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Desarrollo de la diversidad demetabolismos microbianos
3.8×109
años
interacción depresiones selectivas
evolución tiempo
habitat Microorganismos
Bacterias Arqueas Eucariotes
Diversidad
fisiológica
Metabolismo, replicación y herencia son inseparables del contexto ambiental
presión selectivarecursos
ClasificaciónClasificación metabólicametabólica segúnsegúnrequerimientosrequerimientos de C de C yy E E
Fuente de E
Fuente de C Fuente de C
Quimiotrofos Fototrofos
Aceptor final de electrones
Usa H2O para reducir CO2?
Si No
luzquímica
Comp. orgánicos Comp. orgánicos
Comp.orgánicos
Comp.inorgánicos
O2 No O2
CO2 CO2
Quimioheterotrofos Quimiolitotrofos FotoautotrofosFotoheterotrofos
FermentativoFotosíntesisanoxigénica
Fotosíntesisoxigénica
oxidativo
NO3-, SO4
2-,Fe(III), Mn(VI)
Bacteriasoxidantes deS, Fe y CO
GNB, PNB
MetabolismoMetabolismo::AnabolismoAnabolismo yy catabolismocatabolismo
• Biosíntesis• Creación de uniones C-C• Reducción asimilatoria de CO2, NO3
-, SO42-
• Oxidación de sustratos reducidos• Uso de fosforilación y transporte de electrones• Reducción disimilatoria de O2, NO3
-, Fe(OH)3, Mn(OH)4, SO4
2-, CO2
Material celular, macromoléculas, biomasa Recursos
ATP ATPIntercambio deenergía bioquímica
La La termodinámicatermodinámica predicepredice queque reaccionesreaccionesson son energéticamenteenergéticamente favorablesfavorables
Reactivos
Productos
Tipos de reacciónCambio de estadoDisolución/precipitaciónFormación de complejosReacción ácido/baseAdsorción/desorciónOxidación/reducciónOxidación/reducción
Reducción
Oxidación
A B A oxidado B reducido
ReaccionesReacciones redoxredox, , equilibrioequilibrio químicoquímicoyy energíaenergía librelibre
Reducción
Oxidación
moléculaorgánicacon 2H
NAD+ (carrierde electrones)
moléculaorgánicaoxidada
NADH + H+
(carrier de e-
reducido)
H+H+
ReaccionesReacciones redoxredox, , equilibrioequilibrio químicoquímicoyy energíaenergía librelibre
Las Las coenzimascoenzimas aumentanaumentan la la diversidaddiversidad de dereaccionesreacciones redoxredox posiblesposibles en en unauna célulacélula
La cantidad de energía que puede serliberada de 2 hemi-reacciones se puedecalcular a partir de la diferencia en lospotenciales de reducción de las 2reacciones y el número de electronestransferidos:
Zehnder, A.J.B. and W. Stumm. 1988. Geochemistry and biogeochemistry of anaerobic habitats.A.J.B. Zehnder (ed.) Biology of Anaerobic Microorganisms, pp. 1–38
PotencialPotencial de de reducciónreducción: : medidamedida de la de la tendenciatendenciaa a donardonar electroneselectrones en en sistemassistemas biológicosbiológicos
estadooxidado
estadoreducido
1. 1. TermodinámicaTermodinámica de la hemi- de la hemi-reacciónreacción
Respiración aeróbica -125
Desnitrificación -119
Reducción de manganeso -98
Reducción de hierro -42
Fermentación -27
Reducción de sulfato -25
Metanogénesis -23
Acetogénesis -22
ΔG0 (kJ/ec)Proceso
2. 2. PresenciaPresencia de de constituyenteconstituyentegeoquímicogeoquímico en el en el ambienteambiente
Respiración aeróbica -125
Desnitrificación -119
Reducción de manganeso -98
Reducción de hierro -42
Fermentación -27
Reducción de sulfato -25
Metanogénesis -23
Acetogénesis -22
ΔG0 (kJ/ec)Proceso
Aceptor terminalde electrones
Producto Microorganismo
Aeróbico
Anaeróbico
3. 3. FisiologíaFisiología de los de los microorganismosmicroorganismos
Distancia
Proceso dominante de aceptor terminal de electrones
+10
0
-10
AceptoresAceptores de de electroneselectrones
pE
Respiraciónaeróbica
O2
orgánicas
O2
SOSO44--
ReducciónReducción de de sulfatosulfato
SOSO44--
HH22SS
Metanogenesis
CO2
CH4
H2
Desnitrificación
NO3-
NONO33--
Reducción de Fe (III)
Fe (III)
Fe (II)
Especies químicas
Equi
vale
nte
s
