Diversidad de Levaduras Marinas Productoras de Fitasas

7/25/2019 Diversidad de Levaduras Marinas Productoras de Fitasas

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Ciencias Marinas

ISSN: 0185-3880

[email protected]

Universidad Autnoma de Baja California

Mxico

Hirimuthugoda, N. Y.; Chi, Z.; Li, X.; Wang, L.; Wu, L.

Diversidad de levaduras marinas productoras de fitasas

Ciencias Marinas, vol. 32, nm. 4, diciembre, 2006, pp. 673-682

Universidad Autnoma de Baja California

Ensenada, Mxico

Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=48032406

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Ciencias Marinas(2006), 32(4): 673682

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Introduccin

La fitasa (mioinositol hexakisfosfato fosfohidrolasa, EC3.1.3.8) cataliza la liberacin de fosfato a partir del fitato(hexakifosfato de inositol), que es el principal tipo de fosfato

presente en los granos de cereal, legumbres y semillas oleagi-nosas, por lo que suele incorporarse en el pienso de aves decorral, cerdo y pescado. Adems, la fitasa tiene un ampliorango de aplicaciones en nutricin animal y humana debido aque puede reducir la excrecin de fsforo en animales mono-gstricos si se utiliza como sustituto del fosfato inorgnico en

Introduction

Phytase (myo-inositol hexakisphosphate phosplase, EC 3.1.3.8) catalyses the release of phosph

phytate (myo-inositol hexakiphosphate), which is thtype of phosphorus present in cereal grains, legumeseeds. Therefore, phytase can be incorporated into c

poultry, swine, and fish diets. It has a wide applications in animal and human nutrition since it c

phosphorus excretion of monogastric animals by inorganic phosphates in the animal diet, thus co

Diversidad de levaduras marinas productoras de fitasas

Diversity of phytase-producing marine yeasts

NY Hirimuthugoda 1,2 , Z Chi1*, X Li1, L Wang1, L Wu 1

1UNESCO Chinese Center of Marine Biotechnology, Ocean University of China, Yushan Road No. 5, Qingdao, China.* E-mail: [email protected]

2Department of Animal Science, Faculty of Agriculture, University of Ruhuna, Mapalana, Kamburupitiya, Sri Lanka.

Resumen

Se aislaron cepas de levaduras marinas de diferentes hbitats y se monitorearon las que mostraron ser productoras deDe las 327 cepas aisladas, 10 mostraron comparativamente mayor actividad fitasa. Se examinaron las caractersticas fisioy bioqumicas de las levaduras productoras de fitasas, as como el pH y temperatura ptimos para su produccin. Tamanalizaron secuencias parciales del gen 18S rARN. Con base en las caractersticas bioqumicas y fisiolgicas y afilogenticos, se encontr que las 10 cepas estn estrechamente relacionadas con Hanseniaspora uvarum(cepa WZ1), Yalipolytica(cepa W2B),Kodamaea ohmeri(cepa BG3), Candida carpophila(cepa N12C),Issatchenkia orientali s(cepa YCandida tropicalis (cepa MA6), Yarrowia lipolytica(cepa YF08), Candida carpophila(cepa NY4E), Candida tropicaliYF12C), y Candidad tropicalis (cepa MB2). Estas cepas se obtuvieron de estmagos de peces no identificados, de vsce

Holothur ia scabra, de Hexagrammos otaki i, de Hexagrammos otaki i, de Synechogobius hasta, as como directamente dde mar. Es interesante resaltar que algunas levaduras marinas pueden producir fitasa alcalina. sta es la primera vez reportan cepas de levaduras marinas capaces de producir fitasa extracelular o unida a las clulas. Los resultados tambin que las levaduras marinas productoras de fitasa fueron lo suficientemente diversas como para ser utilizadas en la bioremede contaminacin marina por fsforo.

Palabras clave : levaduras marinas, fitasa, diversidad gentica, rbol filogentico.

Abstract

Marine yeast strains from different habitats were isolated and phytase-producing marine yeasts were screened. Of thyeast strains isolated, 10 showed comparatively higher phytase activity. Physiological and biochemical characters of thstrains, and optimum pH and temperature of the crude phytases produced by them were examined. Partial sequences of trDNA were also analyzed. Based on the physiological and biochemical characters and phylogenetic analyses, the 10 strainfound to be closely related toHanseniaspora uvarum(strain WZ1), Yarrowia lipolytica (strain W2B),Kodamaea ohmeriBG3), Candida carpophila(strain N12C), Issa tchenkia oriental is(strain YF04C), Candida tropicalis (strain MA6), Yalipolytica(strain YF08), Candida carpophila(strain NY4E), Candida tropicalis(strain YF12C), and Candida tropicalisMB2). They were obtained from gut of unknown fish, gut of Holothuria scabra, gut of Hexagrammos otakii ,

Hexagrammos otakii , gut of Synechogobius hasta, and seawater. It is interesting to note that some marine yeast strainsproduce alkaline phytase. This is the firs t report of marine yeast strains capable of producing extracellular phytase or cellphytase. The results also indicated that phytase-producing marine yeasts were diverse enough to be used in bioremediamarine phosphorous pollution.

