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DIVISIÓN DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALÚD
TESIS
Especialización en Biotecnología
Departamento de Biotecnología
“Estimación de la capacidad antioxidante de ácidos
hidroxicinámicos obtenidos de la pulpa de café”
PESENTA
IBI. Miguel Angel Arellano González
COMITÉ TUTORIAL
Director: Dr. J. Gerardo Saucedo Castañeda
Asesora: Dra. Ma. Ascención Ramírez Coronel
México D.F 3 de Agosto 2009
iii
I. Resumen
Este trabajo tuvo como propósito evaluar la capacidad antioxidante de la pulpa de café, así
como evaluar las diferencias de esta capacidad, en los extractos de la pulpa antes y después de
ser fermentada con Aspergillus tamarii.
En una primera etapa, a 10 gramos de pulpa no fermentada y a la pulpa de café no fermentada
se les realizaron extracciones con una mezcla de metanol: agua (80:20) seguida de una hidrólisis
alcalina con NaOH 2M y de una concentración de los ácidos hidroxicinámicos en acetato de etilo.
Posteriormente cada uno de los extractos fue analizado por su contenido en: a) Compuestos
fenólicos (libres, esterificados y totales), b) Azúcares Totales, c) Capacidad antioxidante por el
método del ABTS (radical 2,2-azinobis-3(-etilbenzotiazolin-6-sulfonato)). Por otra parte, se
determinó la cantidad de ácidos hidroxicinámicos en cada uno de los extractos por HPLC,
calculando así la capacidad antioxidante de cada uno de los extractos obtenidos de la pulpa de
café fermentada y no fermentada. Se observó una disminución en la cantidad de compuestos
fenólicos totales en la pulpa de café fermentada comparada con la pulpa de café no fermentada
inicial.
La capacidad antioxidante fue estimada por diferentes formas: a) Porcentaje de inhibición de
color, b) Equivalentes trólox y c) Con parámetros cinéticos conocidos como dosis eficiente
cincuenta (ED50), Tiempo eficiente (TED50) y Eficiencia antiradical (E.A), los cuales dan una
relación entre la cantidad de antioxidante y el tiempo de reacción. Se decidió estudiar el ED50,
TED50, y E.A de los extractos y estándares de referencia. Los resultados muestran que, existe una
relación directa entre el tipo de molécula que reduce el ABTS•+, con la capacidad antioxidante.
Podemos señalar que la cantidad total de compuesto fenólicos no es la única variable
relacionada con la capacidad antioxidante, sino que es el tipo de molécula antioxidante y su
concentración lo que interactúa directamente con el radical y el medio donde se encuentra. Al
comparar la capacidad antioxidante de la pulpa de café fermentada de la no fermentada
podemos concluir que; los extractos de pulpa de café fermentada presenta una mejor capacidad
antioxidante a pesar de que contiene menor cantidad de compuestos fenólicos totales. Aunque
el contenido de polifenoles es mayor en la pulpa no fermentada es interesante notar que la
pulpa de café fermentada presenta un aumento considerable en la concentración de polifenoles
libres debida a la acción enzimática de Aspergillus tamarii sobre la pared celular y que a su vez
parte de estos ácidos hidroxicinámicos liberados son metabolizados por el mismo hongo.
iv
II. Agradecimientos
Quiero agradecer al Dr. Jesús Gerardo Saucedo-Castañeda en relación a mi trabajo de
especialidad, por sus comentarios oportunos y apoyo en la realización de este trabajo de
especialidad. Así mismo, a la Dra. Ascención Ramírez-Coronel, por brindarme todo el apoyo en el
trabajo experimental y sus acertados comentarios.
Agradezco también a los compañeros de la planta piloto 4, por el apoyo y amistad que he
recibido durante la duración de mis estudios (Ricardo, Rodrigo, Daniel, Blanca, Gladys, Oswaldo,
Ruth y Caro).
A la pandilla, que siempre me apoyaron para seguir con los estudios de posgrado y que han
estado conmigo en las buenas y en las malas (Luis, César, Cabello, Víctor, Julio, Abraham y
Matías).
Doy gracias a mis padres, que a pesar de todo siempre me han apoyado en todas las decisiones
que he tomado tanto buenas como malas y siguen conmigo. Especialmente a mi mamá, que
siempre me cuida y se preocupa para que siga adelante y sea un hombre de bien.
I. Resumen Iii
II. Agradecimientos Iv
1. Introducción
1
2. Revisión Bibliográfica
3
2.1 La pulpa del café
4
2.2. Composición Química de la pulpa del café
5
2.3. Los compuestos fenólicos
6
2.4. Extracción de polifenoles de la pulpa del café
8
2.5. Métodos para la obtención de la capacidad antioxidante
10
2.5.1. Método del ABTS y formas de expresar la capacidad antioxidante
11
2.5.1.1. Disminución de color
13
2.5.1.2. Equivalentes trolox (mM)
14
2.5.1.3. Parámetros cinéticos de la capacidad antioxidante
16
2.5.1.3.1. Dosis eficiente 50 (ED50)
16
2.5.1.3.2. Tiempo eficiente 50 (TED50)
18
2.5.1.3.3. Eficiencia Antiradical (EA=1/ED50*TED50)
18
3. Justificación
20
4. Objetivos
22
4.1. Objetivo General
22
4.2. Objetivos Particulares
22
ii
5. Materiales y Métodos
23
5.1. Diagrama de Bloques
26
5.2. Origen de la pulpa del café
27
5.3. Preparación de la pulpa del café
27
5.4. Porcentaje de humedad
27
5.5. Extracciones
27
5.5.1. Extracción con hexano
27
5.5.2. Extracción metanol agua 80:20, v/v
28
5.5.3. Hidrólisis alcalina
28
5.5.4. Purificación de ácidos hidroxicinámicos con acetato de etilo
28
5.6. Métodos analíticos
29
5.6.1. Medición de Azúcares totales
29
5.6.2. Estimación de Polifenoles totales
29
5.6.3. Estimación de la capacidad antoxidante
30
5.6.3.1. Obtención del ED50
30
5.6.3.2. Obtención del TED50
31
5.6.3.3. Estimación de la eficiencia antiradical
31
5.6.4. Cuantificación ácidos hidroxicinámicos por HPLC
32
6. Resultados y Discusión
34
iii
6.1. Porcentaje de humedad de la pulpa del café inicial
35
6.2. Azúcares totales de la pulpa no fermentada y de pulpa de café fermentada
35
6.3. Compuestos fenólicos totales de la pulpa de café no fermentada y de la
pulpa fermentada
36
6.4. Espectros de absorción del ABTS
37
6.4.1. Estabilidad del ABTS
39
6.4.2. Capacidad antioxidante de compuestos de la pulpa del café
40
6.4.3. Capacidad antioxidante en equivalentes trolox
41
6.4.4. Parámetros cinéticos de la capacidad antioxidante de moléculas
estándar
44
6.4.5. La capacidad antioxidante de los extractos fenólicos de la pulpa del
café
51
6.4.5.1. Pulpa de café no fermentada vs pulpa de café fermentada
51
6.5. Recuperación de ácidos hidroxicinámicos con acetato de etilo
54
7. Conclusiones
57
8. Perspectivas
60
9. Bibliografía
62
10. Anexos
60
A. Preparación de curva patrón de azúcares totales
69
B. Preparación de curva patrón de polifenoles totales
72
iv
C. Curvas patrón de capacidad antioxidante de trolox, ácido ferúlico y acido
clorogénico por el método de ABTS
75
D. Obtención de parámetros cinéticos para la capacidad antioxidante
79
E. Cálculo del TED50
83
1
INTRODUCCIÓN
2
1. INTRODUCCION
En México el tratamiento de residuos agro-industriales puede evitar problemas fuertes de
contaminación. Uno de estos productos es la pulpa de café que se ha utilizado como
suplemento de alimentación en ganados, debido a que es rica en proteínas, pectinas sin refinar,
azúcares y antioxidantes naturales. Dentro de este tipo de moléculas se encuentran los ácidos
hidroxicinámicos, los cuales son considerados ácidos fenólicos simples. Los ácidos fenólicos
simples poseen un solo anillo aromático. Entre los principales encontramos al ácido ferúlico,
ácido caféico, ácido p-cumárico, ácidos sinápico y ácido clorogénico. Estos compuestos son
abundantes en los vegetales, tales como las manzanas, hojas de té, uvas, ciruelas y en el grano
del café. Clifford (1999) encontró que los ácidos ferúlico, y p-cumárico, se encuentran libres y
esterificados a los polisacáridos de la pared celular de las plantas, en tanto que el ácido caféico
se encuentra formando ésteres con el ácido quínico o con otros hidroxicinamatos (ferúlico y p-
cumárico), los cuales forman el grupo de los ácidos clorogénicos. Latif et al, 1999, encontró que
una gran cantidad de compuestos polifenólicos poseen capacidad antioxidante. Los
antioxidantes son compuestos capaces de donar rápidamente un átomo de hidrógeno a una
molécula oxidada o en peligro de oxidación transformándola en un producto estable. La
importancia de un antioxidante depende de su concentración, del medio donde actúa y de su
habilidad para interaccionar con sistemas regeneradores de radicales libres. Un radical libre es
cualquier especie que contiene uno o más electrones desapareados. Este busca a toda costa
otro electrón para poder aparearse. En la intensa búsqueda, estos radicales libres son
extremadamente reactivos. Para saber si un compuesto tiene capacidad antioxidante, existen
ensayos con los cuales se puede estimar la capacidad antioxidante. Uno de los métodos es la
peroxidación de lípidos y el otro, es por medio de la captura de radicales libres (Sánchez-Moreno
y Larrauri, 1998). Dentro de los ensayos de captura de radicales libres tenemos los siguientes:
Captura de peróxido de hidrógeno, captura de radicales (–OH), método DPPH (Secuestro del
radical estable 2,2-difenil-1-picrilhidrazil) y el método ABTS o método del TEAC (Capacidad
antioxidante en equivalentes trolox). En este trabajo estimamos la capacidad antioxidante
extractos fenólicos de la pulpa de café no fermentada y fermetada, con el propósito de
otorgarle un valor agregado. Hemos utilizado la técnica del ABTS tanto para la disminución de
color como para calcular los equivalentes trolox y parámetros cinéticos.
3
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
4
2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.1 La pulpa de café
La pulpa del café es un material de desecho que procede de la industria del café. En las
publicaciones citadas (Rathinavelu y Graziosi, 2005) llegan a la conclusión de que la pulpa del
café puede reemplazar hasta un 20% de los concentrados comerciales en la alimentación del
ganado lechero, sin efectos perjudiciales y con un ahorro del 30%. Los resultados generales de
los estudios de alimentación realizados con cerdos indicaron que, el grano de cereales puede ser
sustituido por pulpa deshidratada de café en hasta un 16% de la ración total, sin ningún efecto
perjudicial con respecto al aumento de peso o a la conversión del pienso. Eso significa que al
final del período establecido, cada cerdo criado ha dejado cerca de 50 kg de grano de cereales
disponible para consumo humano u otros usos alternativos (Rathinavelu y Graziosi, 2005).
Además de hacerse con cerdos, los experimentos de alimentación con pulpa de café se hicieron
con peces, pollos, corderos y conejos. En esos experimentos de alimentación se determinó el
aumento diario del peso corporal y se midieron la toma diaria de materia seca y la eficiencia de
conversión de la alimentación. En los cerdos alimentados con raciones que contenían hasta un
15% de pulpa de café ensilada con un 5% de melaza se observó un aumento de peso igual o
mejor que en los alimentados con concentrados comerciales (Rathinavelu y Graziosi, 2005).
