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Actividad 7
DISEÑAR UN LABORATORIO
INSTITUCIONAL PARA EL ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD BIOLÓGICA DE
PRODUCTOS NATURALES DERIVADOS DE LA BIODIVERSIDAD DE LA
MACARONESIA
Documento de Trabajo
Fundación Instituto Canario de Investigación del Cáncer (FICIC)
ÍNDICE
1. Objetivos del Informe
2. Introducción
3. Metodología
3.1. Laboratorio de Química
3.2. Laboratorio de Biotecnología y Biología Molecular
3.3. Laboratorio de Ensayos biológicos
3.3.1. Estudio de Actividad Antitumoral
3.3.2. Estudio de Actividad Antibiótica
3.3.3. Estudio de Actividad Anti-VIH
3.3.4. Estudio de Actividad Antifúngica
3.3.5. Estudio de Actividad Antiparasitaria
3.4. Laboratorio de Apoyo Computacional (Estudios In Silico)
4. Infraestructura
4.1. ÁREAS DEL LABORATORIO
4.1.1 Laboratorio de Química
4.1.2. Laboratorio de Biotecnología y Biología Molecular.
4.1.3. Laboratorio de Bio-Ensayos.
4.1.4. Laboratorio de Apoyo Computacional (Estudio In Silico).
4.1.5. Grandes Equipos
4.2. EQUIPAMIENTO Y MATERIAL FUNGIBLE.
4.2.1. Laboratorio de Química.
4.2.2. Laboratorio de Biotecnología y Biología Molecular.
4.2.3. Laboratorio de Bioensayos.
4.2.4. Laboratorio de Apoyo Computacional.
4.2.5. Zonas Comunes.
4.2.6. Material Fungible.
4.2.7. Componentes de Medios Nutritivos.
5. Distribución del Laboratorio.
5.1. LABORATORIO DE QUÍMICA Y ZONA DE ALMACÉN/CULTIVOS
5.2. LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA/BIOLOGÍA MOLECULAR Y
BIOENSAYOS.
5.3. LABORATORIO DE GRANDES EQUIPOS.
5.4. LABORATORIO COMPUTACIONAL (ESTUDIO IN
SILICO)/DESPACHOS.
6. Seguridad en el Laboratorio.
7. Epotilona: de la molécula al fármaco
8. Bibliografía
1. OBJETIVO
El presente informe describe los requisitos y necesidades para la creación de un
Laboratorio Institucional para el Estudio de la Actividad Biológica de Productos
Naturales Derivados de la Biodiversidad de la Macaronesia y su posible explotación
como moléculas bioactivas, en el marco del proyecto BIOPHARMAC PCT MAC 2007-
2013.
Los Objetivos que recoge el informe presentado son:
5. Diseñar una metodología científica y fases del proceso que permita el desarrollo
de fármacos a partir de productos naturales de origen Macoronésico y diseño de
un laboratorio institucional que permita alcanzar esas metas.
6. Identificación de los equipos e infraestructuras necesarios para la realización de
estudios de actividad farmacológica a partir de los compuestos aislados y
caracterizados.
2. INTRODUCCIÓN
Los productos naturales han estado, desde tiempos ancestrales relacionados con el
hombre, ya que han sido usados no sólo para tratamiento de diferentes afecciones, sino
también como colorantes, nutrientes, aromas o fragancias (Newman et al. 2000). Dicha
importancia esta apoyada por hechos, como son el primer indicio del uso de unas 1.000
sustancias derivadas de plantas, recogido en la antigua Mesopotamia hacia el año 2.600
A.C en unas tablillas de arcilla en cuneiforme, donde se usaba el aceite de especies como
Cedrus o Cupressus. El escrito de la antigua china (1.100 A.C), Materia Medica, donde
se recogen unas 52 prescripciones, o el sistema Ayurvédico de la India (1.000 A.C), con
alrededor de 500 drogas, representan ejemplos claros del uso, por parte de la humanidad,
de las plantas y productos derivados de las mismas para la lucha contra diferentes
afecciones.
Existen ejemplos de productos, descritos por primera en el siglo XIX, que siguen
usándose en la actualidad en medicina. Así, la quinina, agente antimalárico, la morfina o
codeína, usados como analgésicos, la digoxina, usado como agente antiarrítmico en
insuficiencias cardíacas, o la atropina, que se emplea en oftalmología, anestesia y en el
tratamiento de enfermedades cardíacas y gastrointestinales (Phillipson 2001).
Tras el aislamiento de estos compuestos, le siguieron hechos como la
comercialización de morfina pura por parte de E. Merck en 1826 o el primer fármaco
semi-sintético puro basado en un producto natural, la aspirina, por parte de Bayer en 1899
(Grabley and Thiericke 1999), o el descubrimiento de los antibióticos aislados de
especies de Streptomyces, Penicillium o Cephalosporium.
Todos estos datos no hacen más que confirmar la importancia que tienen los
productos naturales como fuente primaria de medicamentos. De hecho la Organizacion
Mundial de la Salud (OMS) estima que el alrededor del 80% de la poblacion mundial
confia en la medicina tradicional para sus primeras atenciones. En paises como la India,
el 70% de la población sigue confiando en la medicina tradicional como fuente para
satisfacer las necesidades sanitarias, creciendo hasta el 90% en países como Etiopía
(OMS 2002).
La búsqueda de compuestos de origen natural, especialmente de plantas, con
actividad biológica es un proceso que engloba varias disciplinas científicas
interelacionadas, que van desde la botánica, fitoquímica, genética, biotecnología, química
o biología molecular.
El objetivo principal de los laboratorios que invierten en investigación en
productos naturales es el desarrollo de compuestos bioactivos y sus posibles análogos
como agentes quimioterapéuticos, citotóxicos, antivirales o antiinflamatorios (Lee 2004).
Es conocido que la comercialización de un fármaco es un proceso arduo y que se
prolonga durante muchos años, que requiere de sucesivas etapas, como son el
descubrimiento de nuevos compuestos bioactivos (aislamiento de fuentes naturales),
mejora de sus propiedades (diseño racional de derivados), ensayos preclínicos
(farmacología, toxicología) y finalmente ensayos clínicos y puesta en el mercado (Lee
2004).
La industria farmacéutica invierte grandes esfuerzos, sobre todo económicos, para
el descubrimiento, desarrollo y comercialización de fármacos, ya sea mediante la síntesis
química, mimetizando un productos natural bioactivo, o mediante la obtención, de
grandes cantidades del mismo, de la fuente natural. En relación a esto, cabe destacar, que
muchos compuestos poseen estructura complejas, lo que hace que la síntesis química de
los mismos sea un proceso muy difícil e incluso económicamente inviable, lo que pone de
manifiesto nuevamente la importancia de la investigación en productos naturales como
uno de los principales medios de obtención de fármacos.
En la actualidad existen varios ejemplos de metabolitos secundarios aislados de
fuentes naturales y que están siendo utilizados como fármacos. Así el taxol, aislado de la
corteza de la especie Taxus brevifolia, es usado en la actualidad como potente agente
antitumoral de uso regular en la clínica (Fig. 1).
Figura 1. Estructura química del Taxol.
OH
O
OAC
OAcO
H
OOHO
O
OH
NH
Otro ejemplo claro, son la vinblastina y vincristina, alcaloides indol-terpénicos
aislados de la planta Catharanthus roseus empleados en el tratamiento de una gran
variedad de tipos de cáncer (Neuss and Neuss 1990) (Fig. 2).
Figura 2. Estructura química de la vinblastina y vincristina.
De igual manera, se han aislado metabolitos secundarios procedentes de otras
fuentes naturales como pueden ser bacterias, levaduras u hongos y que son ampliamente
usados en medicina, como por ejemplo el antibiótico rifamicina S producido por la
bacteria Amycolatopsis mediterranei, eritromicina A producida por Streptomyces
erytherus, los antitumorales doxorubicina y epotilona producidos por Streptomyces
peuceticus y Sorangium cellulosum, respectivamente, o el antifúngico anfotericina B,
sintetizado por Streptomyces nodosus (Weissman and Leadlay 2005) (Fig. 3).
Figura 3. Estructuras químicas de metabolitos bioactivos aislados de microorganismos y usados en
NH
N
MeO2C
OH
NR
MeO
N
HOAc
OH
CO2MeH
R: Me (Vinblastina)R: CHO (Vincristina)
O
O
OH
O
OO
NH
O
OHOH
O
O
H3CO
(1) Rifamicina S(antibiotico)
O
O
O
OHOH
HO
O
O
OHO
OCH3
O
N(CH3)2HO
(2) Eritromicina A (antibiotico)
O
OOCH3
OH
OH O
OH
O
OH
O
OHNH2
(3) Doxorubicina (antitumoral)
O
OO OH
HO N
S
(4) Epotilona (antitumoral)
O
O OH
OH
OH OH O
OH
COOH
O OOH
NH2OH(5) Anfotericina (anti-fúngico)
medicina.
Lamentablemente, las escasas cantidades de muchos de los compuestos aislados
de fuentes naturales encarecen la comercialización del mismo, con la consecuente barrera
económica a la hora de acceder a dichos fármacos (Tabla 1). De manera paralela, muchas
de las fuentes naturales, sobre todo plantas, están catalogadas como especies en peligro
de extinción, lo que hace necesario la obtención de métodos alternativos para satisfacer la
demanda de nuevos fármacos.
En los años 70 el desarrollo de la biotecnología moderna y la aparación de la
tecnología del ADN recombinante cambiaron la visión de las empresas farmacéutica y los
laboratorios en relación a como afrontar la búsqueda y desarrollo de nuevos fármacos
(Demain 2006), y se empezaron a utilizar diferentes especies de bacterias, plantas o
incluso células animales como modelos para el estudio y búsqueda de nuevos fármacos.
Compuesto Usos Especie origen Precio ($/Kg)
Ajmalicina Antihipertensivo Catharanthus roseus 37.000
Artemisinina Antimalarico Artemisia annua 400
Camptotecina Antitumoral Camptotheca acuminata 432.000
Codeina Sedante Papaver somniferum 17.000
Colchicina Antitumoral Colchium autumnale 35.000
Digoxina Estimulante cardiaco Dioscorea lanata 3.000
Diosgenina Precursor esteroidal Dioscorea deltoidea 1.000
Morfina Sedante Papaver somniferum 340.000
Quinina Antimalarico Cinchona ledgeriana 500
Taxol Antitumoral Taxus brevifolia 600.000
Vincristina Antileucemia Catharantus roseus 2.000.000
Vinblastina Antileucemia Catharantus roseus 1000000
Tabla 1. Ejemplos de productos naturales comercializados como farmacos y coste de los mismos
El proyecto “Genoma Humano” y la publicación de la secuencia de ADN de
nuestro genoma cambió definitivamente la visión de la medicina. La interpretación de la
información contenida en el ADN permitirá conocer diferentes aspectos, a nivel
molecular, de enfermedades como el cáncer, Alzheimer, Parkinson, fibrosis quística o
enfermedades hepáticas o hereditarias. A partir de este punto, se han descubierto
innumerables proteínas cuya función está asociada a diferentes patologías en diferentes
enfermedades que son objeto de estudio prioritario para las diferentes empresas
farmacéuticas.
En relación al estudio del cáncer, son muchos los ejemplos en los últimos años del
descubrimiento de nuevas proteínas descritas que aparecen implicadas en la biología de la
célula y cuya función o “mal función” se ha visto está relacionada con la aparición de
diferentes tipos de cáncer. Así tenemos por ejemplo la familia de proteínas de la Aurora
Quinasas, quinasas de serina/treonina cuya función es la de regular la mitosis celular,
asegurando una adecuada segregación del material genético durante la división celular. Se
ha descrito que la sobre-expresión de este grupo de quinasas está relacionado con la
aparición de muchos tipos de cánceres, estableciéndose como una diana terapéutica
(Richard et al. 2006). Otro ejemplo claro son las proteínas de “unión estrecha” claudinas,
relacionadas con la adhesión de las células en los tejidos epiteliales. Se ha descrito que la
sobreexpresión de los genes correspondientes está relacionada con la aparición de varios
tipos de cáncer como son los de próstata, pancreático o de mama, por lo que se reconoce
este grupo de proteínas como prometedoras dianas terapéuticas (Patrice 2005). Otro
ejemplo lo representa el factor de transcripción altamente conservado TWIST, que está
altamente expresado en cáncer de próstata. La inactivación de este gen mediante ARN de
transferencia permite que líneas tumorales in vitro sean más sensibles a la muerte celular
mediada con Taxol. Además, la inactivación de este gen suprime la capacidad de
migración e invasión de los tumores de próstata independientes de andrógenos (Zhang et
al. 2005). Por lo tanto la proteína TWIST está considerada como una clara diana
terapéutica y un conocimiento más profundo de su función permitirá una mayor eficacia
en el tratamiento del cáncer de próstata.
Además del cáncer, otras enfermedades han centrado el interés del hombre. Así, el
SIDA y la investigación de los mecanismos de infección del VIH han recibido mucha
atención en los últimos años. Por citar un ejemplo, los co-receptores CCR-5 y CXCR-4,
imprescindibles para la entrada el virus en las células, han sido descritos como dianas
terapéuticas y existe un interés creciente en la búsqueda de fármacos que puedan inhibir
dicho proceso (Schols 2004). De manera paralela, la tuberculosis, ha centrado el interés
del hombre, y se han publicado varios trabajos en relación a la descripción de nuevas
dianas terapéuticas. El producto génico de la familia de proteínas PE-PGRS está
involucrada en varios procesos del ciclo biológico del agente etiológico Mycobacterium
tuberculosis, como son la síntesis de la pared celular, la capacidad para adquirir nutrientes
del medio, la regulación de la transcripción, o el metabolismo energético. Dicha familia
de proteínas está descrita como diana terapéutica en la lucha contra la tuberculosis
(Sharma et al. 2004).
En los últimos 20 años ha habido un tremendo incremento en el conocimiento de
los mecanismos moleculares y patológicos de muchas enfermedades. Muchos de estos
mecanismos han permitido describir nuevas dianas terapéuticas, lo que de manera
paralela ha llevado a una mayor demanda de nuevos fármacos. La industria farmacéutica
ha incrementado sus esfuerzos tanto humanos como económicos para satisfacer dicha
demanda. Todo este esfuerzo se ha visto apoyado en el desarrollo tecnológico y
computacional que ha permitido desarrollar nuevos métodos de análisis, nuevas
herramientas de purificación de productos, herramientas en síntesis químicas más
potentes, nuevos ensayos in vitro y herramientas bioquímicas más eficaces y sensibles, la
robotización de los laboratorios, el uso de microorganismo como herramientas en la
producción de proteínas o fármacos, manipulación genética de organismos, producción a
gran escala de fármacos, bioensayos guiados, etc.
Todo este desarrollo tecnológico sumado al gran conocimiento acumulado ha
cambiado el enfoque de la industria farmacéutica de lo que es la investigación en la
búsqueda de fármacos, estableciéndose un modelo de abordaje multidisciplinar que
engloba desde la química y química sintética hasta la biología molecular o la
biotecnología. Incluso se han desarrollado nuevos métodos como son los métodos de alto
rendimiento, bioinformático, quimioinformático o genómica funcional que han permitido
el análisis de miles de compuestos al día optimizando el equilibrio coste-tiempo.
Ejemplos de nuevas técnicas y/o tecnologías aplicadas a la búsqueda de fármacos son
muchas. Por ejemplo, se ha desarrollado lo que se conoce como métodos de alto
rendimiento (high-throughput methods) o barridos de alto rendimiento (high-throughput
screening), que permiten a los investigadores realizar ensayos de bioactividad de miles de
productos al mismo tiempo, análisis de miles de genes, test farmacológicos de miles de
fármacos, bioensayos guiados de miles de muestras naturales, con el consiguiente ahorro
de tiempo y dinero. A través de estos procesos se puede rápidamente identificar algún
compuesto activo, metabolitos, anticuerpos, o incluso genes que en unas condiciones
determinadas, están modulando una ruta bioquímica, como por ejemplo con el uso de los
microchips de ADN, que permiten el estudio de todo el perfil de expresión genético de
una muestras bajo una condiciones de laboratorio determinadas.
Desde el punto de vista de la química y química sintética se ha desarrollado la
técnica de la “click chemistry” que permite la síntesis de moléculas de una manera rápida
y fiable en unos pocos pasos sintéticos y a partir de pequeñas entidades químicas,
mimetizando a la naturaleza. Esta química ha tenido en los últimos años un creciente
interés y las aplicaciones van desde el diseño de fármacos hasta la química de materiales
(Moses and Moorhouse 2007). Otra de las técncias que se han desarrollado en los últimos
años ha sido la síntesis química asistida por microondas, que permite la reducción de los
tiempos de síntesis de horas o días a minutos o segundos, además de poder llevar a cabo
reacciones bajo unas condiciones muy controladas permitiendo la obtención del producto
final, y que, en otras condiciones resultarían muy difícil de realizar (Larhed et al. 2002).
Estos avances, junto con otros, como por ejemplo, aplicaciones de la química
computacional y estudios “In Silico” han permitido la creación de lo que se conoce como
librerías químicas o quimiotecas, donde se producen miles de compuestos,
potencialmente activos, para en posteriores ensayos ser evaluados frente a un receptor o a
una diana terapéutica.
Desde el enfoque de la biología molecular y biotecnología, el desarrollo de
técnicas como la PCR (Polymerase Chain Reaction), el clonaje de genes, la manipulación
de microorganismo, ha permitido la producción a gran escala de productos químicos ya
sean naturales o modificaciones de los mismos, proteínas de interés médico, anticuerpos
u hormonas, usando los microorganismo como pequeñas factorías. El fundamento teórico
de esta aproximación se basa en la introducción, de grupos de genes conocidos que
participan en la síntesis de algún metabolitos o proteína o algún gen aislado responsable
de un paso metabólico de interés químico, en la bacteria, microorganismo o célula objeto
de estudio y crecerla bajo las condiciones adecuadas para poder producir el producto final
deseado en grandes cantidades, de forma continua y controlada.
Un ejemplo concreto lo tenemos en los policétidos, productos naturales que se encuentran
en diferentes fuentes naturales como bacterias, hongos o plantas, con un amplio espectro
de actividades biológicas como antibióticos, insecticidas o inmunosupresores (Fig. 3). El
sistema enzimático responsable de la síntesis de estos compuestos, las policétidos sintasas
(PKs), son un grupo de genes, unidos en cadena, donde cada gen, codifica para una
proteína, que a su vez es responsable de una modificación química específica de la
molécula a sintetizar. El funcionamiento coordinado de esta maquinaria genética permite
alcanzar la síntesis de una determinada molécula, proceso que se ha conseguido controlar
y manipular, lo que permite diseñar moléculas específicas que pueden sintetizarse con
esta metodología y sistema biológico (Fig. 4).
CoSA
O
Propionil-CoA
+
6 (2S)-metilmalonil-CoA
HO ASCo
O O
AT AT AT AT AT AT ATACP KS KS KS KS KS KS
KR KR KR KR KRACP ACP ACP ACP ACP ACP TE
DH ER
Módulo 1 Módulo 2 Módulo 3 Módulo 4 Módulo 5 Módulo 6 FINMódulo carga
S S S S S S SO
OH
O
OH
OH
O
O
OH
OH
O
OH
OH
O
O
OH
OH
OH
O
O
OH
OH
OH
OH
O
Ciclación
O
O
O
OH
OH
OH
Hidroxilación
Transferencia de glicosilo
O
O
O
OH
OH
O
OH
O
OH
OH
Hidroxilación
Transferencia de glicosilo
O
O
O
OH
O
O
OH
O
OH
OH
HO
OHO
N(CH3)2
MetilaciónO
O
O
OH
O
O
OH
O
OCH3
OH
HO
OHO
N(CH3)2
Eritromicina A
Precursores
Figura 4. Complejo polipéptido sintasa responsable de la síntesis de eritromicina A constituido por un
módulo de carga, 6 módulos de extensión y el módulo de terminación. AT: acetil-transferasa, ACP: dominio
de proteína transportadora de acilos, KS: ceto-sintasa, KR: ceto-reductasa, DH: dehidratasa, ER: enoil-
reductasa.
La manipulación de estos genes, bien mediante eliminación de algún componente
del complejo enzimático, la introducción de un nuevo gen o la modificación del
hospedador microbiano mediante la expresión heteróloga de alguno o algunos
componentes del complejo enzimático, da lugar a un cambio biosintético afectando al
producto final de la ruta metabólica o incluso, la obtención de un producto que de manera
natural no se produce (Trefzer et al. 2002, Palaniappan et al. 2003).
Pero no sólo los microorganismo han sido foco de estudio, ya que también los
sistemas vegetales han sido utilizados como material de producción de metabolitos
secundarios bioactivos, aprovechando que muchos de los compuestos que se pretenden
comercializar son metabolitos de origen vegetal. Existen muchos ejemplos en la literatura
científica, donde se describen los esfuerzos llevados a cabo para la optimización y sobre-
producción de metabolitos de interés farmacológico producidos en células o tejidos
vegetales. El taxol (Paclitaxel®) hoy en día se obtiene mayoritariamente de cultivos de
células en suspensión a gran escala de diferentes especies de Taxus, con grandes
rendimientos (Tabata 2006).
Teniendo en cuenta estos antecedentes, y dentro del marco del proyecto
BIOPHARMAC, se pretende realizar el diseño de las características de un laboratorio
institucional, que contemple todas las necesidades científicas e investigadoras,
recogiendo la metodología a realizar, las diferentes fases del estudio o equipos e
infraestructura requeridas para el estudio de la actividad biológica y el potencial
terapéutico de productos naturales derivados de la biodiversidad Macaronésica.
3. METODOLOGÍA PARA LA BÚSQUEDA DE COMPUESTOS CON
ACTIVIDAD FARMACOLÓGICA
Durante los últimos 15 años, muchas de las compañías farmacéuticas han
reducido la búsqueda de nuevos fármacos basados en productos naturales a favor de la
síntesis de librerías químicas. Una de las razones para este cambio resultó ser la
incompatibilidad de las librerías de productos naturales con los cribados basados en
métodos de alto rendimiento (Lam 2007). Esto fue una decisión prematura ya que, los
productos naturales han sido desde siempre una fuente importantísma de nuevos
fármacos. El desarrollo de las nuevas tecnologías que han hecho posible la
compatibilidad de los métodos de cribado con los productos naturales, la mejora de
técnicas genéticas o la manipulación genética de organismos, han hecho que el interés de
las empresas farmacéuticas por los productos naturales vuelva a resurgir (Li and Vederas
2009).
La amenaza real que afecta a la biodiversidad de las especies, ya sea en los
bosques o selvas o en los ambientes marinos, ha hecho que la investigación en productos
naturales se vuelva cada vez más y más importante, ya que la naturaleza nos ofrece una
fuente inagotable de nuevos compuestos que pueden ser usados como fármacos (Bohlin
et al. 2010). Diferentes estrategias basadas en estudios etnofarmacológicos, ecológicos,
toxiciológicos, o incluso estudios filogenéticos y de biología molecular se han aplicado
para poder llevar a cabo estudios de evaluación de la biodiversidad con el objetivo de
buscar nuevas sustancias bioactivas, obteniendo como resultado importantes
descubrimientos en medicina.
Importante también en la investigación actual es el desarrollo de nuevas
estrategias para la selección, aislamiento y caracterización de nuevos productos con
estructuras químicas únicas y con potencial actividad farmacológica. De igual manera,
nuevas técnicas y aproximaciones se hacen necesarias para seguir describiendo nuevas
dianas terapéuticas, realizar ensayos de actividad más potentes y optimizar las
actividades.