Key words : marine yeasts, phytase, genetic diversity, phylogenetic tree.


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Ciencias Marinas, Vol. 32, No. 4, 2006

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la dieta animal, contribuyendo significativamente a la protec-

cin del medio ambiente. La fitasa tambin permite mejorar ladisponibilidad de minerales, elementos traza, aminoacidos yenerga en la dieta (Vats y Barnerjee 2004).

En las ltimas dcadas la industria de la maricultura engeneral, incluyendo cultivos de gambas, bivalvos, algas y pepi-nos de mar, se ha desarrollado rpidamente gracias a la grandemanda de alimentos marinos. Prcticas de gestin no orien-tadas a la proteccin ambiental, muy comunes en los sistemasde cultivo intensivo, tales como descargas de restos y aguasresiduales de las plantas de tratamiento, parecen estar relacio-nadas con la contaminacin por fsforo en el medio marino.Dada la falta de fitasa en los estmagos de animales marinoscultivados, sta se ha venido incorporando en su alimentacin

para reducir este tipo de contaminacin.Debido a la facilidad de su cultivo y a su gran productivi-

dad enzimtica, los microorganismos son las mejores fuentespara la produccin comercial de fitasas. Actualmente todas laspreparaciones de fitasa autorizadas en la UE como aditivos ali-menticios se producen mediante recombinaciones de cepas dehongos filamentosos, y los genes que expresan la fitasa provie-nen de hongos de dos casos del gnero Aspergillus (Haefner etal. 2005). En la ltima dcada, las encimas que puedendegradar fitasas provenientes de levaduras terrestres comoSchwanniomyces occidentalis(Nakamura et al.1999), Pichiaanomala (Vohara y Satyanarayana 2004), Arxula adeninivo-rans(Sano et al.1999), Hansenula polymorph (Mayer et al.1999) y Rhodotorula gracilis(Bindu et al. 1998) tambin han

sido objeto de creciente atencin, ya que pueden ser fcilmenteincorporadas en dietas balanceadas y son ricas en nutrientes.Sin embargo, se conoce muy poco sobre levaduras marinas

productoras de fitasa.Recientemente se ha encontrado que el ocano cuenta con

un potencial enorme de fuentes biolgicas, incluyendo levadu-ras marinas y sus genes. Se cree que las levaduras marinas

productoras de fitasas pueden ser ms adecuadas como aditivopara los piensos marinos que las f itasas de microorganismos deorigen terrestre, considerando adems que en el medio marinolas levaduras son mas eficientes que los microorganismosterrestres. Por tanto, en este estudio se examin la diversidadfisiolgica y gentica de las levaduras marinas productoras de

fitasa provenientes de diferentes medios, con el objetivo deencontrar levaduras marinas que puedan producir grandes can-tidades de fitasa extracelular de potencial aplicacin en laindustria de cultivos marinos.

Material y mtodos

Muestreo

Durante la campaa Antrtica de 2004 se recolectaron dis-tintas muestras de agua y sedimentos en la parte sur del Mar deChina y del Ocano Pacfico. Tambin se recolectaron mues-tras de agua hipersalina, sedimentos provenientes de salinas y

significantly toward environmental protection. Moreov

helps to improve the availability of minerals, trace elemamino acids and energy (Vats and Barnerjee 2004).In recent decades, the global maricultural industry, in

ing shrimp, bivalve, seaweed, and sea cucumber farminundergone rapid development owing to the high demansea food. Non eco-friendly management practices that arecommon in intensive modern farming systems, such acharges of waste manures and wastewater from trea

plants, appear to be associated with phosphorous pollutthe marine environment. Therefore, phytase is also incrated into the maricultural feed since it is lacking in the gfarmed marine animals.

Microorganisms are the best sources for the commproduction of phytases because of their easy cultivatio

high yields of the enzyme. At present, all phytase preparauthorized in the European Union as feed additives areduced by recombinant strains of filamentous fungi, anexpressed phytase genes are of fungal origin and origintwo cases from the genus Aspergillus(Haefner et al.200the last decade, phytate-degrading enzymes of terrestrial ysuch as Schwanniomyces occidentalis (Nakamura et al.Pichia anomala (Vohara and Satyanarayana 2004), Aadeninivorans (Sano et al. 1999), Hansenula polym(Mayer et al. 1999), and Rhodotorula gracilis (Bindu1998), have also received attention since they can be incorporated into feed diets and are rich in nutrients. Howlittle is known about phytase-producing marine yeasts.

In recent years, it has been found that the ocean consa huge potential of bio-resources, including marine yeastheir genes. We think that phytase-producing marine yeasmore suitable as maricultural feed additives than the phfrom terrestrial microorganisms, because in the sea envment, marine yeasts are more efficient than terremicroorganisms. Therefore, in the present study, the phlogical and genetic diversity of phytase-producing myeasts from different marine environments was examineding at searching for marine yeasts that can produce a amount of extracellular phytase and exploring their potapplications in the maricultural industry.