De los residuos industriales del café pueden obtenerse, en distintos estados de pureza, los
siguientes tipos de sustancias:
• Pectinas sin refinar
• Azúcares naturales del fruto del café
• Compuestos antioxidantes y flavonoides
• Proantocianidinas incoloras
Los subproductos del café tienen muchas propiedades medicinales. Se enumeran a continuación
algunas de ellas:
• Fibra soluble dietética
5
• Propiedades de intercambio de cationes
• Antioxidantes
2.2 Composición química de la pulpa de café
La composición química de la pulpa de café varía de acuerdo a diferentes factores: variedad,
tipo de suelo, madurez, prácticas de cultivo, etc. La composición de la pulpa de café (6-12 %
humedad) ha sido reportado por varios autores. Bressani y Braham (1980) reportan el siguiente
contenido (%): compuestos de la pared celular, 36.8; celulosa, 17.7; lignina, 17.5; cenizas, 8%; y
cafeína, 1.3 % y Barreto-Castro (2001) señala que 65.1 % de los compuestos son carbohidratos y
12.8 % es fibra cruda. Labat et al (2000) reportan la composición de los compuestos fenólicos de
la pulpa de café fresca (%): ácido caféico, 3.1; ácido clorogénico o ácido cafeolquínico, 2.7-0,36;
ácido ferúlico, 0.1; catequina y epicatequina, 4.0-0,2 y taninos 8.6-1.8. Cabe destacar, que las
concentraciones reportadas deben multiplicarse al menos por un factor de 5 al ser expresadas
en base seca.
Recientemente investigadores de nuestro grupo (Ramírez-Coronel et al 2004), encontraron 37.9
y 32.6 g/kg de compuestos fenólicos en pulpa de café fresca y secada al sol durante 3 días; de
los cuales los ácidos hidroxicinámicos representan el 52.7 y 49 %, respectivamente. La diferencia
está representada por las proantocianidinas, polímero de catequina, que puede ser hidrolizado
enzimáticamente a ácido protocatecoico y posteriormente modificado en ácido caféico,
convirtiéndose en otra fuente potencial de precursores de la vainillina.
Los ácidos ferúlico, p-cumárico y caféico se encuentran libres y esterificados a los polisacáridos
de la pared celular de las plantas. El ácido caféico, también se encuentra formando ésteres con
el ácido quínico, y se conoce como el grupo de los ácidos clorogénicos (Clifford, 1999).
No obstante los avances recientes, el análisis de los compuestos fenólicos es complejo y las
cifras reportadas varían considerablemente. Finalmente, el análisis de la información de la
literatura sugiere que la pulpa de café puede ser un sustrato adecuado para la obtención de
enzimas del tipo cinamoil esterasa y de esta manera, liberar los ácidos hidroxicinámicos de la
pared celular de la pulpa del café, mediante reacción enzimática y sin uso de solventes (Pérez
Morales, 2008).
6
A continuación se describirá la estructura de los compuesto fenólicos y porque se dice que
tienen propiedades antioxidantes.
2.3 Los compuestos fenólicos
El término fenólicos es empleado para definir aquellos compuestos que poseen uno o más
grupos hidroxilo (OH) como sustitutos en un anillo aromático (Waterman, 1994), los cuales son
abundantes en los vegetales, como manzanas, café, uvas, ciruelas y en las hojas de té, entre
otros. Estos compuestos se clasifican en tres grupos: Ácidos fenólicos simples, derivados,
flavonoides y fenoles poliméricos. Pueden clasificarse dependiendo del número de carbonos
(Cn) que contenga la cadena lateral, su representación es C6Cn. Entre los principales grupos se
encuentran los derivados de los ácidos benzoicos (C6-C
1) y los ácidos hidroxicinámicos (C
6-C
3).
Dentro de los ácidos hidroxicinámicos está el ácido ferúlico (4-hidroxi-3-metoxicinámico), el
ácido caféico (3,4-dihidroxicinámico), el ácido p-cumárico (4-hidroxicinámico) y sinápico (4-
hidroxi-3,5-dimetoxicinámico), éste último no se encuentra presente en la pulpa del café. En la
figura 1 se observan las estructuras de algunos ácidos hidroxicinámicos.
7
Figura 1. Estructura de los ácidos hidroxicinámicos
Una gran cantidad de compuestos polifenólicos son antioxidantes. La oxidación es un proceso
auto- catalítico de reacción en cadena. Los antioxidantes son capaces de donar rápidamente un
átomo de hidrógeno a la molécula en peligro de oxidación transformándola en un producto más
estable (Latif et al, 1999). En la industria alimentaria, se utilizan antioxidantes sintéticos como el
hidroxibutiltolueno (BHT), el hidroxibutilanisol (BHA) y el polietilenglicol (PG) para reducir los
procesos oxidativos. Sin embargo, su uso es objeto de serias discusiones en relación con los
efectos tóxicos y carcinogénicos que provocan. Por el contrario, las tendencias actuales se
orientan a la utilización de antioxidantes como ácidos hidroxicinámicos (ferúlico, caféico, p-
cumárico y sinápico) provenientes de fuentes naturales (Auerbach y Gray, 1999).
Las células utilizan una serie de enzimas para atrapar O2
y H2O2 p.ej., superóxido dismutasa,
catalasa y glutatión peroxidasa, además emplean compuestos antioxidantes captadores de
radicales libres como son: vitamina E, vitamina C, beta carotenos y compuestos fenólicos.
8
Dentro de ellos cobran especial importancia los compuestos fenólicos y flavonoides extraídos de
determinados alimentos. Su acción dependerá de la interacción directa de la especie reactiva
para formar complejos de menor reactividad, mientras que, en otras ocasiones actúa como un
co-substrato en la acción catalítica de las enzimas (Couteau et al, 2001).
En el organismo, se produce un equilibrio entre oxidantes/antioxidantes, cuando este equilibrio
se rompe a favor del oxidante se produce un estrés oxidativo, el cual está implicado en muchos
procesos fisiopatológicos. Por eso, es de vital importancia consumir alimentos que contengan
antioxidantes naturales o suministrar a nuestro organismo un consumo diario de estos
compuestos y que así se pueda mantener el equilibrio entre oxidantes/antioxidantes, e incluso
esté a favor de la concentración de antioxidantes (Barreto-Castro, 2001).
Los compuestos fenólicos, tienen capacidad de inhibir mutaciones bacterianas y tienen la
capacidad de actuar como donadores de hidrógenos y de atrapar iones metálicos, inhiben la
oxidación de lipoproteínas las cuales están implicadas en la patogénesis de enfermedades
coronarias. Poseen actividad anti-carcinogénica actuando como inhibidores en procesos
cancerígenos.
Las aplicaciones de los polifenoles en la industria alimentaria, es de que pueden dar a los
alimentos una vida útil más prolongada ya que los protege de frente al deterioro oxidativo y sus
posibles efectos benéficos en los humanos y animales. Estudios recientes, sugieren que el
consumo regular de esos alimentos ricos en polifenoles, reducen el riesgo de enfermedades
asociadas al daño oxidativo, como las enfermedades cardiovasculares y el cáncer.
2.4 Extracción de polifenoles de la pulpa del café
Existen dos formas de obtener los ácidos hidroxicinámicos a partir de la pulpa de café: a) La
primera es realizar extracciones con disolventes de diferente polaridad, con lo cual se extraen
compuestos fenólicos no ligados a la pared (Ramírez-Coronel et al 2004) y b) la segunda, es
utilizar enzimas (tipo cinamoil esterasas) que liberen los ácidos hidroxicinámicos ligados a la
pared (Clifford 1999). El primer caso ha sido desarrollado por investigadores de nuestro grupo,
donde una vez eliminadas las ceras, se realizan extracciones sucesivas con disolventes polares
como acetona, alcohol y agua (Ramírez-Coronel et al 2004). Los diferentes disolventes son
9
eliminados y los extractos se fraccionan por cromatografía obteniendo compuestos que pueden
ser utilizados para producir enzimas para la biotransformación de ácidos hidroxicinámicos en
precursores de la vainillina. En el segundo caso, los ácidos hidroxicinámicos se encuentran
esterificados a diferentes polisacáridos (arabinoxilanos, xiloglucanos y pectina) los cuales han
sido reportados (Ishii y Hiroi, 1990). La producción de esterasas para romper estos enlaces ha
sido investigada con gran interés durante los últimos años (Faulds y Williamson 1999). Las
esterasas tienen la característica de ser inducibles y excretadas al medio. Por ejemplo, las
cinamoil ácido esterasas son enzimas del tipo carboxil éster hidrolasas, su número de
clasificación es EC 3.1.1.1. Estas enzimas pueden también hidrolizar un pequeño número de
ésteres de ácidos hidroxicinámicos, como el ácido clorogénico, formado por la unión de los
ácidos caféico y quínico. Las enzimas tipo cinamoil esterasas han sido purificadas y
caracterizadas a partir de los cultivos de cepas fúngicas (Tenkanen et al 1991, Borneman et al
1992, Faulds y Williamson 1993) y de cepas bacterianas (Couteau et al 2001). Estudios recientes
en el laboratorio, han demostrado la producción de extractos enzimáticos con actividad feruloil
esterasas por fermentación en medio solido de cepas de Aspergillus tamarii y de Rhizomucor sp,
utilizando como substrato pulpa de café y están siendo utilizadas en la liberación de ácidos
hidroxicinámicos ligados a la pared celular de la misma (Pérez Morales, 2008 y Torres-Mancera
2008).
Se ha hablado del método de hidrólisis enzimática para realizar las extracciones de polifenoles
que se encuentran esterificados o ligados en la pared celular de la pulpa de café u otros tipos de
plantas que poseen este tipo de compuestos químicos. Otro método utilizado para extraer los
polifenoles que se encuentran esterificados a los polisacáridos de la pared celular de las plantas
en especifico la pulpa de café son los dos tipos de hidrólisis química que se conocen la hidrólisis
alcalina e hidrólisis ácida. Dónde, dependiendo de cada tipo de hidrólisis que se realiza se tendrá
una diferencia de cantidad de compuestos liberados, ya que una hidrólisis ácida es más afín a
enlaces éter, mientras que la hidrólisis alcalina es específica para enlaces esteres. Urbaneja y
colaboradores en 1997, realizaron una hidrólisis ácida para la obtención y cuantificación de los
azúcares de la pulpa de café. Dentro de nuestro grupo, se ha utilizado la extracción alcalina para
liberar los polifenoles y azúcares de la pulpa de café (Torres-Mancera 2008).
A continuación se hace una revisión de los diferentes métodos para la obtención o medición de
capacidad antioxidante.
10
2.5 Métodos utilizados para la obtención de la capacidad antioxidante.
La generación de radicales libres está relacionada directamente con la oxidación de sistemas
biológicos y de alimentos, por lo tanto es de gran importancia la búsqueda de métodos para la
determinación de secuestro de radicales libres.
Los cuales se basan en ensayos químicos con sustratos lipídicos o ensayos más complejos para
medir la capacidad antioxidante total de fluidos y muestras biológicas por medio de captura de
radicales libres. En el caso de los alimentos es necesaria la determinación de la eficacia de su
naturaleza antioxidante para la protección de estos alimentos con agentes antioxidantes
(Halliwell et al., 1995). Los métodos podrían usarse como herramienta para la selección de
diferentes especies, variedades y condiciones de cultivo con naturaleza antioxidante (Fogliano et
al., 1999; Leonardi et al., 2000).