Por lo tanto, la investigación en productos naturales y el desarrollo de nuevos
fármacos no se concibe como algo simple, sino como un campo de investigación
multidisciplinar donde todas las disciplinas, tanto químicas como de biología molecular y
biomédicas deben ser complementarias en todo el proceso de investigación, desde la
purificación de un producto de una fuente natural, hasta su producción industrial, pasando
por la mejora química de su actividad o la manipulación genética de la fuente de origen.
En el Esquema 1 se puede ver la interrelación de las diferentes disciplinas que
participan en la ardua labor de descubrir y desarrollar nuevos fármacos.
Esquema 1. Interrelación entre las distintas disciplinas implicadas en el descubrimiento y desarrollo de
fármacos.
A continuación se describen diferentes posibilidades dentro de la metodología a
seguir en la búsqueda de nuevos fármacos, destacando algunos aspectos del proceso,
apoyándonos en datos publicados y que refuerzan el carácter multidisciplinar de la
investigación a realizar. Para una mejor comprensión dividiremos el proceso en base a
las diferentes áreas de investigación, subdividiéndose en laboratorios más específicos,
como el de química, el de ensayos biológicos, el de química computacional y el de
biología molecular y biotecnología.
3.1. LABORATORIO DE QUÍMICA.
El laboratorio de química sirve para la realización de varias actividades
relacionadas por ejemplo, con la obtención de productos naturales de diversas fuentes,
aprovechando diferentes organismos, como son las plantas, hongos o microorganismos
como fuente de obtención de moléculas de interés. Otra aproximación será usar la
química sintética para obtención de moléculas orgánicas que puedan poseer actividad
biológica. Por último también se realizarán modificaciones químicas de aquellos
compuestos más prometedores, buscando la mejora de sus características farmacológicas.
En resumen, en el laboratorio de química se realizarán trabajos de 1) fitoquímica de
productos naturales, 2) síntesis de moléculas orgánicas y 3) semisíntesis y modificaciones
químicas.
En relación a la fitoquímica y la búsqueda de productos naturales bioactivos, este
primer enfoque a realizar es uno de los más comunes dentro de la investigación de
productos naturales, ya que como se ha comentado, se quiere aprovechar diferentes
organismos como fuente de nuevos metabolitos con estructuras químicas novedosas, que
no hayan sido descritos y que posean una potencial actividad farmacológica de interés.
Existen innumerable ejemplos de metabolitos aislados de fuentes naturales con
muy variada actividad biológica, y que demuestran la importancia de esta primera
aproximación hacia la búsqueda de fármacos, ya que permiten disponer de una batería de
productos líderes, que en muchos casos son imposibles de obtener mediante la síntesis
química.
El estudio fitoquímico tiene como primer paso la obtención del material de partida
basándose en datos etnobotánicos, de medicina tradicional, o de artículos ya publicados.
Tras la recogida del material, este se secará y tras la homogeneización del mismo, se
someterá a extracción con disolvente orgánicos, para posteriormente, mediante técnicas
cromatográficas, como son la cromatografía de exclusión molecular, cromatografía de
afinidad o cromatografía de partición mediante centrífuga, etc., aislar los metabolitos
secundarios, los cuales, una vez caracterizados mediante técnicas analíticas, como la
Resonancia Magnética Nuclear o la Espectrometría de Masas, serán sometidos a
diferentes ensayos de actividad biológica.
Ejemplo de esto lo tenemos en el aislamiento y purificación de triterpenos con
actividad citotóxica de la especie Acacia mellifera, especie usada en la etnomedicina
Africana para tratar pneumonía, malaria, sifilis o dolores de estomago (Mutaia et al.
2004). Otro ejemplo de compuesto bioactivo aislado de una fuente natural es el caso de la
Taurospongina A, aislada de la esponja Hippospongia sp., que mostró actividad
inhibidora de la ADN polimerasa β y de la transcriptasa reversa del virus (Ishiyama et al.
1997).
En la región Macaronésica, y más concretamente en el Archipiélago Canario,
existen múltiples ejemplos de compuestos bioactivos aislados de especies endémicas de
la región. Así, tenemos que las hojas de Maytenus canariensis son masticadas por los
agricultores ya que sirven como estimulante y alivia la fatiga. Estudios fitoquímico han
dado lugar al aislamiento e identificación de numerosos metabolitos secundarios, entre
otros sesquiterpenos con actividad insecticida (Fig. 5) (González et al. 1997, González et
al. 1992) o triterpeno fenoles con actividad antibiótica (González et al. 1996).
Figura 5. Estructura de triterpenos aislados de Maytenus canariensis con actividad insecticida.
Otro ejemplo lo tenemos en el aislamiento de dos diterpenos con actividad
insecticida de la especie Persea indica también llamado Viñátigo, especie de la familia
Lauraceae, que se halla en los archipiélagos de Azores, Madeira y Canarias (González-
Coloma et al. 1992). Esta actividad insecticida también ha sido descrita en los aceites
esenciales de varias especies de plantas endémicas de la Macaronesia, concretamente del
archipiélago de Azores, como Laurus azorica (Loro o Laurel), Juniperus brevifolia
(Cedro) y Persea indica (Viñatigo), contra el gusano u oruga común Pseudaletia
unipuncta (Rosa et al. 2010).
Una alternativa a las plantas como fuente de metabolitos bioactivos la ofrecen los
HO OOAC
AcO
OBz OBz
O
OAc
HO OOAC
AcO
OAc OBz
O
OAc
microorganismo, diferenciándose éstos en la manera de recolección y posterior cultivo,
previos al proceso de extracción del conjunto de metabolitos secundarios. Además los
microorganismo ofrecen muchas veces la ventaja que bajo condiciones diferentes de
cultivo varían su perfil metabólico, produciendo nuevos compuestos. Ejemplo de esto lo
tenemos en la producción de una batería de 37 epotilonas, metabolitos citotóxicos
obtenidos de cepas de la Myxobacteria Sorangium cellulosum (Hardt et al. 2001).
Igualmente, existe en la actualidad, y gracias al desarrollo tecnológico, la
posibilidad de combinar las técnicas convencionales de purificación de productos y
ensayos bio-guiados, que permiten seguir la pista del o de los productos bioactivos
durante el proceso de separación y aislamiento, centrándose en aquellas fracciones que
muestren actividad, para finalmente obtener el producto activo purificado. Ejemplo de
este abordaje es el aplicado por Hsun-Shuo Chang y colaboradores al obtener una serie de
metabolitos del grupo de los sesquiterpenos con actividad citotóxica, mediante
fraccionamiento bio-guiado del extracto de raíz de la especie Magnolia kachirachirai
utilizada en medicina tradicional en Taiwan (Chang et al. 2010). Igualmente, se puede
aplicar a la extracción de productos naturales la tecnología de los métodos de alto
rendimiento (High-Throughput System), combinado en ocasiones con métodos analíticos
o de purificación complementarios, como son UPLC (Ultra Performance Liquid
Chromatography), UPLC-MS (Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass
Spectrometry), lo que permite el tratamiento y fraccionamiento de un gran número de
muestras obtenidas previamente en un tiempo muy inferior a los empleados con métodos
tradicionales (Tu et al. 2010).
Estos datos refuerzan la idea de que los productos naturales siguen siendo de gran
importancia como fuente de nuevos compuestos ofreciendo una gran variedad, desde el
punto de vista estructural y también desde el punto de vista de actividades biológicas, y
que además permiten obtener metabolitos que pueden ser considerados como líderes, a
partir de los cuales se realiza el diseño y desarrollo de nuevos fármacos.
La segunda aproximación que se llevará a cabo en el laboratorio de química es la
síntesis química de compuestos. Dicha síntesis se orienta, muchas veces en base a una
diana terapéutica, lo que se conoce como síntesis orientada a diana, creando librerías de
pequeñas moléculas potencialmente activas, en base a los datos recopilados de dicha
diana molecular, en relación a la estructura o función biológica. Igualmente puede
realizarse el diseño de una librería de moléculas para llevar a cabo un estudio de
modulación, activación o silenciamiento de rutas biosintéticas sin centrarse en una diana
particular aplicando lo que se conoce como síntesis orientada a la diversidad, que permite
simultáneamente, identificar nuevas dianas y qué moléculas interaccionan con ellas
(Gibbs 2000). Hay que tener en cuenta que la síntesis de compuestos pretende mimetizar
los productos naturales, ya que estos tienen la ventaja evolutiva de haber sido
seleccionados por su capacidad de unión a receptores moleculares. Esta mimetización
puede derivar en el descubrimiento de compuestos con mejoradas características
farmacológicas (Breinbauer et al. 2002). Hay que tener en cuenta que la creación de
librerías químicas o quimiotecas se realiza muchas veces basándose en el concepto de
“Estructura privilegiada”, concepto que define un motivo estructural capaz de
interaccionar con múltiples y nada relacionadas dianas moleculares con una alta afinidad.
Éstas son tipicamente estructuras rígidas, sistemas policíclicos con heteroátomos capaces
de poseer diferentes sustituyentes orientados en el espacio tridimensional (Nicolaou et al.
2002).
Para llevar a cabo la síntesis de moléculas la química posee diversas herramientas
como por ejemplo las reacciones multicomponentes. Estas reacciones se definen como
reacciones de 3 o más componentes quirales o no quirales, en un mismo recipiente de
reacción, añadidos al mismo tiempo, o prácticamente al mismo tiempo, para dar como
resultado un compuesto final de síntesis que posee partes de los reactivos usados (Fig. 6).
Esta reacción tiene ventajas como por ejemplo los bajos costes, el corto tiempo
consumido, así como los aspectos beneficiosos medio ambientales (Ramón and Yus
2005).
Figura 6. Esquema de una reacción multicomponente.
La idea de la reacción multicomponente puede aplicarse a numerosas reacciones,
en base a que tipo de compuestos final se desee sintetizar. Existen muchos ejemplos en la
literatura científica donde se expone el uso de numerosas reacciones químicas aplicando
la metodología de la reacción multicomponente, como por ejemplo las reacciones
asimétricas con paladio, la reacción de Mannich, la de Passerini, Diels-Alder o
Knoevenaguel-Michael (Ramón and Yus 2005 y referencias incluidas).
Otra herramienta usada en la síntesis química es el microondas, que tiene como
base el calentamiento de la reacción para acelerar el proceso químico. La ventaja más
importante del uso del microondas es la reducción del tiempo de reacción de días a horas
e incluso minutos o segundos (Kappe 2004). Haciendo uso del microondas se ha llevado
a cabo síntesis químicas mediante reacciones de naturaleza variada, como por ejemplo las
reacciones de Suzuki, la de Sonogashira, Buchwald-Hartwig o la Condensación de
Ullmann (Kappe 2004 y referencias incluidas).
La tercera aproximación que se realizará en el laboratorio de Química es la
modificación de productos que o bien previamente se han evaluado para actividades
biológicas, dando buenos resultados o bien productos aislados de fuentes naturales y que
por varios motivos, similitud estructural, abundancia, bioactividad de moléculas
similares, etc., se hace interesante la obtención de derivados para disponer de pequeñas
baterías de compuestos para su estudio y evaluación.
Como ejemplo se puede citar el trabajo de Huang y colaboradores que partiendo
de dos triterpenos activos, uno implicado en la inhibición de la maduración del virus del
SIDA y otro para el bloqueo de su entrada, y sabiendo de antemano la relación estructura-
actividad, desarrollaron la síntesis química de una pequeña librería de unos 20
compuestos combinando las dos propiedades anteriores, obteniendo así nuevos derivados
que poseían ambas actividades mejoradas (Huang et al. 2006). Otro atractivo ejemplo de
modificación química es la obtención de derivados del triterpeno dammarano (17α)-23-
(E)-dammara-20,23-diene-3β, 25-diol, para llevar a cabo un estudio de relación
estructura-actividad en relación a la propiedad antiinflamatoria de dicho compuesto
natural. Los autores desarrollaron la síntesis de compuestos más estable
termodinámicamente, y con una accesibilidad mayor a la derivatización en posición 17,
con una configuración β en dicha posición, que los convertía en compuestos con
actividades antiinflamatoria in vivo muy prometedoras (Scholz et al. 2004).
Otra aproximación muy interesante a tener en cuenta, ya que no sólo es novedosa
sino también que consiste en una mezcla de modificación química de productos naturales
y de modificación bioquímica, es la diseñada por el grupo del Dr. Furlan. La metodología
planteada se basa en usar un extracto vegetal como librería de compuestos de partida, sin
conocer su composición y hacerla reaccionar frente a una enzima, para así introducir las
modificaciones correspondientes, transformando grupos químicos comunes en el
metabolismo secundario, obteniendo un extracto final que contenga compuestos con
grupos químicos poco habituales, que de manera natural no serían sintetizados.
Ejemplo de esta aproximación fue el tratamiento del extracto butanólico
procedente de la planta Polygonum ferrugineum Wed con la enzima hidrazina
monohidrato mediante reflujo en etanol. Esta enzima reacciona con grupos químicos tales
como cetonas, aldehídos, ésteres y amidas para formar tanto hidrazonas o acil hidrazidas.
En esta reacción se intercambia un átomo de oxígeno por 2 átomos de nitrógeno. El
extracto resultante se evaluó frente a Candida albicans, patógeno humano que produce
infecciones de mucosas y sistémicas como organismo oportunista en pacientes
inmunocomprometidos. Dicho extracto mostró actividad frente a C. albicans, mientras el
extracto original no mostró actividad alguna. Tras este resultado estudios de
fraccionamiento bioguiado del extracto activo resultante, permitió el aislamiento de un
compuesto pirazol (Fig. 7). Dicho compuesto no se encontró en el extracto original,
indicando que el mismo fue sintetizado tras el método de modificación química aplicado
(López et al. 2007).
Figura 7. Estructura del pirazol aislado del extracto de Polygonum ferrugineum tratado con hidrazina
monohidrato, y que mostró actividad frente Candida albicans.
H3CO
H3COOH
OH
N NH
3.2. LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA Y BIOLOGÍA MOLECULAR.
Este laboratorio abarcará una gran variedad de actividades relacionadas con
aspectos como la manipulación genética de organismos, la producción in vitro de
metabolitos, crecimiento in vitro de plantas o tejidos vegetales, estudios de perfiles
genéticos de líneas celulares, producción de proteínas usando microorganismo, uso y
manipulación de líneas tumorales, etc.
El uso de microorganismo en un laboratorio de biología molecular y biotecnología
es algo muy habitual. De hecho, uno de los procesos a llevar a cabo en el laboratorio será
el uso de microorganismos como por ejemplo la bacteria Escherichia coli o la levadura
Pichia pastori como sistemas estables y robustos de producción de proteínas
recombinantes, bien para producir enzimas para biocatálisis, producción de factores de
transcripción, de receptores de membrana, etc. Así por ejemplo, se ha conseguido
producir el factor de inducción del interferón gamma humano en E. coli. Dicho interferón
participa en la respuesta inmune activando los macrófagos y las células Nk. La proteína
recombinante producida in vitro, a partir del ADNc generó la misma respuesta que la
proteína nativa. Esto muestra la posibilidad de conseguir una manera alternativa de
obtención de dicho factor de activación del interferón gamma empleando bacterias (Ushio
et al. 1996). Escherichia coli también puede utilizarse para producir enzimas que pueden
a su vez ser empleadas como biocatalizadores en síntesis orgánica, para llevar a cabo
alguna reacción específica que mediante la química tradicional, no pudiera ser efectuada.
Así, tenemos la producción de la ceto-ester reductasa I de Saccharomyces cerevicie que
lleva a cabo la reducción de un β-ceto ester dando lugar a su derivado hidroxilado con un
centro quiral adicional en su estructura (Fig. 8) (Kawai et al. 1998).
Figura 8. Reducción estereoselectiva del ceto-ester 1 mediante la ceto-ester reductasa aislada de
Saccharomyces cereviciae.
CO2Me
O
CO2Me
CO2Me
OH
CO2Me
Ceto-ester Reductasa I
NADPHGlucosa 6-fosfato
Otra clase de proteínas susceptibles de ser expresadas en estos sistemas biológicos
son los anticuerpos, usados muchas veces en terapias contra, por ejemplo, el cáncer. El
fragmento de anticuerpo de cadena variable, A33scFv reconoce la glicoproteína de
superficie conocida como A33, que se expresa en cáncer de colon, y que es utilizada
como antígeno diana en inmunoterapia. Se ha conseguido expresar en la levadura
metiltrófica Pichia pastoris, el fragmento A33scFv, lo que demuestra que el anticuerpo
funcional puede producirse en cantidades suficientes y de forma continua y controlada
para ser usado tanto en terapia como en diagnóstico del cáncer de colon (Leonardo et al.
2004).
Los microorganismos también son usados en el laboratorio como pequeñas
factorías de producción de metabolitos secundarios de interés farmacológico, bien por la
propia capacidad del microorganismo de producir un compuestos o bien mediante
manipulación genética del mismo, que conlleve a la producción no natural de un
compuesto de interés. Ejemplo de este tipo de manipulación lo tenemos con los alcaloides
rebecamicina y estaurosporina, que poseen actividad antitumoral. El grupo de genes
responsables de la biosíntesis de estos metabolitos aislados del hongo actinomicete
Lechevalieria aerocolonigenes se combinaron con genes seleccionados de otros
microorganismos, como Streptomyces albogriseolus, siendo posteriormente introducidos
en Streptomyces albus, llegando a obtenerse con este abordaje 30 derivados metabólicos
(Fig. 9) (Sánchez et al. 2005).
(1) (2)
Figura 9. Estructura de rebecamicina (1) y estaurosporina (2).
Otro ejemplo de manipulación de rutas genéticas, lo tenemos en el antibiótico
eritromicina. El sistema enzimático responsable de la síntesis de estos compuestos, las
policétidos sintasas (PKs), son un grupo de genes, unidos en cadena, donde cada gen es
HN
NH
N
OO
Cl Cl
O OH
HO
OCH3
OH
HN
N N
O
O
NHCH3
H3CO
HH3C
responsable de una modificación química específica (Fig. 10).
La manipulación de estos genes, bien mediante eliminación de algún componente
del complejo enzimático, la introducción de un nuevo gen o la modificación del
hospedador microbiano mediante la expresión heteróloga de alguno o algunos
componentes del complejo enzimático, da lugar a un cambio biosintético afectando al
producto final de la ruta metabólica o incluso, la obtención de un producto que de manera
natural no se produce (Trefzer et al. 2002, Palaniappan et al. 2003).
Figura 10. Complejo policétido sintasa responsable de la síntesis de eritromicina A constituido por un
módulo de carga, 6 módulos de extensión y el módulo de terminación. AT: acetil-transferasa, ACP: dominio
de proteína transportadora de acilos, KS: ceto-sintasa, KR: ceto-reductasa, DH: dehidratasa, ER: enoil-
reductasa.
CoSA
O
Propionil-CoA
+
6 (2S)-metilmalonil-CoA
HO ASCo
O O
AT AT AT AT AT AT ATACP KS KS KS KS KS KS
KR KR KR KR KRACP ACP ACP ACP ACP ACP TE
DH ER
Módulo 1 Módulo 2 Módulo 3 Módulo 4 Módulo 5 Módulo 6 FINMódulo carga
S S S S S S SO
OH
O
OH
OH
O
O
OH
OH
O
OH
OH
O
O
OH
OH
OH
O
O
OH
OH
OH
OH
O
Ciclación
O
O
O
OH
OH
OH
Hidroxilación
Transferencia de glicosilo
O
O
O
OH
OH
O
OH
O
OH
OH
Hidroxilación
Transferencia de glicosilo
O
O
O
OH
O
O
OH
O
OH
OH
HO
OHO
N(CH3)2
MetilaciónO
O
O
OH
O
O
OH
O
OCH3
OH
HO
OHO
N(CH3)2
Eritromicina A
Precursores
Pero no sólo los microorganismos serán susceptibles de ser manipulados. En el
laboratorio de Biotecnología y Biología Molecular también se trabajará con plantas como
sistema de estudio y producción de metabolitos secundarios.
Las plantas en muchas ocasiones ofrecen un sistema perfecto de producción de
productos naturales. A finales de los años 60, el cultivo de células y tejidos vegetales se
convirtió en una alternativa como fuente de metabolitos secundarios bioactivos,
pudiéndose establecer cultivos en condiciones in vitro de casi cualquier especie vegetal
en un medio nutritivo con los reguladores de crecimiento apropiados, lo cual permite la
producción de metabolitos secundarios de interés farmacológico de manera casi
indefinida (Alfermann and Peterson 1995).
Existen muchos ejemplos en la literatura científica, donde se describen los
esfuerzos llevados a cabo para la optimización y sobreproducción de metabolitos de
interés farmacológico producidos en células o tejidos vegetales. El compuesto
antitumoral taxol (Paclitaxel®) (Fig. 11) hoy en día se obtiene mayoritariamente a partir
de cultivos de células en suspensión a gran escala de diferentes especies de Taxus, con
grandes rendimientos (Tabata 2006).
Figura 11. Estructura química del Taxol.
La biotecnología vegetal se ha convertido en una atractiva herramienta aplicable a
la explotación de especies vegetales de interés para el hombre mediante el cultivo de
células, tejidos, órganos y organismos completos a través de su crecimiento in vitro para
la producción y obtención de fármacos a gran escala. Además, el descubrimiento de
bacterias del género Agrobacterium, las cuales de manera natural llevan a cabo la
OH
O
OAC
OAcO
H
OOHO
O
OH
NH
transformación genética de plantas mediante la transferencia de parte de su material
genético, ha facilitado la modificación genética de plantas, y más concretamente el
establecimiento de cultivos in vitro, tanto de callos como de raíces en cabellera (Fig. 12),
que proporcionan un sistema de estudio donde se llevan a cabo modificaciones de
diferentes rutas biosintéticas de interés mediante transferencia de genes que codifican
enzimas participantes en una determinada ruta metabólica, o el silenciamiento de genes
que permiten acumular intermediarios metabólicos más interesantes, o la sobreexpresión
de factores de transcripción que regulan diferentes rutas metabólicas, y todo esto con el
fin último de obtener mayores cantidades de metabolitos secundarios bioactivos bajo
condiciones controladas y manipulables (Tzfira et al. 2004, Gelvin 2003).
Figura 12. Cultivo in vitro de raíces en cabellera (izquierda) y placa de Petri con callos (derecha).
Los primeros trabajos de la aplicación de la ingeniería genética en plantas
medicinales fueron realizados por Yun y colaboradores, investigando la ruta de los
alcaloides tropánicos. Estos autores expresaron el gen de la enzima hiosciamina 6β-
hidroxilasa (H6H) de Hyoscyamus niger controlado por el promotor vegetal 35S, lo que
dio lugar a una sobreexpresión de la actividad H6H en plantas de Atropa belladonna (Yun
et al. 1992). Las plantas transgénicas de A. belladonna mostraron la conversión de
hiosciamina en escopolamina (Fig. 13), siendo este último un compuesto
farmacéuticamente más interesante y con mayor potencial (Oksman-Caldentey and Arroo
2000).
Figura 13. Estructura química de los alcaloides tropánicos hiosciamina y escopolamina.
