentración final del 0,05 por100 y se dejó 4 horas en reposo a tem-peratura ambiente. A continuación se dia-lizó contra tampón AFT 1/2, se añadió0,5 por 100 de albúmina de suero bovinoy se conservó el conjugado a —18° C enfrascos de vidrio, una vez filtrado por0,45 \Á y adicionado volumen a volumencon glicerol.

de inmunoglobulinas (Ig). Las placas yatapizadas, lavadas y secas se conservaron a—18° C hasta su utilización.

Los extractos de muestras vegetales fue-ron preparados con un homogeneizador devastago POLYTRON tipo PT 10-35 (Kine-matica). Como tampón de extracción seempleó una solución de 2 por 100 depolivinil pirrolidona (PVP-10.000) en aguafisiológica tamponada (AFT), o este mismotampón con diferentes aditivos: 0,2 por 100de dietilditiocarbamato sódico (DIECA),0,2 por 100 de ovoalbúmina y 2,5 por100 de ácido nicotínico.

La dosis idónea del conjugado inmuno-globulina — enzima (Ig-E) a utilizar parala detección de cada virus se determinóensayando diversas diluciones que variaronentre 1/100 y 1/4.000 del conjugado entampón de extracción sin aditivos.

La reacción serológica se reveló utilizan-do una solución de 1 mg/ml de p-nitro-fenil fosfato en un tampón pH 9,8 con-teniendo 10 por 100 de dietanolaminaen agua destilada. La lectura de resulta-dos se realizó en un lector automático deplacas TITERTEK MULTISKAN (Flow),a los 30 y 60 minutos de comenzar lareacción enzimática.

Realización del ensayo inmunoenzimático

El ensayo inmunoenzimático ELISA-DAS («double antibody sandwich») se rea-lizó habitualmente en las cuatro etapasclásicas (figura 1) descritas por ENGVALLy PERLMANN (1971), aunque en algunos ca-sos, para la detección del CLSV, se utilizótambién la variante del método propuestapor FLEGG y CLARK (1979).

Como inmunoadsorbente se utilizaronmicroplacas de poliestireno M129B (DY-NATECH). La dosis idónea de tapizadopara cada antisuero fue determinada ensa-yando concentraciones entre 0,1 y 20 \Á g/ml

Determinación del material vegetal yépocas más idóneas de toma de muestras

Durante un ciclo vegetativo completo delos melocotoneros inoculados con PRSV,PDV y CLSV se tomaron periódicamentemuestras representativas de cada estadovegetativo: en primavera, botones florales,pétalos, anteras, flores completas, hojasjóvenes y brotes tiernos; en verano, hojasjóvenes, hojas adultas y frutos (pedúnculoy mesocarpo); en otoño, hojas adultas, ho-jas agostadas y ramos; y, en invierno,ramos y yemas latentes. Todas estas mues-tras, junto con otras equivalentes de árbo-

Observación visual o espectrofotométrica del producto coloreado. La intensidad del color es proporcional a laconcentración de antígenos en la muestra.

les sin inocular, fueron analizadas a fin decomprobar la capacidad de la técnicaELISA para detectar los virus en cada tipode material y época del año, y las posi-bilidades de utilización de la misma en en-sayos rutinarios de selección sanitaria.

Comparación de la técnica ELISA conlos métodos tradicionales de diagnóstico*

A fin de establecer la fiabilidad de latécnica ELISA, ésta se ha comparado conlos métodos tradicionales de inoculación deindicadores leñosos. En el caso de los virusILAR, 46 plantas de melocotonero y 60del híbrido almendro X melocotonero fue-ron analizadas mediante la técnica ELISAy, paralelamente, yemas de estas plantasfueron injertadas sobre el indicador Pru-nus serrulata, variedad Shirofugen. Lacomparación con CLSV se llevó a cabo enforma análoga, pero utilizando el indica-dor melocotonero de semilla GF-305. Seanalizaron 18 plantas de melocotonero, 14de albaricoquero y 92 del híbrido almen-dro X melocotonero. Los métodos de inocu-lación, en cada caso, fueron los descritospor LLÁCER (1978).