En el caso de sistemas biológicos el estrés oxidativo y el balance de las reacciones con especies
oxigenadas deben defenderse y repararse con sistemas antioxidantes. La determinación del
antioxidante en sistemas biológicos podría contribuir a la prevención y evaluación de la
oxidación. Se pueden clasificar las pruebas para alimentos y sistemas biológicos en dos grupos:
el primero es la evaluación de la peroxidación de lípidos con sustratos lipídicos o de
lipoproteínas bajo condiciones estándares. El segundo grupo se basa en la captura de radicales
libres viables (Sánchez-Moreno and Larrauri, 1998). Para sustratos en sistemas con composición
diferentes, se necesita de métodos analíticos donde son empleadas las pruebas de secuestro de
radicales para evaluar la efectividad antioxidante. La metodología para evaluar los antioxidantes
naturales son interpretados de acuerdo a los sistemas y al método analítico que se utiliza
(Frankel, 1993; Arnao et al., 1999; Fogliano et al., 1999; Frankel and Meyers, 2000).
La captura de radicales libres es el método más utilizado para medir la capacidad antioxidante
en extractos vegetales, por lo que son los más reportados en la literatura.
Mencionaremos los diferentes métodos para la obtención de la capacidad antioxidante por
secuestro de radicales libres:
11
• Secuestro de radicales superóxidos (O2).
• Secuestro de peróxidos de hidrógeno (H2O2).
• Secuestro de ácido hipocloroso (HOCl).
• Secuestro de radicales hidróxilo (OH).
• Secuestro de radicales peroxilos (ROO).
Entre los métodos tenemos también, aquellos que utilizan azo-compuestos para la generación
de radicales peróxido, como los siguientes:
• Método TRAP (Parámetro total de antioxidante para el secuestro de radical).
• Método ORAC (Capacidad de absorbencias del radical oxígeno).
• Método ABTS (secuestro del catión radical 2,2-azinobis-3(-etilbenzotiazolin-6-sulfanato)
o método del TEAC (Capacidad antioxidante en equivalentes trolox).
• Método DPPH (Secuestro del radical estable 2,2-difenil-1-picrilhidrazil).
• Método DMPD (secuestro del radical catión N,N-dimetil-p-fenildiamina).
De los métodos mencionados anteriormente, los más reportados y utilizados para la obtención
de la capacidad antioxidante de muestras biológicas son el método de ABTS y el método de
DPPH. Esto es porque el tiempo de estabilidad de la reacción es suficientemente aceptable para
realizar las pruebas y presentan buena correlación. La búsqueda de métodos más específicos,
que proporcionen una información química que sea directamente relacionada con el deterioro
oxidativo de alimentos y muestras biológicas, podría ser el objeto de futuras investigaciones. A
continuación, se describe uno de los dos métodos más utilizados para la determinación de la
capacidad antioxidante para muestras de alimentos y frutas.
2.5.1. Método del ABTS
Secuestro del catión radical 2,2-azinobis-3(-etilbenzotiazolin-6-sulfanato) o método del
TEAC (Trolox equivalent antioxidant capacity).
12
Este método, fue descrito por Kuskoski, et al, 2005, el radical ABTS•+ se obtiene tras la
reacción de ABTS•+ (7 mM) con persúlfato potásico (2,45 mM, concentración final)
incubados a temperatura ambiente (25ºC) y en la oscuridad durante 16-24 h. Una vez
formado el radical ABTS•+ se diluye con etanol hasta obtener un valor de 0,70 (±0,1) de
absorbancia o bien una absorbancia inicial conocida, a 754 nm. Este método se mide por
medio de espectrofotometría, en el cual se va leyendo la absorción, mientras que hay una
disminución de color, al reaccionar con la muestra de antioxidante. Los resultados se
expresan en TEAC (actividad antioxidante equivalente a Trolox).
La figura 2 muestra la reacción de formación del radical ABTS•+, donde el ABTS
reducido en presencia de persulfato de potasio reaccionan para formar el radical.
Figura 2. Formación del radical catión ABTS•+ (Ananth, 2001).
En la figura 3 se muestra la posible reacción de estabilización del radical ABTS•+ y un compuesto
antioxidante, en la primera parte de la reacción se forma el ABTS reducido y un radical libre
fenoxil. El radical libre fenoxil puede tener 3 vías alternativas que puede seguir: 1) El ABTS
reducido regresando a los compuestos originales; 2) encontrar otro radical fenoxil y
neutralizarse entre ellos dos formando un dímero; 3) encontrar un segundo radical ABTS•+ y
estabilizarlo formando dos iones, el ion fenolato y el ion ABTS2+.
13
Figura 3. Posible reacción del radical ABTS•+ catión con los antioxidantes (Ananth, 2001)
2.5.1.1.Disminución de color
En esta forma de expresión de resultados se grafica tiempo contra absorbancia, donde la
reacción provoca una disminución de color, por tal razón, conforme pasa el tiempo las
absorbancias disminuyen al desaparecer el color en presencia de un antioxidante (Figura 4).
14
Figura 4. Efecto del tiempo en supresión de la absorbencia del radical catión ABTS•+ (Re et
al.,1999)
La expresión de resultado es graficar el porcentaje de la disminución de color con respecto al
tiempo, (Figura 5).
Figura 5. Porcentaje de inhibición contra coeficiente de concentración (Re et al., 1999)
2.5.1.2. Equivalentes de Trolox (mM)
Para expresar los resultados en mM de equivalentes de Trolox se realizan los siguientes pasos
• Se realiza una curva patrón
o El radical ABTS•+ se tiene que diluir hasta alcanzar una absorbencia de 0.7
o Se prepara la solución del compuesto estándar del antioxidante (Trolox)
• Se hacen las lecturas en el espectro en un lapso de tiempo y se calculan las diferencias
de absorbancia inicial y final.
• Se calibra la curva patrón de la siguiente manera:
15
Δ trolox=(At=trolox-At=6trolox)- ΔAsolvente(0-6minutos)
Con este tipo de calibración se obtiene la siguiente tabla
Concentraciones Deltas de absorbencias
C1 D1
C2 D2
C3 D3
C4 D4
Se hace la gráfica y se obtiene la curva patrón calibrada con la cual se realiza una regresión lineal
y utiliza la ecuación de la recta para calcular el porcentaje de inhibición de las muestras
problemas.
• Se determina la cantida
con ordenada al origen
• Se despeja concentración de trolo
Se obtiene los mM de equivalencias de trolox al poner los deltas de absorbencias de las
muestras
2.5.1.3 Parámetros cinéticos para la capacidad antioxidante
Sánchez-Moreno y Larrauri en 1996, reportaron la capaci
cinéticos, los cuales relacionan la concentración del antioxidante y el tiempo que tarda en
reaccionar o actuar. Recientemente, Pérez
antioxidantes en términos de e
se tienen que calcular dos parámetros cinéticos: Dosis eficiente 50 (ED50), tiempo eficiente 50
(tED50), y eficiencia antiradical (EA).
2.5.1.3.1. Dosis Eficiente 50
El ED50 (dosis eficiente) se obtiene graficando el porcentaje residual de ABTS
concentración del estándar y este se expresa como micromoles de compuestos viables para
Se determina la cantidad de mM de equivalentes de trolox por la ecuación de la recta
con ordenada al origen
e despeja concentración de trolox
Se obtiene los mM de equivalencias de trolox al poner los deltas de absorbencias de las
.5.1.3 Parámetros cinéticos para la capacidad antioxidante
Moreno y Larrauri en 1996, reportaron la capacidad antioxidante utilizando parámetros
cinéticos, los cuales relacionan la concentración del antioxidante y el tiempo que tarda en
reaccionar o actuar. Recientemente, Pérez-Jiménez y Saura-Calixto (2008) reportan la capacidad
en términos de expresión cinética. Para poder presentar resultados de esta forma
se tienen que calcular dos parámetros cinéticos: Dosis eficiente 50 (ED50), tiempo eficiente 50
), y eficiencia antiradical (EA).
te) se obtiene graficando el porcentaje residual de ABTS
concentración del estándar y este se expresa como micromoles de compuestos viables para
16
x por la ecuación de la recta
Se obtiene los mM de equivalencias de trolox al poner los deltas de absorbencias de las
dad antioxidante utilizando parámetros
cinéticos, los cuales relacionan la concentración del antioxidante y el tiempo que tarda en
Calixto (2008) reportan la capacidad
xpresión cinética. Para poder presentar resultados de esta forma
se tienen que calcular dos parámetros cinéticos: Dosis eficiente 50 (ED50), tiempo eficiente 50
te) se obtiene graficando el porcentaje residual de ABTS•+ de la
concentración del estándar y este se expresa como micromoles de compuestos viables para
17
atrapar radicales libres por micromol de ABTS•+ (Pérez-Jiménez y Saura Calixto, 2008). Las
unidades del ED50 son micromoles de compuesto antioxidante/micromoles de ABTS•+ y este se
calcula gráficamente de la siguiente manera:
Figura 6. Gráfica del porcentaje de radical catión ABTS•+ remanente vs concentración de
antioxidante (Pérez-Jiménez y Saura Calixto, 2008).
Se realiza una grafica donde se tiene en el eje de la ‘x’ las diferentes concentración del
antioxidante que se probaron y en el eje de la ‘y’ el porcentaje de ABTS•+ remanente, se
entiende por remanente de ABTS•+, la cantidad de ABTS•+ que se encuentra presente todavía en
la solución después de un cierto tiempo que se dejó reaccionar con el antioxidante.
Se tomó la ecuación de la recta para calcular la concentración necesaria para llegar al 50 por
ciento la concentración del radical.
18
2.5.1.3.2. Tiempo eficiente 50 (tED50)
El tED50 se define como el tiempo necesario para que el antioxidante alcance el 50% de
estabilidad del radical. El tED50 se calcula de forma gráfica haciendo cinéticas a diferentes
concentraciones de antioxidante (Figura7).
Figura 7. Cinética de para la obtención del tED50.
Donde se grafica en el eje de las ‘x’ el tiempo que se dejará reaccionar el antioxidante con el
radical (ABTS), en el eje de las ‘y’ se tendrá el porcentaje de remanente de ABTS•+. Se realiza una
regresión lineal en la cual se tendrá una ecuación de la curva de forma logarítmica.
y = a ln(x) + b
2.5.1.3.3. Eficiencia antiradical (E.A=1/ED50*TED50)
Este parámetro, relaciona la concentración del antioxidante con el tiempo de reacción del
mismo. En el cual sabemos que si el valor de t-1 nos dice que tan veloz es nuestra reacción, a
19
valores mayores, velocidades grandes y a volares menores, velocidades pequeñas de reacción.
Se tomó la ecuación y se calculó el tiempo que tardó en llegar al 50% del remanente (tED50). Con
los parámetros ED50 y tED50 se calculó la eficiencia anti radical (E.A). Esta se obtiene multiplicando
el ED50 y el tED50 y se saca su inversa como se muestra continuación.
�. � = 1��50 ∗ ��50
Sánchez-Moreno et al, 1996, proponen una clasificación de los antioxidantes según su tED50
tED < 5 minutos antioxidante rápido
tED = 6-30 minutos antioxidante intermedio
tED > 30 min antioxidante lento
20
JUSTIFICACION
21
3. JUSTIFICACION
En los años recientes, la Biotecnología ha resuelto problemas de la industria del café a través de
metodologías que involucran el control biológico de plagas, producción de setas, utilización
integral de residuos (pulpa y mucílago) mediante el ensilaje, composteo y lombricultura. Por
otro lado, se han hecho esfuerzos importantes para disminuir el impacto ambiental de los
beneficios húmedos (Favela et al 1989; Perraud et al 2000; Sera et al 2000; Roussos et al 2000).
Sin embargo, la valorización comercial de los residuos es limitada y no se cuentan con
alternativas que mejoren la economía de la industria cafetalera independientemente de la
cotización del café. El interés por los subproductos del café es inversamente proporcional al
precio de venta del producto principal. En la industria alimentaria, se utilizan antioxidantes
sintéticos como el butilhidroxitolueno (BHT), el butilhidroxianisol (BHA) y el polietilenglico (PG)
para reducir los procesos oxidativos. Pero han descubierto que el consumo de estos compuestos
puede producir cáncer.