Otro ejemplo, de ingeniería metabólica es el llevado a cabo en células en
suspensión de Catharanthus roseus, planta medicinal que produce interesantes
compuestos anticancerígenos y otros con aplicaciones en afecciones cardiológicas, las
cuales sobreexpresaban los genes de la estrictosidina sintasa (STR) y triptofano
decarboxilasa (TDC) que participan en la ruta metabólica de alcaloides terpénicos
indólicos (Fig. 14). Las células modificadas acumularon gran cantidad de estrictosidina,
precursor de la vincristina y vinblastina (Canel et al. 1998), que posteriormente mediante
química sintética será usado como producto de partida en la obtención de éstos dos
valiosos antitumorales.
Otra posibilidad que ofrece la ingeniería genética es la de producir proteínas de
interés en células o tejidos vegetales. Así, se ha descrito la producción y secreción en el
medio de cultivo, de formas biológicamente activas de interleukina-2 y 4, por parte de
células modificadas genéticamente de tabaco (Nicotiana tabacum) (Magnuson et al.
1998). Igualmente, en células de tabaco se ha descrito la producción de inmunoglobulina
G1 de ratón ( Sharp and Doran 2001).
O
O
H CH2OH
N
Me
O
O
H CH2OH
N
Me
O
Hiosciamina Escopolamina
Figura 14. Ruta biosintética parcial de los alcaloides vinblastina y vincristina y enzimas TDC y STR
sopbreexpresadas.
Otro aspecto atractivo a tener en cuenta con respecto a las biotecnología vegetal,
es el de poder llevar a cabo el crecimiento y propagación in vitro de plantas para
diferentes fines, como por ejemplo conservación de especies endémicas en peligro de
extinción, disponer de material vegetal que puede ser usado en el aislamiento de nuevos
compuestos que están bajo estudio y de los cual se necesitan más cantidades o el
aislamiento de un metabolito que no puede ser obtenido mediante otras vías, por ejemplo
sintéticas o en definitiva, para la obtención de compuestos de interés para cualquier
ámbito de la actividad humana.
Se ha llevado a cabo la propagación in vitro de la especie Atropa baetica,
NH
COOH
HH2N
Ruta del shikimico Ruta del mevalonato
O
H
H
HO
H3COOC
OGlc
L-triptofanologanina
NH
NH2
triptamina O
H
H
H3COOC
OGlc
OH
secologanina
TDC
NH
NH
O
H
H
H3COOC
OGlcH
estrictosidina
Vinblastina
Vincristina
STR
clasificada como especie en peligro de extinción. Esta especie es endémica del norte de
Marruecos y sur de España, y como otras especies de la familia de las Solanaceas,
produce los alcaloides atropina y escopolamina de interés médico y de uso terapéutico
común (Zárate et al. 1997). Aquí se combina la posibilidad de recuperar la población de
una especie en peligro de extinción, que además es interesante desde el punto de vista
farmacológico. Otro ejemplo de la aplicación de las herramientas de biotecnología
vegetal se llevó a cabo con el objeto de obtener compuestos bioactivos de la especie
Maytenus ilicifolia, ya que dicha especie es una fuente importante tanto de triterpenos
con actividad antitumoral como de metabolitos con propiedades antioxidantes (Filho et
al. 2004), donde a partir de hojas se obtuvieron callos en cultivos productores de los
compuestos de interés.
Otro tipo de células que se manejan en el laboratorio, son las células de diferentes
líneas tumorales en cultivo, que tras ser manipuladas podrán, por ejemplo, ser utilizadas
para diferentes ensayos de actividad biológica, o simplemente para estudiar el efecto en el
crecimiento o comportamiento celular, tras la introducción de un gen determinado, o para
la realización de bioensayos para testar la actividad antitumoral de determinados
compuestos como se describe más abajo. p27 es un inhibidor de quinasas dependiente de
ciclinas, el cual controla la fase G1 del ciclo celular en combinación con pRb. Se ha
asociado la actividad de p27 con parada del ciclo celular y con apoptosis. La transfección
de células tumorales de pulmón, usando ADNc de p27 fue posible usando como vector
un adenovirus. Tras la transfección el crecimiento de las líneas celulares H322, A549 y
SQ-5, las cuales expresaban pRb, fue inhibido casi completamente. Este estudio demostró
que el efecto inhibidor e inductor de apoptosis mediante sobre-expresión de p27,
necesitaba de la expresión de pRb, y que la transfección mediante adenovirus del factor
p27, puede considerarse una buena estrategia en la terapia contra el cáncer (Naruse et al.
2000).
Aspecto relacionados con el estudio del perfil de expresión génica de genes
relacionados con la aparición del cáncer, o su implicación en el desarrollo del mismo,
serán también tareas a realizar. Ejemplo de esto son los genes HOX, implicados en el
control de la morfogénesis durante el desarrollo embrionario. Estudios de expresión
génica, mediante RT-PCR tiempo real cuantitativa mostraron que los genes HOX se
expresan de una manera tejido-dependiente en el adulto y que la desregulación de la
expresión de la familia Abd-B de estos genes está implicada en el desarrollo del tumor de
tiroides (Takahashi et al. 2004).
3.3. LABORATORIO DE ENSAYOS BIOLÓGICOS.
Una de las aproximaciones obligadas a practicar en el proceso global de búsqueda
de fármacos, y complementaria a otras son los ensayos in vitro para determinar la posible
actividad biológica de un compuesto. Estos ensayos abarcan un amplio espectro de
actividades, como pueden ser la actividad antitumoral, antibiótica, antiinflamatoria,
insecticida, anti-VIH, etc. En este apartado se citan ejemplos de diferentes ensayos
realizados, tanto in vitro como in vivo y que reflejen la metodología a seguir en el proceso
y su utilidad en este tipo de laboratorios.
3.3.1. Estudios de Actividad Antitumoral. (faltan imágenes)
Los fármacos derivados a partir de productos naturales o productos naturales per
se, constituyen actualmente el principal arsenal quimioterapéutico empleado para el
tratamiento del cáncer representando aproximadamente el 60-65% de los fármacos
disponibles. De esta forma, los fármacos que interfieren con la división y proliferación
celular, incluyendo los agentes alquilantes, alcaloides, agentes que afectan a la
polimerización de la tubulina, y los inhibidores de la topioisomerasa, son ejemplos de
agentes citotóxicos ampliamente empleados en la terapia del cáncer, muchos de los cuales
se han derivado de productos naturales muy relevantes como son el taxol, vinblastina,
vincristina, antraciclina, daunomicina y doxorubicina (Newman et al. 2003).
A parte de los agentes anteriormente comentados, los cuales son todos citotóxicos, es
decir promueven la muerte de la célula tumoral, otro fenómeno mostrado en muchos tipos
de cáncer es la inexistencia de un efectivo proceso de muerte celular programada o
apoptosis, ya que la alteración o mutación de los diferentes reguladores de la apoptosis
conduce invariablemente a la tumorogénesis. Al respecto, es importante destacar que el
surco menor del ADN constituye otra diana importante para el tratamiento antitumoral.
Así, la trabectedina (también conocida como ecteinascidina-743 o ET-743) y con
nombre comercial Yondelis, es un ejemplo de un compuesto derivado de un producto
natural marino que se une al surco menor del ADN empleado en su lanzamiento para el
tratamiento quimioterápico del sarcoma de tejidos blandos y del cáncer de ovario, aunque
se sigue investigando su aplicación para el tratamiento de otros tipos de cáncer y ya se ha
ampliado su uso para nuevos tipos de cáncer (Baker et al. 2007). La trabectedina se une
selectivamente a la guanina del ADN provocando una deformación de la estructura
molecular de la hélice y consecuentemente, una alteración de los procesos del ciclo
celular que provocan la apoptopsis.
Por otro lado, las quinasas de proteína que regulan los procesos de señalización
intracelular implicados en los mecanismos moleculares que median diferentes fenómenos
como son el crecimiento celular, diferenciación y apoptosis, constituyen dianas
potenciales para el desarrollo de fármacos antitumorales (Sarkar et al. 2006). Uno de los
ejemplos más representativos de estas vías de señalización es la vía de Jak (Janus Kinase)
– STAT (Signal Transducers and Activators of Transcription). En los últimos años se ha
demostrado firmemente que los factores de transcripción STAT son claves en múltiples
procesos biológicos muy bien conservados a lo largo de la evolución. Muchas citoquinas,
hormonas y factores de crecimiento utilizan los STAT para controlar una gran variedad de
respuestas biológicas como son el desarrollo, la diferenciación, la proliferación o la
supervivencia celulares (Ivanenkov et al. 2008, Levy et al. 2002). Las citoquinas y los
factores de crecimiento regulan dos grupos fundamentales de tirosinas quinasas (TK)
necesarias para activar a los STAT: la familia de proteínas JAK, asociadas a receptores, y
los dominios intracelulares de los receptores con actividad TK intrínseca. A éstas se
suman otras TK citoplasmáticas capaces de activar STAT (p.ej., Src). La fosforilación en
tirosina de los STAT les permite dimerizarse, translocarse al núcleo y unirse a las
regiones promotoras dianas donde determinan su transcripción y, finalmente, el fenotipo
celular. Modificaciones adicionales, incluyendo la fosforilación de residuos de serina, así
como la formación de complejos con proteínas coactivadoras resultan también necesarias
para conseguir una máxima actividad transcripcional (Mertens et al. 2007).
Las consecuencias funcionales de la activación dependen del tipo de STAT
activado, ya que la mayoría muestran un patrón de regulación de genes con características
muy diferenciadas. Un aspecto muy importante de este proceso es su exquisita regulación
negativa para asegurar que las respuestas fisiológicas no se conviertan en patológicas
(O'Sullivan et al. 2007). En situaciones fisiológicas, la activación de la vía JAK-STAT se
caracteriza por ser rápida (minutos) pero transitoria, seguido por un período de
inactivación durante el cual la célula permanece refractaria a nuevos estímulos (Croker et
al. 2008). Esto es importante para el control del fenotipo celular normal, (Waxman and
O'Connor 2006) así como para el de determinadas patologías (e.g., cáncer) (O'Sullivan et
al. 2007).
Los STAT regulan su propia inactivación, en parte, a través de genes dianas que
codifican a las proteínas SOCS (Suppresors of Cytokine Signaling). Estas proteínas,
generalmente, actúan como inactivadores de JAK y STAT de forma muy similar a un
mecanismo clásico de retroalimentación negativa (O'Sullivan et al. 2007)
Actualmente existen numerosas evidencias experimentales que muestran cómo la
activación constitutiva o aberrante de STAT o el silenciamiento de las proteínas SOCS,
son mecanismos frecuentemente implicados en la transformación tumoral de las células
inducida por numerosos oncogenes y en la progresión maligna de múltiples cánceres
humanos (Groner et al. 2008). En concreto, la activación aberrante o constitutiva de
STAT3 y STAT5 y/o la pérdida de señalización dependiente de STAT1 o el silenciamiento
de SOCS se asocia con el desarrollo de un importante número de tumores humanos. Esto
se entiende porque las proteínas STATs pueden regular muchos procesos biológicos
importantes en oncogénesis como son: la progresión del ciclo celular, apoptosis,
angiogénesis, metástasis e invasión tumoral y la capacidad del tumor de evadirse del
sistema inmune. Por esta razón, los inhibidores de TK y los moduladores directos o
indirectos de las proteínas STAT se están mostrando muy útiles como antitumorales
(Ivanenkov et a. 2008, Seidel et al. 2000). En los últimos años, se han introducido en la
práctica clínica algunos inhibidores de TK los cuales han mejorado dramáticamente el
tratamiento de diferentes tipos de cáncer. Sin embargo, continuamente se acumulan
evidencias a favor de que las células malignas se pueden hacer resistentes a estos
inhibidores desarrollando mutaciones constitutivamente activas (Constantinescu et al.
2008) que las hacen insensibles al fármaco, o a través de la activación de otras TK o
mecanismos autocrinos o paracrinos (Haura et al. 2005, Luo and Laaja 2004). Por otra
parte, con pocas excepciones, las TK activadas en un determinado tumor son muchas
veces desconocidas. Afortunadamente, los STAT son un punto de convergencia para
muchas de las vías de señalización dependientes de esas TK, lo que nos indica que la
búsqueda de inhibidores de STAT aún nos permitirá sostener la promesa de encontrar
fármacos con una elevada eficacia incluso en presencia de insensibilidad celular a los
inhibidores de TK.
Obviamente, existen innumerables bioensayos para determinar si un determinado
producto tiene o no actividad antitumoral, por lo que intentar comentarlos todos haría que
este documento fuera prácticamente interminable. Por lo tanto, a continuación se
presentan los bioensayos que consideramos más relevantes y que se podrían llevar a cabo
rutinariamente en cualquier laboratorio para determinar la actividad antitumoral de
productos naturales tanto in vitro como in vivo.
Ensayos in vitro
Los principales ensayos in vitro para determinar la actividad antitumoral se
realizan con líneas celulares tumorales (transformadas e inmortales) que se cultivan en
condiciones estériles en el laboratorio. Existen una gran cantidad de líneas celulares
tumorales disponibles para realizar estos bioensayos in vitro, aunque quizás entre las más
empleadas podríamos citar:
1. HEL: línea celular de leucemia humana.
2. SKBR3: línea celular de cáncer de mama humano.
3. MCF-7: línea celular de cáncer de mama humano.
4. HEK: línea celular de cáncer renal humano.
5. HeLa: cáncer epitelio de cervix humano.
6. NCTC 3749: linfoma de ratón.
El ensayo colorimétrico de viabilidad celular del MTT ([3-(4,5-dimethylthiazol-2-
yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide]) es uno de los ensayos más frecuentemente
practicados para determinar el efecto citotóxico de un determinado producto sobre líneas
celulares tumorales. El MTT es un bioensayo bastante sencillo de realizar y que permite
cuantificar el efecto inhibidor del crecimiento celular de líneas celulares tumorales
(cuantificación de la proliferación celular y evaluación citotóxica de un producto). El
MTT es un sustrato sintético que es reducido por enzimas mitocondriales y citosólicas en
las células metabólicamente activas dando como resultado un producto coloreado e
insoluble (sal de formazán) que se acumula en el interior de las células. Tras la captación
y entrada del MTT por las células y su metabolización hasta la producción de formazán,
seguidamente se procede a la rotura celular y a la solubilización del formazán con el
detergente SDS y con ácido clorhídrico (HCl). Finalmente, se realiza una medición
espectrofotométrica de la absorbancia a 570nm que será un indicador del número de
células vivas (viables). Esta determinación espectrofotométrica no es capaz de detectar
las células que hayan muerto tras la exposición al compuesto a evaluar, siendo la señal
generada dependiente del grado de activación celular (células vivas) (Mosmann 1983).
Para transformar el valor de absorbancia registrado a 570nm en número de células
viables, se debe cuantificar la relación lineal entre este valor de absorbancia y el número
de células viables sembradas para cada línea celular. Hay que tener en cuenta que para
realizar este bioensayo, siempre se ha de trabajar en condiciones de total esterilidad, en
cabina de flujo laminar para evitar la contaminación de los cultivos celulares y que
además el MTT debe prepararse justo en el momento de su uso, comprobando que no
tiene coloración azulada ni está precipitado.
Un claro ejemplo del uso del método colorimétrico MTT para determinar
viabilidad celular lo podemos encontrar en el estudio de actividad pro-apoptótica de
varios derivados del triterpeno betulina y ácido betulínico, frente a varias líneas tumorales
humanas, con el fin de establecer una relación estructura-actividad de los compuestos
ensayados (Sarek et al. 2003).
A continuación se muestra lo que podría considerarse un protocolo resumido del
proceso a seguir para la detección de células viables mediante este método.
1. 1. Sembrar las células a testar en una placa de cultivo de 96 pocillos y
a la densidad óptima de células correspondiente a la fase lineal de
crecimiento exponencial. Si son células que crecen es suspensión (no
adheridas al substrato), el tratamiento puede empezarse entre 1-2 horas
después de sembrarlas. Si son células adherentes, el tratamiento se
empezará al día siguiente de la siembra, cuando estas células se hayan
adherido.
2. 2. Aplicar el compuesto/extracto a evaluar en disoluciones seriadas en
el cultivo celular, conociendo las concentraciones finales a las que se va a
encontrar el compuesto a ensayar en el medio de incubación (células más
cocktail de incubación).
3. 3. Tras el periodo de incubación de las células con el
compuesto/extracto a evaluar (37ºC, 5% CO2, dependiendo el tiempo de
incubación del compuesto/extracto a evaluar), añadiremos a cada pocillo el
MTT a una concentración de 0,3 mg/mL y dejamos actuar el producto
incubando las células sin agitación a 37ºC (5% CO2), en oscuridad,
durante 2-4 horas, dependiendo del metabolismo de la línea celular a
evaluar (hay que tener en cuenta la densidad celular y la actividad
metabólica de la línea celular a tratar, de forma que si ésta es alta, es
suficiente una incubación de 2 horas.
1. 4. Tras la incubación procederemos a la rotura celular (lisis) y
a la solubilización del producto metabólico del MTT (formazán)
añadiendo 100µl por pocillo de SDS-HCl (20% de SDS en HCl 0,02M) a
cada pocillo. Este tratamiento permite disolver los cristales de formazán
que se han producido por la reducción del tetrazolium. Para que se
produzca una disolución completa podemos realizar la incubación con
SDS-HCl durante toda la noche a 37ºC.
2. 5. Recogemos el lisado y medimos la absorbancia a 570nm mediante
un lector de mircroplaca (espectrofotómetro). Siempre es conveniente
medir una muestra blanco que contendrá MTT+SDS-HCl, ya que esta
muestra nos dará la absorbancia debida a estos productos. Esta
absorbancia blanco o control la restaremos a la absorbancia obtenida para
cada una de las muestras problema. Siempre que hacemos este tipo de
determinaciones hay que tener en cuenta que estamos aplicando la ley de
Beer-Lambert (también conocida como ley de Beer o ley de Beer-Lambert-
Bouguer), la cual es una relación empírica que relaciona la absorción de
luz con las propiedades del material atravesado. Esta ley establece una
relación lineal (entre un rango de absorbancia) de lectura establecido por
el investigador entre la absorbancia detectada a 570nm y la cantidad de
células. Esto significa que las lecturas de absorbancia a 570nm no serán
correctas si los valores se salen del rango lineal (absorbancia a 570nm>1).
En ese caso se debe diluir la muestra (por ejemplo una dilución 1:1) con
MTT-SDS-HCl y volver a leer. En este caso, la concentración real
resultará de multiplicar el valor obtenido en la dilución por el factor de
dilución utilizado. La ley de Beer-Lambert se desvía de su
comportamiento lineal en concentraciones superiore a 0.01M.
1. El índice de Citotoxicidad (IC) se calcula mediante la siguiente
fórmula:
IC (%): (1-A/B) x 100; donde A es la lectura de densidad óptica de la
muestra problema (correspondiente a las células tratadas con el compuesto
bioactivo a ensayar) y donde B es la lectura de densidad óptica del control
(correspondiente a las células tumorales controles no incubadas con el
fármaco a ensayar).
Otra técnica que permite estudiar la viabilidad celular y por tanto también la
muerte celular apoptótica, es la citometría de flujo. La citometría de flujo es una técnica
de análisis celular que implica medir las características de dispersión de luz y
fluorescencia que poseen las células conforme se las hace pasar a través de un rayo de
luz. Para su análisis por citometría de flujo, las células deben encontrarse individualmente
en suspensión en un fluido. Las células sanguíneas pueden analizarse prácticamente de
manera directa, las células de tejidos sólidos deben primero dispersarse. Al atravesar el
rayo de luz, las células interaccionan con éste causando dispersión de la luz. Basándose
en la difracción de la luz en sentido frontal, se puede evaluar el tamaño de las células que
pasan y al medir la reflexión de la luz de manera lateral se evalúa la granularidad o
complejidad de estas. Además de la dispersión de la luz, si previamente a su análisis se
coloca a las células en presencia de anticuerpos monoclonales marcados con moléculas
fluoredscentes, se puede evaluar que células poseen los antígenos complementarios a los
anticuerpos monoclonales usados. El uso de moléculas fluorescentes distintas (distintos
colores de fluorescencia) permite analizar la presencia de varios marcadores de manera
simultánea.
La citometría de flujo puede ser empleada para la determinación de la actividad
antitumoral de un determinado producto por su capacidad para cuantificar la apoptosis
celular que se produce tras la exposición al agente citotóxico en estudio. Durante la
apoptosis (muerte celular programada), las células pierden la simetría en la composición
de fosfolípidos de membrana, exponiendo en el exterior celular la fosfatidilserina, que
debería situarse en la cara interna, y puede ser utilizada para cuantificar la appoptosis.
Este proceso se puede monitorizar mediante la técnica de citometría de flujo, utilizando la
proteína de unión a fosfolípidos Annexina V, marcada a su vez con una molécula
fluorescente, la cual posee una alta afinidad por la fosfatidilserina. Este método es rápido
y fácil de llevar a cabo en el laboratorio, aunque requiere la adquisición de un equipo de
citometría de flujo de alto valor económico (Vermes et al. 1995).
Para evitar el uso del citómetro de flujo para la cuantificación de la apoptosis, se puede
realizar un ensayo rápido y simple de ELISA (acrónimo del inglés Enzyme-Linked
ImmunoSorbent Assay, Ensayo por Inmunoabsorción Ligado a Enzimas). ELISA es una
técnica de inmunoensayos en la cual un antígeno inmovilizado se detecta mediante un
anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable como cambio
de color o algún otro tipo; en ocasiones, con el fin de reducir los costes del ensayo, nos
encontramos con que existe un anticuerpo primario que reconoce al antígeno y que a su
vez es reconocido por un anticuerpo secundario que lleva enlazado la enzima
anteriormente mencionada. La aparición de colorantes permite medir indirectamente
mediante espectrofotometría el antígeno en la muestra, lo que abarata sobremanera la
realización de esta técnica ya que la determinación colorimétrica final se realiza mediante
la utilización de un simple espectrofotómetro.
Un ejemplo de este tipo de ensayos es la cuantificación de apoptosis en células
tumorales MDA-MB-231 (cáncer de mama) que han sido expuestas al compuesto
bioactivo que queremos ensayar, mediante la utilización de un kit comercial de ELISA
(M30-Apoptosense; Peviva AB, Bromma, Sweden). Este kit está basado en el corte
proapoptótico de la proteína citoqueratina-18 (K18), la cual se expresa en las células de
los carcinomas más frecuentes. Cuando se induce la apoptosis de las células tumorales a
través de la terapia antitumoral, las proteínas caspasas proceden al corte de K18 en varios
fragmentos lo que deja expuesto el antígeno M30 (región de aminoácidos de la K18). Los
fragmentos de la proteína K-18 son liberados al medio extracelular y pueden ser
detectados a través de esta técnica de ELISA, la cual utiliza para ello un aticuerpo
monoclonal específico contra el antígeno M30 de la K18. Por lo tanto, es posible
cuantificar la apoptosis celular inducida por un determinado compuesto mediante la
exposición in vitro de células tumorales al agente a testar, procediendo posteriormente a
la cuantificación espectrofotométrica del antígeno M30 de K-18 empleando para ello el
kit de ELISA comercial que hemos comentado. Normalmente, en estos ensayos se suele
usar un agente antitumoral de probada eficacia proapoptótica sobre células tumorales
(control positivo), como por ejemplo el paclitaxel.
Como comentamos anteriormente, la modulación del nivel de activación (grado de
fosforilación) de determinadas proteínas quinasas (tirosin-quinasas o TK) implicadas en
procesos celulares tales como el crecimiento y la diferenciación celular, y por supuesto la
apoptosis, puede ser uno de los mecanismos a través de los que actúe un compuesto con
actividad antitumoral (por ejemplo a través de la vía de JAK-STAT).
