Universidad Adventista de las Antillas Departamento de Ciencias - Biologa Biologa Molecular - Lab 2 Diluciones y Grficas JACard Introduccin: El trabajar con diluciones es algo rutinario en un laboratorio de biologa molecular e investigacin ya sea porque necesitas concentraciones muy pequas para pesar y medir por lo que tienes que partir de una solucin mas concentrada a una menor o porque las soluciones comerciales vienen a unas concentraciones (stocks) altas y se usan a unas concentraciones (working) mas ligeras. Igualmente en el conteo de clulas o bacterias para sembrar o cuantificar se usa mucho el concepto de diluciones en serie. Diluciones: Cuando se hacen diluciones siempre se comienza con una concentracin de algo y aades mas solvente, bajando la concentracin del soluto. Asi que si haces clculos y ves que la concentracin aumenta!!... algo hicistes mal! Revisa el trabajo para asegurarte que la concentracin disminuy.

C1V1=C2V2Lo importante aqui es definir las variables bien. Ej: Si tienes un buffer de fosfato de sodio 0.2M, y tomas 10 ml de el y lo aades a 90 ml de agua. Cual es la concentracin final de la nueva solucin o de la dilucin? Para esta frmula necesitas 3 de las 4 variables; C1= concentracin inicial, 0.2M V1= volumen inicial, 10ml C2 = ? concentracin final a la queda que no sabemos, x, lo que nos preguntan! V2= volumen final, _____ml. Este es un posible punto de error: 90 ml no es el volumen final, es 100ml. Factores de dilucin (fd): es la segunda forma de hacer diluciones. - Un factor de dilucin es una expresin matemtica que te permite calcular cuanto ms diludo est una solucin resultante preparada a partir de una solucin stock o mas concentrada. Se calcula como el volumen final dividido entre el volumen inicial (el que tomastes del concentrado). Cual es el factor de dilucin en el ejercicio anterior? 100ml/10ml = 10 o lo que es igual, una dilucin de 1 en 10; o sea 0.1 o sea diluido 10 veces!, Una vez tienes el factor de dilucin, que se hace con el? - lo multiplicas por la C1 C2=C1 x fd C2= 0.2M x 0.1 = 0.02M - divides la C1 entre el fd. C2=C1/fd; C2= 0.2M/10 = 0.02M - la [ ] sera 1/10 de la original! Diluciones Mltiples: Si vas a hacer un dilucin en serie (3 veces o n veces), la concentracin final se calcula de la siguiente forma: Fd1= 100ml/10ml = 10 Fd2 = 50ml/2ml = 25 Fd3 = 90ml/30ml= 3 Calculando el FD para cada paso de la serie y luego multiplicando los tres factores de dilucin FDTotal= 10x25x3= 750 a 1 Si comenzamos con el mismo 0.2M cual sera la nueva concentracin: Cfinal= C1/fdtotal = 0.2M/750 = 0.00027 M = 0.27mM = 270 M ________________________ Grficas Generalmente los resultados de experimentos se reportan o resumen en forma de grficas. Repasaremos como hacer grficas manuales y por computadoras.

1

Manual: Una grfica es una representacin de la relacin entre dos variables 2 cantidades. Una es la que se controla, se llama variable independiente y se coloca en el eje de X. La otra cantidad es la que cambia conforme cambia la independiente, se le llama variable dependiente y se coloca en el eje de Y. Ejercicio: Se colocaron distintas cantidades de protena en una serie de tubos y por espectrofotometra se midi la absorbancia. Cul es la variable independiente? La dependiente? Prepara una grfica donde se representa p (proteina) vs q (Absorbancia), donde p va en x y q en y usando papel de grfica. (Recuerda poner ttulo, leyenda y descripcin de que es lo representado en la grfica) Data: Concentracin de proteinas Absorbancia (mg) 0.001 0.05 0.003 0.16 0.005 0.225 0.007 0.33 0.008 0.375