Por otra parte, las propiedades benéficas de los antioxidantes son ampliamente reconocidas:
son compuestos que químicamente son muy cercanos a los compuestos fenólicos de la pulpa de
café, como los ácidos hidroxicinámicos (p.ej., ácidos ferúlico, caféico, p-cumárico), los cuales se
encuentran en una proporción de 1 a 2 % en pulpa de café seca. Compuestos que son de gran
interés para la industria de cosméticos, alimentaría y farmacéutica (Ramírez-Coronel et al 2004).
El consumo de alimentos ricos en hidroxicinamatos ha mostrado efectos benéficos. Estudios in
vitro e in vivo con animales de laboratorio, señalan que el ácido caféico presenta propiedades
antivirales y antitumorales, pero aun estos efectos no han sido demostrados en el humano
(Okuda et al 1992 y Saija et al 1999). En cosmetología son empleados en la fabricación lociones y
cremas protectoras de radiación UV (Saija et al, 1999). Cabe destacar que no existen reportes en
la literatura sobre la capacidad antioxidante de los extractos de la pulpa de café, los pocos
trabajos que existen se centran en el grano de café.
El interés de este proyecto se centra en la extracción química y enzimática de los ácidos
hidroxicinámicos de la pulpa del café. Así como evaluar la capacidad antioxidante de los
extractos obtenidos por la vía química (Pulpa sin fermentar) y enzimática (Pulpa fermentada) ya
que no existen reportes de la capacidad antioxidante de la pulpa del café en la literatura, no
obstante que su composición ha sido ya objeto de varios estudios.
22
4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo General
Determinar la capacidad antioxidante de compuestos fenólicos (ácidos hidroxicinámicos)
obtenidos de la pulpa de café.
4.2 Objetivos particulares
• Determinar el contenido total de ácidos fenólicos de la pulpa de café.
• Estandarizar la técnica de ABTS para la determinación de la capacidad antioxidante con
ácidos hidroxicinámicos de referencia (estándares).
• Estimación de la capacidad antioxidante de ácidos hidroxicinámicos de extractos
fenólicos de pulpa de café (extracciones metanólicas e hidrólisis alcalina).
• Estimación de la capacidad antioxidante de ácidos hidroxicinámicos de extractos
fenólicos de la pulpa de café fermentada (extracciones metanólicas e hidrólisis
alcalina).
• Medición de ácidos hidroxicinámicos de ambas pulpas de café por HPLC.
23
MATERIALES Y MÉTODOS
24
5. MATERIALES Y MÉTODOS
Material biológico
• Pulpa de café (variedad Arabica, proveniente de Veracruz; Cosecha 2006)
• Un lote de pulpa de café fermentada (variedad Arabica, Veracruz; Cosecha 2006)
• Las muestra de pulpa de café fermentada fue proporcionada por Gladys Gabriela Pérez
Morales, como parte de sus estudios de Maestría. Medio de cultivo: maltosa como
fuente de azúcar (Pérez- Morales, 2008)
o Microorganismo: Aspergillus tamarii (Pérez- Morales, 2008)
o Tiempo de fermentación: 22 horas (Pérez- Morales 2008)
Solventes
• Metanol
• Hexano
• Acido acético
• Agua destilada
Estándares
• Acido ferúlico (Sigma)
• Acido caféico (Sigma)
• Acido clorogénico (Sigma)
• Sacarosa (Sigma)
• Trolox (Sigma)
• Ácido tánico (Sigma)
• Ácido gálico (Sigma)
• Catequina (Sigma)
• Epicatequina (sigma)
25
Reactivos
• Fenol
• Ácido sulfúrico
• Reactivo de Folin Ciocalteau (Sigma)
• ABTS (Sigma), “Acido 2,2-azinobis-3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico”
• Persulfato de potasio (Sigma)
• Cloruro de sodio
• Fosfato dibásico de sodio
Técnicas analíticas
• Técnica de Folin Ciocalteau (Kuskoski et al, 2005)
• Técnica de azúcares totales (Dubois et al, 1956)
• Técnica del radical ABTS (Re et al, 1998)
26
5.1 Diagrama de bloques
Secado y preparación de la
pulpa de café
Hidrólisis alcalina NaOH 2
Molar
Extracción con hexano
Extracciones con
Metanol-agua 80:20
Medición de polifenoles totales
Medición de azúcares totales
Estimación de la capacidad
antioxidante (ABTS)
Fase acuosa Acetato de etilo
Extracción selectiva con
acetato de etilo
Medición de polifenoles totales
Medición de azúcares totales
Estimación de capacidad
Cuantificación por
HPLC
27
5.2 Origen de la pulpa de café
La pulpa de café (Variedad Arabica), se obtuvo del “Beneficio de Café Finos localizado” en
Coatepec, Veracruz. Este beneficio pertenece a la empresa “AGROINDUSTRIAS UNIDAS DE
MÉXICO S.A DE C.V” grupo que está incorporado al Consejo Regulador del Café en el Estado de
Veracruz. La pulpa recolectada se obtuvo directamente del despulpado del beneficio húmedo.
5.3 Preparación de la pulpa de café
La pulpa de café fue limpiada, separando las cascaras y basura con la que viene mezclada,
después se puso en una charola extendida y se dejó al sol durante un día para ser secada.
Posteriormente se metió en un molino para pulverizar y tener un tamaño de partícula pequeño
y uniforme. Ya pulverizada la pulpa, se guardó en un desecador para mantenerla libre de
humedad.
5.4 Porcentaje de humedad
Para calcular el porcentaje de humedad se tomó una muestra de 2 g de pulpa de café, se pesó
tomando el dato del peso inicial, después se puso en la estufa a 65ºC durante 2 días, para
eliminar la cantidad de humedad, se saca la pulpa de café y se vuelve a pesar. El porcentaje de
humedad se calcula de la siguiente manera.
%PS = peso inicial − peso �inalpeso inicial ∗ 100
5.5 Extracciones.
Para la extracción de polifenoles libres y azúcares se trató la muestra de la siguiente manera:
5.5.1 Extracción con hexano
Se pesaron 10 g de cada una de las pulpas secas, en matraces Erlenmeyer de 250 ml por
triplicado, se les hizo una extracción con 50 ml de hexano a una temperatura constante de 30ºC,
28
con una agitación de 100 rpm durante 30 minutos, para liberar la muestra de carotenoides,
pigmentos y ceras (Ramírez-Coronel et al, 2004).
5.5.2 Extracción con solución Metanol-Agua 80:20 (v/v)
El residuo de la primera extracción paso a un segundo proceso de extracción con 50 mL de una
solución de metanol -agua 80:20 (v/v), acidificada al 1% con acido acético. Las condiciones de
extracción fueron las siguientes: temperatura de 55 ºC con una agitación de 100 rpm durante 35
minutos. Este proceso se repitió tres veces para tener un volumen final de 150 mL de solución.
En esta extracción se recuperan polifenoles que se encuentran libres en la pulpa de café, así
como los azúcares libres (Ramírez-Coronel et al, 2004).
5.5.3 Hidrólisis alcalina con NaOH 2 M.
Los residuos de las extracciones de metanol-agua, se trataron con 150 mL de NaOH a 2 M para
realizar una hidrólisis alcalina. Las condiciones de hidrólisis fueron las siguientes: temperatura
de 45ºC con agitación de 100 rpm durante 2 hrs (Torres-Mancera, 2008).
5.5.4 Purificación de ácidos hidroxicinámicos con acetato de etilo
Tratamiento para extractos con metanol-agua (80-20 v/v).
Para extraer los compuestos fenólicos (ácidos hidroxicinámicos), la muestra de metanol-agua se
introdujo en un rotavapor para evaporar el metanol y obtener un concentrado de polifenoles, el
concentrado se acidificó con ácido clorhídrico al 50% v/v a un pH 3 (Torres-Mancera 2008).
Obtenidos los concentrados se realizaron las extracciones con acetato de etilo en un embudo de
separación, agregando la muestra y posteriormente el acetato de etilo en una proporción 1:2
para lograr tener las dos fases, una acuosa y una orgánica. Obteniendo los polifenoles en la fase
orgánica (Torres Mancera 2008).
29
5.6 Métodos analíticos
5.6.1 Medición de azúcares totales
Para la medición de azúcares totales se utilizó la técnica del fenol sulfúrico. El fundamento de la
técnica del ácido fenol sulfúrico es la hidrólisis de las cadenas de azúcares para liberar los
monosacáridos. Separadas las cadenas, el fenol aporta grupos cromóforos que producen color al
reaccionar con oxígeno de cada hexosa y pentosa que se tiene. Esta coloración se mide por
espectrofotometría a una longitud de onda de 400 nm. (Dubois et al, 1956).
Para realizar el método se preparó una solución reactivo, en la cual se agregó 1 ml de ácido
sulfúrico por cada miligramo de fenol, se dejó reposar entre 1 y 2 horas. En un tubo de ensayo
se agregó 1 ml de muestra, se metió a un baño de hielo y se agregaron 2 ml de la solución
reactivo, se sacó del baño de hielo y se agitó para homogenizar. Después se calentó a 90 ºC y se
dejó incubando durante 9 minutos, se dejó enfriar y finalmente se leyeron las absorbencias a
400 nm en un espectro de región visible (Dubois et al, 1956 modificado). Se realizó una curva
estándar de sacarosa con concentraciones de 0 a 1000 mg/L.
5.6.2 Estimación de polifenoles totales
El método utilizado para medir polifenoles es el método espectrofotométrico desarrollado
por Folin-Ciocalteau 1927 (Kuskoski et al 2005), para la determinación de fenoles
totales, se fundamenta en su carácter reductor y es el más empleado. Se utiliza como
reactivo una mezcla de ácidos fosfowolfrámico y fosfomolibdíco en medio básico, que se
reducen al oxidar los compuestos fenólicos, originando óxidos azules de wolframio
(W8O23) y molibdeno (Mo8O23). La absorbancia del color azul se mide en el
espectrofotómetro (Kuskoski et al, 2005). Para la realización del método se siguen los
siguientes pasos:
En un tubo de ensaye se agregó 0.5 ml de muestra, y se efectúo una dilución 1: 20 con
una solución de metanol-ácido acético al 2.5%, se agitó para homogenizar, después se
agregó 0.25 ml del reactivo de folin, se agitó nuevamente para homogenizar, se agregó 1
ml de solución de carbonato de sodio a 200g/L, por último se agregaron 3.5 ml de agua
destilada y se agitó para homogenizar. Se incubó durante 10 minutos en baño maría a 70
30
ºC, se dejó enfriar y por último se leyeron las absorbancias en un espectro a una longitud
de onda de 700 nm (Kuskoski et al 2005).
5.6.3. Estimación de capacidad antioxidante
El método utilizado para medir la capacidad antioxidante, fue el método
espectrofotométrico conocido como ABTS•+ el cual se obtiene tras la reacción de ABTS
(7 mM) con persulfato potásico (2,45 mM, concentración final) incubados a temperatura
ambiente (±25ºC) y en la oscuridad durante 16 h. Una vez formado el radical ABTS•+ se
diluye con búfer (NaCl y NaH2PO4 37.5 y 5 M respectivamente), hasta obtener un valor
de absorbancia comprendido entre 0,70 (±0,1). (Re et al, 1998). Se observó la
disminución del radical en presencia de un antioxidante, en este caso Trolox que es
utilizado como estándar, ya que se sabe que es un análogo de la vitamina E el cual se
utiliza como antioxidante y posteriormete cada una de la mustras.