ImpactoImpacto geoquímicogeoquímico de la de la respuestarespuesta a aunauna perturbaciónperturbación ambientalambiental
gas oil
ReaccionesReacciones redoxredox, , equilibrioequilibrio químicoquímicoyy energíaenergía librelibre
oxidación
reducción
-27.87 0 -744.6 -39.83
Energía libre de formación(de tablas)
TransducciónTransducción de de energíaenergía biológicabiológica
Los denominadores comunes en el metabolismo deenergía son ATP y los potentiales transmembrana
Fosforilación a nivel de sustrato
Respiración
Fotofosforilacion
Mecanismos para lageneración de ATP
La La conservaciónconservación de de energíaenergía estáestá ligadaligada a aun un estadoestado energizadoenergizado de la de la membranamembrana
Los transportadores de electrones estánorientados en la membrana de modo que amedida que los electrones sontransportados, los protones son separadosde los electrones
Potencial de reducción
+
DiversidadDiversidad catabólicacatabólica::quimio-organotrofosquimio-organotrofos
Flujo de carbonoFermentación
Flujo de carbonoen respiración
Comp orgánicosTransporte de e-Generación de pmf
Aceptores deelectrones
Respiración anaeróbica
Respiración aeróbica
Biosíntesis
aceptoresorgánicos
DiversidadDiversidad catabólicacatabólica::quimio-litotrofosquimio-litotrofos
Transporte de e-Generación de pmf
Aceptores deelectrones
Respiración anaeróbica
Respiración aeróbica
Biosíntesis
DiversidadDiversidad catabólicacatabólica::FotótrofosFotótrofos
Fotoheterótrofos
Compuestosorgánicos
Transportede electrones
Biosíntesis Biosíntesis
generación de pmfy poder reductor
Fotoautótrofosluz
Dadorde e-
EconomíaEconomía del del crecimientocrecimiento
glucólisis ciclodel
TCA
Los precursores, que son la fuente demonómeros para todos los componentescelulares, se originan en los pathwayscentrales: gucólisis y ciclo del ácidotricarboxílico (TCA)
Todos los sustratos ingresan en los pathwayscentrales luego de un número limitado dereacciones, para proveer al organismo con losmetabolitos precursores
bacteria
MetabolismoMetabolismo oxidativooxidativo
• Qué pasa con la energía?
• Qué pasa con la biomasa
ContaminantesContaminantesorgánicosorgánicos yynutrientesnutrientes((C,P,N,O,Fe,SC,P,N,O,Fe,S…………))
CrecimientoCrecimiento –– divisióndivisióncelularcelular
COCO22
consumoconsumo de O de O22
RespiraciónRespiración aeróbicaaeróbica
célula microbiana
fósforo
luz
calor
38 ATP
CH2OO2
CH2O
CO2
O2
CinéticaCinética de de crecimientocrecimiento
tasa de utilización desustrato
Máximo coeficiente decrecimiento microbiano
Tasa de crecimientoespecífica
Concentración debiomasa activa
EfectoEfecto de la de la concentraciónconcentraciónde de sustratosustrato
Constante desaturación
Máxima tasa decrecimiento específica
Crecimiento debiomasa activa
Máxima tasa específica deutilización de sustrato
CrecimientoCrecimiento netoneto
Coeficiente dedecaimiento
Bodegom, Microb Ecol 2007, Vol. 53
Crecimiento en 3-Cl benzoato
SignificadoSignificado del del coeficientecoeficientede de decaimientodecaimiento bb
Por definición:
cuando
Smin es un parámetro cinético independiente de la configuración del reactor
Que pasa cuando b = 0?
La existencia de un Smin es consecuencia de decaimiento y mantenimiento microbiano
La mínima concentración de sustrato que se puede lograr en un sistema aumenta con b
RepresentaciónRepresentación genómicagenómica: : quéqué son, son,queque hacenhacen, de , de dondedonde vienenvienen??
Nelson, K.E., et al., 2002. Complete genome sequence and comparative analysis of the metabolically versatile Pseudomonas putidaKT2440. Environ. Microbiol. 4:799–808.
ConclusionesConclusiones extraídasextraídas de los de losgenomasgenomas bacterianosbacterianos
Nelson, K.E., et al., 2002. Complete genome sequence and comparative analysis of the metabolically versatile Pseudomonas putidaKT2440. Environ. Microbiol. 4:799–808.