Dibujar la Lnea y La Escala Debes conocer algo sobre el sistema y los resultados esperados. Por ejemplo con el ejercicio de proteina se espera una lnea recta, al menos hasta un lmite de cantidad (ug) de proteina en el tubo. Asi que se espera o se trata de dibujar una linea recta, la mejor que pase por los puntos. Se hace por computadoras, con una calculadora con estadsticas que saca pendiente e intercepto, o al ojo, pero NO uniendo todos los puntos con una lnea en zigzag tiene que ser una recta. Si la relacin que se espera es una lineal, la mejor lnea ser determinada por una regresin linear, (operacin que reduce la distancia entre la lnea y los puntos que debe tocar). Esto tambien se conoce como el mtodo de los cuadrados mnimos. Explicar dicho mtodo est fuera del objetivo de este ejercicio se asume que usted ya lo conoce. A veces el problema esta en como representar los nmeros en la grfica por el nmero de ceros. Lo mejor es usar exponente o en este ejemplo, cambiar la unidad de mg a g. Otro punto importante es la escala. A cuantos cm equivale un ug por ejemplo? Y siempre hay que ser consistente en la misma grfica, no hagas ajustes para acomodar data a la mala. Tambin es importante usar la grfica completa y tratar de que el ngulo de la lnea sea lo mas cerca a un angulo de 45o.Abs (x10)

Titulo0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0 2 4 6 8 10 ug protein (x1000)

Los ejes tienes un X 10 o X1000, que dicen lo que se ha hecho con los nmeros que estn en el eje. Se multiplicaron por 10 o por 1000. Asi que el eje de x indica que el valor representa el nmero de ug de proteina multiplicado por 1000. Cuales fueron las medidas originales de Abs? En cuanto al 0, mucha gente piensa que debe ser un punto en la grfica siempre, hay veces que si y hay veces que no. Por ejemplo prepara la siguiente grafica. Se est graficando log de peso molecular de un fragmento de DNA vs su mobilidad en una gelatina. Mobilidad 6 2.9 1 0.1 LogMW 4.18 4.6 4.82 4.95 MW 15,000 40,000 66,000 90,000

2

Si la grfica se comienza en el origen (0) se vera comprimida en el eje de Y, si la comenzamos de 4 en adelante se usa mucha mas area.

Log MW

6 5 4 3 2 1 0 0 2 4 Mobilidad (cm ) 6 8

5 4.9 4.8 4.7 4.6 4.5 4.4 4.3 4.2 4.1 0 2 4 M obilidad (cm) 6 8

Nota la diferencia entre la distribucin de la data en el toda el rea de la grfica. El error al tratar de interpolar en la grfica ser mayor mientras menos area de esta se use.

Escalas logartmicas: Para hacer grficas con estas escalas se puede utilizar papel semilog, el cual prcticamente hace los clculos para uno. Este viene divididos en ciclos. En cada ciclo se puede poner la data que caiga dentro de una potencia de 10. La data desde 15000 a 90000 cae toda dentro de un ciclo (10000 a 100000). Si quieres incluir tambin a 200000, necesitas otro ciclo. En un papel logartmico tu colocas los nmeros 15000, 40000 etc directamente en la grfica en Y. NO trates de poner 4.18, 4.60 etc en el papel log.!

MW 100,000

10,000 0 1 2 3 4 5 6 7

Puntos de data corruptos Escojer cuando estos puntos existen es algo que se puede hacer mejor a ojo que a computadora.Si tu quieres poner en grfica los datos de la tabla a la derecha tu notars 5 de los 6 puntos caern perfectamente bien en la lnea recta. Pero un punto va a estar bien afuera. La mayora de los programas de computadoreas dibujarn un lnea incluyndolo, cuando en realidad no se debe incluir. Lo que se debe hacer es o repetir la

ug proteina Absorbancia 0 0 10 0.1 20 0.2 30 0.05 40 0.4 0.5 50

3

Chart Title

0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 -0.1 0 10 20 30 40 50 60

lectura de 30 ug hacer la lnea sin incluirlo y si usando los otro 5 puntos. Obviamente la linea que mejor recoge la tendencia de esta data es la que no lo incluye . Como ser la lnea si eliminas el punto (30, 0.05). Demuestrlo. Graficas con computadoras La mayora de las computadoras que tenemos en nuestras casas u oficinas incluyen un paquete de programas que traen un spreadsheet que trae capacidad para hojas de hacer clculos y graficar. Entre programas para este tipo de anlisis estn Sigmaplot, Quatro, SPSS, y Excell. En nuestro lab lo mas que tendremos oportunidad para usar es Excel asi que ese ser el