- Preparación del radical ABTS•+
Se hizo una solución del radical catión ABTS.+ a una concentración final de 7 mM de ABTS
reducido y 2.45 mM de persulfato de potasio para la formación del radical. Se dejó reposar la
solución a temperatura ambiente protegida de la luz durante 24 hrs para la estabilización del
radical. Ya estable el radical se diluyó hasta obtener una absorbencia de 0.7 a una longitud de
onda de 734 nm. En una celda se agregó 1 ml de la solución del radical y se agregaron 10 µl del
antioxidante. Se realizó la cinética con un tiempo de 30 minutos.
5.6.3.1. Obtención del ED50
El ED50 es la dosis o concentración eficiente de un antioxidante para reducir el 50% del radical
catión ABTS+.. Para la obtención de este parámetro se realizaron cinéticas en el
espectrofotómetro a una longitud de onda de 734 nm con una duración de 30 minutos para
cada corrida. De las cinéticas se realizaron las graficas de porcentaje remanente del radical
catión ABTS.+ y por la ecuación de la recta se calculó el ED50 (Pérez-Jiménez y Saura Calixto
2008).
31
5.6.3.2 Obtención del TED50
El tED50 es el tiempo necesario para que esta concentración de antioxidante reduzca al 50% la
cantidad original del radical catión ABTS+.. Se obtuvieron los TEC50 a diferentes concentraciones,
se realizó una curva patrón y con ayuda de la ecuación de la curva se calcula el TED50 (Pérez-
Jiménez y Saura Calixto 2008). El cual es calculado utilizando los datos de las cinéticas, obtenidas
para cada estándar y cada muestra.
5.6.3.3 Estimacion de la Eficiencia Antiradical (EA).
La Eficiencia antiradical relaciona tanto la concentración de un antioxidante como el tiempo
necesario para actuar.
La eficiencia antiradical se calcula con la siguiente fórmula:
AE= 1/(ED50*TED50)
De esta manera los valores altos corresponden a aquellos antioxidantes que alcanzan el EC50 en
menos tiempo. Donde podremos observar que entre más pequeños sean los valores de ED50 y
tED50 la eficiencia antiradical tendrá un valor más alto y por lo tanto se podrá decir que es un
buen antioxidante (Pérez-Jiménez y Saura-Calixto 2008).
Basados en el TED50 Sánchez Moreno y Saura Calixto 2008, clasifican el comportamiento de un
antioxidante de la siguiente manera: <5 minutos (Rápido); valores entre 5-30 minutos
(intermedio); > 30 minutos (Lento). De esta manera, se calcularon los TED50 de varios compuestos
estándares (comerciales) y de las muestras obtenidas a partir de pulpa de café sin fermentar así
como de la pulpa de café fermentada (Cuadro 1).
32
Estándar ED50 (g de
antioxidante
/gramos de
DDPH)
Estado
estacionario
(minutos)
TED50
(minutos)
Clasificación
Acido gálico 26 ±1 5-29.3 14.69 ±1.1 Intermedio
Acido tánico 59 ±3 6.5-60 29.55 ±1.6 Intermedio
Acido caféico 69 ±7 4-20.5 5.26 ±0.31 Rápido - intermedio
Acido ascórbico 76 ±7 1-1.5 1.15 ±0.08 Rápido
Quercetin 84 ±6 6-75 63.28 ±3.15 Lento
BHA 93 ±6 19.5-119.5 103.85 ±7.21 Lento
Rutin 102 ±9 23.5-60 46 ±3.2 Lento
Acido ferúlico 163 ±10 8-58.5 49.74 ±4.18 Lento
DL-άTacoperol 201 ±11 7-19.3 9.52 ±0.17 Intermedio
Resveratrol 331 ±12 41.5-90 60.46 ±4.25 Lento
Cuadro 1. Clasificación del poder antioxidante de moléculas estándar (Sánchez Moreno y Saura
Calixto 2008)
5.6.4 Cuantificacion de ácidos hidroxicinámicos por HPLC
Una modificación al método de Kim et al, 2006 fue utilizada, se realizaron extracciones con
acetato de etilo para recuperar los ácidos hidroxicinámicos y poder hacer la identificación y
cuantificación de los mismos por HPLC con las siguientes condiciones. Se utilizó como fase móvil
una solución de ácido acético 2.5% (B) y acetonitrilo (A) grado HPLC. A continuación se presenta
el gradiente utilizado, a una velocidad de flujo de 1.2 ml min-1.
33
Tiempo minutos % B % A
0.01 100 0
30 90 10
50 80 20
55 70 30
60 50 50
65 100 0
70 100 0
El volumen de inyección de la muestra fue de 10 µL. Los ácidos hidroxicinámicos fueron
monitoreados a 320 nm. Se utilizó un HPLC marca Shimadzu software lab-solution. 51L-20 A HT
con automuestreador, y desgasificador DGU-20AS, equipado con un arreglo de diodos SPP-
M20A. La separación se realizó en una columna VARIAN Polaris 5 Amide C18 de 200 X 4.6 mm.
34
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1 Porcentaje de humedad
Cuadro 2. Porcentaje de humedad inicial de la pulpa de café.
6. 2 Azúcares totales de la pulpa de café no fermentada vs Pulpa de café fermentada
En la figura 8, se muestra la cantidad de azúcares totales (g /Kg) en ba
pulpa de café no fermetada y en la pulpa de café fermentada en los extractos metan
(Polifenoles libres) y en los extractos obtenidos por hidrólisis alcalina (Polifenoles esterificados).
Figura 8. Cantidad de azúcares en t
base seca
88
116
0
50
100
150
200
250
300
Pulpa de café sin fermentar
g de
azu
cure
s/K
g de
pu
lpa
de c
afé
seca
Peso inicial
gramos
2
ESULTADOS Y DISCUSIÓN
Cuadro 2. Porcentaje de humedad inicial de la pulpa de café.
. 2 Azúcares totales de la pulpa de café no fermentada vs Pulpa de café fermentada
En la figura 8, se muestra la cantidad de azúcares totales (g /Kg) en base seca, contenida en la
pulpa de café no fermetada y en la pulpa de café fermentada en los extractos metan
(Polifenoles libres) y en los extractos obtenidos por hidrólisis alcalina (Polifenoles esterificados).
Figura 8. Cantidad de azúcares en totales en la pulpa de café no fermentada y fermentada en
120
116
125
Pulpa de café sin fermentar Pulpa de café fermentada
Peso final
gramos
% de humedad
1.89 5.5
35
. 2 Azúcares totales de la pulpa de café no fermentada vs Pulpa de café fermentada
se seca, contenida en la
pulpa de café no fermetada y en la pulpa de café fermentada en los extractos metanólicos
(Polifenoles libres) y en los extractos obtenidos por hidrólisis alcalina (Polifenoles esterificados).
otales en la pulpa de café no fermentada y fermentada en
Azúcares Esterificados
Azúcares Libres
36
Observamos que la fracción metanólica solubilizó alrededor de 88 g/Kg en la pulpa no
fermentada y 120 g/Kg en la pulpa fermentada. Puede observarse un incremento en el
contenido de azúcares en la pulpa fermentada, muy probablemente debida a la actividad
enzimática de hidrólisis de la pared celular de la pulpa del café. Además es de considerar los
azúcares aportados por el crecimiento del microorganismo utilizado. En ambas muestras la
extracción por hidrólisis alcalina libera los azúcares ligados a la pared celular.
Los valores de azúcares obtenidas fueron comparados en la literatura con Urbaneja y col., 1996,
quien reporta el contenido total de azucares de una pulpa de café no fermentada, obtenidos por
hidrólisis ácida.
Alrededor de 229 g/Kg (22.9%, p/p). En este trabajo se obtuvo para la pulpa no fermentada 204
g/Kg (20.4%, p/p) de azúcares totales lo que queda en el mismo orden de magnitud, comparada
con los datos obtenidos por Urbaneja et al, 1996. Para la pulpa de café fermentada se obtuvo un
total de 245 g/Kg de azúcares totales (24.5 %, p/p).
Cabe mencionar que en ambos trabajos se utilizaron diferentes métodos de hidrólisis. Urbaneja
utiliza una hidrólisis ácida y en la realizada en este trabajo fue una hidrólisis alcalina donde las
condiciones fueron, una concentración 2M de NaOH, tiempo de hidrólisis 2 hrs, temperatura de
40ºC y con una agitación de 100 rpm.
6.3 Compuestos fenólicos totales de pulpa de café no fermentada vs Pulpa de café
fermentada.
En la figura 9 se comparan las cantidades en base seca, de polifenoles totales obtenidas en la
pulpa de café no fermentada con la pulpa de café fermentada.
37
Figura 9. Polifenoles totales en la pulpa de café no fermentada y pulpa fermentada
En esta figura podemos ver que se obtiene 335 g/Kg de polifenoles totales en la pulpa no
fermentada (33.5%, p/p) y 323 g/Kg en la pulpa fermentada (32.3% p/p), las diferencias de
polifenoles totales entre ambas pulpas son poco significativas. Donde sí hay una diferencia
significativa es en el aumento de ácidos fenólicos libres que podemos explicar por la acción de
hidrólisis enzimática causada por las enzimas tipo esterasa, del microorganismo utilizado en la
fermentación. En la misma figura podemos ver que la mayor parte de ácidos fenolicos están
ligados a la pared celular por enlaces de tipo Ester 63.5 % y 57.27 %, sin embargo, una fracción
cercana al 37% es aportada por los polifenoles libres o no ligados a la pared celular.
6.4 Espectros de absorción del ABTS •+
Se realizó un barrido de absorbancia para localizar la longitud de onda en la cual se pudiera
realizar los análisis de capacidad antioxidante, se buscó una longitud de onda donde no hubiera
interferencia por los compuestos que se tienen en la pulpa de café con la absorbancia del radical
122 138
213185
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Pulpa de café sin fermentar
Pulpa de café fermentada
g P
olif
enol
es/K
g de
pu
lpa
de
café
Polifenoles esterificados
Polifenoles libres
38
catión ABTS•+. En las siguientes graficas se muestran los barridos del ABTS•+ en solución
metanólica la cual tiene la fracción de polifenoles libres.
Figura 10. Barrido del ABTS y la pulpa de café en solución metanol-ácido acético (polifenoles
libres)
En la figura 11 se muetsra un barrido de la fracción de polifenoles en la fracción de hidróxido de
sodio 2M y el ABTS.
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
220 320 420 520 620 720 820
Ab
sorb
anci
as
Longitud de onda λ
Barrido de muestra en solución metanólica
Muestra
ABTS
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
220 420 620 820
Abs
orb
nci
as
Longitud de Onda
Muestras
ABTS
39
Figura 11. Barrido de hidrólisis de la pulpa de café (polifenoles que se encontraban esterificados
en la pared celular de la pulpa de café).
Teniendo como antecedente la longitud de onda a la que se trabajará para la lectura de la
capacidad antioxidante, la cual es de 720 nm en el espectro. El barrido nos mostró que no
tendríamos interferencias en la lectura (Re et, al 1999).
6.4.1. Estabilidad del radical ABTS•+
La figura 12 muestra la estabilidad del ion ABTS.+ para diferentes diluciones después de 72 horas
de que se formó el radical. El espectro nos confirmó que el radical ABTS.+ es estable después de
hasta 72 horas, como se menciona en la literatura.
Figura 12. Barridos de estabilidad del radical cation ABTS•+ a diferentes diluciones y a 72 hrs.
40
6.4.2. Capacidad antioxidante de compuestos de la pulpa del café
En las figura 13 se muestra la capacidad antioxidane de la muestra de polifenoles libres
extraídos con la solución agua-metanol de la pulpa de café, mostrada en porcentaje de
inhibición de color, obteniendo un promedio del 35% de desaparicion de color, esta
desaparicion de color se refiere a la cantidad de ABTS.+ el cual se encontraba oxidado y se
empieza a reducir al agregarle 10 µL de muestra, basicamente la disminución de color del ABTS
es por efecto de los polifenoles que se encuentran en la solución.