Material and methods

Sampling

Seawater and sediment samples were collected froSouth China Sea and Pacific Ocean during the Antarctic eration in 2004. Hypersaline seawater, sediment from saltand different species of marine animals and algae werecollected from the coast of Qingdao (China) and the IOcean.

Isolation of marine yeasts

Two milliliters of seawater or 2 g of sediments or 2 mhomogenized guts of marine animals or homogenized m


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Hirimuthugoda et al.: Diversity of phytase-producing yeasts

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diferentes especies de animales marinos y algas a lo largo de la

costa de Qingdao, China y en el Ocano ndico.

Aislamiento de levaduras marinas

De las diferentes muestras se obtuvieron 2 mL de agua demar, 2 g de sedimento o bien 2 mL de intestino de animalesmarinos u homogeneizado de algas, que inmediatamente des-

pus del muestreo se mezclaron en una suspensin de 20 mLde medio YPD (2% glucosa, 2% polipeptona y 1% de extractode levadura), preparado con agua de mar con un suplemento de0.05% de cloranfenicol, dejando dicha suspensin a tempera-tura ambiente durante cinco das. Despus de la dilucinnecesaria de los distintos cultivos, la mezcla resultante seintrodujo en placas de medio YPD con 0.05% de cloranfenicol,

que fueron incubadas a 2025C durante cinco das. De estasplacas se extrajeron diferentes colonias que fueron transferidasa nuevas placas YPD.

Bsqueda de levaduras marinas productoras de fitasa

Cada cepa de levadura obtenida de las placas se cultiv enmedio YPD lquido durante 24 h a 28C. Se recolectaron 2 mLde los cultivos y las clulas obtenidas fueron limpiadas tresveces con agua destilada esterilizada por centrifugacin. Lasclulas limpias fueron inyectadas en placas con vitaminas,sales minerales, 1% de sulfato amnico, 0.5% de fitato sdicocomo nica fuente de carbono y fosfato, y 2% de agar, todo

ello tamponado a pH 5. Despus de 24 h de incubacin, cadacolonia fue transferida a una segunda placa con el mismomedio. Todas las cepas que crecieron vigorosamente en lasegunda placa fueron usadas para la estimacin de fitasa.

Estimacin de fitasa

Las cepas de levadura seleccionadas de la segunda placafueron inoculadas en viales de 250 mL con 50 mL de mediosinttico mnimo con vitaminas, sales minerales, 1% de sulfatode amonio, 0.5% de fitato sdico, y posteriormente fueronincubadas aerbicamente durante cinco das a 28C. Se centri-fug 1 mL del medio de cultivo a 5000 rpm durante 10 min. Elsobrenadante obtenido fue usado como preparacin cruda de

fitasa extracelular. Las pelotillas fueron lavadas tres veces conagua esterilizada y destilada doblemente, y posteriormenteresuspendidos en 1 mL de medio sinttico. Esta suspensin seus como preparacin para la fitasa unida a la clula. La activi-dad fitasa fue estimada de la siguiente manera: se preincubo0.8 mL de solucin de fitato de sodio (5 mM fitato de sodio en0.2 M acetato de sodio, pH 5) a 60 C durante 5 min, aadiendoo bien 0.2 mL de la solucin cruda de fitasa extracelular o de la

preparacin de fitasa unida a la clula, mezclando bien la solu-cin en ambos casos con la ayuda de una punta de pipeta. Lamezcla fue incubada a 60C durante 30 min. La reaccin fue

posteriormente detenida mediante la adicin de 1 mL de TCA(cido tricloroactico) al 5%. El fosfato inorgnico liberado fue

algae were suspended in 20 mL of YPD (2% glu

polypeptone and 1% yeast extract) medium preparedwater and supplemented with 0.05% chloramimmediately after sampling and cultivated at room tefor five days. After suitable dilution of the cell cudilute was plated on YPD plates with 0.05% chloraand the plates were incubated at 2025C for five daent colonies from the plates were transferred to the Y

Screening of phytase-producing marine yeasts

Each yeast strain from the slants was grown in Ymedium for 24 h at 28C. Two milliliters of the cucollected and cells were washed three times withdistilled water by centrifugation. The washed cells w

lated onto plates that contained vitamins, mineralsammonium sulfate, 0.5% sodium phytate as the solecarbon and phosphate, and 2% agar (pH 5). After 24

bation, each colony was transferred to the second plasame medium. All the strains that grew vigorously oond plate were used for the phytase measurement.