ug de proteinas

ejemplo para seguir. El primer paso es colocar la data en la pgina de clculos. Columnas identificadas por Letras y lneas identificadas por Nmeros. Cada combinacin entre estas es una celda. La data debe estar como en la tabla que sigue. Ug de proteina 0 10 20 30 40 50 Absorbancia 0 0.1 0.2 0.29 0.40 0.52 Al subir el programa Excell te abre una pgina vaca con celdas. Puedes poner o no titulos a la columnas. Coloca lo que va en el eje de X en la columna de la izquiera Asi se ver en Excell.

Para crear la grfica luego que tengas la data en la hoja es cuestin de seguir las instrucciones del programa. - En primer lugar seleccionar las celdas que incluyen la data que ira en la grfica. Ej desde A1 a A6 y B1 a B6, todo junto. - Luego hacer click en el cono de chart, escoger el tipo de grfica (lnea, barra, pie) - Escoges scatter plot que no tenga lneas sobre la data, la que tiene lneas busca un 0,0. - Le das next y te pregunta la fuente de la data, esta fue seleccionada ya, asi que next - Lo prximo sera formatear la grfica para ver como va a lucir (titulo, rotulos de los ejes, etc) la mini grfica te da una idea de como se ve. Puedes ir adelante y atrs si cambias de idea. - Luego escojes incluirla en la misma hoja de clculos o en hoja aparte.

Abs vs ug de proteina0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 1 0 20 30 ug proteinas 40 50 60 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 -0.1 0

Abs vs ug de proteinay= 0.01 02x - 0.0024 R2 = 0.9976

1 0

20

30 ug proteinas

40

50

60

Hasta el momento la grfica se ver como la de la izquierda. Como vers no hay lnea que conecte los puntos para que la mquina no una los puntos. Asi escogeremos la regresin lineal que asegura la lnea que major pasa por los puntos. Para hacer la linea: - escojer en chart en los menus superiores y luego add trendline. Lo que sale ahora te da varias opciones incluyendo la linea recta de regresin.

4

-

Ademas de esto escojes en option para que puedas presentar en la grafica la ecuacin y el coefficiente R de regresin. La grfica se vera como la de la derecha.

Graficas No-lineares Que hacer si la grfica no presenta una relacin lineal? La Vel Conc 1/Vel 1/Conc grfica la hars igual que siempre pero usars el wizard de grficas 0.25 0.083 4 12.04819 para adaptar la grfica. Por ejemplo analiza un experimento de 0.5 0.127 2 7.874016 cintica de enzimas. Cuando se representa la velocidad de una 1 0.158 1 6.329114 enzima vs la concentracin de sustrato, se obtiene una relacin 2 0.178 0.5 5.617978 hiperblica (abajo izq). Luego que creas la grfica sin lnea, aades 4 0.203 0.25 4.926108 trendline como antes. Para grficas hiperblicas no hay un menu 5 0.249 0.2 4.016064 ideal. Lo mejor que se puede hacer es escojer logartmica en trendline. Y saldr una curva hiperblica. Esta se ve razonable, solo que es una funcin logartmica. Una grfica logartmica es curva como una hiperblica pero la equacin no parea. Si se intenta interpolar valores dara resultados errneos. Se puede usar el spreadsheet para manipular la data de la siguiente forma. Si tomas el recproco de la data y esta es la que pones en la grfica estars haciendo una grfica LineweaverBurk (abajo). Si ahora usas el trendline podrs hacer una linea recta que se extender cruzando el eje de y hasta interceptar el eje de X. De alli podrs obtener constantes cinticas de la grfica y valores como Km y Vmax. La capacidad para intrapolar dentro de la grfica es posible con la lnea recta en lugar de la hiperbole. Barras de Errores en Grficas Un aspecto que le da mayor validez y solidez a resultados presentados en forma de grfica es el poder incluirles anlisis estadsticos en ellas. Entre los anlisis estadisticos mas comunes estan el promedio y la desviacin o el error estandar. Ambas son medidas de dispersin que permiten tener una idea de cuanto se desvian o alejan del valor promedio las muestras analizadas en la prueba.Linew eaver-Burk Reciprocal Plot y = 1.9446x + 4.2253 15 10 1/ Vel 5 -5 -3 0 -1 -5 1 3 5Vel vs Concentracion de Sust. Velocidad (umol/min) 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0 2 4 6 [ ] sustrato (m M) y = 0.0481Ln(x) + 0.1534