Figura 13. Disminución de color debido a la reducción del ABTS.+ por efecto de los polifenoles
libres de la pulpa de café.
En la figura 14 se muestra la capacidad antioxidane de la muestra de polifenoles hidrolizada,
extraídos por hidrólisis alcalina de la pulpa de café, mostrada en porcentaje de inhibición de
color, obteniendo un porcentaje del 87% de desaparición de color, esta desaparicion de color se
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
0 1 2 3 4 5 6 7
Inhi
bici
ón (
%)
Tiempo (minutos)
Capacidad antioxidante de los compuestos fenólicos libres
41
refiere a la cantidad de ABTS el cual se encontraba oxidado, al poner 10µL de la muestra este se
empieza a reducir por efecto de los polifenoles que se encuentran en solución.
Figura 14. Disminución del color debido a la reducución del ABTS.+ por efecto de los polifenoles
esterificados de la pulpa de café
Observamos que la fracción de ácidos fenólicos esterificados tienen un mayor efecto en la
disminución de color del ABTS.+ en comparación con el efecto mostrado, por la fracción
metanolica o de polifenoles libres.
6.4.3 Capacidad antioxidante en equivalentes de trolox
El cuadro 3 muestra la capacidad antioxidante de los polifenoles de la pulpa de café no
fermentada, en equivalentes trolox. Se tiene compuestos fenólicos libres con una capacidad
antioxidante de 1.39 mM en equivalentes de trolox. Mientras que, para los compuestos
fenólicos esterificados su capacidad antioxidante es de 68.29 mM en equivalentes de trólox.
0
20
40
60
80
100
120
0 1 2 3 4 5 6 7
Inhi
bicó
n (
%)
Tiempo (minutos)
Capacidad antioxidante de los compuestos fenólicos esterificados
42
Siendo casi setenta veces más eficiente los compuestos fenólicos esterificados lo cual se debe
principalmente a que hay una mayor concentración de compuestos fenólicos en esta fracción.
Juntando las dos muestras se tiene un capacidad antioxidante total de 69.68 mM equivalentes
trolox
Muestra
Capacidad antioxidante (equivalentes Trolox mM)
Compuestos fenólicos libres
1.39 ±0.27
Compuestos fenólicos esterificados
68.29 ±2.33
Cuadro 3. Capacidad antioxidante de los polifenoles de la pulpa de café en equiv de Trolox
(mM).
A continuación se muestra un cuadro (4), comparativo de capacidades antioxidantes en mM de
equivalentes trolox, con diferentes subproductos o productos agrícolas que han trabajado otros
autores.
43
Capacidad antioxidante mM eq. Trolox Técnica utilizada
Este trabajo
Pulpa de café
69.68 ABTS
Grano de café
R Pulido., et al, 2003
13 .28 ABTS
Grano de café
R Pulido., et al, 2003
12.13 FRAP
Vino
R Pulido., et col, 2003
10.9 ABTS
Vino
R Pulido et al, 2003
22.6 FRAP
Jugo de naranja Pellegrini
N., et al 2007
5.06 ABS
Espinacas
Pellegrini N., et al, 2007
0.28 ABTS
Tomate
Pellegrini N., et al, 2007
1.17 ABTS
Cuadro 4. Capacidad antioxidante mM equivalentes trolox. Obtenidos de la pulpa de café y
comparada con otros productos agrícolas reportados en la literatura.
En el cuadro 4, se hace la comparación de la capacidad antioxidante en mM equivalentes trolox
con otros productos agrícolas tales como el vino, grano de café, espinacas y el tomate. Se puede
observar que la capacidad antioxidante de la pulpa de café, es mayor a la de los demás
productos, pero debemos tomar en cuenta que en dos de las referencias se realizaron técnicas
44
diferentes a la de ABTS, utilizando la técnica de FRAP. Sin embargo, podemos decir en
conclusión, que en general la pulpa de café tiene una mayor capacidad antioxidante. Otra
observación pertinente, es la mayor capacidad antioxidante de los ácidos fenólicos esterificados
respecto de los ácidos fenólicos libres.
6.4.4 Parámetros cinéticos de la capacidad antioxidante de moléculas estándar
Cinéticas de estándares
Para la obtención de los parámetros cinéticos se realizaron cinéticas con estándares de ácidos
hidroxicinámicos y dos moléculas modelo que fueron el ácido tánico y el ácido gálico, los cuales
fueron disueltos en metanol. Las concentraciones utilizadas dependieron de cada estándar que
se utilizó, al igual que los tiempos de reacción que fueron entre 15 y 30 minutos. A continuación
se muestran las cinéticas de reacción de: ácido clorogénico, ácido ferúlico, ácido caféico, trolox,
catequina, ácido tánico y ácido gálico a diferentes concentraciones, observándose su capacidad
para eliminar el color del ABTS.+. Mostrándose una relación de la concentración y el tiempo de
reacción.
Cinética del ácido clorogénico:
0
20
40
60
80
100
120
0 10 20 30 40
AB
TS
•+ r
eman
ente
, (%
)
Tiempo (minutos)
0.5 mM
1 mM
2 mM
3 mM
4 mM
5 mM
45
Figura 15. Cinética de ácido clorogénico y ABTS•+ remanente a: 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0 y 5.0
milimolar, con un tiempo de reacción de 30 minutos
Cinética del ácido caféico:
Figura 16. Cinética de acido caféico y ABTS•+ remanente a: 0.25, 0.5, 1.0 y 2.0 milimolar, con un
tiempo de reacción de 30 minutos
Cinética del ácido ferúlico:
0
20
40
60
80
100
120
0 10 20 30 40
AB
TS
•+ r
eman
ente
, (%
)
Tiempo (minutos)
0.25 mM
5 mM
1 mM
2 mM
0
20
40
60
80
100
120
0 5 10 15 20
AB
TS
•+ r
eman
ente
, (%
)
Tiempo (minutos)
0.5 mM
1 mM
2 mM
3 mM
46
Figura 17. Cinética de acido ferúlico y ABTS•+ remanente a: 0.5, 1.0, 2.0, y 3.0 milimolar, con un
tiempo de reacción de 30 minutos
Cinética del trolox:
Figura 18. Cinética de trolox y ABTS•+ remanente a: 1.0, 2.0, 3.0 y 4.0 milimolar, con un tiempo
de reacción de 30 minutos
Cinética de la catequina
0
20
40
60
80
100
120
0 5 10 15 20AB
TS
•+ r
eman
ten
te,
(%)
Tiempo ( minutos)
1 mM
2 mM
3 mM
4 mM
0
20
40
60
80
100
120
0 10 20 30 40
AB
TS
•+ r
eman
ente
, (%
)
Tiempo (minutos)
0.25 mM
0.5 mM
1 mM
2 mM
47
Figura 19. Cinética de la catequina y ABTS•+ remanente a: 0.25, 0.5, 1.0, y 2.0milimolar, con un
tiempo de reacción de 30 minutos
Cinética del ácido tánico:
Se prepararon soluciones de ácido tánico con las siguientes concentraciones 5, 10, 20 y 30
micromolar, con un tiempo de reacción de 30 minutos
Figura 20. Cinética del ácido tánico y ABTS•+ remanente a: 5, 10, 20 y 30 milimolar, con un
tiempo de reacción de 30 minutos
Cinética del ácido gálico:
0
20
40
60
80
100
120
0 10 20 30 40AB
TS
•+ r
eman
ente
, (%
)
Tiempo en minutos
5 uM
10 uM
20 uM
30 uM
0
20
40
60
80
100
120
0 10 20 30 40
AB
TS
•+ r
eman
ente
, (%
)
Tiempo (minutos)
50 uM
100 uM
150 uM
200 uM
250 uM
48
Figura 21. Cinética del ácido gálico y ABTS•+ remanente a: 50,100, 150, 200 y 250 milimolar, con
un tiempo de reacción de 30 minutos.
Tabla de valores de ED50 obtenido para los estándares analizados.
Estándar Pendiente intercepción R2 ED50 mM de
antioxidante
s
Valor
estequiométrico
.
Átomos
de H
*Ácido tánico -0.13 96.7 0.99 0.01 0.02 50
Acido tánico -2.50 96.6 0.95 0.019 0.03 33
*Ácido gálico -0.33 97.8 099 0.058 0.12 8.5
Ácido gálico -207.2 109.3 0.99 0.219 0.44 4.6
Ácido ferúlico -20.0 74.9 0.90 0.71 1.4 0.71
Catequina -62.95 91.5 0.97 0.66 1.32 2
Ácido caféico -31.03 99.9 0.99 1.6 3.22 0.62
Ácido sináptico -33.90 93.9 0.90 1.3 2.6 0.7
Taxifolina -14.32 76.0 0.97 2 4 0.48
Trolox -25.72 105.6 0.99 2.1 4.3 0.23
Ácido clorogénico -24.26 97.7 0.98 2 4 0.5
Cuadro 5. Comparación de ED50 (mM de antioxidante/mM de ABTS•+). *Nota: los números en
negritas corresponden a los valores calculados por Pérez-Jiménez y Saura Calixto,
2008.
49
Para poder comparar la capacidad antioxidante de los diferentes estándares, se calcula el ED50
de cada uno de ellos. El ED50 es la concentración necesaria de antioxidante para disminuir la
cantidad de radical ABTS.+ presente en la reacción un 50%.
Para este parámetro se tiene que a menores valores de ED50 hay una mejor capacidad
antioxidante ya que se necesitaría una concentración menor para estabilizar el 50% del radical
presente. En la tabla 9 se puede observar que el ácido tánico posee un ED50 menor que los
demás por lo que es un mejor antioxidante, este está seguido por el ácido gálico y después se
tiene al ácido ferúlico. El compuesto que tiene el ED50 más grande y por lo tanto es el que posee
una capacidad antioxidante por debajo de los demás compuestos, es el ácido clorogénico. Estos
valores se compararan mas adelante con los compuestos fenólicos extraídos de la pulpa de café.
La tabla 10 muestra la eficiencia antiradical de los diferentes estándares. Donde, podemos
observar que el ácido tánico tiene una mayor eficiencia anti-radical, ya que como podemos ver
que la relación entre su ED50 y el TED50 nos da un número chico y al calcular su inversa se tiene
un número mayor, lo que se conoce como eficiencia anti-radical. Lo que se puede observar es
que los estándares analizados tienen un TED50 que los ubica como muy rápidos debido a que se
encuentran dentro del un intervalo menor a 5 minutos (Sánchez Moreno y Saura Calixto 2008).
A diferencia de la tabla anterior, en esta tabla de eficiencia anti-radical el ED50 está en g de
antioxidante y se hace la conversión para posteriormente comparar los resultados con las
muestras de pulpa de café.
Estándar y muestras ED50 (g de antioxidante) TED50
minutos
Actividad anti-radical
(A.E)
Acido tánico 1.6E-4 0.6 10,533
Acido gálico 1.9E-4 4 1315
Catequina 9E-4 1.5 740
Acido sináptico 1.5E-3 1.1 606
Acido ferúlico
Acido caféico
Trolox
Taxifolina
Acido clorogénico
Cuadro 6. ED50 (g de antioxidante), tED50 (minutos) y Actividad antiradical A.E
diferentes estándares probados
El cuadro 6, también muestra los tiempos de cada uno de los compuestos f
están dados en minutos.
Como conclusión se observó que la eficiencia antiradical de los estándares se puede ordenar de
la siguiente manera: ácido tánico > ácido gálico > catequina > ácido sinápico > ácido ferúlico >
ácido caféico > ácido clorogénico (Figura 22).