Phytase assay

The selected yeast strains from the second pinoculated into a 250-mL flask with 50 mL of thsynthetic medium containing vitamins, mineral sammonium sulfate, and 0.5% sodium phytate, and th

aerobically for five days at 28C. One milliliter of tmedium was centrifuged at 5000 rpm for 10 min. Thtant obtained was used as the crude extracellula

preparation. The pellets were washed three times wized double distilled water and then resuspended in the synthetic medium, and the cell suspension was ucell-bound phytase preparation. The phytase actassayed as follows: 0.8 mL of sodium phytate solmM sodium phytate in 0.2 M sodium acetate, pH

pre-incubated at 60C for 5 min, and 0.2 mL of extracellular phytase preparation or the cell-boun

preparation were added and mixed well with thepipette tip. The mixture was incubated at 60C for 30reaction was stopped by addition of 1 mL of 5

(trichloroacetic acid). The inorganic phosphate libequantitatively determined by the ammonium method (Chi et al. 1999) in a spectrophotometer aOne unit of phytase activity was defined as the aenzyme causing the release of 1.0M of inorganic

per minute under the assayed conditions. In order tthe effects of temperature on phytase activity, thactivity was determined at 37C, 45C, 50C, 55C, 6and 70C. The effect of pH on the enzyme activity wmined by incubating the mixture between pH 4.0 andthe standard assay condition. The buffers used wacetate (pH 4.06.0) and 0.2 M Na 2B40710 H(pH7.09.0).


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determinado cuantitativamente mediante el mtodo del molib-

dato de amonio (Chi et al.1999) en un espectrofotmetro a 700nm. La unidad de actividad fitasa se defini como la cantidadde encima que provoca la liberacin de 1 M de fosfato inorg-nico por minuto bajo las condiciones del experimento. Para

poder examinar los efectos de la temperatura en la actividadfitasa, sta ltima se midi a 37C, 45C, 50C, 55C, 60C,65C y 70C. El efecto del pH en la actividad enzimtica sedetermin incubando la mezcla entre pH 4 y 9, usando las con-diciones de experimentacin estndar. Los tampones usadosfueron acetato 0.2 M (pH 4.06.0) y Na2B40710 H2O-H3Br30.2M (pH 7.09.0).

Extraccin total del ADN genmico y PCR

Todo el ADN genmico de las cepas de levaduras se aisly purific utilizando los mtodos descritos por Sambrook etal. (1989). Se utilizaron precursores universales para laamplificacin del gen 18S ARNr de las levaduras. El precursorforward fue P1 (5-ATCTGGTTGATCCTGCCAGT-3) y elreverse fue P2 (5-GATCCTTCCGCAGGTTCACC-3)(Thanh et al.2002). Veinticinco microlitros de la mezcla reac-tiva contenan 12.5 L de 10 tampn, 2 L de dNTP 10 mM,1.5 L de MgCl2 25 mM, 1 L de 20 g mL1 de P1, 1 L de20 g mL1de P2, 0.5 L de 5 UL 1 Taq ADN polimerasa,0.5 L de ADN templado y 17.75 L de H 2O. La amplificacin

por PCR se llev a cabo mediante la desnaturalizacin a 94Cdurante 5 min seguida por 30 ciclos de desnaturalizacin a94C durante 1 min, templado a 55C durante 1 min, extensina 72C por 2 min, y una extensin final a 72C por 10 min. El

producto del PCR se separ por electroforesis en agarosa, y serecuper usando una columna en gel UNIQ para ADN(BIOASIA, Shanghai). El producto PCR recuperado fueincluido en un vector pGEM-T e introducido en clulas compe-tentes deEscherichia coli JM109. Los transformadores fueronseleccionados en placas con ampicilina. Los plsmidos en lasclulas transformadas se extrajeron usando el mtodo descritoen Sambrook et al. (1989). Para poder confirmar que los pro-ductos del PCR fueron incluidos en el vector, los plsmidos

purificados se utilizaron como plantilla para la amplificacindel gen 18S rARN de las cepas de levadura. El sistema de reac-tivos y las condiciones para la amplificacin del PCR fueron

las mismas descritas anteriormente. El fragmento del gen 18SrARN insertado en el vector fue secuenciado por la CompaaShanghai Sangon.

Anlisis filogentico

Las secuencias obtenidas fueron analizadas para detectarsimilitudes utilizando BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). El rbol filogentico se construy usando el paquetede software PHYLIP, versin 3.75c (Felsenstein, 1995). Lasmatrices de distancia se generaron usando el programa DNA-DIST, basado en el modelo de dos parmetros de Kimura(Kimura 1980). Se realizaron anlisis tipo Neighbor-joining delos datos mediante el programa Neighbor del paquete PHYLIP.