Antisueros polivalentes artificiales

Con el objeto de comprobar la posibi-lidad de detectar en un solo ensayo cual-quiera de los virus citados anteriormente oinfecciones mixtas de ellos, se prepararonantisueros artificiales mediante mezcla deinmunoglobulinas y, en su caso, conjuga-dos anti-PRSV y anti-PDV o anti-PRSV,anti-PDV y anti-CLSV. Las mezclas seprepararon de forma que cada uno de loscomponentes estuviese en la concentraciónóptima previamente establecida para larealización del ensayo. Estos antisueros po-livalentes fueron comparados con los anti-sueros específicos de cadja virus frente a

extractos de plantas sin inocular, de plan-tas inoculadas con un virus y mezclas deextractos de plantas inoculadas con virusdiferentes. La concentración de cada virusen la mezcla fue la misma que en losextractos individuales, para lo cual éstos sediluyeron adecuadamente con extracto deplantas sin inocular. Las cepas de virusutilizadas para los ensayos fueron: «almondcalico virus» (PRSV), «chlorotic necroticring virus» (PDV) y «butteratura» (CL&V).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Condiciones idóneas de realización delensayo y cepas detectadas

Concentraciones de tapizado y conjugado

En la figura 2 se puede apreciar lavariación de la absorbancia o densidadóptica obtenida a 405 nm, en función dela concentración de tapizado con inmuno-globulinas anti-PRSV y anti-PDV. Puedeobservarse cómo la densidad óptica aumen-ta con la concentración de tapizado hastaalcanzar un valor de saturación que co-rresponde a la concentración 2,5 ¡A g/mlde Ig. Para la detección rutinaria de am-bos grupos de virus se ha seleccionadouna concentración de 2 \i g/ml como lamás idónea, ya que proporciona valoresde densidad óptica claramente distingui-bles de los que dan los extractos de plan-ta sana y representa una economía dereactivos.

Las figuras 3 y 4 muestran la variaciónde la densidad óptica en función de laconcentración de tapizado y de la dilucióndel conjugado inmunoglobulina-enzimapara los virus PRSV y PDV, respectiva-mente. Para la concentración de 2 /¿ g/mlde tapizado se han elegido como dilucio-nes idóneas del conjugado 1/1.000 para

Fig. 2.—Variación de la densidad óptica (405 nm) en función de la concentración de tapizado con inmunoglobulinasanti-PRSV y anti-PDV, para un extracto de planta inoculada con PRSV o con PDV y para un extracto de planta sin inocular.

Fig. 3.—Variación de densidad óptica (405 nm) en función de la concentración del tapizado y de la dilución del conjugadoinmunoglobulina-enzima para un extracto de planta inoculada con PRSV y un extracto de planta sin inocular.

PRSV y 1/2.000 para PDV. En formaanáloga, en la figura 5, se representa lavariación de densidad óptica en funciónde las concentraciones de tapizado y con-jugado para la detección del CLSV. Se haoptado por una concentración de tapizadode 2 \JL g/ml de inmunoglobulinas y unadilución de conjugado de 1/200.

En todos los casos se ha comprobadoque las placas, una vez sensibilizadas, lava-das y secas, pueden conservarse a —18° Cdurante al menos un año, siendo válidaspara la realización del ensayo.

Tampón de extracción de virus

El tampón de extracción AFT con 1 por100 de PVP, sin más aditivos, ha propor-cionado buenos resultados para la detec-ción de los virus I LAR en melocotoneroy ciruelo, empleando una relacción pesode muestra/volumen de tampón de 1/20.