Para determinar el nivel de fosforilación (activación) de estas proteínas quinasas
se pueden emplear varias técnicas basadas igual que el ELISA en el uso de anticuerpos
específicos. Una de las técnicas más ampliamente usadas para la determinación de los
cambios en el nivel de fosforilación de proteínas quinasas que emplea anticuerpos
específicos es la técnica del Western blot o inmunoblotting.
Primeramente, antes de comenzar el proceso de Western blot hemos de incubar las
células tumorales que estemos utilizando con el compuesto para el que queremos
determinar su potencial actividad antitumoral. Obviamente, parte del cultivo celular debe
permanecer como control y ser expuesto únicamente al vehículo en el que esté diluido el
compuesto. Posteriormente, tras el periodo de incubación con el compuesto se procede a
la lisis celular y a la preparación de extractos proteícos totales, siempre incluyendo
inhibidores de proteasas y de fosfatasas en el tampón de extracción tal como se describe
en (Guerra et al. 2004, Guerra et al. 2008, Guerra et al. 2007). A continuación, se procede
a la cuantificación de la concentración de proteínas del extracto usando por ejemplo la
técnica del ácido bicinconínico (Smith et al. 1985).
Una vez obtenido el extracto proteinco, la técnica del Western blot prosigue con la
separación electoforética de las proteínas atendiendo a su peso molecular, empleando
geles de acrilamida que se preparan en condiciones desnaturalizantes (Sodium Dodecyl
Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)). Tras la electroforesis, se
procede a la transferencia de las proteínas separadas por su peso molecular a una
membrana (soporte sólido), que será posteriormente incubada con anticuerpos
específicos. En este momento comienza la fase de inmunodetección.
Durante la inmunodetección se emplean anticuerpos específicos, normalmente
comerciales, que estarán dirigidos contra las formas fosforiladas y totales de las proteínas
quinasas sobre las que queremos testar la potencial actividad farmacológica de nuestro
compuesto. Inicialmente, incubaremos la membrana con el anticuerpo primario dirigido
contra la forma fosforilada o total de la proteína quinasa que estemos estudiando (por
ejemplo STAT5), para posteriormente realizar una serie de lavados que permitirán
eliminar el exceso de anticuerpo no unido. Finalmente, emplearemos un anticuerpo
secundario que estará dirigido contra el primario para detectar la unión anticuerpo
primario–proteína fijada en la membrana, formándose un complejo proteína diana (forma
fosforilada o total)–anticuerpo primario–anticuerpo secundario. Generalmente, el
anticuerpo secundario tiene unido a él una enzima llamada Peroxidasa de Rábano
(Horseradish Peroxidase (HRP)), la cual es capaz de catalizar una reacción química en la
que finalmente se genera un producto que emite luz (quimioluminiscencia). La cantidad
de luz emitida puede ser registrada mediante un equipo que contiene una cámara digital
que sea lo suficientemente sensible para detectar esa quimioluminiscencia, para
posteriormente realizar una cuantificación de la intensidad de la señal mediante un
software apropiado. Esta técnica permite determinar por ejemplo, cambios en el nivel de
fosforilación (actividad) de una determinada proteína quinasa haciendo una proporción
entre la señal obtenida para la forma fosforilada de la proteína y la obtenida para la forma
total, cambios en el nivel de expresión de una proteína, cambios postraduccionales de la
proteínas (la fosforilación es también una modificación postraduccional, pero existen
muchas otras), interacciones entre diferentes proteínas, etc.
En definitiva, esta metodología nos puede permitir saber si el producto natural que
nosotros estamos ensayando es capaz de actuar como antitumoral, ya que la utilización de
esta técnica nos puede permitir determinar, si ese producto es capaz de inhibir, por
ejemplo, la fosforilación (inhibir la actividad) de proteínas quinasas que se encuentran
constitutivamente activas en determinados tipos de tumores. Existen múltiples estudios
publicados en los cuales se utiliza la técnica del Western blot para determinar la actividad
antitumoral de un determinado fármaco. Por ejemplo, en un estudio recientemente
publicado se ha empleado esta técnica para determinar el efecto del fármaco AZD1480
(un potente inhibidor de JAK2) sobre la señalización intracelular mediada por STAT3, y
sobre la oncogénesis en tumores sólidos (Hedvat et al. 2009).
Otra técnica que podemos utilizar para investigar si un determinado producto es
capaz de inhibir o reducir el nivel de fosforilación de proteínas quinasas implicadas en
procesos celulares relevantes para el desarrollo de tumores, es la inmunofluorescencia-
inmunohistoquímica.
Se trata de una metodología más cualitativa que cuantitativa, en la que también se
emplean anticuerpos específicos (generalmente comerciales) dirigidos contra las formas
fosforiladas y totales de las proteínas de interés, y que serán utilizados para incubar
nuestros cultivos de células tumorales. Inicialmente, los cultivos de células tumorales
serán incubados con diferentes concentraciones del producto a testar, para tras este
tiempo de incubación proceder a la fijación de las células. La fijación de las células se
suele realizar con 4% de Paraformaldehido, aunque también se puede usar metanol,
acetona, etc (Marín et al. 2003).
Tras la fijación se procede a la incubación de las células fijadas con un anticuerpo
primario dirigido contra la forma fosforilada o total de la proteína quinasa de interés.
Generalmente, la incubación con el anticuerpo primario se realiza en un medio que
contiene detergente para así alterar la permeabilidad de la membrana y permitir la entrada
de los anticuerpos (primarios y secundarios) al interior celular, para que de este modo se
pueda producir su interacción con la proteína quinasa de interés (Marín et al. 2003). Por
otro lado, también se emplea esta técnica para detectar proteínas con un dominio
sobresaliendo en la cara externa de la membrana (proteínas receptoras de membrana). En
esta variante, no debemos usar detergentes para no producir alteraciones de la
permeabilidad de la membrana plasmática (Marín et al. 2003). Tras la incubación con el
anticuerpo primario y después de eliminar el exceso de anticuerpo no unido mediante una
serie de lavados, se procede a incubar las células con el anticuerpo secundario dirigido
contra el primario. El anticuerpo secundario permitirá revelar la unión antígeno (proteína
de interés) – anticuerpo primario, ya que lleva unido una enzima como por ejemplo la
HRP o un fluorocromo. Es precisamente el método de revelado empleado el que
diferencia a la inmunohistoquímica de la inmunofluorescencia. En la inmunohistoquímica
o en nuestro caso en la inmunocitoquímica (ya que estamos trabajando con cultivos de
células tumorales), el anticuerpo secundario suele tener acoplado la enzima HRP, de
forma que la adición de un determinado substrato (3,3-diaminobencidina, (DAB)),
producirá una reacción química de oxidación catalizada por la HRP en la cual el substrato
(DAB) es convertido en un producto insoluble de color marrón que precipitará en la zona
donde se encuentre el complejo proteína (antígeno)–anticuerpo primario–anticuerpo
secundario.
En la inmunofluorescencia, el anticuerpo secundario estará acoplado a un
fluorocromo que es capaz de emitir luz de una determinada longitud de onda (espectro de
emisión) cuando es excitado con luz de una longitud de onda apropiada (espectro de
absorción). Cada fluorocromo (Fluorescein Isothiocyanate (FITC), Cyanine Dyes (Cy2,
Cy3 y Cy5), Texas Red, Rhodamin Red, etc.) tendrá su espectro de absorción-emisión
característico.
Las ventaja de la inmunohistoquímica es que podemos visualizar los resultados en
un microscopio óptico normal, mientras que para visualizar los resultados de la
inmunofluorescencia debemos usar un microscopio de fluorescencia, equipo que resulta
bastante más caro que un microscopio óptico normal. Sin embargo, la inmufluorescencia
permite detectar varias proteínas simultáneamente mediante el empleo de anticuerpos
secundarios acoplados a distintos fluorocromos que emitirán luz con longitudes de onda
diferentes al ser excitados, esto siempre y cuando el microscopio de fluorescencia que
empleemos tenga los filtros adecuados para detectar esos espectros de emisión.
Estas técnicas permiten saber, aunque sea de una manera cualitativa, si el producto
que nosotros estamos testando es capaz de inhibir por ejemplo, la fosforilación de un
proteína quinasa implicada en procesos de tumorogénesis porque detectaremos menos
señal (determinada por inmunocitoquímica o inmunofluorescencia) en las células
incubadas con el producto que en las células control (incubadas con el vehículo del
compuesto). Ambos métodos de revelado permiten ubicar la localización de la proteína en
la célula, lo cual puede resultar muy interesante para investigar, por ejemplo, si la
inhibición de la fosforilación de la proteína quinasa diana, impide además su posterior
dimerización y traslocalización al núcleo para modular la expresión génica, como es el
caso de los factores de transcripción STAT. De esta forma, los ensayos de
inmunofluorescencia han sido ampliamente empleados para determinar con precisión la
inhibición de la traslocación al núcleo de factores de transcripción implicados en
oncogénesis (por ejemplo STAT3) en respuesta al tratamiento con un determinado agente
antitumoral (Hedvat et al. 2009).
Otros ensayos a realizar en el laboratorio podrían ser los relacionados con la
inhibición de las enzimas Topoisomerasa I y II. Éstas son enzimas nucleares que juegan
un papel importante en eventos metabólicos del ADN, como son replicación,
transcripción, recombinación o segregación de cromosomas. La Topo I cataliza la
relajación del ADN super enrollado rompiendo y uniendo una hebra del ADN, usando
ATP. En cambio la Topo II lleva a cabo la relajación del ADN super enrollado mediante la
rotura de la doble cadena de ADN, reacción dependiente también de ATP. Estas enzimas
se han descrito como dianas terapéuticas en la quimioterapia del cáncer (Liu 1989).
Haciendo uso de este tipo de ensayos, se evaluó la actividad inhibidora de las
Topoisomerasas I y II de varios triterpenos (lupeol, betulina y oleanos) aislados y
purificados de la especie Phyllanthus flexuosus, determinándose así la capacidad
inhibitoria de estos compuestos sobre estas enzimas (Wada et al. 2001).
Por último, de entre todos los potenciales ensayos in vitro que se podrían realizar,
cabe destacar los que intentan determinar si el producto que nosotros estamos testando
para actividad antitumoral tiene la capacidad de inhibir la migración y la capacidad de
invadir nuevas regiones del cuerpo (metástasis) que poseen normalmente las líneas
celulares tumorales. Estos ensayos pueden proporcionar una información clave en lo que
se refiere a la capacidad del producto a ensayar para bloquear la capacidad de
metastatizar de estas células.
Estos ensayos son generalmente realizados para cuantificar la capacidad que
tienen diversas líneas celulares tumorales para migrar e invadir nuevas regiones, lo cual
es estudiado mediante ensayos de migración e invasión a través de los pocillos de la placa
multipocillos que utilizaremos para cultivar las células (Qin and Cheng 2010, Tai et al.
2010). En los ensayos de migración, se siembran en torno a 1 x 105 de células
(generalmente se usan las líneas celulares de cáncer de mama MCF-7 o SKBR3)
resuspendidas en medio carente de suero (Fetal Bovine Serum (FBS)-free RPMI-1640
medium) en la cámara superior de cada pocillo de la placa, los cuales contienen una
membrana de policarbonato (6,5 mm de diámetro, 8,0 µm de tamaño de poro, Corning
Incorporated) no recubierta.
Para los ensayos de invasión, se siembran también en torno a 1 x 105 células
resuspendidas en medio de cultivo FBS-free RPMI-1640 en la cámara superior de cada
pocillo de la placa, los cuales contienen una membrana de policarbonato, pero esta vez
recubierta de matriz gelificada que retendrá las células (se mide la capacidad de las
células para penetrar en este matrigel). Posteriormente, para ambos ensayos se añade en
la cubeta inferior de cada pocillo medio RPMI-1640 que contendrá 10% de FBS, el cual
actuará como quimio-atrayente de las células tumorales sembradas en la cubeta superior,
y la concentración deseada del producto que estamos testando como antitumoral.
Tras un periodo de incubación variable (generalmente entre 24-48 horas para los
ensayos de migración y de unas 60 horas para los ensayos de invasión), se procede a la
fijación de las células que se encuentran en la cara inferior de la membrana con 10% de
formalina y a su posterior tinción con 0,2% de cristal violeta. Las células que no hayan
migrado a través de la membrana se eliminan con un bastoncillo de algodón y
posteriormente, se toman imágenes de las células que han migrado a través de la
membrana usando para ello un microscopio invertido equipado con un objetivo de 200
aumentos (200X). La cuantificación del número de células que han migrado o invadido se
puede realizar tomando entre cinco y seis campos seleccionados al azar. También se
puede completar la cuantificación tras la adquisición de las imágenes disolviendo la
membrana de cada pocillo con ácido acético al 10% durante 3 horas, para posteriormente
medir espectrofotométricamente a 595 nm.
Ensayos In vivo
Los ensayos in vivo se llevan a cabo empleando en primera instancia roedores.
Estos ensayos son unos de los más habitualmente practicados para evaluar y determinar la
toxicidad y el efecto de un potencial fármaco en un organismo completo, previo al
siguiente paso del desarrollo de un fármaco, esto es, los ensayos y estudio de las fases
clínicas. Al igual que ocurre con los ensayos in vitro, existen múltiples ensayos in vivo
realizados con animales de experimentación (ratones y ratas) para determinar la actividad
antitumoral de un determinado producto. A continuación citaremos dos de los más
comúnmente usados.
El primero de los ensayos que comentaremos es el modelo de xenoinjerto de
tumor. Este modelo se utiliza generalmente con el propósito de determinar si el
compuesto que estamos testando (p.ej., el que se haya mostrado más activo para inhibir la
proliferación y formación de colonias de células tumorales in vitro) afecta al crecimiento
del tumor in vivo. Básicamente, las células tumorales (p. ej., MCF/, LNCaP) se inoculan
subcutáneamente con matrigel (BD Biosciences, Bedford, MA, USA), sobre ambos flancos
de un pliegue de piel del lomo del animal (p. ej., 106 células/sitio), en “ratones desnudos”
(del inglés nude) hembras de 5 semanas. Con la inyección de las células tumorales
conseguiremos inducir un tumor en el ratón desnudo. Estos ratones (también llamados
ratones xenagrafos) poseen una mutación génica que impide el desarrollo del timo, por lo
que poseen un sistema inmunitario deficitario (están inmuno-deprimidos). Una vez
inducido el tumor en el ratón desnudo, el compuesto a ensayar se administra diariamente
por vía intraperitoneal o en el agua de bebida al animal para conocer su efecto sobre el
tumor inducido. El tamaño del tumor se mide semanalmente durante 6-7 semanas y su
volumen se calcula usando la fórmula: volumen = ( /6) A B2 (A=diámetro más largo
del tumor, B=diámetro más corto del tumor) (Bost et al. 1999).
Existen muchísimos trabajos donde se describe el uso de ratones desnudos para la
evaluación de compuestos con potencial actividad farmacológica. Un ejemplo claro es el
desarrollo de compuestos similares a la camptotecina, como inhibidores de la
Topoisomerasa I, realizado por Emerson y colaboradores. En este estudio, los autores
fueron capaces de desarrollar dos análogos de la camptotecina, que tras superar los
ensayos in vitro satisfactoriamente, fueron evaluados en ratones a los cuales se les había
inducido cáncer de colon. Las pruebas confirmaron la regresión del cáncer en un
porcentaje de éxito del 60% tras el tratamiento (Emerson et al. 1995).
Otro ensayo in vivo particularmente relevante es el de la prevención del desarrollo
de carcinomas mamarios en ratas inducidos por el compuesto 7,12-dimetilbenceno
antraceno (DMBA). La inducción de cáncer de mama en rata con DMBA es un modelo
de tumor hormono-dependiente ampliamente usado (Labrie et al. 2001). Brevemente, el
modelo consiste en la inducción de un adenocarcinoma mamario (Callejo et al. 2005) en
las ratas mediante una única administración intragástrica de DMBA a la edad de 50 días.
Transcurridos 45 días de la administración de DMBA, se determina periódicamente el
tamaño del tumor (midiendo el diámetro perpendicular de mayor longitud). Un subgrupo
de animales es tratado diariamente, empezando 3 días antes de la administración de
DMBA, y hasta el final del experimento, con vehículo (metilcelulosa) o con el
compuesto en estudio. Los animales se sacrifican 6 meses después de la administración
de DMBA. En cada grupo experimental, se analizarán los siguientes parámetros: 1)
número de animales fallecidos y 2) con los que sobrevivan y finalicen el experimento, se
registran el tamaño y número de tumores desarrollados. Esto nos permitirá conocer la
incidencia tumoral, la media del número de tumores y la media del tamaño tumoral por
animal con o sin tratamiento para conocer la capacidad antitumoral in vivo del compuesto
en estudio.
3.3.2. Estudio de Actividad Antibiótica.
La adaptación y resistencia de las bacterias a los antibióticos son fenómenos de
gran preocupación clínica. Estos están originados en gran parte debido al uso
indiscriminado de los antibióticos por parte de la población y también en muchas
ocasiones al uso innecesario, debido a falsas creencias. Esto ha generado durante muchos
años problemas realmente importantes en el ámbito médico ya que se han generado cepas
de Staphylococcus aureus metilresistentes (MRSA), cepas de Enterococci vancomicina
resistentes (VRE) o cepas de bacterias Gram-negativas, como son Escherichia coli,
Salmonella tiphy, Legionella pnuemophila o Pseudomonas aeruginosa multiresistente.
Esta última puede ser considerada el mayor patógeno en países desarrollados (Hancock
1998). Así la necesidad y urgencia para el descubrimiento de nuevos antibióticos para
continuar con la lucha contra las bacterias sobre todo de las que ofrecen mayor resistencia
(Rao 1998).
Existen varios mecanismos por los cuales las bacterias adquieren resistencia a los
antibióticos. Éstos pueden agruparse en 3 grupos:
1. resistencia intrínseca: mecanismos que existen en la población de una
especie con independencia de la exposición a antibióticos. Uno de los
mecanismos que participan en la adquisición de esta resistencia son las
conocidas bombas de flujo hacia el exteriro (efflux pumps). De hecho,
Poole y colaboradores (1993) demostraron en Pseudomonas aeruginiosa,
la participación de un sistema de flujo hacia el exterior, que involucraba a
las proteínas MexA, MexB o OprM, ya que bacterias donde se inducía una
mutación para cualquiera de estos genes sufrín un aumento de hasta 10
veces su susceptibilidad a antibióticos como la tetraciclina o cloranfenicol.
2. resistencia adquirida: mecanismos mediante los cuales se induce una
reistencia inestable sin ningún cambio observable en el genotipo debido a
la exposición a antibióticos. Este caso de resistencia es el más dificil de
estudiar. Aún así, se ha demostrado in vivo que las bacterias son capaces
de revertir completamente su susceptibilidad cuando se consiguen aislar
del hospedador en el cual fueron susceptibles (Bryan 1991).
3. resistencia genética: adquisición estable de cambios en el genotipo
mediante mutaciones mayoritariamente, o mediante la adquisición de
plásmidos que confieran reistencia. Un ejemplo lo tenemos en la
resistencia a los antibióticos aminoglicósidos observado en P. seruginosa,
la cual podría provenir del adquisición de ciertos plásmidos que confieren
la capacidad de modificar los aminoglucósidos mediante reacciones de
acetilación, adenilación o fosforilación. Además, se sabe que estas
bacterias poseen en su cromosoma un gen de resistencia a
aminoglucósidos, aphA, que se activa mediante algúna mutación (Okii et
al. 1983).
Ensayos In Vitro
Uno de los ensayos más sencillos que se realizan en un laboratorio para evaluar un
compuesto como posible antibacteriano, es el de difusión de disco en agar. Este método
consiste en impregnar en un disco de papel estéril, una cantidad precisa del compuesto a
ensayar, tras lo cual se deposita sobre la superficie de un cultivo de bacteria en placa de
Petri para su evaluación. Tras un tiempo de incubación, la difusión del compuesto desde
el disco hacía afuera del mismo y hacía el agar creará una zona o halo donde se pueda
observar la ausencia de crecimiento del microorganismo si fuera sensible a dicho
compuesto confirmándose así su capacidad antibiótica (National Committee for
Laboratory Standards. 2003) (Fig. 8).
Figura 8. Halo de inhibición del crecimiento bacteriano de Microcuccus luteus formado tras inoculación de
disco de papel con un extracto/compuesto.
Un posible protocolo resumido se describe a continuación:
6. 1. Se pueden evaluar todas las especies de bacterias que se desee,
como por ejemplo las Gram (+): Bacilus subtilis, Microccus luteus,
Rhodococcus opacus; o las Gram (-): Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas
syringae, E. coli DH5α, E. coli HS699 y alguna levadura como Hansenula
anomala y Sacaromyces cereviciae.
7. 2. Crecer las bacterias toda una noche a 30ºC en medio nutritivo
Muller-Hinton y las levaduras en medio GYP (Glucosa: 20g/L, Extracto de
levadura: 5g/L, Peptona: 10g/L).
8. 3. Al día siguiente mezclar 15 mL de medio Muller-Hinton con agar
solidificado blando (0.8% agar) con unos 200-400 µL del cultivo de
bacterias o levaduras de la noche anterior y verterlo en una placa de Petri.
Tras un tiempo de solidificación del medio, depositar sobre la superficie
del cultivo discos de papel de filtro estériles impregnados con un volumen
determinado del extracto a evaluar.
9. 4. Finalmente, dejar las placas crecer hasta el día siguiente a 30ºC.
Mediante este método, se pudieron detectar diferentes cepas de Staphylococcus
aureus metil-resistentes, bacteria cuya población resistente está emergiendo de manera
muy alarmante, y que causa los mayores problemas en los test rutinarios de detección de
resistencia, y se demostró que las bacterias reaccionaban mejor al antibiótico cefotaxima
que a la oxacilina (Cauwelier et al. 2004). Igualmente este sencillo test se practicó para
detectar fenotipos resistentes a Beta-lactamasas de la bacteria Pseudomonas aeruginosa,
bacteria oportunista responsable de las infecciones nosocomiales, aquellas que aparecen
en los hospitales y centros de atención clínica (Vedel 2005).
Una variable del método de difusión, es el conocido como E Test, el cual consiste
en disponer de una tira impermeable (5-50 mm de longitud) con una concentración de
antibiótico predefinida, la cual se coloca en la superficie del cultivo en placas de Petri con
agar y se deja para que ocurra el mismo proceso de difusión. Tras el tiempo de
crecimiento bacteriano adecuado, el punto donde el halo de inhibición intersecta con la
tira de antibiótico, nos indica la concentración mínima inhibitoria de dicho antibiótico
(Fig. 9).
Figura 9. E Test mostrando como la zona de inhibición intersecta con la tira de antibióticos.
Este método resulta tan fiable como otros métodos de susceptibilidad usados,
como por ejemplo el de difusión de disco, comentado anteriormente (Baker et al. 1991).
Ensayos In Vivo
El estudio in vivo de la actividad antibacteriana, se lleva a cabo también haciendo
uso de ratones. Ejemplo de esto lo tenemos en el trabajo realizado por Koga y
colaboradores (Koga et al. 2005), donde se evaluó in vivo, la capacidad antibiótica del
compuestos CS-023 (Figura xxxx). Este compuesto mostró in vitro ser un potente
antibiótico contra las bacterias Pseudomonas aeruginosa y la meticillin resistente
Staphilococcus aureus, ademas de contra cepas de Eschcerichia coli. Durante los ensayos
in vivo, ratones de 22 a 28 gramos de peso, usados en el experimento fueron infectados,
intraperitonealmente, con 0,2 mL de una suspensión de bacterias, usando en el
experimento hasta 13 cepas de bacterias tanto Gram + como Gram -. EL compuesto a
evaluar se comparó con otros antibióticos administrados, como el imiperem, ceftriaxona,
ampicillina o levofloxacina. Tras el periodo de evaluación, los resultados mostraron que
el CS-023 resultó ser un potente antibiótico contra bacterias Gram + y Gram – en la lucha
contra infecciones nosocomiales.