Figura 22. Capacidad antioxidante de los estándares analizados
1.2E-3 1.4
1.4E-3 1.5
2.7E-3 1.7
2.8E-3 1.1
3.4E-3 1.5
ED50 (g de antioxidante), tED50 (minutos) y Actividad antiradical A.E
diferentes estándares probados
El cuadro 6, también muestra los tiempos de cada uno de los compuestos fenólicos (T
Como conclusión se observó que la eficiencia antiradical de los estándares se puede ordenar de
la siguiente manera: ácido tánico > ácido gálico > catequina > ácido sinápico > ácido ferúlico >
ácido clorogénico (Figura 22).
22. Capacidad antioxidante de los estándares analizados
50
595
476
217.8
324
196
ED50 (g de antioxidante), tED50 (minutos) y Actividad antiradical A.E de los
enólicos (TED50), estos
Como conclusión se observó que la eficiencia antiradical de los estándares se puede ordenar de
la siguiente manera: ácido tánico > ácido gálico > catequina > ácido sinápico > ácido ferúlico >
51
En la figura 22, se muestra las estructuras de los compuestos fenólicos (estándares), ordenados
de mayor capacidad antioxidante al que posee menor capacidad antioxidante.
Un resultado es que el clorogénico este en último lugar ya que la tendencia es que entre más
compleja sea la molécula y tenga más sustitutos OH tenga más capacidad antioxidante, por lo
que podemos decir que los OH del ácido quínico no participa en la donación de protones, en
cambio para la catequina y el acido tánico la mayoría de los OH están ligados a un anillo
aromático, por lo que podemos decir que para que un OH done su protón más fácilmente, este
debe estar unido a un anillo aromático.
Otra forma de clasificar a los antioxidantes es el tiempo tED50 esta comparación la realiza
Sánchez-Moreno 1994. Donde dicen que si el tiempo de un antioxidante es de alrededor de 5
minutos este es un antioxidante rápido y bueno.
Basados en esta clasificación, los ácidos hidroxicinámicos analizados están dentro de la
clasificación de antioxidantes rápidos. Podemos decir que los antioxidantes presentes en la
pulpa de café se clasifican en antioxidantes rápidos.
6.4.5 La capacidad antioxidante de los extractos fenólicos de la pulpa del café.
6.4.5.1 Pulpa de café no fermentada vs pulpa de café fermentada
Se tomó una muestra de pulpa de café y una muestra de pulpa de café fermentada por 22 horas
con Aspergillus tamarii adicionando un medio mineral y maltosa como fuente de carbono
(Pérez-Morales 2008). En secciones anteriores (7.2-7.3) se presentaron las concentraciones de
azúcares y ácidos fenólicos en pulpa de café, fermetada y no fermentada. En esta sección se
presentan las capacidades antioxidantes de ambas pulpas.
Los resultados se muestran a continuación.
En los cuadros 7 y 8 se muestran los parámetros cinéticos de la capacidad antioxidante, de
ambas muestras analizadas. Se encontró que la pulpa de café fermentada mostró una mayor
52
capacidad antioxidante respecto de la pulpa de café no fermentada tanto por lospolifenoles no
ligados a la pared celular como aquellos esterificados a la misma.
Cuadro 7. Parámetros cinéticos de la pulpa de café no fermentada.
Muestras de pulpa de
café
ED50 (g de
antioxidante)
TED50 minutos Actividad anti-radical
(A.E)
Fenoles libres
(metanol-agua)
2.2E-04 ±4E-05
0.53 ±0.32
8,576 ±390
Fenoles estérificados
(NaOH)
2.1E-03 ±2.6E-04
0.1 ±2E-02
4,761 ±3,741
Fenoles libres en
acetato de etilo
1.9E-04 ±8.7E-05
1.22 ±2.8E-02
4,314 ±2,590
Fenoles esterificados
en acetato de etilo
2.1E-03 ±1.3E-04
2.01 ±1
236 ±129
Muestras de pulpa de
café
ED50 (g de
antioxidante)
TED50 minutos Actividad anti-radical
(A.E)
Fenoles libres (metano-
agua)
3.9E-04 ±6.34E-05
0.74 ±0.35
3,436 ±1249
Fenoles esterificados 5.1E-05 ±1.2E-06 2.6 ±0.19 754 ±329
53
Cuadro 8. Parámetros cinéticos de la pulpa de café no fermentada.
En los cuadros 7 y 8, se muestran los valores TED50 calculados para los extractos de ácidos
fenólicos libres y esterificados de la pulpa de café no fermentada y fermentada
respectivamente, observándose valores de de TED50 inferiores a cinco minutos para cada una de
las muestras. Basados en la clasificación del poder antioxidante reportada por Sánchez Moreno
y Saura Calixto, 2008, los ácidos hidroxicinámicos analizados están dentro de la clasificación de
antioxidantes rápidos.
En la Figura 23 puede observarse como la pulpa de café fermentada muestra una menor
cantidad de remanente de ABTS•+. En la cinética de reacción y además vemos que los órdenes
de magnitud entre la pulpa no fermentada y la pulpa fermentada son muy próximos. Sin
embargo la pulpa de café fermentada tiene mayor capacidad antioxidante la cual puede verse
en la figura 23, ya que las muestras de la pulpa fermentada reducen aproximadamente el 80%
del ABTS•+ en tanto que la no fermentada reduce solo el 60%.
(NaOH)
Fenoles libres en
acetato de etilo
2E-05 ±7.8E-06
0.41 ±0.35
121,951 ±37709
Fenoles esterificados
en acetato de etilo
3.4E-05 ±4.22E-06
1.12 ±0.19
25,982 ±4858
54
Figura 23. Cinética de loa ácidos hidroxicinámicos de la pulpa del café no fermentada y pulpa de
café fermentada.
6.5. Recuperación de ácidos Hidroxicinámicos con acetato de etilo
Para concentra los ácidos hidroxicinámicos de cada uno de los extractos se desplazo el metanol
de las muestras que lo contenían quedando en fase acuosa, así se agregó una proporción 1:2 de
acetato de etilo y se redujo a un volumen de 5 ml cada muestra. Cada una de las fracciones fue
analizada para polifenoles totales (Figura 24) y posteriormente los ácidos hidroxicinámicos
fueron identificados y cuantificados a su vez por HPLC como se describió previamente en
materiales y métodos (Cuadro 20).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 2 4 6 8 10 12
Rem
anen
te d
e A
BT
S.+
, (%
)
tiempo (minutos)
pulpa de café fermentada esterificados pulpa de café fermentada libres
pulpa de café sin fermentar esterificados pulpa de café sin fermentar libres
55
Figura 24. Concentración de ácidos fenólicos concentrados en acetato de etilo.
Cantidad de ácidos hidroxicinámicos por HPLC
Extracciones
Ferúlico
(g/L)
Caféico
(g/L)
Cumárico
(g/L)
Clorogénico
(g/L) Total (g/L)
Total
(mg/Kg)
Pulpa de café
no
fermentada 7.1E-5 1E-4 3.3E-5 5.6E-4 7.6E-4 76.4
Pulpa de café
fermentada 2.5E-5 2.4E-4 1E-5 1.5E-4 4.2E-4 42.5
Cuadro 9. Cantidad de ácidos hidroxicinámicos en la pulpa de café fermentada y no fermentada
por HPLC.
6.2714.47
40.00
16.40
0.00
10.00
20.00
30.00
40.00
50.00
60.00
Pulpa de café sin fermentar Pulpa de café fermentada
g P
olif
en
ole
s/kg
de
pu
lpa
de
caf
é
Polifenoles esterificados
Polifenoles libres
56
En la figura 24, al cuantificar los compuestos fenólicos totales (en base seca) fue de 46.27 y de
30.87 g/Kg para la pulpa de café no fermentada y fermentada con A. tamarii respectivamente.
En la tabla 9 vemos que en la pulpa de café no fermentada hay una mayor cantidad de ácidos
hidroxicinámicos (76.4 mg/Kg), en tanto que en la pulpa de café fermentada solo recuperamos
(42.5 mg/Kg) observándose una perdida en la segunda. Esto último puede ser explicado por qué
posiblemente Aspergillus tamari al liberar los ácidos hidroxicinámicos de la pared celular de la
pulpa los utiliza en su metabolismo. Finalmente existen diferencias significativas en la cantidad
de cada uno de los ácidos hidroxicinámicos de la pulpa no fermentada respecto de la
fermentada., por ejemplo, la cantidad de ácido cafeíco en la pulpa de café fermentada se
incrementa al doble y el ácido clorogénico disminuye. Mostrandose una hidrólisis enzimática del
ácido clorogénico a ácido caféico. Así también observamos una disminución de acido ferúlico y
acido p-coumárico en la pulpa de café fermentada respecto de la no fermentada.
57
CONCLUSIONES
58
7. Conclusiones
Para la cantidad de azúcares se obtuvo una cantidad en el rango reportada por Urbaneja et al
1997, la diferencia la atribuimos a las hidrólisis realizadas, debemos recordar que los azúcares se
encuentran unidos a la pared celular por dos tipos de enlaces; un enlace éter o un enlace ester.
En la hidrólisis alcalina se tiene más afinidad por enlaces tipo éster, mientras para la hidrólisis
ácida se tiene más afinidad por enlaces tipo éter.
La cantidad de polifenoles totales de la pulpa del café, medidos por el método de Folin-
Ciocalteau, no han sido reportados en la literatura en el caso de la pulpa de café, ya que la
mayoría de los trabajos se enfocan a la cuantificación de ácidos hidroxicinámicos por HPLC
(Ramírez-Coronel 2004).
En el caso de la capacidad antioxidante no se tienen reportes de ésta, pero se hace una
comparación directamente con la reportada para el grano de café, teniendo una capacidad
antioxidante mucho mayor para la pulpa de café, que para el café de una orden de 5 veces
mayor, esto puede deberse a que la pulpa de café ya tratada puede haber liberado más
polifenoles en proceso de tratado del café y por lo mismo tendríamos más compuestos que
ayuden a la capacidad antioxidante. En comparación con otros sustratos vegetales como el vino
(10.9 mM equv. Trolox), jugo de naranja (5.06 mM equv. Trolox), espinacas (0.28 mM equv.
Trolox), tomate (1.17 mM equivalentes Trolox), el reportado en este trabajo está por encima de
los mencionados para la pulpa de café (69.68 mM equivalentes Trolox).
En el caso de los parametros cinéticos, dosis efeciente cincuenta (ED50), el tiempo eficiente
cincuenta (TED50) y la eficiencia antiradical (E.A), nos permiten hacer una estimación de
acuerdo a la cantidad en gramos de polifenoles y el tiempo de reacción para poder clasificar a
los compuestos y muestras como mejores antioxidantes o capacidades antioxidantes.
Se estableció una relación entre los compuestos fenólicos y tipos de ácidos hidroxicinámicos en
su capacidad antioxidante. Donde observamos que hay mayor capacidad antioxidante en la
pulpa fermentada teniendo una concetración menor de comuestos fenólicos ya que tiene una
59
perdida del 66% de otros compuestos fenólicos con respecto a la pulpa de café no fermentada.
En le caso de los ácidos hidroxicinámicos hay tambien una disminución del 55.6%.
Comparativamente la pulpa de café fermentada con la no fermentada contiene un contenido
menor de ácidos fenólicos totales y un contenido menor ácidos hidroxicinámicos totales. Los
cuales son metabolizados por le microorganismo con la que se fermentó la pulpa de café
(Aspergillius tamarii).