1. Correspondencia entre el tamaño del genoma y número deORF
2. Cepas de la misma especie pueden tener variado genotiposy fenotipos
3. Diversidad en el tamaño
Cuanto conocemos de labiología de procariotas?
Almacenamientoy procesamientode información
Metabolismo Funciones nocaracterizadas
Procesoscelulares
Optimización de compuestos bioactivosa lo largo de la evolución
3.8×109
años
interacción depresiones selectivas
evolución tiempo
habitat Microorganismos
Bacterias Arqueas Eucariotes
Diversidad
fisiológica
ImportanciaImportancia del del cultivocultivo en en laboratoriolaboratorio
Bioprospección
Fisiologíaen cultivo
Secuenciadel genoma
Metagenómica Pre-genómica
Post-genómica
Elementos mayoritarios encélulas microbianas
Elemento FunciónC
O
H
N
S Proteínas, coenzimas
P Acidos nucleicos, fosfolípidos, ácido tecoico, coenzimas
K Principal catión inorgánico, cofactor enzimático
Mg Cofactor enzimático, unido a pared celular, membrana yésteres de fosfato, incluído ácidos nucleicos y ATP
Ca Cofactor enzimático, unido a pared celular
Fe Citocromos, ferredoxina, proteína Fe-S, cofactor enzimático
Na Transporte y transducción de energía
Cl Principal anión inorgánico
Constituyentes principales de las
células en las macromoléculas y
otras moléculas orgánicas
Elementos minoritarios:cofactores
Elemento Función
Mn2+ Superóxido dismutasa, fotosistema II
Co2+ Coenzima B12
Ni2+ Hidrogenasa, ureasa
Cu2- Citocromo oxidasa, oxigenasa
Zn2+ Alcohol deshidrogensa, aldolasa, fosfatasa alcalina,RNA y DNA polimerasa, arsenato reductasa
SeO32- Formato deshidrogenasa, glicina reductasa
MoO42- Nitrogenasa, nitrato reductasa, formato
deshidrogenasa, arsenato reductasa
WO42- Formato deshidrogenasa, aldehído oxidoreductasa
TemperaturaTemperatura
Ecuación de Arrhenius
Coeficiente de temperatura Q10
Relación de las velocidades de reacción a 2 temperaturasT2 y T1, con T2 =T1 +10
OxígenoOxígeno
Aerobios Facultativos Anaerobios Anaerobiosaerotolerantes Microaerófilos
CatalasaSuperoxido dismutasa
SOD-
UnaUna clasificaciónclasificación ecológicaecológica de debacteriasbacterias
Acidobacteria
Betaproteobacteria
Bacteroidetes
oligotrofos
copiotrofos
EstrategiasEstrategias de de vidavida: 2 : 2 extremosextremos de un de uncontinuocontinuo
K
r
Crecimientoexponencial
Crecimientologístico
Número de generaciones
Tam
año
de p
obla
cion
es (N
)
TriadaTriada de de supervivenciasupervivencia
Panikov, N.S. Microbial Ecology en Environmental Biotechnology (2010) Wang, L.K., Ivanov, V., Tay, J.H. Hung,Y.T. eds. Humana Press
EnriquecimientoEnriquecimiento selectivoselectivo comocomo mecanismomecanismode de adaptaciónadaptación en en biotecnologíabiotecnología ambientalambiental
Alta tasa de crecimientoAlta afinidad por sustrato limitante
Los Los microorganismosmicroorganismos ““no no cultivablescultivables””““The great plate count anomalyThe great plate count anomaly””
Staley, J. T., and A. Konopka. 1985. Measurements of in situ activities of nonphotosynthetic microorganisms in aquatic andterrestrial habitats. Annu. Rev. Microbiol. 39:321-346.
Achtman M, Wagner M (2008) Microbial diversity and the genetic nature of microbial species. Nat Rev Microbiol 6:31–440
Los Los microorganismosmicroorganismos ““no no cultivablescultivables””The great plate count anomalyThe great plate count anomaly
PorPor quéqué los los microorganismosmicroorganismos se seresistenresisten a a crecercrecer en en cultivocultivo??