3.3.3. Estudio de Actividad anti-VIH
El sida (acrónimo de síndrome de inmunodeficiencia adquirida) es una
enfermedad que afecta a los humanos infectados por el Virus de Inmuno Deficiencia
(VIH). Se dice que una persona padece de sida cuando su organismo, debido a la
inmunodeficiencia provocada por el VIH, no es capaz de ofrecer una respuesta inmune
adecuada contra las infecciones. Cabe destacar la diferencia entre estar infectado por el
VIH y padecer de sida. Una persona infectada por el VIH es seropositiva y pasa a
desarrollar un cuadro de sida cuando su nivel de linfocitos T CD4 (Figura xxxx), células
que ataca el virus, desciende por debajo de 200 células por mililitro de sangre.
Figura xxx. Viriones de VIH-1 ensamblándose en la superficie de un linfocito (izquierda) y componentes
del VIH (derecha).
Las células que el VIH invade son esencialmente los linfocitos T CD4+, pero
también en menor medida los monocitos/macrófagos, las células dendríticas, las células
de Langerhans y las células de microglía del cerebro. La replicación viral tiene pues lugar
en tejidos diversos (de ganglios linfáticos, intestino, cerebro, timo,…). Los órganos
linfoides, sobre todo los ganglios linfáticos, constituyen la principal sede de su
replicación. El virus está presente en numerosos líquidos del organismo, en particular la
sangre y las secreciones genitales.
La replicación del virus se desarrolla en las siguientes etapas:
1. La fijación representa la primera etapa en la invasión de una célula. Se
basa en el reconocimiento mutuo y acoplamiento de proteínas de la
envoltura del virión, las gp120 y gp41, y los receptores de la célula blanca,
los CD4. Este reconocimiento no es posible sin ayuda de correceptores
propios de las células susceptibles de ser invadidas; en el caso de los
macrófagos son los CCR5 y en el caso de los LT4, los CXCR4, que
interactúan con la proteína superficial. Macrófagos y LT4 tienen en común
su principal receptor: el receptor CD4. Este reconocimiento es condición
obligada para que el virus llegue a penetrar en la célula y continuar con el
proceso de infección.
2. La entrada del virión en la célula es el segundo paso: una vez reconocido
el virión por los receptores de superficie, este entra dentro de la célula
fusionándose la envoltura lipídica del virión con la membrana plasmática
de la célula. Protegidos por la cápside y las nucleocápsides, los dos ARN
mensajeros que forman el genoma viral y sus proteínas asociadas se
encuentran ahora en el citoplasma. Tras esto se elimina la cubierta
proteica, cápside y nucleocápsides, quedando el ARN vírico libre en el
citoplasma y listo para ser procesado mediante la transcripción inversa del
ARN vírico para formar ADNc (ADN complementario, monocatenario)
manteniendo la misma información. Cada una de las dos moléculas de
ARN llega desde el virión asociada a una molécula de transcriptasa inversa
que se ocupa del proceso. Las dos moléculas de ADNc generadas se
asocian para formar una molécula de ADN, que es la forma química de
guardar la información que una célula eucariota es capaz de procesar.
3. El paso siguiente es la integración del genoma vírico en el genoma de la
célula huésped. Para ello penetra en el núcleo y se inserta en el ADN
celular con ayuda de una enzima denominada integrasa, que procede del
virión infectante. Una vez integrado en el ADN celular la transcripción del
ADN vírico se lleva a cabo conjuntamente con el ADN de la célula
mediante los mecanismos normales de replicación. El resultado de la
transcripción es un ARNm (ARN mensajero). Una vez procesado, el
ARNm puede salir del núcleo a través de los poros nucleares. Una vez en
el citoplasma el ARNm proporciona la información para la traducción, es
decir, la síntesis de proteínas, que es realizada a través del aparato
molecular correspondiente, del que forman la parte fundamental los
ribosomas. Por acción de proteasas específicas del VIH, las poliproteínas
producto de la traducción son procesadas, cortándolas, para formar las
proteínas constitutivas del virus. Las proteínas víricas fabricadas se
ensamblan, junto con ARN provirales, para formar los componentes
internos de la estructura del virión, los que constituyen la cápside y su
contenido.
4. El último paso es la gemación: cuando los nucleoides víricos se aproximan
a la membrana plasmática y se hacen envolver en una vacuola que termina
por desprenderse, formando un nuevo virión o partícula infectante. En
cada célula infectada se ensamblan varios miles de nuevos viriones,
aunque muchos son incompletos y no pueden infectar.
Ensayos In Vitro
La actividad antivírica centrada en la enfermedad del SIDA también es una
importante actividad biológica que se puede evaluar con extractos o compuestos aislados
y caracterizados. Existen muchos ejemplos de compuestos de origen natural con alguna
actividad anti-VIH. Uno de estos ejemplos es el compuesto 3-oxo-Calenduladiol,
obtenido mediante modificación química del calenduladiol, un triterpeno lupano aislado
de la especie Maytenus apurimacensis (El Jaber-Vazdekis et al. 2009), el cual fue
evaluado como posible antirretroviral. El 3-oxo-calenduladiol, impide la infección viral y
la fusión con las células al interaccionar específicamente con el co-receptor celular de la
proteína de la envuelta vírica R5. Los resultados de este estudio mostraron que el 3-oxo-
calendualdiol es un antagonista específico del co-receptor CCR5, ya que su unión ocurre
sin que se desencadenen la activación de la señalización celular o internalización de
receptor (Barroso-González et al. 2009). Este estudio permite tomar como punto de
partida este compuesto, para poder desarrollar nuevos anti virales eficaces. Los ensayos
biológicos realizados en este estudio se basaron fundamentalmente en ensayos de fusión
célula-célula, donde se usaron líneas celulares que en unos casos expresaban el co-
receptor CCR5 y en otros casos la proteína de la envuelta vírica R5. Dichas células se
crecían juntas para así mimetizar la fusión célula-virus, y poder en última instancia
evaluar la actividad anti-fusión del compuesto a ensayar (Valenzuela-Fernández et al.
2005, Valenzuela-Fernández et al. 2001). Otro ejemplo de compuesto que inhibe la
entrada del virus del SIDA en la célula mediante el bloqueo de la interacción de los co-
receptores celulares CXCR4 y CCR5 con las proteínas víricas X4 y R5, respectivamente,
es el del flavonoide baicalina, compuesto aislado y purificado de la planta medicinal
Scutellaria baicalensis (Li et al. 2000).
Ensayos In Vivo
La obtención de una vacuna contra el VIH/SIDA es la única esperanza para
controlar esta epidemia. Precisamente, una de las principales limitaciones para estos
proyectos es la ausencia de un modelo animal que reproduzca de forma satisfactoria la
infección por VIH y el desarrollo del SIDA. Un modelo de este tipo pudiera facilitar
enormemente la evaluación rápida y simultánea de un número elevado de conceptos
vacunales que, en la actualidad, a falta de un criterio mejor, se ven obligados a recorrer el
largo camino que va desde los estudios de laboratorio hasta los ensayos clínicos de
eficacia en humanos.
Los experimentos realizados en ratones han mostrado que en esta especie existen
limitaciones que impiden el desarrollo del ciclo replicativo normal del VIH-1. Desde
1986 se descubrió que el principal receptor del VIH en las células humanas era CD4
(Maddon et al. 1986). La molécula CD4 murina presenta baja afinidad por la proteína de
la envoltura gp120 y, por consiguiente, el primer paso necesario para la infección ocurre
muy ineficientemente (Landau et al. 1988). Sin embargo, la expresión del CD4 humano
en células murinas tampoco las vuelve susceptibles a la infección por VIH-1, ya que
aunque el virus se une a las células no puede ser internalizado eficientemente (Maddon et
al. 1986, Landau et al. 1988). Estos resultados han sido corroborados en ratones
transgénicos para CD4 humano (Lores et al. 1992), en los cuales no se detectó
integración del provirus ni producción de partículas virales después de la inoculación de
VIH-1 en estos animales.
El descubrimiento de que los receptores celulares de quimiocinas (CXCR4, CCR5
y otros) son co-factores medulares para la entrada del VIH en las células, podría explicar
el bloqueo de la entrada viral a las células de ratones. Sin embargo, algunos hallazgos
indican que la presencia de la proteína CXCR-4 murina no constituye una barrera para la
entrada viral (Tachiba et al. 1997). A pesar de que ratones transgénicos para CCR5 y CD4
humano son susceptibles a la infección por VIH-1, no se producen nuevas partículas
virales en ellos (Browning et al. 1997).
Estas observaciones permiten concluir que la replicación del VIH en células
murinas no sólo es bloqueada en el paso inicial de unión al receptor CD4, sino que
existen, además, interferencias en pasos posteriores a la entrada del genoma viral y su
inserción en la célula hospedante. Estas características hacen que no sea factible el uso
del modelo murino para la infección por VIH.
Otro modelo murino usado para el estudio de fármacos antiVIH son los
denominados ratones SCID. La introducción de células hematopoyéticas humanas
totipotentes a la línea murina CB-17 scid/scid, mediante el injerto de tejido fetal humano
(timo, nódulos linfáticos mesentéricos, hígado) y/o linfocitos de sangre periférica,
permiten el crecimiento y/o desarrollo de una serie de células humanas que constituyen
blanco para el VIH (Mosier et al. 1988, McCune et al. 1988).
Aunque los ratones SCID trasplantados con tejido humano ofrecen un medio para
estudiar la enfermedad inducida por el VIH in vivo, no reproduce ni remotamente la
compleja inmunopatogénesis de la condición, que involucra diferentes tejidos y ocurre
durante un período prolongado. El modelo de ratón SCID es el único que existe para
evaluar in vivo la actividad antiviral de diferentes compuestos después de la infección por
VIH (zidovudina, didesoxiinosina, neviparina, etc.) (Rabin et al. 1996). También se ha
empleado en estudios de vacunas para demostrar la efectividad de la transferencia pasiva
de anticuerpos monoclonales neutralizantes (Safrit et al. 1993, Gauduin et al. 1997) y
células humanas de sangre periférica (Mosier et al. 1992, van Kuyk et al. 1994, Zhang et
al. 1996, Sarin et al. 1999) para proteger contra la infección. No obstante, las
conclusiones que puede proporcionar este modelo sobre la eficacia de las vacunas son
muy limitadas y existen muchas dudas sobre si este modelo aporta un conocimiento
diferente al que se obtiene en los experimentos in vitro.
Existen otros modelos animales para el estudio de la actividad anti vírica de
diferentes compuestos. Uno de ellos son los conejos. La infección de conejos por VIH
está bien documentada.
El VIH es capaz de replicarse in vitro en células normales de conejo, pero nunca a
los niveles que se alcanzan en las células humanas (Kulaga et al. 1988, Hague et al.
1992). Las células de conejo transfectadas con el gen que codifica la molécula CD4
humana, son más susceptibles a infectarse con VIH-1 (Yamamura et al.1991, Snyder et al.
1995) y la infección de ambos tipos de células (transfectadas y no transfectadas) puede
ser bloqueada por la presencia de CD4 humano soluble (Hague et al. 1992). Además, la
molécula CD4 de conejo difiere de la humana en 6 de los 18 aminoácidos identificados
como principales en la unión del receptor humano a la gp120 (Hague et al. 1992). La
introducción de ADN proviral a células SIRC (línea celular fibroblástica derivada de la
córnea de los conejos) y células mononucleares de sangre periférica (CMSP) de conejos,
permitió la producción de partículas virales infectivas, lo que demostró que la entrada
viral es el paso limitante para la replicación del VIH en esta especie (Kulaga et al. 1988).
Estos estudios llevaron a desarrollar conejos transgénicos para la molécula CD4 humana
(Snyder et al. 1995).
El descubrimiento del papel de los receptores de quimiocinas como correceptores
para el VIH, podría explicar los bajos niveles de infección que se obtienen en los conejos
transgénicos. Speck y colaboradores (1998) demostraron que la presencia de CD4 y
CCR5 humanos en células de conejo elimina el bloqueo de la entrada viral y permite la
replicación a niveles similares a los que se alcanzan en células humanas. Además, se
pudo detectar la formación de sincitios y la producción de partículas virales infectivas
después de la exposición a diferentes cepas de VIH que usan CCR5. Estos
descubrimientos sugieren que es factible el desarrollo de un modelo de conejo
transgénico para CD4 y los correceptores, aunque es imposible predecir los niveles de
replicación viral que se podrían alcanzar in vivo y la posible enfermedad que estaría
asociada a dicha infección.
Las principales ventajas de los modelos de animales pequeños son su
disponibilidad, bajo costo y fácil manutención. Sin embargo, hay reservas con respecto a
la utilidad de estos animales para estudiar las interacciones virus-hospedante. Los
procedimientos usados para lograr la infección son incompatibles con las rutas naturales
de infección del VIH. Además, como los ratones y conejos están distantes de los primates
evolutivamente, es necesario analizar con cautela su relevancia como modelo animal para
estudiar un agente etiológico altamente específico de especie.
La alternativa actual a los posibles ensayos in vivo con animales, y que han sido
amplíamente usados y aceptados es el estudio de un posible fármaco directamente en
humanos infectados con el VIH, a los cuales se les suministran diferentes dosis del
fármaco en estudio y de un placebo, durante un periodo determinado de tiempo, tras el
cual, y como criterio que refleja la eficacia del fármaco, se analiza el ARN mensajero del
VIH presente en el plasma sanguíneo. Este tipo de estudios permitará caracterizar la
curva dosis-respuesta del fármaco con una razonable precisión. Este tipo de estudios fue
el aplicado durante el estudio en fase clínica del compuesto denominado Maravirovic,
desarrollado por la empresa Pfizer, el cual es un inhibidor de entrada, ya que
concretamente bloquea la proteína gp120 vírica, la cual se une al co-receptor CCR5. El
VIH es entonces incapaz de unirse a los macrófagos humanos (Rosario et al. 2006,
Rosario et al. 2005).
3.3.4. Estudio de Actividad Antifúngica
Si bien muchos hongos son útiles para el hombre, otros pueden infectarnos,
además de afectar a plantas o animales, perturbando su equilibrio interno y
enfermándolos. Los hongos parásitos causan graves enfermedades al ser humano, por lo
que la lucha contra éstos es un frente a tener en cuenta en la búsqueda de fármacos
bioactivos.
• Enfermedades vegetales: Los hongos causan enfermedades como el tizón del
maíz, que destruye granos y los mildiús que infectan una gran variedad de frutas
también son hongos. Las enfermedades micóticas causan la pérdida del 15 por
ciento de las cosechas en las regiones templadas del mundo. En las regiones
tropicales, donde la alta humedad favorece el crecimiento de los hongos, la
perdida puede llegar al 50 por ciento. Los hongos compiten directamente con el
ser humano por la comida. Lamentablemente para nosotros, a veces son ellos lo
que ganan. Un claro ejemplo una enfermedad micótica conocida como la roya del
trigo, afecta a uno de los cultivos más importantes en América del Norte. Las
royas se deben a un tipo de basidiomicete que necesita dos plantas distintas para
completar su ciclo de vida. El viento lleva a los trigales las esporas que la roya
reproduce en el agracejo. Las esporas germinan en los trigales, infectan las plantas
de trigo y reproducen otro tipo de espora que infecta al trigo, con lo que la
enfermedad se propaga rápidamente. Ya avanzada la temporada de cosecha, la
roya produce un nuevo tipo de espora negra y resistente, la cual sobrevive
fácilmente al invierno. En la primavera, esta espora pasa por una fase sexual y
reproduce esporas que infecta al agracejo, en cuyas hojas la roya produce las
esporas que infectan al trigo, y así sucesivamente. Por fortuna, una vez que los
agrónomos entendieron el ciclo de vida de la roya, pudieron frenarla destruyendo
los agracejos.
• Enfermedades humanas: Los hongos parásitos también infectan al ser humano.
Un deuteromicete puede infectar el área de entre los dedos de los pies y causar la
infección conocida como pie de atleta. Los hongos forman un micelio
directamente en las capas exteriores de la piel. Esto produce una llaga inflamada
desde la que las esporas pasan fácilmente a otras personas. Cuando los hongos
infectan otras áreas, como el cuero cabelludo, producen una llaga escamosa roja
llamada tiña. El microorganismo Candida albicans, una levadura puede trastornar
el equilibrio interno del cuerpo humano y producir enfermedad micótica. Crece en
regiones húmedas del cuerpo, sin embargo, el sistema inmunológico y otras
bacterias competidoras normalmente la controlan.
• Enfermedades animales: Si bien las enfermedades micóticas humanas son
problemáticas, pocas son tan mortales como la infección de un hongo del genero
cordyceps. Este hongo infecta a los saltamontes de las selvas de Costa Rica. Las
esporas microscópicas germinan en el saltamontes y producen enzimas que poco a
poco penetran el fuerte exoesqueleto del insecto. Las esporas se multiplican y
siguieren las celular y tejidos del insecto, hasta matarlo. Al final del proceso de
digestión, nacen hifas que cubren el exoesqueleto en descomposición con una red
de material micótica. Entonces salen estructuras reproductoras de los restos del
saltamontes, que producirán esporas y propagaran la infección.
Ensayos In Vitro
Para evaluar algún extracto o compuesto como potencial antifúngico existen
muchos ensayos que pueden aplicarse en un laboratorio para dicho fin. Veremos algunos
de ellos aplicados a ejemplos ya publicados de compuestos que presentaron actividad
antifúngica.
Existe el llamado micro-método simple, que consiste en obtener de cultivos del
hongo las esporas y micelios y preparar una solución de los mismos mezclados
posteriormente con una solución al 2% de agar del medio nutritivo utilizado para cada
caso, esta mezcla se depositará sobre una superficie de vidrio, pudiendo ser ésta un
portaobjetos de microscopia, creando una capa de unos 2 mm de espesor. Por otro lado,
usando el extracto o solución del compuesto a ensayar, depositaran gotas del mismo sobre
otra superficie de vidrio nuevamente, dejando secar las gotas. Una vez obtenido todo
esto, se cortarán discos de 1 cm de diámetro de la capa de agar conteniendo la solución de
esporas y micelios, y dichos discos se depositaran cubriendo la gota de extracto
previamente seca. Tras esto se incubará el sistema a la temperatura necesaria y durante el
tiempo oportuno para cada especie de hongo, hasta poder hacer el conteo de esporas
germinadas y las no germinadas (Ronald et al. 1971).
El protocolo aplicado detallado más específicamente, en este caso sería el
siguiente:
1. Crecer un cultivo de nuestro hongo en placa de Petri bajo condiciones
adecuadas.
2. Tras el tiempo de crecimiento añadir unos 5 ml de de medio nutritivo
fresco como PD (Potato-dextrose) sobre la superficie de la placa.
3. Recoger las esporas y micelio raspando la superficie con una varilla de
vidrio.
4. Decantar esta suspensión obtenida y añadir un volumen igual de una
solución de agar al 2% a 50ºC.
5. Depositar inmediatamente esta mezcla (50-75 esporas bajo el objetivo de
100x del microscopio) sobre una superficie de vidrio, como por ejemplo un
porta de microscopia óptica para así obtener una capa de unos 2 mm de
espesor solidificada.
6. La solución del compuesto a evaluar, se deposita como gotas sobre una
superficie de vidrio (porta) y se deja secar la gota que tendrá entre 5-8 mm
de diámetro.
7. Cortar discos de 1 cm de diámetro de la capa de agar con las esporas y
micelio y depositar el disco sobre la gota previamente seca.
8. Incubar el sistema a la temperatura de crecimiento del hongo en
condiciones adecuadas para el mismo.
9. Tras este tiempo, llevar a cabo el conteo de esporas germinadas y no
germinadas.
Otro método sencillo que permite evaluar el potencial antifúngico de un
compuesto determinado, es una variación del método MTT descrito anteriormente. En
este método se usa otra sal de tetrazolio, la 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-
[(sulphenylamino) carbonyl]-2H-tetrazolium-hydroxide, la XTT, conjuntamente con la
menadiona como agente acoplante de electrones. Tras el periodo de incubación de las
células junto al metabolito a ensayar y el XTT y menadiona, se mide a 450 nm de
longitud de onda la formación de formazan. Igual que el ensayo MTT, la lectura reflejará
la cantidad de células o tejido que se mantienen viables, y que forman el formazan, frente
a aquellas células o tejido muerto tras el tratamiento con el compuesto antifúngico
(Meletiadis et al. 2001).
Ensayos In Vivo
Existen muchos ejemplos de ensayos in vitro para la evaluación de la acividad
antifúngica utilizando modelos murinos (Hood et al. 2010). Así por ejemplo, Ben-Ami y
colaboradores estudiaron la actividad in vitro del compuesto colistin (polymyxin E)
contra varias especies de hongos Mucorales. Para los ensayos in vivo en modelos murinos
se utilizó el Colistematato, un fármaco proactivo de la colistina, fármaco menos tóxico y
usado para tratamientos parenterales, para la evaluación de dicha droga contra Rhizopus
oryzae, hongo oportunistico que infecta a humanos y agente etiológico de la zigomitosis
(más popularmente conocida como mucormicosis).
Hembras de ratón BALB/c con peso entre 18 y 22 gr fueron tratadas para ser
immunosuprimidas con 75 mg/kg de ciclofosfamida intraperitonealmente inyectada 4 y 1
días antes de la inoculación y 300 mg/kg de cortisona acetato subcutaneamente 1 día
antes de la inoculación. Los ratones se anestesiaron con 2% de isoflurano mediante
inhalación y se inocularon intranasalmente con 35 microlitros de una solución que
contenía 3.500 esporas de R. oryzae. Adicionalmente la ciclofosfamida (75 mg/kg) se
administró 2 y 5 días tras la inoculación. Los ratones control se trataron con inyecciones
de suero salino estéril en los mismos tiempos usados para las muestras tratadas.
El tratamiento con colistimetato no afectó significativamente a la mortalidad de
los ratones BALB/c que fueron infectados intranasalmente con esporas de R. oryzae. Por
el contrario la administración intranasal de dicho fármaco incrementó la supervivencia a
los 10 días en un 33 a 61% de la población tratada. Además, la cantidad pulmonar de
hongos en los ratones tratados fue significativamente menor que en aquellos no tratados
(Ben-Ami et al. 2010).
Este tipo de ensayos con ratones immunodeprimidos, en los cuales se le provoca
una enfermedad fúngica, es un buen modelo para el estudio in vitro de compuestos con
potencial actividad antifúngica.
3.3.5. Estudio de Actividad Antiparasitaria
En la actualidad existen muchas enfermedades originadas por diferentes parásitos
para las cuales se investiga duramente con el objetivo de conseguir fármacos potentes que
sean eficaces en la lucha contra dichos agentes etiológicos. Así tenemos por ejemplo, la
leishmaniasis que es una enfermedad causada por diferentes especies de protozoos del
genero Leishmania. Las manifestaciones clínicas de la enfermedad, van desde úlceras
cutáneas que cicatrizan espontáneamente, hasta formas fatales en las cuales se presenta
inflamación severa del hígadon y del bazo (Figura xxx).