El diagnóstico de CLSV en melocotone-ro es factible con el mismo tampón de ex-tracción empleado para los virus ILAR,adicionado de 0,2 por 100 de DIECA y0,2 por 100 de ovoalbúmina, sin necesidadde añadir nicotina ni de utilizar la modi-ficación propuesta por FLEGG y CLARK (1979).En cambio, para la detección de CLSV enalbaricoquero se requiere o bien la incu-bación simultánea del extracto y del con-jugado (modificación de FLEGG y CLARK,1979) o la adición de ácido nicotínico al2,5 por 100 al tampón de extracción talcomo recomiendan DETIENNE, DELBOS yDUNEZ (1980). En nuestras condiciones, seobtienen mejores resultados con la adiciónde nicotina, empleándose una relación pe-so de muestra/volumen de tampón de1/10 ó 1/20.

Cepas de virus detectadas

En las condiciones descritas, los suerosanti-PRSV, anti-PDV y anti-CLSV fue-

ron capaces de detectar las siguientes ce-pas de virus:

— Suero anti-PRSV

prunus ring virusnecrotic ring spot virusnecrotic ring virusnecrotic ring mottle virusrugose mosaic virusalmond calico virus

— Suero anti—PDV

chlorotic ring viruschlorotic necrotic ring virussour cherry yellows virus

— Suero anti—CLSV

bark split virusIn 21 (prunus salicina)pseudo plum pox virusbutteraturaviruela

Material vegetal y épocas de toma demuestras

Se ha comprobado que la técnica ELI-SA permite la detección de los virusPRSV, PDV y CLSV sobre melocotoneroen cualquier época del año, utilizandopreferentemente flores, hojas jóvenes obrotes tiernos en primavera, hojas jóvenesen verano y ramos en otoño e invierno.

Se ha logrado también la detección delos virus ILAR en botones florales, pétalos,anteras, flores cuajadas, hojas adultas yfrutos, no obstante la fiabilidad del ensayoen hojas agostadas es baja.

La posibilidad de detectar estos virusen ramas (tanto en yemas latentes como

Fig. 4.—Variación de la densidad óptica (405 nm) en función de la concentración del tapizado y de la dilución del conjugadoinmunoglobulina-enzima para un extracto de planta inoculada con PDV y un extracto de planta sin inocular.

Fig. 5.—Variación de la densidad óptica (405 nm) en función de la concentración del tapizado y de la dilución del conjugadoinmunoglobulina-enzima para un extracto de planta inoculada con CLSV y un extracto de planta sin inocular.

en entrenudos), permite la realización dediagnósticos incluso durante el invierno,de modo análogo al empleado por MINK(1980) para la detección de «cherry rugosemosaic virus» antes de la floración.

confirmar los obtenidos por PRACROS et al.(1981), según los cuales el número totalde muestras con reacción positiva es su-perior mediante la utilización de la técni-ca ELISA que por el empleo del indicadorGF-305.

Comparación de la técnica ELISA conlos métodos tradicionales de diagnóstico

En la figura 6A se muestran los resul-tados obtenidos en la comparación entrela técnica ELISA y el indicador Shirofugenpara la detección de virus ILAR. La com-paración ha sido repetida durante 2 añoscon el mismo material. De un total de106 plantas analizadas por ambas técnicasen 1980 se obtuvieron 103 diagnósticoscoincidentes y 3 divergentes, de los cuales2 correspondían a reacciones positivas porELISA y negativas sobre Shirofugen y eltercero a una planta que dio reacciónnegativa en ELISA y positiva sobre Shi-rofugen. En 1981 la coincidencia de resul-tados fue total, al reaccionar positivamenteen ambas técnicas las 3 plantas diver-gentes en 1980. Las 2 plantas que en1980 dieron reacción positiva en ELISAy negativa sobre Shirofugen eran meloco-toneros infectados con la cepa «chloroticring virus» de PDV. En 1981 estas plan-tas produjeron sobre Shirofugen una reac-ción de hipersensibilidad más leve y tardíaque el resto de cepas ILAR inoculadas,volviendo a reaccionar positivamente en latécnica ELISA.