60
PERSPECTIVAS
61
8. Perspectivas
Si consideramos que los compuestos fenólicos de la pulpa de café, son una nueva fuente de
antioxidantes naturales, se podran utilizar para el desarrollo de farmacos o utilizarlos en
alimentos, se tendría que realizar los siguientes estudios:
1) Desarrollar un proceso para obtener una buena concentración de ácidos hidroxicinámicos por
vía enzimática, deshidratados y libres de solventes.
2) Realizar estudios de estabilidad a temperatura y fotoestabilidad de los compuestos fenólicos
obtenidos.
3) Evaluar la viabilidad en estudios in vivo para ver como se comportan en un sistema biológico.
62
BIBLIOGRAFÍA
63
9. Bibliografía
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69
ANEXOS
70
10. Anexos
Anexo A. Preparación de curva patrón de azúcares totales
Se mezclaron 0.25g de sacarosa en 250 ml de agua para la cual se tiene una concentración final
de 1 g/L.
Después se hicieron las siguientes disoluciones para tener las concentraciones que desean
tener.
Concentración
(mg/L)
Vol. de sol
patrón ml
Vol. de agua
(ml)
Vol. de reactivo
(ml)
Volumen final
(ml)
0 0 1 2 3
100 0.1 0.9 2 3
200 0.2 0.8 2 3
300 0.3 0.7 2 3
400 0.4 0.6 2 3
500 0.5 0.5 2 3
600 0.6 0.4 2 3
700 0.7 0.3 2 3
800 0.8 0.2 2 3
900 0.9 0.1 2 3
1000 1 0 2 3
Preparación de sol reactivo
71
La solución reactivo se preparó adicionando 1mg de fenol por lmL de ácido sulfúrico. Por lo que
se preparó la cantidad necesarios de reactivo necesarios para agregar a los tubos con las
muestras.
Teniendo las concentraciones en tubos y la solución reactiva, se agregaron 2 ml de sol. Reactivo
por cada tubo con solución estándar. El volumen final de la reacción fue de 3 ml por tubo, los
cuales se metieron en baño maría a una temperatura de 93ºC durante 9 minutos, después se
enfríaron a temperatura ambiente (Dubois et al 195, modificado). Ya fríos se lee la absorbancia a
una longitud de onda de 480 nm. En nuestra curva patrón se obtienen los siguientes datos:
Concentración mg/L Absorbancia
0 0
100 0.10
200 0.22
300 0.36
400 0.43
500 0.59
600 0.73
800 1.09
1000 1.22
72
Anexo B. Preparación de curva patrón de polifenoles totales
Para la preparación de la curva patrón de polifenoles, se preparó una solución madre diluyendo
0.01 gramos de acido clorogéncio y se aforó a 10 ml de metanol, para tener una concentracion
final de 2.8 mM. Con esta solucion se prepararon la concetraciones que a continuación se
presentan:
Concetración
(mM)
Vol. de sol.
Estándar
(ml)
Vol de
metanol-ácido
acético 80/20
(ml)
Vol de
reactivo
(ml)
Vol. de sol
CaCO2 200
g/L (ml)
Vol de
agua (ml)
Vol. final
(ml)
0 0 10 0.25 1 3.5 14.75
0.2 0.5 9.5 0.25 1 3.5 14.75
y = 0.0013x - 0.0255R² = 0.9901
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
0 200 400 600 800 1000 1200
Ab
sorb
anci
a
Concetración mg/L
Curva patrón de Azúcares totales
73
0.4 0.5 9.5 0.25 1 3.5 14.75
0.6 0.5 9.5 0.25 1 3.5 14.75
0.6 0.5 9.5 0.25 1 3.5 14.75
1 0.5 9.5 0.25 1 3.5 14.75
Teniendo los tubos con los volumenes finales, estos fueron metidos en baño maría a 75 ºC
durante 15 minutos. Despues se dejó enfriar a temperatura ambiente. Se leyó a una longitud de
onda de 700 nm obteniendo las siguientes absorbancias (Kuskoki et al, 2005)
Concentración mM de Acido
clorogénico Absorbancia
0 0
0.2 0.13
0.4 0.17
0.6 0.20
0.8 0.29
1 0.39
74
La curva patron esta dada por equivalentes de àcido clorogénico
La conversión de mM a g/L se hizo de la siguiente manera:
��1000 = � ∗ �� = ��
! ∗ " #�� $ = #
!
mM = concentración en mili-molar
M = molaridad
PM = Peso molecular del estándar
y = 0.9998x + 0.0232R² = 0.9627
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0.45
0.5
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4
Abs
orb
anci
a
Concentraciones (g/L)
Curva patrón de polifenoles totales
75
Anexo C. Curvas patrón de capacidad antioxidante de trolox, ácido ferúlico y acido clorogénico
por el método de ABTS
El ABTS•+ se preparó agregando una concentración de 7mM de ABTS y 24 mM de persulfato de
potasio en metanol, ésta se agitó para homogenizar. La solución se dejó reposar durante 24
horas en oscuridad y temperatura ambiente para generar el radical ABTS•+.
Se preparó una solución madre de 2 mM de estándar Trolox y se realizaron diluciones para
obtener las concentraciones adecuadas para la realización de la curva patrón. Esta se hizó de la
siguiente manera se tomó 1 ml de solución ABTS•+ radical y se agregaron 10 µL de antioxidante
(estándar).
El método a seguir es el siguiente: se diluye la solución ABTS•+ radical hasta que se tenga una
absorbancia de 0.7±0.02, luego se toma 1 mL de solución ABTS.+ radical, se agrega 10 µL de
solución antioxidante (estándar) y se deja reposar durante 6 minutos y se lee la absorbancia a
una longitud de onda de 734 nm (Re et al, 1998)
Curva patrón Trolox
Concentración mM Absorbancia % de inhibición
0 0 100 0
0.4 0.636 90.8 9.2
1.2 0.508 72.5 27.4
1.6 0.399 57 43
2 0.342 48.8 51.1
76
Este mismo procedimiento se realiza para el ácido clorogénico y el ácido ferúlico
Curva patrón Ferúlico
Concentración mM Absorbancia % de inhibición
0 0 100 0
0.4 0.5745 82.0714 17.9286
0.8 0.55 78.5714 21.4286
1.6 0.3945 56.3571 43.6429
2 0.309 44.1429 55.8571
y = 26.059x - 0.9585R² = 0.9923
0
10
20
30
40
50
60
70
0 0.5 1 1.5 2 2.5
% d
e in
hib
ició
n d
e co
lor
Concetración (mM)
Curva patrón Trolox
77
Curva patrón de Clorogénico
Concentración mM Absorbancia % de inhibición
0 0 100 0
0.4 0.67 95.7 4.2
0.8 0.566 80.8 19.1
1.2 0.52 74.2 25.7
1.6 0.422 60.2 39.7
2 0.369 52.7 47.2
y = 26.364x + 2.4618R² = 0.9814
0
10
20
30
40
50
60
70
0 0.5 1 1.5 2 2.5
% d
e in
hib
ició
n
Concetración (mM)
Curva patrón de Ferúlico
78
y = 70.418x - 2.2585R² = 0.9846
-10
0
10
20
30
40
50
60
0 0.2 0.4 0.6 0.8
Ab
sorb
anci
a
Concentración (g/L)
Curva Patrón de Clorogénico
79
Anexo D. Obtención de parámetros cinéticos para la capacidad antioxidante
Cálculo del ED50 para lo diferentes estándares.
Para el cálculo de este parámetro se preparó una solución madre de los diferentes ácidos
hidroxicinámicos de 5 mM. Posterimete se realizaron diluciones para obtener los siguientes
concentraciones: 5.0, 4.0, 3.0, 2.0, 1.0, 0.5, 0.025 todo en mM. Se realiza la técnica de ABTS
como se menciona anterimente, con la diferencia de que el tiempo de reacción de 30 minutos.
Despues se realizaron cinéticas a estas diferentes concentraciones como se muestra en la
siguiente gráfica (Jaráz-Pérez et al, 2008)
En el eje de las ‘x’ se tiene el tiempo y en el eje de la ‘y’ el porcentaje de remanente del ABTS•+
radical
De la grafica se toman las absorbancias finales o donde ya no hay cambios significativos para
realizar una curva patrón como se muestra a continuación
0.000
0.100
0.200
0.300
0.400
0.500
0.600
0.700
0.800
0 10 20 30 40
Ab
sorb
anci
a
Tiempo (minutos)
Cinética del ácido caféico
0.25 mM
5 mM
1 mM
2 mM
80
Se toma la ecuación de la recta
y = ax + b
Donde: y es el porcentaje de remanente de ABTS•+ radical
x es la concetración que se quiere calcular ED50
Con la ecuación de la recta se calcula el ED50 de cada uno de los estáandares con respecto a su
curva patrón al igual que las muestras de pulpa de café.
A continucación se presentan las curvas patron del acido tánico, ferúlico, clorogénico y las
muestras de pulpa de café.
y = -31.039x + 99.92R² = 0.9977
0
20
40
60
80
100
120
0 0.5 1 1.5 2 2.5
Re
ma
ne
ne
te d
e A
BT
S•+
, ( %
)
Concentración de caféico (mM)
% Remanente de ABTS•+ en ácido caféico
81
y = -2508.9x + 96.673R² = 0.9512
0
20
40
60
80
100
120
0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05
Rem
anen
te A
BT
S•+,(
%)
Concetración de Tánico (mM)
% Remanente de ABTS•+ en ácido tánico
y = -20.064x + 74.976R² = 0.9008
0
10
20
30
40
5060
70
80
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
Rem
ante
nte
de
AB
TS•+,(
%)
Concetración de ferúlico (mM)
% Remanente de ABTS•+ en ácido ferúlico
82
y = -23.604x + 99.358R² = 0.9884
020406080
100120
0 1 2 3 4 5
Rem
anen
te d
e A
BT
S•+,(
%)
Concetración de clorogénico (mM)
% Remanente de ABTS• + en ácido clorogénico
y = -8E+06x + 140.3R² = 0.9993
0
20
40
60
80
100
0.0E+00 5.0E-06 1.0E-05 1.5E-05 2.0E-05Rem
anen
te d
e A
BT
S•+,(
%)
Concentración (g)
% Remanente deABTS•+ en muestras de pulpa de café en acetato
83
Anexo E. Cálculo del TED50
Para el cálculo del TED50 se retoman las graficas de la cinéticas, en la cual se toman las
concetraciones que pasan el 50% del remanente del ABTS y realizando una regresión para la
curva en este caso logaritmica se obtiene lo siguiente.
y = -2E+06x + 101.89R² = 0.9803
-20
0
20
40
60
80
100
120
0 0.00001 0.00002 0.00003 0.00004 0.00005Rem
anen
te d
e A
BT
S•+,(
%)
Concentración (g)
% Remanente de ABTS•+ en muestras de fenoles esterificados en NaOH
y = -11.23ln(x) + 99.791R² = 0.9339
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 500 1000 1500 2000
Rem
anen
te d
e A
BT
S•+, (
%)
Tiempo (minutos)
Cinética de ácido ferúlico
84
La cinética se grafica el tiempo de reaccion contra el porcentaje de remanente de ABTS•+
Se toma la ecuación de la curva en este caso como se menciono un ecuación logaritmica
y = aln(x) + b
Donde : y es el remanente del ABTS
x es el tiempo que se desea calcular
A continucación mostramos los cinéticas del acido tánico, ferúlico, clorogénico y la muestras de
la pulpa de café.
y = -34.87ln(x) + 75.949R² = 0.9218
0
20
40
60
80
100
120
0 2 4 6 8 10 12
Rem
anen
te d
e A
BT
S•+,
(%)
Tiempo (minutos)
Cinética del clorogénico
![Metanol Final[1]](https://img.pdfslide.es/doc/110x75/55cf9d77550346d033adc17e/metanol-final1.jpg)