Figura xxx. Úlcera en un individuo afectado por Leishmaniasis.
Otra de las enfermedades más comunes en el mundo es la malaria, enfermedad
producida por parásitos del género Plasmodium. Es la primera en importancia de entre las
enfermedades debilitantes, con más de 210 millones de casos cada año en todo el mundo.
La enfermedad puede ser causada por una o varias de las diferentes especies de
Plasmodium: P. falciparum, P. vivax, P. malariae, P. ovale o P. knowlesi. Los vectores de
esta enfermedad son mosquitos pertenecientes al género Anopheles. Los síntomas son
muy variados, empezando con fiebre, escalofríos, sudoración y dolor de cabeza. Además
se puede presentar náuseas, vómitos, tos, heces con sangre, dolores musculares, ictericia,
defectos de la coagulación sanguínea, shock, insuficiencia renal o hepática, trastornos del
sistema nervioso central y coma.
Ensayos In Vitro
Los ensayos a realizar en un laboratorio de manera eficaz, y que permite ampliar
la búsqueda de compuestos bioactivos, son los ensayos antiparasitarios. Un ejemplo de
esto es el llevado a cabo por Saadeh y colaboradores (Saadeh et al. 2009), los cuales
evaluaron una batería de compuestos derivados nitroimidazoles como posibles
antiparasitarios contra las especies Entamoeba histolytica y Giardia intestinalis,
responsables de la amebiais y la giardasis, respectivamente. El ensayo consistió en
mezclar una cantidades conocidas de una disolución en DMSO de los compuestos a
evaluar, con un volumen conteniendo 20.000 células de los parásitos, en un volumen final
de 15 ml. De manera paralela se realizaron controles negativos, sin compuestos a evaluar,
y un control positivo con el compuesto antiparasitario conocido metronidazol. Tras el
tiempo de incubación se realizó el conteo de las células de parásito haciendo uso del
compuesto azul de tripan (Aley et al. 1994), el cual de manera diferencial penetra en las
células muertas pero no es capaz de ser incoporado en células vivas, debido a la
integridad de la membrana celular, lo que permite la visualización de las células
inviables, de color azul, haciendo uso de un hemocitómetro.
Ensayos In Vivo
Para el estudio de la actividad antiparasitaria in vivo se pueden utilizar igualmente,
los modelos experimentales basados en ratones. Así Rodríguez-Pérez y colaboradores,
ealuaron los extractos de seis plantas (Bambusa vulgaris, Parthenium hysterophorus,
Melaleuca leucadendron, Indigofera suffruticosa, Artemisia absinthium, Simarouba
glauca), como posibles extractos con actividad antimalárica frente a Plasmodium
falciparum o Plasmodium berghei. Los ensayos in vivo se llevaron a cabo usando ratones
de la línea OF1 (albinos suizos) hembras, con un peso aproximado de 20 gramos,
infectados con parásitos. Para el ensayo con drogas se siguió el esquema descrito por Lin
y colaboradores como se describe (Lin et al. 1994). Los ratones fueron inoculados en el
día cero (d0) por vía intraperitoneal con 0,2 mL de la suspensión de parásitos (106 formas
eritrocíticas) extraídos de un donante infectado. El día tres (d3) se realizaron frotis finos
de sangre venosa de cada uno de los ratones, para confirmar por conteo microscópico que
los niveles de parasitemia fueron semejantes en todos los animales. Los ratones fueron
separados en grupos de cinco y colocados en cajas plásticas, garantizando los
requerimientos nutricionales y la temperatura adecuada. Los extractos fueron utilizados a
dosis de 500, 250 y 100 mg/kg de peso y se administraron por vía intraperitoneal (Deharo
et al., 2001). Se mantuvo la administración de una dosis diaria de los extractos desde el
d0 hasta el día seis (d6). Se determinó el nivel de parasitemia desde el día tres (d3) hasta
el día siete (d7) mediante el conteo microscópico de 6000 glóbulos rojos. Se siguió
diariamente la mortalidad de los animales. Como controles se utilizaron dos grupos que
fueron administrados por la misma vía, uno con el solvente de los extractos (etanol al
20%) y el otro con fosfato de cloroquina (Sigma Co, EU) a una dosis de 10 mg/kg de
peso (Deharo et al., 2000, Deharo et al. 2001). Además se utilizó un grupo control con
ratones no tratados. Los experimentos con cada extracto se realizaron dos veces. Al
evaluar estas especies in vivo frente a Plasmodium berghei NK65, mostraron mayor
actividad inhibidora A. absinthium con un 65,9% de reducción de la parasitemia a la dosis
de 500 mg/kg, M. leucadendron con un 50% de reducción a la dosis de 250 mg/kg y S.
glauca con una reducción del 43,2% a la dosis de 100 mg/kg.
Otra aproximación in vivo para evaluar la capacidad antiparasitaria de los
compuestos a evaluar, podría ser similar a la realizada por Danilo y colaboradores
(Danilo et al. 2009, Miguel et al. 2008). En estos ensayos los autores evaluaron el
compuesto tamixifeno como potencial agente antiparasítico contra protozoos causantes de
algunas variedades de la Leishmaniasis (Leishmania braziliensis y Leishmania chagasi).
Ratones hembras BALB/c (n =6–8) se infectaron en la oreja izquierda con un número
aproximado de 1105 promastigotes (nombre que recibe una de las fases del ciclo vital del
parásito) de L. braziliensis. 3 semanas después de la infección, se organizaron los grupos
aleatoriamente en función del tamaño de las lesiones observadas. Se administraron
intraperitonealmente durante 15 días 20 mg/kg/día de tamoxifeno (6 mg/mL tamoxifeno
citrato 150 mM NaCl), 20 mg/kg/day meglumina antimoniata o esuero salino esteril. Se
evaluaron y midieron el tamaño de las lesiones como diferencia a tener en cuenta entre
individuos infectados y no-infectados. La carga del parasito se determino 6 semanas tras
la infección. Igualmente el peso corporal se evaluó antes y después de la evaluación. De
manera paralela los autores infectaron a los denominados Golden hamsters (machos y
hembras, n=6–12) con unos 1108 células de amastigotes (nombre que recibe una de las
fases del ciclo vital del parásito) de la especie L. chagasi. 4 semanas despues de la
infección, se trataron los animales de la misma manera que se indicó para los ratones. Al
final del tratamiento la carga de parásitos se determinó y en el hígado. La supervivencia
de los animales fue seguida durante 3 meses despues de la interrupción del tratamiento.
El resultado global de estos ensayos fue que el tamoxifeno mató a los amastigotes
intracelulares de L. braziliensis y L. chagasi a una concentración inhibitoria del 50%
(IC50) de 1.9+0.2 y 2.4+0.3 mM, respectivamente. El tratamiento con tamoxifeno de
ratones infectados con L. braziliensis resultó en una reducción significativa en el tamaño
de las lesiones y además en una reducción del 99% de la carga de parásitos comparado
con los controles. Por otro lado los hamsters infectados con L. chagasi tratados con
tamoxifeno mostraropn una significativa reducción de la carga de parásitos en el hígado y
hasta un 95%-98% de reducción de la carga de parásitos en el bazo. Además todos los
animales tratados sobrevivieron, mientras el 100% de los animales a los cuiales se les
interrumpio el tratamiento murieron 11 semanas después de dicha interrupción.
3.4. LABORATORIO DE APOYO COMPUTACIONAL (estudio in silico)
Los innumerables experimentos biológicos y químicos han proporcionado mucha
y valiosa información, que durante décadas ha estado dispersa en la literatura científica,
técnicas de laboratorio o patentes. Toda esta información ha hecho que en las últimos
años, unido al avance informático, se hayan desarrollado bases de datos para almacenar
dicha información y así disponer de ella de una manera más organizada, rápioda y eficaz.
Esto ha hecho también que se conozca mejor el estado de la investigación, y ha facilitado
el desarrollo de lo que se conoce como estudios in-silico, contrariamente a los ya
conocidos estudios in-vivo e in-vitro (Malik et al. 2006). Existen muchas bases de datos
(bioinformática), relacionadas con muchos campos de la ciencia, creadas a partir de la
información recopilada. Ejemplo de estas son: GenBank http://www.ncbi.nlm.nih.gov/;
Histone Database http://research.nhgri.nih.gov/histones/; Peptaibol
http://www.cryst.bbk.ac.uk/peptaibol/ home.shtml; Gene3D
http://cathwww.biochem.ucl.ac.uk:8080/ Gene3D/; SCOP http://scop.mrc-
lmb.cam.ac.uk/scop; Cancer Chromosomes
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db =cancerchromosomes; Tumor Gene
Family Databases. Toda esta información puede ser usada en investigación química,
bioquímica, investigación del cáncer, búsqueda y desarrollo de fármacos, recibiendo el
nombre de Herramientas Bioinformáticas. En el laboratorio de Apoyo Computacional se
realizarán estudios donde el uso de herramientas bioinformáticas complemente o generé
nuevas vías en la investigación en productos naturales y fármacos.
Con respecto a la química los estudios In silico ayudan entre otras ventajas a
ahorrar mucho tiempo y dinero en las investigaciones destinadas al diseño de fármacos.
Unos buenos modelos de estudio marcan muchas veces la diferencia entre el diseño
exitoso de un fármaco o el de aquel que ha fallado.
En el diseño racional de fármacos existen muchas aproximaciones. Una de ellas es
lo que se conoce como QSAR y 3D-QSAR, método informático que permite predecir los
requerimientos estructurales, espaciales y químicos de una hipotética molécula ideal. Este
método indirecto parte de un desconocimiento total de la diana molecular, pero por el
contrario requiere que se disponga de una batería de moléculas con una actividad
biológica determinada ya conocida, que serán introducidas en el modelo informático. A
partir de éstas el programa revela los datos de esa molécula ideal y qué propiedades debe
tener para poseer una actividad biológica óptima.
Otra aproximación son los conocidos Molecular Docking. Esta herramienta
requiere que se conozca la diana molecular, previamente cristalizada y publicada su
estructura tridimensional en alguna de las bases de datos como las antes citadas.
Alternativamente, se puede disponer de la secuencia de aminoácidos y predecir
bioinformáticamente la estructura tridimensional de la proteína (enzima). A partir de este
punto y disponiendo de una batería de compuestos activos frente a esa diana, se estudia el
modelo de unión diana-receptor y se verifica la fiabilidad del estudio QSAR si se diera el
caso. Un ejemplo claro de estas dos aproximaciones lo tenemos en el estudio de
modelización molecular de derivados de 4,5-dihidro-1H-pirazol (4,3-h) quinazolinas
como potentes inhibidores de la CDK2/ciclina A. En este estudio se evaluaron 38
compuestos como posibles inhibidores de la CDK2/ciclina A, ya que en muchos cánceres
existe una disminución de la expresión de los reguladores naturales de dicha ciclina
(Ficher et al. 2003). El estudio QSAR, mostró que un grupo atractor de electrones más
potente y un grupo menos volumino como sustituto en el anillo pirazolo, mejoraría la
capacidad inhibidora del compuesto (Fig. xxxxx). Igualmente, el Molecular Docking
mostró que grupos aceptores de enlaces de hidrógeno en el anillo de benceno (meta, para-
R3) y grupos dadores de enlaces de hidrógeno en el anillo de benceno (orto-) pueden
potenciar el efecto inhibidor de estos derivados. Estos resultados obtenidos en el estudio
3D-QSAR y docking proporcionan pistas muy útiles para la síntesis de nuevos inhibidores
más potentes y que posean los requerimientos farmacocinéticos para futuros estudios clínicos
(Ai et al. 2010).
A B C
Figura xxxxxx. (A) Campos estéricos: contorno verde (80% contribución) indica las regiones donde un
grupo voluminoso incrementa la actividad; contorno amarillo (20% contribución) indica las regiones donde
grupos voluminosos disminuyen la actividad; (B) Campos electrostáticos: contorno azul (80%
contribución) representa las regiones donde grupos dadores de electrones incrementa la actividad; contorno
rojo (20% contribución) representa las regiones donde grupos que retiran electrones incrementa la
actividad; (C) mapa de contorno de aceptores de enlaces de hidrógeno.
Otro uso de las herramientas bioinformáticas es el que se practica en biología
molecular para la comparación de secuencias de genes o proteínas. En el estudio de la
especie Atropa baetica, y más concretamente la secuenciación del gen h6h, gen que
participa en la ruta de los alcaloides tropánicos, atropina y escopolamina, se utilizaron
diferentes herramientas bioinformáticas, para comparar el gen secuenciado con el mismo
gen pertenecientes a otras especies vegetales relacionadas. Empleando estas herramientas
se pudo determinar la relación filogenética de las especies analizadas, además de
comparar la secuencia de aminoácidos correspondiente, entre dos especies muy cercanas,
A. baetica y A. belladonna. Igualmente, mediante programas como el SOPMA, se
pueden predecir las estructuras tridimensionales de la proteían resultante (Geourjon and
Deléage 2005). El resultado fue que los dos genes de h6h de ambas especies de Atropa
sólo difieren en 4 aminoácidos, los que ayuda a afianzar la idea de que ambas especies
podrían derivar de un ancestro común, tal y como mostró también el análisis filogenético
(Fig. xxxx) (El Jaber-Vazdekis et al. 2009).
Figura xxxxx. Árbol Filogenético de diferentes H6H pertenecientes a A. baetica, A. belladonna
(BAA78340), H. niger (ABG89397), A. acutangulus (ABM74185), A. tanguticus (AAQ75700), S.
parviflora (AAY53932), D. metel (AAQ04302), y otras dioxigenasas de S. medusa (AAM48133), S.
tuberosum (BAC23050), S. lycopersicum (AAA80501), A. thaliana (NP_196481).
4. INFRAESTRUCTURA
En el siguiente apartado se describe detalladamente todos los componentes, ya
sean grandes equipos, aparatos y materiales, que se hacen necesarios para equipar nuestro
laboratorio, basándonos en la metodología científica desarrollada, para poder llevar a
cabo todos los pasos del proceso de búsqueda y comercialización de nuevos fármacos.
Igualmente se describirá brevemente el papel que desempeñará cada área de nuestro
laboratorio, y así tener un concepto global de todo el proceso. Por último se hará
mención especial a los grande equipos necesarios y el uso y control de los mismos, ya
que estos aspectos son imprescindible dentro del buen funcionamiento de un laboratorio.
4.1. ÁREAS DEL LABORATORIO
4.1.1 Laboratorio de Química
La área de química de nuestro laboratorio, está diseñada para llevar a cabo todo el
trabajo científico relacionado con el tratamiento de material de partida, normalmente
vegetal, a partir de el cual se conseguirá el aislamiento, purificación y elucidación
estructural de nuevas moléculas o moléculas ya conocidas para su uso en los posteriores
experimentos de ensayos de actividades biológicas. No hay que olvidar que dicha sección
deberá estar perfectamente acondicionada para llevar a cabo experimentos de
modificación química, semisíntesis o síntesis, necesarios para la mejora de las
características biológicas de aquellas moléculas objeto de estudio o la obtención de
estructuras que, por su escasez en la naturaleza, hacen inviable su extracción de la fuente
natural correspondiente.
Para una mejor comprensión de las necesidades a cubrir, en el diseño del
laboratorio dividiremos la sección de química en varias actividades, clasificadas en
función a la etapa del proceso de investigación realizada en cada momento, incluyendo
todo tipo de aparatos científicos que se prevean usar. Así, tendremos las siguientes
actividades:
4. Tratamiento y procesado de muestras.
5. Separación, aislamiento y purificación de moléculas.
6. Elucidación estructural.
7. Modificaciones químicas, semisíntesis y síntesis.
10. Tratamiento y procesado de muestras.
El objetivo de esta actividad es la extracción del conjunto de metabolitos
secundarios de la muestra biológica objeto de estudio. Para ello se tendrá que disponer
del material de partida secado o bien secarlo, triturarlo, someterlo a extracción con
disolvente orgánicos, eliminación del disolvente y obtención del extracto crudo inicial,
listo para ser usado en la separación y purificación de moléculas de interés biológico.
11. Separación, aislamiento y purificación de moléculas.
En esta etapa de la investigación se pretende purificar las moléculas de interés ya
conocidas, o nuevas entidades moleculares que puedan llegar a presentar actividad
biológica, a partir de los extractos obtenidos con anterioridad. Para ello se usaran
diferentes técnicas cromatográficas, como la cromatografía de exclusión molecular,
cromatografía de afinidad o el uso de grandes aparatos como bien pudieran ser UPLC,
HPLC, cromatografos de gases-masa o un auto-purificador. Igualmente durante este
proceso se puede aplicar las técnicas de fraccionamiento bio-guiado, que permite hacer
un seguimiento de las fracciones bioactivas y descartar las no activas, con el consecuente
ahorro de tiempo.
12. Elucidación estructural.
El objetivo de la elucidación estructural es la caracterización de las moléculas
aisladas, facilitando las características físico-químicas. Para ello se hace necesario el uso
de técnicas como son la Resonancia Magnética Nuclear, Espectrometría de Masas,
Dicroísmo Circular o Difracción de Rayos X.
13. Modificaciones químicas, semisíntesis y síntesis.
Durante el desarrollo de este tipo de experimentos, lo que se pretende es o bien
modificar químicamente una molécula, que se conoce posee actividad biológica y se
busca la mejora de dicha actividad, o bien llevar a cabo una semisíntesis o síntesis total,
ya que las escasas cantidades obtenidas de dicha molécula directamente de la fuente
natural, hace al proceso de extracción inviable y económicamente poco rentable.
4.1.2. Laboratorio de Biotecnología y Biología Molecular.
En este laboratorio se realizaran muchos experimentos de diferente índole. Las
necesidades de este laboratorio son varias. Se llevará a cabo la manipulación de ácidos
nucléicos mediante PCR, hibridaciones, secuenciación de ADN, retro-PCR, Real Time-
PCR, genotipado, uso de chips de ADN para estudios de perfil génico, etc. También se
necesitará infraestructura para la manipulación y modificación genética de
microorganismos o tejidos vegetales para la producción de proteínas o de compuestos
bioactivos. Igualmente se hará necesario una infraestructura idónea para el cultivo de
diferentes organismos desde bacterias, hongos y tejidos vegetales o plantas, así como
equipos para realizar cultivos a gran escala y/o fermentadores.
4.1.3. Laboratorio de Bio-Ensayos.
El laboratorio de bio-ensayos requerirá de una infraestructura más específica, ya
que se manipularan en muchos casos ratones de laboratorio, líneas tumorales humanas,
bacterias patógenas, virus o parásitos. Esto hace que esta zona deba poseer un alto grado
de esterilización y aparatos apropiados, que evite la presencia de contaminaciones y
permitiendo el crecimiento aislado pero controlado de diferentes organismos. Por tanto el
material de laboratorio de esta área requiera del uso de cámaras de cultivo de seguridad
biológica, cámaras de incubación, cámaras de flujo laminar para trabajar de manera
estéril, zonas de esterilización de material biológico, etc.
4.1.4. Laboratorio de Apoyo Computacional (Estudio In Silico).
En este laboratorio, las necesidades de infraestructura son menores que en los ya
mencionados anteriormente, debido a la naturaleza de la investigación a realizar. Los
equipos necesarios en este laboratorio abarcan ordenadores potentes que permitan el
acceso a bases de datos internacionales y el uso de softwares especiales que permitan
realizar todos los experimentos de modelización química y molecular o los virtual
screening de librerías de compuestos. Así se hará necesario la instalación de ordenadores,
conexiones a internet, impresoras, mobiliario adecuado, etc.
4.1.5. Grandes Equipos
El laboratorio o parte del mismo dedicado a los grandes equipos es un aspecto a
analizar profundamente, ya que la inversión a realizar es muy importante, además de ser
equipos que ocupan mucho espacio físico. Así por ejemplo un equipo de Resonancia
Magnética Nuclear está en torno a los 1,5 millones de euros, necesitando además de una
zona adecuada para la instalación, personal cualificado que lleve a cabo las pruebas así
como el mantenimiento del equipo. En este punto cabe destacar que una opción viable y a
tener en cuenta es la colaboración con instituciones, como Universidades u Hospitales,
que ya dispongan de dichos equipos.
4.2. EQUIPAMIENTO Y MATERIAL FUNGIBLE.
4.2.1. Laboratorio de Química
Descripción del artículo Cantidad Precio
Trituradora de material vegetal
Equipo Sohxlet de diferentes tamaños 15.000,00 €
Mantas calefactoras 5.000,00 €
Rotavapores 4.000,00 €
Sistemas de secado y destilación de disolventes 3.800,00 €
Liofilizador (VWR; Ref. 535-0026) y accesorios x1 20.000,00 €
Bombas de presión (VWR; Ref. 181-0094) X2 (1800) 3.600,00 €
Bombas de vacio (VWR; Ref. 181-1514) X2 (3400) 6.800,00 €
Equipo de cromatografía media presión 90.000,00 €
Concentrador para muestras químicas (VWR, Ref. 521-1547) x1 5.500,00 €
Cromatotrón 7.000,00 €
Transiluminador visualizar geles multibanda 365/254 (VL-TCP-20.L.C., Biogen) x1 958,00 €
Cubetas para TLC (VWR; Ref. 552-0020) 1.000,00 €
Generador de Nitrógeno líquido
HPLC-Masas 90.000,00 €
Autopurificador Waters 200.000,00 €
Resonancia Magnética Nuclear (RMN) 1.500.000,00 €
Equipo analítico de Infrarojo 94.000,00 €
Aparato de Difracción Rayos X
Microondas para reacciones (tubos y accesorios) 50.000,00 €
Agitador magnético múltiple (VWR, ref. 442-0013) x1 1.200,00 €
Termómetros y termostatos x3 (367) 1.100,00 €
Equipos de seguridad 12.000,00 €
4.2.2. Laboratorio de Biotecnología y Biología Molecular
4.2.3. Laboratorio de Bioensayos
4.2.4. Laboratorio de Apoyo Computacional
4.2.5. Zonas Comunes
4.2.6. Material Fungible
4.2.7. Componentes de Medios Nutritivos
5. DISTRIBUCIÓN DEL LABORATORIO
Tras presentar la infraestructura, en cuanto a material y aparatos, necesaria para
disponer de un laboratorio interdisciplinar de garantías que permita el desarrollo de una
investigación de calidad en lo referente a la búsqueda de nuevos fármacos derivados de la
biodiversidad Macaronésica, presentamos a continuación los planos del diseño de un
hipotético laboratorio que contemple todas las necesidades mencionadas anteriormente.
Dichos planos muestran una posible distribución de los laboratorios de química,
biotecnología, biología molecular, bioensayos, química computacional y grandes equipos,
así como el inmobiliario necesario para el equipamiento de los mismo.
5.1 LABORATORIO DE QUÍMICA Y ZONA DE ALMACÉN/CULTIVOS
Como se puede observar en el plano adjunto (Fig.xxx), el laboratorio de química
se dispondría contiguo al almacen de productos químicos. El laboratorio dispondría de
unos 8-12 mesas de trabajo acondicionadas con tomas de agua, aire, nitrogeno gaseoso, y
estanterias para material de trabajo, además de una serie de campanas de extracción
donde se realizaran los experimentos y reacciones químicas necesarias, las cuales
igualmente estarán equipadas, cada una de ellas, con las tomas necesarias y el
correspondiente extractor de gases (Fig xxxx). Hay que tener en cuenta la necesidad de
disponer de un lava-ojos y duchas de seguridad contiguo a los lugares de trabajo. La
dispocisión que se presenta requiere de una superficie de 68-70 m2 para el laboratorio en
sí y de 22-25 m2 para el almacén.