En la figura 6B figuran los resultadosde la comparación entre la técnica ELISAy la inoculación en melocotonero de se-milla GF-305 para la detección de CLSV.De un total de 124 plantas, se obtuvieron108 diagnósticos coincidentes y 16 diver-gentes (8 albaricoqueros Búlida infectadospor «Viruela» y 8 híbridos almendro Xmelocotonero). En todos ellos se obtuvoreacción positiva por ELISA y negativasobre GF-305. Estos resultados parecen

Antisueros polivalentes artificiales

En la figura 7 se representan, en formade histograma, los valores de densidadóptica obtenidos con las diferentes combi-naciones antígeno-anticuerpo utilizadas pa-ra comprobar la eficacia de un antisueropolivalente artificial anti-PRSV y anti-PDV.

Los resultados obtenidos ponen de ma-nifiesto que, en las condiciones del ensayo,el poder de detección del antisuero po-livalente frente a cada uno de los viruses análogo al de los antisueros individua-les. Ello parece indicar que, a las con-centraciones ensayadas, no hay interacciónentre las inmunoglobulinas de cada virusen el proceso de tapizado.

Los valores de densidad óptica obtenidoscon antisueros individuales cuando se rea-liza el ensayo frente a la mezcla de virusno difieren significativamente de los obte-nidos frente a cada uno de los viruspor separado. Cuando se ensaya el anti-suero polivalente frente a la mezcla devirus, los valores de densidad óptica obte-nidos son significativamente superiores alos del resto de condiciones ensayadas.

La ausencia de reacción que se observaentre cada virus y el antisuero heterólogoconfirma la ausencia de parentesco seroló-gico entre ambos virus, ya que esta reac-ción heteróloga no difiere significativamen-te de la reacción obtenida con extractossanos.

En la figura 8 se representan, en formade histograma, los valores de densidadóptica obtenidos con las diferentes combi-naciones antígeno-anticuerpo utilizadas pa-ra comprobar la eficacia de un suero

Fig. 6.—Resultados de la comparación entre la técnica ELISA y los métodos tradicionales de diagnósticos. Número de plan-tas con reacción positiva o negativa en cada técnica.

polivalente artificial anti-PRSV, anti-PDVy anti-CLSV.

Los resultados obtenidos ponen de ma-nifiesto que, en las condiciones descritas,el antisuero polivalente es capaz de detec-tar cualquiera de los 3 virus o mezcla deellos, siendo de destacar que cuando seencuentran los 3 virus en el mismo extrac-to, los valores de densidad óptica son neta-mente superiores a los del resto de con-diciones ensayadas.

Cuando se utilizan los antisueros sim-ples, no interfiere en el diagnóstico la pre-sencia de virus heterólogos respecto al an-tisuero empleado. Se obtienen similares re-sultados cuando al virus homólogo del an-tisuero le acompañan uno o dos heteró-logos en el extracto.

A medida que aumentan los componen-tes del suero polivalente nos alejamos delas condiciones ideales de realización delensayo para cada virus concreto y ellose traduce en una disminución de la den-sidad óptica con respecto a la obtenidacon el antisuero simple, por lo cual, lautilización de antisueros polivalentes de 3o más componentes vendrá limitada porla especificidad de cada uno de los anti-sueros individuales.

CONCLUSIONES

Los resultados expuestos en el presentetrabajo muestran el interés de la técnicaELISA como método de detección de virusILARy CLSV en frutales de hueso.

En comparación con los métodos tradi-cionales de diagnóstico, la técnica ELISAaporta mayor rapidez (diagnósticos en 24horas) y la posibilidad de utilización agran escala de una forma semi-automáticay objetiva. Es tan fiable como la inocula-ción sobre Shirofugen para la detección devirus ILAR, permitiendo además discernir

entre PRSV y PDV, y aparece con mayorcapacidad de detección de CLSV que lainoculación sobre melocotonero de semillaGF-305, siendo una técnica mucho máseconómica.