En el siguiente ejemplo se realizaron unas medidas en triplicado de conteo radioactivo para 4 muestras.. Prepare 1/[ ] sustrato la grfica donde presente individualmente cada muestra. Calcule el promedio para cada muestra y la desviacin estandar y prepare la grfica donde solo se presenten los promedios. Incluya en esta ltima las barras de errores en Y con el valor de la desviacin estndar. Coloque la data en el spreadsheet como se muestra. Luego para la grfica de barra utilice el Wizar de Excell escojiendo la opcin de graficas de barras. Prepare la siguiente data en una grfica de barras: Control 3H DDT DEHP 1000 8000 4500 7000 1500 7500 5000 7500 1250 9200 6000 6500

5

Radioactividad Desplazada por EDCs1 0000

10000 8000 CPMs 6000 4000 2000 0 Control 3H DDT DEHP Series1 Series2 Series3 Series4

8000 6000 4000 2000 0 Control 3H DDT DEHP

Si le da next a todos los pasos la grafica que saldra es la de la izquierda que muestra como comparan los valores de cada medida con los de su grupo (1000, 1500, 1250; 8000, 7500, 9200; etcetera) pero esto no dice mucho sobre el resultado general del experimento porque estos valores son repeticiones (triplicados) de una misma prueba. Lo correcto aqu seria obtener el promedio de cada grupo (control, 3H, DDT, DEHP) y comparar estos promedios. Para esto haremos uso de las funciones y formulas de Excell para calcular. Colocas el cursor en la celda debajo de 1250 y les das insert function. Aqu abren dos columnas, a la izquierda categoras de formulas (escoge Statistics) y a la derecha las formulas de esta categoria (escoge Average). En la linea de number 1 seleccionas las celdas que corresponden a los 3 valores para control, enter y te coloca en la celda el valor del promedio de esos tres datos. Haces copy a esa celda, seleccionas las otras 3 celdas a la derecha y haces paste y vers que hace el mismo clculo para los otras celdas. A la izquierda rotula con AVG. Has la grfica de barra pero solo seleccionando los valores en AVG para cada muestra (arriba, derecha). Ahora en la celda debajo del AVG para control, insertas la funcin para STDEV. Escoje las mismas celdas que usastes para calcular el AVG del control y de las otras 3 muestras. La hoja presentar ahora la desviacin estandar de cada promedio. Para incorporar este valor a la grfica de barras haces doble click sobre cualquiera de las columnas de la nueva grafica y abre un menu donde escogers, Y error bar. Luego escoges custom y alli pones el cursor al lado del signo + y seleccionas las celdas con los STDEV y luego lo pones al lado del signo (-) y colocas las mismas celdas, OK. En las columnas saldr una barra vertical que dice que ese promedio puede subir hasta un mximo o bajar hasta un mnimo, o sea fluctuar por la cantidad del STDEV como un mas o menos. Preguntas para contestar: Como las ecuaciones de las lineas rectas se pueden usar para predecir resultados? Prepara las misma graficas menos las ultima en papel de grfica manualmente. Prepara una grafica con la siguiente data de forma manual y en la computadora Ug de prot 0 2 4 6 8 10 12 Absrobancia 0 0.12 0.28 0.40 0.52 0.63 0.72

Usa la ecuacin de la recta de esta ultima data para interpolar, calcula los g de protenas en muestras que leen Abs de 0.45 y 0.25.

6