Figura xxx. Plano de distribución del Laboratorio de Química y almacen y cámara de cultivo.
Figura xxx. Vista 1 del Laboratorio de Química y Campanas de Extracción
Figura xxx. Vista 2 del Laboratorio de Química y Campanas de Extracción
Figura XXXXX. Detalle de las cámaras de flujo laminar situadas en el almacen de química.
5.2. LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA/BIOLOGÍA MOLECULAR Y
BIOENSAYOS
Este laboratorio acojerá un volúmen elevado de trabajo y experimentación al
combinarse en él varias disciplinas, necesitando estar equipado para la aplicación de una
gran variedad de protocolos diferentes.
El plano mostrado (Figura xxxx) refleja la dispocisión de varios lugares de trabajos
equipados con mobiliario adecuado, así como cámaras de flujo laminar necesarias para
realizar una serie de experimentos o manipulaciones que requieren de condiciones de
esterilidad. Así mismo se contempla una zona donde se localizará el servicio de
autoclavado, imprescindible en este tipo de laboratorios, ya que permitirá la esterilización
de medios de cultivos o material de vidrio a usar en el laboratorio, e incluso la
eliminación de contaminantes biológicos tras uso del material, como pueden ser las
bacterias, levaduras y hongos. En la misma zona de autoclave se situarían los dispositivos
de lavado y aparatos relacionados con la obtención de agua de grado biológico (agua
MiliQ). Igualmente se muestra en la figura xxx la disposición de una serie de mesas,
situadas periféricamente, donde se situarían varios aparatos como son los termocicladores
para PCR, agitadores magnéticos, pH-metros, electroforesis, electroporadores,
termomixer, etc.
La superficie a tener en cuenta para cubrir estas necesidades se puede establecer
en 90 m2 aproximadamente.
Figura XXX. Plano general del Laboratorio de Biotecnología/Bilogía Molecular y Bioensayos.
Figura xxx. Vista 1 del Laboratorio de Biotecnología/Biología Molecular y Bioensayos.
Figura xxx. Vista 2 del Laboratorio de Biotecnnología/Biología Molecular y Bioensayos.
A lo ya mencionado anteriormente, hay que añadir las zonas correspondientes a las
cámaras de cultivos para todo lo relacionado con el crecimiento de bacterias, levaduras,
hongos y material vegetal correspondiente a manipulación genética y biotecnología
vegetal, así como las zonas de crecimiento de líneas célulares animales y tumorales
(Figura xxxxxx). Estas zonas han de estar perfectamente delimitadas y separadas,
aislándolas unas de otras para evitar contaminación cruzada, que impediría una adecuada
realización de los experimentos.
La superficie requerida para abarcar estás zonas de cultivo, se establece en torno a los 12
m2 para cada cámara de cultivo, unos 16 m2 para la zona asociada de flujo laminar y
finalmente unos 18 m2 para la zona de cultivos celulares.
Figura xxx. Vista de Cámaras de Cultivos y Cultivos de Células Animales y Líneas tumorales.
Figura xxx. Zonas de Cultivo Celulares/Células Animales y Área de Flujo Laminar.
5.3. LABORATORIO DE GRANDES EQUIPOS
Este laboratorio está diseñado para acoger equipamiento de mayor tamaño
necesario para realizar una serie de experimientos que sólo son posibles si se dispone de
dicha infraestructura. Este tipo de aparatos son, por ejemplo, los UPLC, GC-MS,
ultravioletas, infrarojos, etc.
Evidentemente, las necesidades de espacio para cubrir todas las posibilidades se
hacen enormes, pero si atendemos al plano mostrado (Figura xxxxx) el espacio que se
establece en el mismo es de unos 70 m2, que permitirá adaptarse en cada momento a la
infraestructura disponible en cada momento.
Figura xxxx. Plano de la zona habilitada para grandes equipos.
Figura xxxxxx. Vista del lñaboratorio de Grandes equipos.
No hay que olvidar incluir en esta distribución un espacio adecuado para los
siguientes aparatos:
1. Resonancia Magnética Nuclear.
2. Rayos X
3. Espectrómetro de Masas
4. Autopurificador
Esta serie de infraestructura, es considerablemente mayor que el resto de aparatos
(Figura xxxxxx), además la inversión económica necesaria para disponer de ellos es
elevada, debido a la tecnología empleada en dichos sistemas. Por ello, se valorará, como
ya se comento en anteriores apartados, la posibilidad de llevar a cabo colaboraciones con
distintos centros, como son las Universidades, que ya disponen de una serie de recursos,
que bien podría ser utilizados en un marco de colaboración científica.
Figura XXXXX. Equipo de Resonancia Magnética Nuclear y Autopurificado.
5.4. LABORATORIO COMPUTACIONAL (ESTUDIO IN SILICO)/DESPACHOS
Por último, indicar que a la ya mencionada superficie necesaria para disponer de
todo lo necesario para llevar a cabo la investigación, se hace necesario la presencia de
dependencias para situar los despachos de los investigadiores. Aprovechando estas
dependencias se equipará algunas de las mismas con todo lo necesario para poder realizar
la investigaión pertinente y correspondiente al estudio computacional ya indicado en
apartados anteriores. Por ello, se necesitará del equipamiento adecuado, como
ordenadores, impresoras tomas de red, escritorios, etc.
Igualmente, no olvidar diseñar el espacio asignado para disponer de una sala,
donde se celebrarán reuniones de grupos, así como presentaciones científicas de
invitados, o ponencias de trabajos de investigación, tesis, etc. Dicha sala necesitará de
ordenadores, proyectores, pantallas, y mobiliario adecuado.
Teniendo todo esto en cuenta, se calcula que la superfiie adecuada para cubrir estas
necesidades está en torno a unos 45 m2 para el equipo y despacho computacional,
unos 33 m2 para unos 3 despachos y alrededor de 40 m2 para la sala de reuniones.
6. SEGURIDAD EN EL LABORATORIO
El diseño del laboratorio debe responder a las necesidades del mismo,
predominando la seguridad, la funcionalidad y la eficacia. La adecuada ubicación y
correcta distribución son factores que contribuyen de manera decisiva en el grado de
protección, tanto para la salud como para el medio ambiente, de un laboratorio. La
seguridad en el laboratorio es de elevado interés e imprescindible en el diseño, desarrollo
y funcionamiento del mismo e irremisiblemente no puede obviarse y así se incluye en
este informe.
6.1. EL LABORATORIO.
Algunos aspectos mínimos a tener en cuenta en el diseño del laboratorio son los
relacionados a continuación:
8. Número de laboratorios necesarios.
9. Actividad de cada laboratorio.
10. Número de personas que trabajan en cada laboratorio.
11. Locales complementarios al laboratorio que van a ser necesarios.
6.2. DEPARTAMENTOS DE LABORATORIO.
Se denomina departamentos de laboratorios al conjunto de recintos o locales que
son utilizados por el personal de los laboratorios. Cada departamento está constituido por
uno o varios laboratorios con sus correspondientes pasillos, despachos, vestuarios, etc.,
siempre que estén físicamente unidos entre sí. Bajo este concepto, a los departamentos de
laboratorios no se deben incorporar recintos como pueden ser las oficinas, comedores,
aseos generales o servicios públicos, que son utilizados o visitados por personal no
perteneciente a los laboratorios. La diferenciación entre departamentos de laboratorios y
áreas accesorias a los mismos presenta bastantes ventajas, afectando de manera directa a
la reducción de costes y al incremento de la seguridad del laboratorio. Entre ellas se
pueden citar:
1. La separación de las áreas de riesgo elevado de otras con riesgo inferior.
2. El control de acceso a las áreas con riesgo.
3. La centralización de los servicios de agua, gas, electricidad, etc,
favoreciendo la actuación en caso de emergencia.
6.3. EQUIPAMIENTO.
Partiendo de la idea de que un laboratorio es todo local o recinto en el que se
manipulen o utilicen compuestos químicos o muestras biológicas con fines como la
investigación, análisis o enseñanza, es evidente que no puede establecerse una norma
general, estando en función de cada circunstancia en particular (operaciones, productos
manipulados, tamaña de la empresa). Sin embargo, como recomendaciones generales
aplicables a cualquier tipo de laboratorio se pueden citar las siguientes normas generales:
10. Dar gran importancia al trabajo en las vitrinas extractoras de gases,
recomendándose, de manera general el uso de una vitrina para cada dos
personas.
11. Procurar que el mobiliario (mesas, sillas, armarios) cumpla unos mínimos
requisitos de funcionalidad y comodidad, prestando atención a los
aspectos ergonómicos, especialmente en lo relativo a la utilización de
ordenadores y microscopios y otros instrumentos que requieran diseños
especiales del puesto de trabajo para evitar lesiones debidas a malas
posturas de los operarios.
12. Disponer de armarios de seguridad RF-15 para almacenamiento de
líquidos inflamables.
6.4. TAMAÑO.
Respecto al tamaño del laboratorio no existe un criterio definido; solamente se
recomienda que debe disponerse de espacio suficiente para el normal desenvolvimiento
del trabajo, siendo recomendable una superficie de aproximadamente 10 m2 por persona.
En el RD 486/97 por el que se establecen las disposiciones mínimas de seguridad y salud
en los lugares de trabajo, se indican unas dimensiones mínimas de 3 m3 no ocupados por
trabajador o de 2 m2 de superficie libre por trabajador.
6.5. ALMACENAMIENTO DE PRODUCTOS QUÍMICOS.
El almacenamiento de productos químicos inflamables está contemplado en la
instrucción Técnica Complementaria ITC-MIE-APQ-001 “Almacenamiento de líquidos
inflamables y combustibles”
6.6. ARMARIOS Y RECIPIENTES DE SEGURIDAD.
Si no se dispone específicamente de un almacén de productos o necesariamente se
deba tener en el laboratorio una cantidad de líquidos inflamables elevada, el
almacenamiento de éstos en armarios y recipientes metálicos de seguridad permite
reducir apreciablemente hace que el riesgo de incendio (MIE-APQ-001). Conforme a esta
norma se usarán armarios protegidos con un nivel de seguridad RF-15 (Fig. xxx), según
la norma UNE-EN-1634-1. Todos los armarios deben estar señalizados y disponen de
ciertas características, como son:
1. Juntas de estanqueidad para evitar la salida de vapores peligrosos al exterior.
2. Están construidos con doble cuerpo con ventilación total exterior.
3. Los compartimentos interiores están libre de metales.
4. Los cajones son estancos y fabricados en plástico.
Figura 1. Vista de un armario de seguridad con nivel RF-15.
6.7. PROCEDIMIENTOS ESCRITOS.
• Un laboratorio deberá contar con documentos escritos donde se describan los
procedimientos operativos estándar aprobados por la dirección del laboratorio
• Toda unidad o área debe tener disponibles los Procedimientos Operativos
relacionados con las actividades que se realizan en él. Se usarán libros de texto,
los métodos analíticos, artículos y manuales publicados como complementos de
estos procedimientos operativos.
6.8. APARATOS, MATERIALES, REACTIVOS.
• Los aparatos deben mantenerse limpios y en buen estado de funcionamiento.
• Se deben llevar registros del funcionamiento, mantenimiento, verificación y
calibración de los aparatos.
2. Además, se llevará un registro de los usuarios de los aparatos y tiempo de uso.
3. Los materiales y los reactivos químicos se etiquetan correctamente y se
almacenan a las temperaturas adecuadas teniéndose en cuenta las fechas de
caducidad. Las etiquetas de los reactivos deben indicar su origen, identidad y
concentración u otra información pertinente.
6.9. PUESTO DE TRABAJO.
El diseño del puesto de trabajo debe tener en cuenta las recomendaciones básicas
establecidas en relación con las medidas antropométricas y también que en el trabajo de
laboratorio pueden alternarse las posiciones de pie o sentado. La Figura xxx, muestra las
dimensiones a tener en cuenta en el puesto de trabajo y resume las distancias óptimas
para el trabajo encima de una mesa que de manera indirecta indican también el espacio
necesario para cada trabajador.
Figura xxx. Trabajo sentado en el laboratorio. Distancias y alcances adecuados para mujer (izquierda) y
hombre (derecha).
Figura xxxx. Área de trabajo sobre una mesa.
6.10. FORMACIÓN.
Los trabajadores de un laboratorio poseen ciertas aptitudes, conocimientos y
cualidades, que los capacita para dicha labor, pero a veces no poseen conocimientos
relativos a salud y seguridad en el laboratorio. Hay que preparar a los mismos para que
puedan ser capaces de:
− Reconocer los peligros para la salud y la seguridad en el trabajo.
− Usar los protocolos de seguridad y salud establecidos y así proteger su salud y la
de los compañeros de trabajo.
− Tener especial cuidado a la hora de manipular material nuevo.
Además de estas especificaciones generales, se deberá instruir a los operarios del
laboratorio en los siguientes aspectos:
− Peligros de materiales, máquinas y equipamientos usado.
− Uso de sistemas y equipos de/con ventilación
− Inspección de objetos de vidrio antes de su uso para comprobar la presencia de
roturas, rasguños, etiquetado y así proceder a la eliminación de material
defectuoso.
− Uso de chupas de aspiración junto con las pipetas.
− Desinfección de pipetas tras el uso.
− Manejo de objetos cortantes y jeringas.
− Uso seguro de máquinas y equipamiento.
− Buenas prácticas de limpieza.
− Prácticas en higiene personal.
− Manipulación segura, y almacenamiento correcto de material peligroso.
− Correcta aplicación de procedimientos de control de derrame.
− Seguridad en almacenamiento de desechos peligrosos.
− Como controlar fuentes de ignición.
− Selección, uso, cuidado y limitación del equipamiento para seguridad personal.
− Procedimientos de seguridad y equipamiento de emergencia.
− Informes de peligros y accidentes.
6.11. SUSTANCIAS PELIGROSAS.
Frecuentemente muchas de las sustancias y preparados que se emplean o
manipulan en los laboratorios, son, por una u otra razón, consideradas como peligrosas.
Por ello, es absolutamente necesario que el usuario de los mismos conozca de antemano
sus características, propiedades y de la posible peligrosidad de cada producto a
manipular. Si el proceso a seguir implica la reacción entre sustancias, es asimismo
necesario conocer las particularidades de cada una de ellas, de los productos intermedios,
en el caso de que los haya, y desde luego, del producto final obtenido.
Debe tenerse en cuenta que aunque muchas sustancias o preparados no requieran
indicación de peligrosidad, no por ello deben considerarse inocuas, ante todo, si se tiene
en cuenta su capacidad de reacción con otros productos. Por todo ello, es recomendable
que al manipular cualquier producto químico, se tomen absolutamente todas las debidas
precauciones, tanto en los considerados como peligrosos, como en los que no se agrupan
en esta categoría.
Las Recomendaciones a este respecto son las siguientes:
- Uso permanente de gafas protectoras
- Uso de guantes
- En lo posible, manipular siempre bajo vitrina de extracción de gases.
Igualmente poner suma atención en cuanto a la presencia de llamas abiertas en el
laboratorio u otras posibles fuentes de ignición para evitar fuegos o explosiones.
Descripción de los pictogramas de peligrosidad
Es de elevada importancia familiarizarse y conocer el significado de la simbología
empleada en el etiquetado de productos de laboratorio, muchos de las cuales se presentan
seguidamente.
Explosivos
Sustancias y preparados que puedan explosionar bajo el efecto de una llama o
que son más sensibles a los choques o a la fricción que el dinitrobenceno
Muy tóxicos
Sustancias y preparados que por inhalación, ingestión o penetración cutánea
puedan entrañar riesgos extremadamente graves agudos o crónicos e incluso
la muerte.
Tóxicos
Sustancias y preparados que por inhalación, ingestión o penetración cutánea
puedan entrañar riesgos graves, agudos o crónicos e incluso la muerte. Su
criterio de clasificación se establece en el anexo V, parte l-A del Reglamento
mencionado.
Comburentes
Sustancias y preparados que en contacto con otros, particularmente con los
inflamables, originan una reacción fuertemente exotérmica.
Extremadamente inflamables
Sustancias y preparados líquidos cuyo punto de inflamación sea inferior a 0°
C, y su punto de ebullición inferior o igual a 35° C. Sustancias y preparados
gaseosos que sean inflamables en contacto con el aire a temperatura y presión
normales.
Fácilmente inflamables
Sustancias y preparados sólidos, susceptibles de inflamarse después de un
breve contacto con una fuente de ignición y que continúan ardiendo o
consumiéndose después de la eliminación de dicha fuente. Sustancias y
preparados líquidos cuyo punto de inflamación sea inferior a 21 °C, pero que
no sean extremadamente inflamables. Sustancias y preparados susceptibles de
calentarse y, finalmente, inflamarse en contacto con el aire a la temperatura
ambiente, sin aporte de energía. Sustancias y preparados que en contacto con
el agua o el aire húmedo desprenden gases inflamables en cantidades
peligrosas.
Corrosivos
Sustancias y preparados que en contacto con los tejidos vivos puedan ejercer
sobre ellos una acción cáustica y destructiva.
Irritantes
Sustancias y preparados no corrosivos que por contacto inmediato,
prolongado o repetido con la piel o mucosas puedan provocar una reacción
inflamatoria o irritante.
Nocivos
Sustancias y preparados que por inhalación, ingestión o penetración cutánea
puedan entrañar riesgos de gravedad limitada.
Peligrosos para el medio ambiente
Sustancias y preparados cuya utilización presenta o puedan presentar riesgos
inmediatos o diferidos para el medio ambiente.
Agentes Químicos y Biológicos.
Los compuestos químicos en el laboratorio pueden presentar una variedad de
peligros tanto para la seguridad como para la salud. Por ejemplo:
2. Tóxicos químicos como el benzeno, arsénico y cadmio pueden causar
enfermedades de larga y corta duración, si se inhalan, ingieren o absorben a través
de la piel.
3. Los ácidos y bases pueden causar irritación y quemar los ojos, piel y vias
respiratorias.
4. E nitrógeno en su forma líquida (-189ºC) puede causar quemaduras de frío y en
forma gaseosa asfixia.
5. Solventes orgánicos en mayor o menor grado son peligrosos combustibles e
inflamables.
6. Contacto con gases en recipientes de alta presión, como nitrógeno u oxígeno
puede causar daños corporales. Las reacciones violentas o explosiones que
ocurren al contactar unos con otros producen daños y quemaduras.
Siempre revisar y contemplar los datos de manipulación y utilización facilitados por el
distribuidor del producto.
7. Los virus, bacterias y hongos, presentes en muchas ocasiones en laboratorios de
biomedicina pueden causar infecciones y enfermedades, por lo que su
manipulación debe contemplar estos posibles riesgos.
Agentes Físicos.
− La radiación ionizante de los Rayos-X y radiosiótopos puede causar cáncer.
− La radiación no ionizante puede causar lesiones en ojos y piel. Los Láser son una
fuente común de radiación no ionizante que indebidamente utilizada puede
provocar lesiones.
− Los ruidos y vibraciones producidas por máquinas como agitadores o centrífugas
pueden causar perdida de audición y estrés.
Equipamiento y Aparatos.
−−−− Las maquinas no protegidas, como centrífugas, ,pueden producir lesiones
corporales.
−−−− Equipamiento eléctrico, puede causar quemaduras o shock eléctricos si no se usan
o se mantienen adecuadamente.
−−−− El material de vidrio es común en los laboratorios. Si
se manipula mal, se pueden producir cortes,
y el contacto con líquidos derramados, al caerse, ser golpeados o
sometidos a una presión excesiva o vacío.
6.12. INSTALACIONES DE SEGURIDAD.
El laboratorio debe estar equipado con varios elementos de seguridad, los cuales
tienen que ser reconocidos y comprendidos por los operarios, al igual que estar
familiarizados con su uso.
1. Lavado de ojos. En caso de contacto de material dañino con los ojos, estos deben
lavarse con abundante agua durante al menos 15 minutos en los puntos de lavado de ojos.
Además se recomienda una revisión médica para evaluar posibles daños.
2. Duchas. Igualmente, si hubiese contacto de un material o reactivo químico dañino con
el cuerpo, lavar en las duchas con gran cantidad de agua durante al menos 15 minutos.
3. Extintor de fuegos. Usar extintores de CO2 para la extinción de pequeños fuegos
resultado de accidentes químicos. Los extintores de halohidrocarbonos deben ser usados
cuando el origen del fuego no sea químico.
4. Botiquín de primeros auxilios. Debe disponer de todo el material necesario para
cualquier pequeña incidencia, y ser usado cuando se requiera además de reponer el
material consumido.
5. Mantas. Cubrir el área afectada por un fuego con una manta para prevenir la
dispersión del mismo. Nunca usar agua para eliminar un fuego en el laboratorio.
6.13. MANIPULACIÓN, TRANSPORTE Y ALMACENAMIENTO.
Se exponen a continuación unas instrucciones generales para la manipulación de
los residuos. Siempre debe evitarse el contacto directo con los residuos, utilizando los
equipos de protección individual adecuados a sus características de peligrosidad. Esto es
especialmente importante en el caso de los guantes y de la protección respiratoria ya que
no existen equipos que protejan frente a todos los productos.
− En caso de desconocer sus propiedades y características, todos los residuos
deberán considerarse peligrosos, asumiendo el máximo nivel de protección.
− Cuando sea posible, se utilizará material que pueda ser descontaminado con
facilidad sin generar riesgos adicionales al medio ambiente. En caso contrario,
se empleará material de un solo uso que pueda ser eliminado por un
procedimiento estándar después del contacto con el producto.
− Nunca se han de manipular residuos en solitario.
− Para los residuos líquidos, no se emplearán envases mayores de 30 litros para
facilitar su manipulación y evitar riesgos innecesarios.
− El transporte de envases de 30 litros o más se realizará en carretillas para
evitar riesgos de rotura y derrame.
− El vertido de los residuos a los envases correspondientes se ha de efectuar de
una forma lenta y controlada. Esta operación será interrumpida si se observa
cualquier fenómeno anormal como la producción de gases o el incremento
excesivo de temperatura. Para trasvasar líquidos en grandes cantidades, se
empleará una bomba, preferiblemente de accionamiento manual; en el caso de
utilizar una bomba eléctrica, ésta debe ser antideflagrante. En todos los casos
se comprobará la idoneidad del material de la bomba con el residuo
trasvasado.
− Una vez acabada la operación de vaciado se cerrará el envase hasta la próxima
utilización. De esta forma se reducirá la exposición del personal a los
productos implicados.
− Los envases no se han de llenar más allá del 90% de su capacidad con la
finalidad de evitar salpicaduras, derrames y sobrepresiones.
− Siempre que sea posible, los envases se depositarán en el suelo para prevenir
la caída a distinto nivel. No se almacenarán residuos a más de 170 cm de
altura.
− Dentro del laboratorio, los envases en uso no se dejarán en zonas de paso o
lugares que puedan dar lugar a tropiezos.
6.14. CLASIFICACIÓN DE LOS RESIDUOS.
De entre los residuos generados en los laboratorios, se exponen los siguientes
grupos de clasificación de residuos peligrosos.
Grupo I: Disolventes halogenados
Se entiende por tales, los productos líquidos orgánicos que contienen más del 2% de
algún halógeno. Se trata de productos muy tóxicos e irritantes y, en algún caso,
cancerígenos. Se incluyen en este grupo también las mezclas de disolventes halogenados
y no halogenados, siempre que el contenido en halógenos de la mezcla sea superior al
2%. Ejemplos: Cloruro de metileno, bromoformo, cloroformo, etc.