La posibilidad de detectar virus en ra-mos, incluso en el invierno, permite larealización de diagnósticos en cualquierépoca del año. Además, la técnica ELISA-DAS permite la detección en un solo ensa-yo de virus ILAR y CLSV mediante anti-sueros polivalentes artificiales, siempre quese disponga de antisueros altamente especí-ficos. No obstante, parece más recomenda-ble realizar la detección de los dos virusILAR en un solo ensayo y, a parte, la delCLSV, debido a las especiales característi-cas de este último virus.

Por todo lo expuesto, consideramos quela técnica ELISA es especialmente apro-piada como un primer análisis para losensayos de rutina necesarios en los progra-mas de selección sanitaria, controles de laproducción viverística y de materiales im-portados, prospecciones para la localiza-ción de focos y su erradicación, estudiosepidemiológicos, etc., es decir, todos aque-llos trabajos que exigen la realización deun gran número de ensayos de diagnósti-co de virus en un corto plazo.

La aplicación de la técnica ELISA nosustituirá totalmente el empleo de los mé-todos tradicionales (indicadores leñosos)para la producción de plantas de base li-bres de virus, ya que en ese caso es pru-dente realizar el máximo de pruebas y nohay antisueros disponibles para todos losvirus, pero sí reducirá en gran medidael número de ensayos a realizar por dichosmétodos tradicionales, que son demasiadolentos y costosos.

La aplicación de la técnica ELISA—DAS es sencilla y no requiere instalacionescostosas ni personal altamente especializa-do, por lo que se convierte en una téc-nica capaz de ser usada incluso en fron-teras.

Fig. 7.—Valores de densidad óptica (405 nm) obtenidos con antisueros de PRSV, PDV y polivalente artificial anti-PRSV y anti-PDV para extractos de plantas inoculadas con cada virus y mezcla de ellos y para extractos de plantas sin ino-

cular (T—). Sin diferencias significativas dentro de cada intervalo a, b y c.

Fig. 8.—Valores de densidad óptica (405 nm) obtenidos con antisueros simples (CLSV, PRSV y PDV) y polivalentes arti-ficiales (CLSV y PRSV; CLSV y PDV; CLSV, PRSV y PDV) para extractos de plantas inoculadas con cada virus y mezcla

de ellos y para extractos de plantas sin inocular.

AGRADECIMIENTOS

Los autores desean expresar su agrade-cimiento a Rafael GELLA F ANANAS , del CRI-DA-03 (Zaragoza) del INIA, por la realiza-ción de una parte de los ensayos de diag-nóstico sobre indicadores leñosos que se

citan en este trabajo, a Rafael y MarianoCAMBRA RUIZ DE VELASCO, de la Estación Ex-perimental de Aula-Dei (Zaragoza) delCSIC, por haber suministrado materialvegetal para realizar este estudio, y a Mag-dalena VILCHEZ HIDALGO por el mecanogra-fiado del trabajo.

ABSTRACT

CAMBRA, M.; LLACER, G.; PÉREZ DE SAN ROMAN, C ; MORENO, P y DURBA, V., 1983: Useof enzyme-linked inmunosorbent assay (ELISA) for virus detection on stone fruittrees in Spain. Bol. Serv. Plagas, 9: 45-59.

The development of Regulations by the Ministry of Agriculture in Spain for certifica-tion of fruit trees will make it necessary to carry out a considerable number of tests forvirus diagnosis as rapidly as possible. We are now working at our Station to make upthe technique of shoot-tip grafting in vitro as a method to obtain virus-free stone fruitplants, which also requires a rapid and reliable detection technique for very earlyapplication. In both instances the ELISA method appeared as the most suitable for ourneeds.

We are describing here the best conditions to apply the ELISA-DAS method todiagnose prunus ring spot virus, prune dwarf virus and chlorotic leaf spot virus in stonefruit trees in Spain: proper dosages of coating and conjugate, extracting buffers, plantmaterial and seasons for sample collection. We have studied which virus strains can bedetected and made comparisons with the conventional woody indicators methods.

Advantages of the technique are discussed, and the possibility of detecting in a sin-gle test any one of the three viruses, or a combination of them, by using artificialpolyvalente antiserum prepared from individual antisera.

REFERENCIAS

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