Total genomic DNA extraction and PCR

The total genomic DNA of the yeast strains was isand purified following the methods described by Sambroal. (1989). The universal primers for amplification o18SrRNA gene of the yeasts were used. The forward pwas P1 (5-ATCTGGTTGATCCTGCCAGT-3) andreverse primer was P2 (5-GATCCTTCCGCAGGTTC3) (Thanh et al.2002). Twenty-five microliters of the remixture contained 12.5 L of 10 buffer, 2 L of 10dNTP, 1.5 L of 25 mM MgCl2, 1 L of 20 g mL

1 P1of 20 g mL1P2, 0.5 L of 5 U L 1 Taq DNA polym0.5L of template DNA and 17.75 L of H 2O. The PCR afication was carried out by denaturing at 94C for 5followed by 30 cycles of denaturing at 94C for 1 min, an

ing at 55C for 1 min, extension at 72C for 2 min, and aextension at 72C for 10 min. The PCR product was sepa

by agarose electrophoresis and recovered using the Ucolumn DNA gel recovery kit (BIOASIA, Shanghai)recovered PCR products were ligated into pGEM-T easytor and transformed into competent cells of EscherichiaJM109. The transformers were selected on plates with amcillin. The plasmids in the transformed cells were extraccording to the methods described by Sambrook et al.(1In order to confirm that the PCR products had been ligatethe vector, the purified plasmids were used as templatamplification of the 18S rRNA gene of the yeast strainsreaction system and the conditions for PCR amplification

the same as described above. The 18S rRNA gene fraginserted on the vector was sequenced by the Shanghai SaCompany.

Phylogenetic analyses

The sequences obtained above were analyzed for simby using BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)phylogenetic tree was constructed using PHYLIP softpackage version 3.75c (Felsenstein 1995). Distance mawere generated by the DNADIST program, based on Kimtwo-parameter model (Kimura 1980). Neighbor-joining asis of the data sets was carried out with the Neighbor proof the PHYLIP package.

Routine identification of the yeasts

The routine identification of the yeasts was performelowing the methods described by Kurtzman and Fell (200

Results

Marine yeast strains with phytase activity

A total 327 yeast strains were obtained from seawateriments, marine fish guts and marine algae, but only 10 ofstrains secreted a large amount of phytase into the mediuhad cell-bound phytase activity (table 1).


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Identificacin rutinaria de las levaduras

La identificacin rutinaria de las levaduras se realizusando los mtodos descritos por Kurtzman y Fell (2000).

Resultados

Levaduras marinas con actividad fitasa

Se obtuvo un total de 327 cepas de levadura a partir de aguade mar, intestinos de peces marinos y algas marinas, pero slo10 de estas cepas segregaron cantidades elevadas de fitasa en elmedio o tuvieron actividad fitasa ligada a la clula (tabla1).

Las cepas WZ1, W2B, BG3, N12C, YF04C, MA6, YF08,NY4E, YF12C y MB2 fueron aisladas a partir del intestino de

peces marinos no identificados a lo largo de la lnea de costa deQingdao, intestino deHolothuria scabraen China, intestino deHexagrammes otakii, agua de mar del Ocano Pacfico, intes-tino de Hexagrammes otakii , agua de mar del Ocano ndico,intestino de Synecogobius hasts, agua proveniente de salinas,intestino deHolothuria scabra de Sri Lanka y agua de mar delsur del Mar de China, respectivamente.

Caracterizacin fisiolgica y bioqumica

La tabla 2 muestra los espectros de fermentacin y asimila-cin de fuentes de carbono, y otras caractersticas fisiolgicas y

bioqumicas de las distintas levaduras marinas productoras de

fitasa obtenidas en este estudio.

Strains WZ1, W2B, BG3, N12C, YF04C, MA

NY4E, YF12C, and MB2 were isolated from gut ofmarine fish from the Qingdao coast, gut of Holothurfrom China, gut of Hexagrammes otakii, Pacific Oceter, gut ofHexagrammes otakii, Indian Ocean seawaSynecogobius hasts , saltpan seawater, gut of Holotbra from Sri Lanka, and South China Sea seawatetively.

Physiological and biochemical characterization

Table 2 shows fermentation spectra and carbassimilation spectra, as well as other physiologicachemical characteristics of the different phytase-marine yeasts obtained in this study. Based on this in

and on similar information for the type strains listedman and Fell (2000), we found that strains WZ1, WYF04C and YF08 were similar to HanseniasporaYarrowia lipolytica,Kodamaea ohmeri ,Issatchenkiaand Yarrowia lipolytica, respectively, while N12C were similar to Candida carpophila, and MA6, YMB2 to Candida tropicalis .

Phylogenetic analysis of partial sequences of the 1genes

According to Kurtzman and Fell (2006), traditroutine identification methods that depend on

usually lead to uncertain and inaccurate interpre

Tabla 1.Cepas productoras de fitasa y su actividad.Table. 1. Phytase-producing strains and their activity.

Strains Phytase activity(mU mL1)

Optimum temperature(C)

Optimum pH Habitats

WZ1 19 + 0.011

14 + 0.00426560

78

Gut of unknown fish

W2B 61 + 0.0111 60 8 Gut of sea cucumber,Holothuria scabra(Ch

BG3 62 + 0.0061 65 5 Gut of fish,Hexagrammes otakii

N12C47 + 0.026

1

14 + 0.01225560

65

Seawater (Pacific Ocean)

YF04C 30 + 0.0041 50 9 Gut of fish,Hexagrammes otakii

MA6 35 + 0.0061 65 7 Seawater (Indian Ocean)

YF08 31 + 0.0341 60 7 Gut of fish, Synecogobius hasts

NY4E 44 + 0.0061

16 + 0.00125565

86

Seawater (saltpans)

YF12C 49 + 0.0081

28 + 0.04525565

86

Sea cucumber,Holothuria scabra(Sri Lank

MB2 34 + 0.0231 60 6 Seawater (South China Sea)

1Extracellar enzyme activity.2Cell-bound enzyme activity.