(i) El cultivo en el laboratorio destruye interacciones presentesen ambientes naturales
(ii) Incapacidad de crecer sobre sustratos del medio de cultivo
(iii) Infecciones por fagos
(iv) La alta concentración de sustrato necesaria para obtenercrecimiento detectable en el laboratorio puede ser tóxica
(v) Las prácticas de laboratorio suelen ignorar los primerosciclos de crecimiento en medio líquido que aparentemente nomuestran crecimiento, debido a la falta de buenos métodosde detección de densidad celular y falta de paciencia
El El crecimientocrecimiento microbianomicrobiano puedepuede determinarsedeterminarsesin el sin el usouso de de técnicastécnicas molecularesmoleculares
Zengler, K. Central Role of the Cell in Microbial Ecology (2009) Microbiol Mol Biol Rev, 73: 826-834
EfectoEfecto del del mediomedio de de cultivocultivo yy del deltiempotiempo de de incubaciónincubación
Davis et al., Effects of Growth Medium, Inoculum Size, and Incubation Time on Culturability and Isolation of Soil Bacteria (2005)Appl Environ Microbiol, 71, 826–834
Gellan como agente solidificante:
UsoUso de de aceptoraceptor de de electroneselectronesalternativosalternativos
Kopke et al., Microbial Diversity in Coastal Subsurface Sediments: a Cultivation Approach Using Various Electron Acceptors andSubstrate Gradients (2005) Appl Environ Microbiol, 71, 7819-7830
Costa del Mar de NorteAlta eficiencia de cultivo: 23% del número total de células
en los 2 m superficiales
UsoUso de de aceptoraceptor de de electroneselectronesalternativosalternativos: : reductoresreductores de de sulfatosulfato
Widdel et al., Anaerobic degradation of hydrocarbons with sulphate as electron acceptor (2007) en Sulphate Reducing Bacteria,Barton & Hamilton, eds. Cambridge
UsoUso de de aceptoraceptor de de electroneselectronesalternativosalternativos: : sedimentossedimentos anóxicosanóxicos
Zengler et al., Methane formation from long-chain alkanes by anaerobic microorganisms (1999) Nature, 401, 266
UsoUso de de compuestoscompuestos queque median mediancomunicacióncomunicación entre entre bacteriasbacterias
Ver también Bruns et al., Effect of Signal Compounds and Incubation Conditions on the Culturability of Freshwater Bacterioplankton(2003) Appl Environ Microbiol, 69, 1980–1989
Monómero/óxico Polímero/óxico
Polímero/anóxicoMonómero/anóxico
OHHL: N-(oxohexanoyl)-dl-homoserine lactone
BHL: N-(butyryl)-dl-homoserinelactone
cAMP: AMP cíclico
Bruns et al., 2002
CultivoCultivo yy deteccióndetección de demicroorganismosmicroorganismos
• Mínima cantidad de nutrientes• Incubaciones largas (30d)• Protección de peróxidos• Ácidos húmicos• QS (AHL)
• aeróbico• 1-2% O2• anóxico• 5% CO2
Stevenson et al., New Strategies for Cultivation and Detection of Previously Uncultured Microbes (2004) Appl Environ Microbiol, 70,4748-4755
CultivoCultivo yy deteccióndetección de demicroorganismosmicroorganismos
Stevenson et al., New Strategies for Cultivation and Detection of Previously Uncultured Microbes (2004) Appl Environ Microbiol, 70,4748-4755
CultivoCultivo yy deteccióndetección de demicroorganismosmicroorganismos
Stevenson et al., New Strategies for Cultivation and Detection of Previously Uncultured Microbes (2004) Appl Environ Microbiol, 70,4748-4755
CultivoCultivo de de microorganismosmicroorganismos en enmicrogotasmicrogotas encapsuladasencapsuladas en gel en gel
Zengler et al. Cultivating the uncultured(2002) PNAS 99: 15681-15686
suspensión aceite-bacteria en hielo con a 1,100 rpm
107 microgotas de gel (GMDs)10% ocupadas por una única célula encapsulada
Dilución de células agarosa (40°C).