Grupo II: Disolventes no halogenados
Se clasifican aquí los líquidos orgánicos inflamables que contengan menos de un 2% en
halógenos. Son productos inflamables y tóxicos y, entre ellos, se pueden citar los
alcoholes, aldehídos, amidas, cetonas, ésteres, glicoles, hidrocarburos alifáticos,
hidrocarburos aromáticos y nitrilos. Es importante, dentro de este grupo, evitar mezclas
de disolventes que sean inmiscibles ya que la aparición de fases diferentes dificulta el
tratamiento posterior.
Grupo III: Disoluciones acuosas
Este grupo corresponde a las soluciones acuosas de productos orgánicos e
inorgánicos. Se trata de un grupo muy amplio y por eso es necesario establecer divisiones
y subdivisiones, tal como se indica a continuación. Estas subdivisiones son necesarias ya
sea para evitar reacciones de incompatibilidad, ya sea por requerimiento de su tratamiento
posterior:
�* Soluciones acuosas inorgánicas: soluciones acuosas básicas: Hidróxido sódico, hidróxido potásico.
�* Soluciones acuosas de metales pesados: níquel, plata, cadmio, selenio, fijadores.
�* Soluciones acuosas de cromo VI.
�* Otras soluciones acuosas inorgánicas: reveladores, sulfatos, fosfatos, cloruros.
�* Soluciones acuosas orgánicas o de alta DQO: soluciones acuosas de colorantes.
�* Soluciones de fijadores orgánicos: formol, fenol, glutaraldehído.
�* Mezclas agua/disolvente: eluyentes de cromatografía, metanol/agua. Grupo IV: Ácidos
Corresponden a este grupo los ácidos inorgánicos y sus soluciones acuosas
concentradas (más del 10% en volumen). Debe tenerse en cuenta que su mezcla, en
función de la composición y la concentración, puede producir alguna reacción química
peligrosa con desprendimiento de gases tóxicos e incremento de temperatura. Para evitar
este riesgo, antes de hacer mezclas de ácidos concentrados en un mismo envase, debe
realizarse una prueba con pequeñas cantidades y, si no se observa reacción alguna, llevar
a cabo la mezcla.
Grupo V: Aceites
Este grupo corresponde a los aceites minerales derivados de operaciones de
mantenimiento y, en su caso, de baños calefactores (glicerinas).
Grupo VI: Sólidos
Se clasifican en este grupo los productos químicos en estado sólido de naturaleza
orgánica e inorgánica y el material desechable contaminado con productos químicos. No
pertenecen a este grupo los reactivos puros obsoletos en estado sólido (grupo VII). Se
establecen los siguientes subgrupos de clasificación dentro del grupo de Sólidos:
�Sólidos orgánicos: A este grupo pertenecen los productos químicos de naturaleza
orgánica o contaminados con productos químicos orgánicos como, por ejemplo, carbón
activo o gel de sílice impregnados con disolventes orgánicos.
�Sólidos inorgánicos: A este grupo pertenecen los productos químicos de naturaleza
inorgánica. Por ejemplo, sales de metales pesados.
�Material desechable contaminado: A este grupo pertenece el material contaminado
con productos químicos. En este grupo se pueden establecer subgrupos de clasificación,
por la naturaleza del material y la naturaleza del contaminante y teniendo en cuenta los
requisitos marcados por el gestor autorizado.
Grupo VII: Especiales
A este grupo pertenecen los productos químicos, sólidos o líquidos, que, por su
elevada peligrosidad, no deben ser incluidos en ninguno de los otros grupos, así como los
reactivos puros obsoletos o caducados. Estos productos no deben mezclarse entre sí ni
con residuos de los otros grupos. Ejemplos:
�* Comburentes (peróxidos).
�* Compuestos pirofóricos (magnesio metálico en polvo).
�* Compuestos muy reactivos [ácidos fumantes, cloruros de ácido (cloruro de
acetilo), metales alcalinos (sodio, potasio), hidruros (borohidruro sódico, hidruro de
litio), compuestos con halógenos activos (bromuro de benzilo), compuestos
polimerizables (isocianatos, epóxidos), compuestos peroxidables (éteres), restos de
reacción, productos no etiquetados].
�* Compuestos muy tóxicos (tetraóxido de osmio, mezcla crómica, cianuros,
sulfuros, etc.).
�* Compuestos no identificados.
6.15. TIPOS DE ENVASES.
Para el envasado y correspondiente separación de los residuos se emplean
distintos tipos de bidones o recipientes, dependiendo del tipo de residuo y de la cantidad
producida. Para los residuos del grupo I al VII es recomendable emplear envases
homologados para el transporte de materias peligrosas. La elección del tipo de envase
también depende de cuestiones logísticas como la capacidad de almacenaje del
laboratorio o centro. Algunos tipos de posibles envases a utilizar son los siguientes:
�
�* Contenedores (garrafas) de polietileno de 5 o 30 litros de capacidad. Se trata de
polietileno de alta densidad resistente a la mayoría de productos químicos y los envases
son aptos para los residuos, tanto sólidos como líquidos, de los grupos I a VII. También
pueden emplearse envases originales procedentes de productos, siempre que estén
correctamente etiquetados y marcados.
�* Bidones de polietileno cubiertos con tapa, de 60 y 90 litros de capacidad, destinados
al manipulado de material desechable contaminado.
�* Cajas estancas de polietileno con un fondo de producto absorbente, preparadas para el
almacenamiento y transporte de reactivos obsoletos y otros productos especiales.
�* Envases de seguridad, provistos de cortafuegos y compensación de presión, idóneos
para productos muy inflamables (muy volátiles) o que desprendan malos olores.
6.16. ETIQUETADO E IDENTIFICACIÓN DE LOS ENVASES.
Todo envase de residuos peligrosos debe estar correctamente etiquetado
(indicación del contenido) e identificado (indicación del productor). La identificación
incluye los datos de la empresa productora, la referencia concreta de la unidad (nombre,
clave o similar), el nombre del responsable del residuo y las fechas de inicio y final de
llenado del envase. La función del etiquetado es permitir una rápida identificación del
residuo así como informar del riesgo asociado al mismo, tanto al usuario como al gestor.
Para los residuos de los grupos I al VII, además de la identificación completa del punto
anterior, se utilizan etiquetas identificadoras del grupo de clasificación. A continuación se
propone una codificación de etiquetas de distinto color:
�Grupo I: Etiqueta de color naranja.
�Grupo II: Etiqueta de color verde.
�Grupo III: Etiqueta de color azul.
�Grupo IV: Etiqueta de color rojo.
�Grupo V: Etiqueta de color marrón.
�Grupo VI: Etiqueta de color amarillo.
�Grupo VII: Etiqueta de color lila. 6.17. RESUMEN.
A continuación se resumen algunos de las reglas y precauciones más importantes
a tener en cuenta en el laboratorio y normas de conducta báscias a tener en cuenta.
1. No trabajar nunca sólo en el laboratorio, asegurándose de los horarios y de que
siempre haya alguien más trabajando.
2. En cualquier momento disponer y llevar protección para los ojos, con gafas
especiales resistentes a impactos. Se puede disponer de gafas con protecciones
laterales.
3. Usar las vitrinas de extracción siempre que se trabaje con sustancias venenosas o
gases perjudiciales así como líquidos inflamables o potencialmente explosivos.
4. Protegerse contra explosiones, fuegos químicos o derrame de líquidos mediante la
interposición de un "escudo de seguridad" o de otro tipo
barrera efectiva.
5. Usar un cubo de metal de seguridad con tapa para el transporte de líquidos
peligrosos.
6. No se debe nunca calentar un disolvente orgánico en un recipiente abierto sobre
una llama. Mantener una distancia respetable entre los recipientes abiertos que
contengan disolventes orgánicos y las llamas o fuentes de chispas
7. No depositar vasos o frascos destapados con productos químicos peligrosos en los
refrigeradores.
8. No trabajar con cantidades mayores (más de 100 gr) de reactivos, a menos que se
haya recibido especial instrucción para reacciones a gran escala.
9. Nunca calentar reactivos usando recipientes totalmente cerrado. Asegurarse que el
recipiente o sistema está abierto para evitar la acumulación de presión de vapor de
los gases.
10. No añadir ningún sólido (boiling chips, carbón activo, etc.) a líquidos calientes
para evitar reacciones de ebullición violentas. Realizar dicha adición cuando el
líquido esté a temperatura ambiente.
11. Nunca pipetar con la boca. Usar pipetas automáticas o pipetas con succionadores.
12. No se usarán productos que no estén perfectamente identificados.
13. Asegurarse de que todos los reactivos químicos y sustancias del laboratorio estén
correcta y claramente marcadas con nombre o fórmula y fecha de preparación o
de uso, para poder ser fácilmente identificable en las notas de laboratorio.
14. No devolver nuca reactivos o productos sobrantes a la botella original.
15. Proteger la ropa personal con vestimenta apropiada de laboratorio.
16. Proteger las manos con guantes de plástico, látex o similares, crioguantes o
guantes para manipular objetos calientes.
17. No usar corbatas colgando, pelo suelto o ropas esponjosas, ya que podrían ser
fácilmente inflamables o provocar accidentes.
18. Se deben conocer y entender los procedimientos aprobados referentes a la
eliminación de residuos en el laboratorio.
19. Se deben conocer la localización de las salidas de emergencia, de los extintores y
de todos los elementos de seguridad del laboratorio.
6.18. LEGISLACIÓN DE REFERENCIA.
1. Ley 20/1986 de 14.5 (B.O.E. 20.5.1986). Básica de residuos tóxicos y peligrosos.
2. Real Decreto 833/1988 de 20.7 (Mº de Obras Públicas y Urbanismo B.O.E. 30.7.1988). Reglamento para
la ejecución de la Ley 20/1986. Básica de Residuos Tóxicos y Peligrosos.
3. Orden de 13.10.1989 (Mº de Obras Públicas y Urbanismo B.O.E. 20.11.89) por la que se determinan los
métodos de caracterización de los residuos tóxicos y peligrosos.
4. 90/394/CEE. Directiva del Consejo de 28.6.90 relativa a la protección de los trabajadores contra los
riesgos relacionados con la exposición a agentes carcinógenos durante el trabajo. D.O.C.E. L196, 26.7.90.
5. 90/679/CEE. Directiva del Consejo de 26.11.90 sobre la protección de los trabajadores contra los riesgos
relacionados con la exposición a agentes biológicos durante el trabajo. D.O.C.E. L374, 31.12.1990.
6. 91/689/CEE. Directiva del Consejo de 12.12.91 relativa a los residuos peligrosos. D.O.C.E. L377,
31.12.1991.
7. Real Decreto 53/1992 de 24.1 (Mº de Relaciones con las Cortes B.O.E. 12.2.92). Reglamento sobre
protección sanitaria contra radiaciones ionizantes.
8. 94/904/CEE. Decisión del Consejo de 22.12.94 por la que se establece una lista de residuos peligrosos
en virtud del apartado 4 del artículo 1 de la Directiva 91/689/CEE del Consejo relativa a los residuos
peligrosos. D.O.C.E. L356, 31.12.94.
9. Ley 31/1995 de Prevención de Riesgos Laborales.
10. Real Decreto 39/1997, por el que se aprueba el Reglamento de los Servicios de Prevención.
11. Norma OSHAS 18001:1999 Sistemas de Gestión de la Seguridad y la Salud Laboral.
12. Directrices sobre sistemas de gestión de la seguridad y salud en el trabajo elaboradas por la OIT.
13. Manual de Prevención de Riesgos Laborales.
14. Procedimiento Operativo PSP-09: Creación, revisión y control de documentos.
15. Real Decreto 379/2001, de 6 de abril, por el que se aprueba el Reglamento de almacenamiento de
productos químicos y sus instrucciones técnicas complementarias MIE-APQ-1, MIE-APQ-2, MIE-APQ-3,
MIE-APQ-4, MIE-APQ-5, MIE-APQ-6 y MIE-APQ-7 y corrección de errores de 19 de octubre del Real
Decreto 379/2001.
16. Real Decreto 374/2001, de 6 de abril sobre la protección de la salud y seguridad de los trabajadores
contra los riesgos relacionados con los agentes químícos durante el trabajo.
17. Real Decreto 363/1995, de 10 de marzo de 1995 por el que se regula la notificación de sustancias
nuevas y clasificación, envasado y etiquetado de sustancias peligrosas y modificaciones posteriores.
18. Real Decreto 255/2003, de 28 de febrero, por el que se aprueba el reglamento sobre clasificación,
envasado y etiquetado de preparados peligrosos.
19. Notas Técnicas de Prevención de I.N.S.H.T. (NTP-432).
7. EPOTILONA: DE LA MOLÉCULA AL FÁRMACO
En este apartado mostraremos un ejemplo ilustrativo de como un metabolito
secundario, las epotilonas, aisladas de una fuente natural, el microorganismo Sorangium
cellulosum (Myxobacteria) (Figura xxx), tras atravesar todo el proceso de investigación
descrito anteriormente, llega a convertirse en un fármaco comercializado con gran éxito
tanto comercial y terapéutico, en este caso un potente antitumoral. Seguidamente se
describen, los pasos realizados y culminados para que dicho fármaco llegara al mercado,
desde su aislamiento hasta las pruebas clínicas y su explotación como medicamento.
Figura xxx. Aspecto de colonias de Sorangium cellulosum.
Las epotilonas son lactonas macrocíclicas con potente actividad citotóxica. El
mecanismo de acción es similar al descrito para el antitumoral Taxol (Paclitaxel®), ambos
uniéndose a los microtubulos y estabilizándolos, lo que conduce a la muerte celular por
impedir se realice la mitosis celular correctamente (Goodin et al. 2004). Las epotilonas
pertenecen al grupo de los policétidos y la maquinaria biosintética responsable es la
policétido sintasa de tipo I (Fig. Xxx). Esta maquinaria consiste en un grupo de genes,
agrupados en lo que se conoce como gen-cluster, los cuales codifican para distintas
proteínas, que son responsables en última instancia de las modificaciones bioquímicas,
que ocurren de manera secuencial, que conducen a la obtención del metabolito final.
Figura xxx. Gen-cluster responsable de la síntesis de las epotilonas. Las cajas representan genes. Los
módulos codificados se indican debajo. La flecha gruesa indica la dirección de la transcripción.
A continuación se presenta de manera cronológica como la epotilona se convirtió
en fármaco antitumoral, referenciando los diferente pasos, desde su aislamiento hasta
ensayos biológicos o modificaciones químicas.
La primera constancia de las epotilonas data del año 1995, cuando se describieron
las epotilonas A y B como potentes citotóxicos con actividad similar a la del Taxol, o sea,
inhibidores de la polimerización de microtúbulos (Fig. 2) (Bollag et al. 1995).
Figura 2. Estructura química de la epotilona A y epotilona B
En 1996, Höfle y colaboradores aislaron las epotilonas A y B y caracterizaron
ambos compuestos mediante técnicas tales como la difracción de Rayos X o la
Resonancia Magnética Nuclear (Höfle et al. 1996). Tras la publicación de los nuevos
compuestos y la actividad biológica tan prometedora, no se tardó en conseguirse la
síntesis de los mismos. Así en el año 1997 se describieron diferentes aproximaciones a la
síntesis de la epotilona A y B, mediante diferentes métodos químicos como la
S
N
O
O OH O
OH
RO
Epotilona A R: HEpotilona B R: CH3
macrolactonización, la metátesis o la síntesis en fase sólida (Yang et al. 1997, Nicolaou et
al. 1997, Nicolaou et al. 1997b).
Tras estas primeras aproximaciones la investigación avanzó rápidamente, y en el
año 2000 se publicó el aislamiento y caracterización del grupo de genes responsables de
la síntesis de la epotilona de la bacteria Sorangium cellulosum SMP44. Este grupo de
genes, poseía 56 Kilobases que codifican siete genes diferentes. Cinco de estos genes
codificaban 5 policétido sintasas, epoA, epoC, epoD, epoE, y epoF. Además, el gen epoB
codifica para una sintetasa proteíca no ribosómica (NRPS) que cataliza la formación del
anillo de tiazol presente en estos compuestos, a partir de la incorporación del aminoácido
cisteina. El séptimo gen, la epoK es una citocromo p450 responsable de la epoxidación de
las epotilonas C y D en sus análogos A y B. De hecho la expresión heteróloga de este
último gen en la bacteria Escherichia coli produjo una enzima que era capaz de convertir
in vitro la epotilona D en epotilona B (Julien et al. 2000). Otros trabajos dirigidos hacia el
mismo objetivo se publicaron de manera casi paralela. Así el gene cluster de la epotilona
A y B también se aisló y se caracterizó de otra cepa de la misma bacteria, Sorangium
cellulosum Soce 90 (Molnár et al. 2000).
Durante las diferentes investigaciones se abordaron estrategias variadas para
producir diferentes epotilonas, buscando siempre una mejora en la actividad citotóxica.
Este abordaje se realizó creciendo Sorangium cellulosum So ce90/B2 en 700 litros de
medio nutritivo en condiciones de fermentación, lo que dió lugar al aislamiento de 37
compuestos, variantes de las epotilonas o relacionados con ellas. La estructura de estos
compuestos se elucidó mediante técnicas de Resonancia Magnética Nuclear y de
Espectrometría de Masas. Además ensayos de actividad citotóxica frente a líneas
celulares de fibroblastos de ratón (línea L929) permitieron llevar a cabo un estudio de
estructura-actividad de los compuestos obtenidos (Hardt et al. 2001).
Otra aproximación dentro de la investigación de productos naturales, y aplicado al
caso de las epotilonas, fue la modificación química buscando un análogo que tenga
propiedades mejoradas o que actúe contra otras líneas tumorales mejor que sus
predecesores. Destacar el ejemplo del compuesto BMS-247550 (Ixabepilone), un
derivado semisintético de la epotilona B como agente antitumoral para el tratamiento de
pacientes con tumores malignos, desarrollado por la compañía Bristol-Myers Squibb
(BMS). El modo de acción de BMS-247550 es similar al del paclitaxel (estabilizador de
microtúbulos), pero en estudios in vitro mostró ser el doble de potente que el paclitaxel.
Este análogo es un agente capaz de matar células cancerosas a concentraciones del orden
nanomolar. Lo más interesante de BMS-247550 es que mantiene su actividad
antineoplásica contra aquellos cánceres humanos que de manera natural se volvieron
insensibles al paclitaxel o desarrollaron resistencia al mismo (Lee et al. 2001).
Otro aspecto relacionado con la investigación en productos naturales, es la
aplicación de herramientas de ingeniería genética y biotecnología para la producción de
compuestos de interés. En este sentido, Sorangium cellulosum es un organismo muy
difícil de manipular genéticamente y el crecimiento del mismo es muy lento, por lo tanto
la posibilidad de modificar otro organismo alternativo e introducirle todo el paquete del
ya secuenciado gene cluster de las epotilonas es una opción que se vuelve más atractiva y
viable. De hecho para producir epotilonas de una manera más rápida y en un organismo
más susceptible a la manipulación genética, se consiguió en 2002 la transformación de la
Myxobacteria Myxococcus xhantus. Se insertó en esta bacteria el ADN de 65,4 Kb
perteneciente a S. cellulosum que codificaba por completo el gen-cluster de las
epotilonas. Este proceso de inserción del genoma foráneo, se obtiene gracias a una serie
de recombinaciones homologas que suceden entre el ADN introducido y el cromosoma
del hospedador. El resultado fue establecer una cepa capaz de fabricar las epotilonas A y
B como productos mayoritarios. Sin embargo, mediante técnicas de manipulación
genética, esta misma cepa pudo ser modificada, anulando el gen de la citocromo
epoxidasa p450, epoK, resultando en otra cepa que producía los intermediarios
respectivos epotilonas C y D (Julien and Shah 2002). Estas y otras cepas, son susceptibles
de ser crecidas en diferentes condiciones de cultivo buscando la optimización en la
producción de un determinado compuesto. Así Janice y colaboradores demostraron que
mediante la modificación del medio de cultivo y los métodos de extracción se pudo
optimizar la producción de epotilona D, a partir de una cepa modificada de M. xanthus,
hasta alcanzar la cantidad de 23mg por litro de cultivo (Lau et al. 2002).
De manera análoga, se llevó a cabo la expresión heteróloga del gen-cluster de
epotilona en la baceteria E. coli, organismo mucho más manipulable y cuyo crecimiento
es mucho más rápido que el de M. xanthus, lo que abre la posibilidad de disponer de otra
herramienta para el estudio del gen-cluster de epotilonas y la producción de otros
análogos mediante manipulación genética de dicho cluster (Sarah et al. 2002).
En los últimos años se ha llevado a cabo un estudio muy intenso en lo que al
mecanismo de acción de la epotilona se refiere, publicándose dicho trabajo en el año
2004 (Goodin et al. 2004). Igualmente, y dentro de la dinámica investigadora, se inició el
proceso de secuenciación del genoma completo de Sorangium cellulosum, debido a la
importancia de dicho organismo como productor, no sólo de epotilona, sino de otros
compuestos bioactivos. Dicho trabajo, donde participaron muchos investigadores e
instituciones, se publicó en el año 2007 (Schneiker et al. 2007).
Los últimos pasos previos a la comercialización de un fármaco son los
denominados ensayos clínicos. El compuesto anteriormente citado, el BMS-247550 (Fig.
3) fue evaluado en fase I durante cinco días, administrándose de manera intravenosa.
Figura 3. Estructura química del compuesto epotilona y de su análogo antitumoral comercializado como
BMS-247550 (Ixabepilona).
Algunos de los resultados del estudio fueron que la máxima dosis tolerada fue de
6 mg/m2 administrada como infusión intravenosa cada hora diariamente durante cinco
días consecutivos, cada 21 días. Además, el efecto secundario de toxicidad límitada a una
dosis de 8 mg/m2/d fue la neutropenia (Abraham et al. 2003). Tras esto se acometió la
fase II del ensayo clínico del ya denominado Ixabepilona (BMS-247550),
S
N
X
O OH O
OH
CH3O
Ixabepilona X: NHEpotilona B X: O
administrándose a pacientes con cáncer de mama que anteriormente ya habían recibido la
administración de paclitaxel o docetaxel, una dosis de Ixabepilona 6 mg/m2/d intrevenosa
durante 5 días cada 3 semanas. Como resultado se observó una respuesta positiva en el
22% de los pacientes tratados anteriormente con taxanos. Como aspecto negativo se
observaron neuropatías sensoriales de hasta grado 3 debido a la neurotoxicidad del
compuesto. En las biopsias realizadas se observó la estabilización de los microtubulos
tras el tratamiento con ixabepilona (Low et al. 2005).
Posteriromente, y durante la fase III, se evaluó la eficacia y seguridad del
preparado comercial IXEMPRA (Ixabepilona) en combinación con la capecitabina
comparado con la capecitabina como monoterápico. Este ensayo incluyó 752 pacientes
que fueron previemente tratados con antraciclinas y taxanos. La evaluación del
tratamiento demostró que IXEMPRA en combinación con capecitabina resultó
estadísticamente en una mejora significativa de la supervivencia a la enfermedad
comparado con el tratamiento monoterápico a base de capecitabina.
Tras los ensayos clínicos, finalmente en octubre de 2007 la FDA (Food and Drug
Administration, EEUU) aprobó el Ixabepilona como fármaco para el tratamiento de
cáncer metastático de mama, convirtiéndose en el primer compuesto derivado de las
epotilonas en ser aprobado como tal y explotado comercialmente con gran éxito
terapéutico (Conlin et al. 2007).
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