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Fgl=glucosefermentationandFgal=galactose

fermentation.

Otherassimilationtests:Gl=gluco

se,

Ga=galactose,

Ar=D-arabinose,

Cb=cellab

iose,

La=lactose,

Su=sucrose,

Ma=maltose,

Ra=raffinose,

Ss=solublestarch,

Xy=xylose,

Tr=trehalose,

Sa=salicin,

Ge=gelatinliquifaction,

Uh=ureahydrolysis,

10%

=10%

Nacl,

16%

=16%

Nacl,50%=50%

glucose,

60%=

60%glucose,

37=growthat37C,

40=growthat40C,

As=observationsofascospores,

Ni=growthinnitrite.w=weakgrowth.

Tabla

2.

Caractersticasfisiolgicasybioqumicasdelascepasaisladas.

Table

2.

Physiologicalandbiochemicalcharacte

risticsoftheisolates.

Isolate

Fgl

Fgal

Gl

Ga

Ar

Cb

La

Su

Ma

Ra

Ss

Xy

Tr

Sa

Ge

Uh

10%

16%

50%

60%

37

40

As

Ni

YF12C

+

+

+

+

w

+

+

+

+

w

W

w

+

+

W2B

+

+

w

+

+

w

w

W21

+

+

+

w

BG3

+

+

+

+

w

+

w

+

w

+

+

+

w

+

YF08

+

+

w

+

+

w

w

YF04C

+

+

+

w

+

+

+

+

MB2

+

+

+

+

w

+

+

+

+

w

w

w

+

+

MA6

+

+

+

+

w

+

+

+

+

w

w

w

+

+

NY4E

+

+

+

w

+

+

w

+

w

w

w/

w

N12C

+

+

+

w

+

+

w

+

w

w

w/

w


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Con base en los espectros de fermentacin y de asimilacin

de fuentes de carbono y otras caractersticas fisiolgicas y bio-qumicas de las distintas levaduras marinas productoras defitasa y las cepas tipo listadas por Kurtzman y Fell (2000),encontramos que las cepas WZ1, W2B, BG3, YF04C y YF08fueron similares a Hanseniaspora uvarum , Yarrowia lipoly-tica, Kodamaea ohmeri, Issatchenkia orientalis y Yarrowialipolytica, respectivamente, mientras que N12C y NY4E fue-ron similares a Candida carpophila, y MA6, YF12C y MB2 lofueron a Candida tropicalis .

Anlisis filogentico de las secuencias parciales de losgenes 18S rARN

De acuerdo con Kurtzman y Fell (2006), los mtodos tradi-

cionales y la identificacin rutinaria que dependen del fenotipogeneralmente tienden a interpretaciones poco precisas de lasinteracciones entre especies. El anlisis secuencial de la filoge-nia para realizar taxonoma microbiana es un mtodo ms

preciso para determinar relaciones intra e interespecficas. Portanto, se analizaron secuencias parciales del ITS de 18S rARNde las cepas de levadura para los anlisis comparativos usandoun anlisis BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) yse depositaron en el National Center for BiotechnologicalInformation (NCBI), EUA, bajo los nmeros de acceso queaparecen en la tabla 3. Cafetena roenbergensis (un flageladohetertrofo) se us como elemento fuera del grupo para cons-truir el rbol filogentico. La bsqueda de similitudes entre las

secuencias de 18S rARN aisladas y las que se encuentran en labase de datos del NCBI indica que las cepas de levaduraencontradas en este anlisis son similares a varias especiesfilogenticamente relacionadas. En la figura 1 se muestran lasrelaciones filogenticas de las secuencias de 18S rARN de lascepas identificadas de levaduras marinas, y sus nmeros deacceso en Genbank se muestran en la tabla 3.