2,200rpm
+
CultivoCultivo de de microorganismosmicroorganismos en enmicrogotasmicrogotas encapsuladasencapsuladas en gel en gel
Zengler et al. Cultivating the uncultured(2002) PNAS 99: 15681-15686
CultivoCultivo de de microorganismosmicroorganismos en enmicrogotasmicrogotas encapsuladasencapsuladas en gel en gel
Zengler et al. Cultivating the uncultured(2002) PNAS 99: 15681-15686
CultivoCultivo de de microorganismosmicroorganismos GMDsGMDsproblemasproblemas yy solucionessoluciones
Alain, K., Querellou, J. (2009) Cultivating the uncultured: limits, advances and future challenges. Extremophiles, 13, 583–594
CultivoCultivo de de microorganismosmicroorganismos marinosmarinosen en cámarascámaras de de difusióndifusión
Kaeberlein et al., Isolating “Uncultivable” Microorganisms in Pure Culture in a Simulated Natural Environment (2002) Science, 70,1127-1129
agar
membrana sedimento
La mayoría es invisible a simple vistaLa mayoría no crece luego de 2-3 pasajes
CultivoCultivo de de microorganismosmicroorganismos marinosmarinosen en cámarascámaras de de difusióndifusión
Bollmann et al. Incubation of Environmental Samples in a Diffusion Chamber Increases the Diversity of Recovered Isolates (2007)Appl Environ Microbiol, 73, 6386–6390
Los mútiples pasajes en cámaras de difusión permiten la adaptación al cultivo in vitro
CámarasCámaras de de difusióndifusión en en formatoformatomasivomasivo: : ““IchipIchip””
Nichols et al. Use of Ichip for High-Throughput In Situ Cultivation of “Uncultivable” Microbial Species (2010) Appl Environ Microbiol,76, 2445–2450
OtrosOtros métodosmétodoscon con membranasmembranas
Ferrari et al Cultivating previously uncultured soil bacteria using a soil substrate membrane system (2008) Nature Protocols 3,1261-1264
Microplaca de Petri: un millón decámaras de cultivo
óxido dealuminio poroso
7 x 7µm
Ingham et al. (2007) The micro-Petri dish, a million-well growth chip for the culture and high-throughput screening ofmicroorganisms. PNAS 104, 18217–18222
Microplaca de Petri: un millón decámaras de cultivo
Ingham et al. (2007) The micro-Petri dish, a million-well growth chip for the culture and high-throughput screening ofmicroorganisms. PNAS 104, 18217–18222
chip de 8x36 mmrecubierto en Pt 180.000 cámaras20µm x 20µm
Los chips Los chips puedenpueden ser ser utilizadosutilizados parapararecuentorecuento de UFC de UFC
Ingham et al. (2007) The micro-Petri dish, a million-well growth chip for the culture and high-throughput screening ofmicroorganisms. PNAS 104, 18217–18222
Imagen de microscopio invertido mostrando elcrecimiento de L plantarum (círculos claros) encámaras de 20 x 20 µm
Screening de 200.000 Screening de 200.000 aislamientosaislamientosbasadosbasados en el en el metabolismometabolismo de un de un
organofosforadoorganofosforado
Ingham et al. (2007) The micro-Petri dish, a million-well growth chip for the culture and high-throughput screening ofmicroorganisms. PNAS 104, 18217–18222
fluorescein 3,6-diphosphate fluoresceina
1. Incubación 6 días
2. Recuento: 200.000 c
3. Screening
4. Identificación
“Ley de Moore” de duplicación del númerode transistores en un circuito integrado
Duplica cada 18 meses Ley de Moore Procesador Intel
““LeyLey de Moore de Moore”” parapara la la miniaturizaciónminiaturización de decultivoscultivos microbianosmicrobianos
Gefen & Balaban (2010) The Moore’s Law of microbiology – towards bacterial culture miniaturization with the micro-Petri chip.Trends in Biotechnology 26 , 345-347
Se aplica al volumen de cultivo pero noal número de aislamientos obtenidos!
CultivoCultivo de de ““no no cultivablescultivables””: : resumenresumende de estrategiasestrategias
Alain, Querellou (2009) Cultivating the uncultured: limits, advances and future challenges. Extremophiles 13:583
CultivoCultivo de de ““no no cultivablescultivables””::estrategiasestrategias futurasfuturas
Williamson et al. (2005) Intracellular Screen to Identify Metagenomic Clones that Induce or Inhibit a Quorum-Sensing Biosensor ApplEnviron Microbiol 71: 6335-6344
• Descubrimiento de autoinductores en análisis metagenómicos
LuxR: activador de transcripión
METREX: metabolite-regulated expression
BibliografíaBibliografía adicionaladicional
McMahon, K.D., Garcia Martin, K.D., Hugenholtz, P. (2007) Integratingecology into biotechnology. Current Opinion in Biotechnology, 18: 287–292
Rittmann, B.E. et al. (2006) A Vista for Microbial Ecology and EnvironmentalBiotechnology. Environmental Science and Technology, 40, 1096–1103