Discusin

Hasta donde sabemos, ste es el primer trabajo de investi-gacin completo sobre un rango considerablemente diverso delevaduras marinas productoras de fitasa. Es importante desta-car que ninguno de los animales marinos utilizados era de

cultivo, sino que provenan de medios marinos naturales. Estosresultados muestran que muchas de las levaduras marinas pro-ductoras de fitasa fueron obtenidas de intestinos de animalesmarinos, sugiriendo que pueden existir en dichos ambientes.En la tabla 1 se puede observar que algunas de las fitasas delevaduras marinas pueden actuar de forma ptima en mediosalcalinos. Por ejemplo, la fitasa extracelular en crudo produ-cida por las cepas W2B, NY4E y YF12C, y la fitasa unida aclulas en WZ1 tuvieron un pH ptimo de 8, mientras la fitasaextracelular producida por la cepa YF04C tuvo un pH ptimode 9. Sin embargo, el pH ptimo de las fitasas de levadurasy mohos terrestres es de 2.5 a 5.5. Se ha descrito que las fita-sas alcalinas de microorganismos pueden tener aplicaciones

species interaction. Sequence analysis of phylo

microbial taxonomy is a more accurate method for deinter- and intra-specific relationships. Therefore, 1partial ITS sequences of the yeast strains were comBLAST analysis (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAdeposited at the National Center for BiotechInformation (NCBI, USA) under the accession numare given in table 3. Cafetena roenbergensis (hetflagellate) was used as out-group for constructing thnetic tree. The search for the similarity between the sequences of the isolates and those in the NCBIshowed that the yeast strains obtained in this study ato several phylogenetically-related yeast species. Phrelationships of the 18S rRNA sequences of the mastrains identified are shown in figure 1 and their accession numbers are shown in table 3.

Discussion

To our knowledge, this is the first researchphytase-producing marine yeasts that had a considediversity. It should be stressed that all the marine aninot farmed, but came from natural marine environmresults showed that most of the phytase-producinyeasts were obtained from the guts of natural marinsuggesting that they can exist in such environmentsobserved from table 1 that some phytases from marcan act optimally in alkaline environments. For ex

crude extracellular phytases produced by strains W2and YF12C, and the cell-bound phytase from WZ1mum pH 8, while the extracellular phytase producedYF04C had optimum pH 9; however, the optimu

phytases from terrestrial yeasts and molds was 2.5 tobeen reported that alkaline phytase from microorgapromising applications in industry (Haefner et Therefore, further studies on alkaline phytase fr

Tabla 3.Cepas marinas identificadas y su cdigo de acceso.Table 3.Marine yeast strains identified and their accession num

Strain 18s rRNA

Hanseniaspora uvarumstrain WZ1 DQ 438176 DQ

Yarrowia lipolyticastrain W2B DQ 438177 DQ

Kodamaeasp. strain BG3 DQ 438178 DQ

Candida sp. strain N12C DQ 438179 DQ

Issatchenkia orientalisstrain YF04C DQ 438180 DQ

Candida sp. strain MA6 DQ 438181 DQ

Yarrowia lipolytica strain YF08 DQ 438182 DQ

Candida sp. strain NY4E DQ 499512 DQ

Candidasp. strain YF12C DQ 515959 DQ

Candida sp. strain MB2 DQ 471323 DQ


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prometedoras para la industria (Haefner et al.2005). Por lotanto, es necesario realizar ms trabajos sobre la fitasa alcalina

proveniente de la cepa YF04C. En la tabla 1 se puede observarque Yarrowia lipolyticaW2B y Kodamea ohmeri BG3 tuvie-ron la mayor actividad fitasa extracelular, y ambas fueron ais-ladas a partir de intestinos de animales marinos. Variostrabajos han mostrado que estas dos especies de levadura soncomunes en ambientes marinos o de alta salinidad (Barnett etal. 2000, Jain et al.2004).

La temperatura ptima de las fitasas de levaduras marinasestuvo en un rango entre 55C y 65C. Este resultado es idn-tico que para las levaduras terrestres. En general, la fitasa delevaduras terrestres muestra una gran actividad en el rango detemperaturas entre 50C y 70C, mientras que la temperaturaptima se encuentra principalmente entre 45C y 60C(Haefner et al.2005). Tambin se puede observar en la tabla 1que las cepas WZ1, N12C, NY4E y YF12C pueden producirtanto fitasa extracelular como fitasa ligada a la clula, peroambas fitasas mostraron diferentes temperaturas y pH ptimos.Vohara y Satyanarayana (2004) informaron de ligadura defitasa a la clula en cepas de levaduras terrestres. De acuerdo

YF04C are necessary. Table 1 shows that Yarrowia lipoW2B and Kodamea ohmeri BG3 had the highest extrace

phytase activity and both of them were isolated from thof marine animals. Several studies have shown that thesyeast species are common in marine and saline environ(Barnett et al.2000, Jain et al.2004).

The optimum temperature of phytases from the myeast strains ranged from 55C to 65C. This resultidentical for the terrestrial yeasts. In general, terrestrial

phytase shows high activity in the 5070C temperature rwhile optimum temperature is mostly between 45C60C (Haefner et al. 2005). It can also be seen from tthat strains WZ1, N12C, NY4E, and YF12C can pr

both extracellular phytase and cell-bound phytase, showed different optimal pH and temperature. VoharSatyanarayana (2004) reported the cell-bound charact

phytases in terrestrial yeast strains. According to those auit has been proven that a considerable percentage of

phytases bounds to the cell wall and is thus unavailabphytate digestion as expected in feeding livestock. It canbe inferred from table 1 that the marine yeast strains is

Figura 1.rbol de consenso de las cepas aisladas basado en las secuencias de 18S rARN obtenidas en este estudio y 35 secuenciaspreviamente publicadas obtenidas de GenBank. Los nmeros encima de las ramas son el nmero de bootstrap realizados.Figure 1.Consensus tree of the isolates based on the 18S rRNA sequences obtained in this study and on 35 previously publishedsequences obtained from GenBank. The numbers above the branches are bootstrap values.

N12CNY4E

C. carpophila-AY227715

10088

9895

93

100

100

57

7966

89

50

85

60

80

73

MA6MB2

98

100

100

47

63

68

77

100

100

75

53

76

100

100

100

100

100

100

100

95

100

70

47

48

Y. lipolytica -AB018158

H. valbyensis -AY046254I. orientalis -AY964117


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con estos autores est probado que un considerable porcentaje

de la fitasa est ligado a la pared celular y, por tanto, no estdisponible para la digestin por fitasa esperada en la alimenta-cin de seres vivos. Tambin se puede inferir de la tabla 1 quelas cepas de levaduras marinas aisladas de la superficie dealgas no produjeron ni fitasa extracelular ni ligada a la paredcelular.

Con base en la topologa del rbol filogentico parece quelas 10 cepas aisladas pertenecen a seis especies genticas. Latopologa del filograma en la figura 1 confirma que la cepaWZ1 est muy relacionada con Hanseniaspora uvarum, mien-tras que las cepas W2B y YF08 estn muy relacionadas conYarrowia lipolytica. La cepa BG3 fue asignada a Kodamaeaohmeri. Las cepas N12C y NY4E pueden estar estrechamenterelacionadas con Candida carpophila mientras que la cepa

YF04C pertenece a los miembros de Issatchenkia orientalis .Las secuencias de 18S rARN de las cepas MA6, YF12C yMB2 fueron idnticas que las de Candida tropicalis . A pesarde que los resultados de asimilacin de carbono y fermentacinde las cepas YF12C, MA6 y MB2 fueron similares a Candidatropicalis (tabla 2), el rbol filogentico indica que las cepasMA6, YF12C y MB2 pertenecen a dos genotipos(fig.1).

A pesar de que muchas especies de levaduras terrestres hansido identificadas como productoras de fitasa (Segueilha et al.1992, Lambrechts et al. 1993, Bindu et al.1998, Mayer et al.1999, Nakamura et al.1999), los resultados obtenidos en esteestudio indican que todas las cepas encontradas fueron espe-cies nuevas de levaduras marinas con actividad fitasa. Aunque

el ambiente intestinal de los animales marinos es cido, tam-bin pueden encontrarse cepas de levaduras productoras defitasa alcalina en el intestino de animales marinos (tabla 1).Con base en los resultados obtenidos puede concluirse quecada una de las cepas puede ser objeto de anlisis futuros talescomo anlisis de las propiedades de la enzima purificada,clonacin de genes, etc. Por lo tanto, la purificacin y caracte-rizacin de fitasas alcalinas a partir de levaduras marinas estsiendo objeto de estudio en este laboratorio. La purificacin ylas propiedades de las enzimas purificadas de estas cepas serndiscutidas en trabajos futuros.

Agradecimientos

Esta investigacin ha sido financiada mediante el consejode becas de China y las becas 3032802 de la Fundacin Nacio-nal de Ciencias Naturales de China.

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from the surface of algae did not produce both extrace

phytase and cell-bound phytase.On the basis of tree topology, it appears that the 10 isbelonged to six genospecies. The topology of the phylogrfigure 1 confirms that strain WZ1 was closely related uvarum, while strains W2B and YF08 were closely relaY.lipolytica. Strain BG3 was assigned to K. ohmeri. S

N12C and NY4E could be closely related to C. carpowhereas strain YF04C belonged to members of I. orienThe 18S rDNA sequences of strains MA6, YF12C and were identical to those of C. tropicalis . Although the cassimilation and fermentation results of YF12C, MAMB2 were similar to C. tropicalis (table 2), the phylogtree indicates that these three strains belonged to two gencies (fig. 1).

Though many terrestrial yeast species have been idenas producing phytase (Segueilha et al.1992, Lambrechts1993, Bindu et al.1998, Mayer et al.1999, Nakamura1999), the results obtained in this study indicate that all swere new marine yeast species with phytase activity. Alththe intestinal environment of marine animals is acidic, al

phytase-producing marine yeasts could be present in the tines of marine animals (table 1). Based on the results obtawe conclude that every single strain can be subjected to fanalysis (e.g., analyzing properties of purified enzymes,cloning, etc.). The purification and characterization of alk

phytase from marine yeasts are being undertaken in this latory, and the properties of purified enzymes of these s

will be discussed in future works.

Acknowledgements

This research was supported by the Chinese ScholCouncil and grant 3032802 from the National Natural ScFoundation of China.

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Recibido en febrero de 2006;

aceptado en octubre de 2006.

Documents

Diversidad de Levaduras Marinas Productoras de Fitasas