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INTRODUCCION
El ácido ribonucleico (ARN) y el ácido desoxirribonucleico (ADN) son macromoléculas que intervienen en el almacenamiento y la transferencia de la información genética, son componentes fundamentales de la célula y constituyen entre el 5 y 10% del proceso. Normalmente no se encuentran solos si no que se encuentran formando nucleoproteínas, ya que suelen unirse a determinados tipos de estas como las histonas.
El ARN se localiza tanto en el citoplasma celular como en el núcleo, mitocondrias y cloroplastos, mientras que el ADN se sitúa fundamentalmente en el núcleo de la célula y también en cloroplastos mitocondrias en pequeñas cantidades. Los grupos fosfato secundarios que se repiten en el DNA y constituyen los puentes entre nucleótidos adyacentes, tienen un pK bastante bajo y se ionizan por completo a pH bastante superior a 4. El DNA es el almacén de la información genética, mientras que el RNA es el que interviene en la expresión de esa información.
El ADN se desnaturaliza fácilmente y debe trabajarse con cuidado para obtener un producto estructuralmente semejante al encontrado en la célula. Debe eliminarse la tensión mecánica y condiciones físicas y químicas extremas y deben inhibirse las nucleasas. Se puede agregar citrato de sodio para ligar Ca++ y Mg++ los cuales son cofactores de las DNasa. Las nucleoproteínas son solubles en agua y soluciones de alta concentración iónica, pero son insolubles en soluciones de baja concentración iónica (0.05- 0.25 mol/L) esta propiedad es usada en su extracción. Las nucleoproteínas de DNA son solubles en soluciones salinas concentradas, pero son insolubles en soluciones salinas diluidas.
Una fuente importante de nucleoproteínas son los tejidos ricos en núcleos (leucocitos, espermatozoides, células hepáticas, etc.). En soluciones salinas concentradas las desoxirribonucleoproteínas forman disoluciones muy viscosas y se solubilizan en soluciones salinas diluidas.
Al ser precipitadas, las nucleoproteínas se sedimentan en forma de hilos. Una de las técnicas empleadas para diferenciar nucleoproteínas de DNA de las nucleoproteínas de RNA es la reacción con difenilamina, que frente a las nucleoproteínas de DNA da
una coloración azul a diferencia del color verde que da frente a las nucleoproteínas de RNA.
Se ha empleado frecuentemente la reacción de difenilamina de Dische, esta depende de la formación de color azul al calentar DNA con difenilamina en disolución acida. La presencia de azúcar reducido se detecta más en los nucleótidos de purina que en los de piridina. Para incrementar la sensibilidad de la reacción y reducir la interferencia de otros compuestos se añade acetaldehído y se deja quela reacción se lleve a cabo a 100°C la reacción transcurra durante varias horas a 30°C.En presencia de NaCl 1M la polilisina interacciona específicamente con el DNBA rico en A + T pudiendo precipitarlo de una mezcla con DNA rico en G+C. por otra parte la poliarginina interacciona preferentemente con el DNA rico en G+C.
La concentración de ADN en la muestra se puede estimar con la reacción de la difenilamina. Este colorante reacciona selectivamente con 2-desoxipentosas. En disolución ácida la desoxipentosa se convierte en el altamente reactivo β-hidroxilevulínaldehído que reacciona con la difenilamina para dar un compuesto azul. Una curva patrón de concentraciones conocidas de DNA nos permitirá determinar el contenido en DNA del problema por interpolación sobre la recta patrón de las densidades ópticas de la disolución problema.
MATERIALES Y REACTIVOS.
Hígado de rata Mortero con pistilo Vidrio de reloj Vaso de precipitados de
500 ml Vaso de precipitado de
250 ml Bureta Tubos para centrífuga
Pinzas para tubo de ensaye
Baño maría Gradilla Pipetas de 5 y 10 ml NaCl 1 N Agua destilada Reactivo de difenilamina NaOH al 4%
FICHAS DE SEGURIDAD
DIFENILAMINA
CLORURO DE SODIO NaCl
HIDROXIDO DE SODIO NaOH
PROCEDIMIENTO
1) DE NUCLEOPROTEINA DE DNA1. Pesar 10g de hígado de conejo, triturarlo durante 10-15 minutos, agregando
poco a poco 70 ml de NaCl.2. Transferir la solución a tubos para centrífuga. Centrifugar los tubos durante 10 minutos a 2500 rpm.3. Decante el líquido cobre la probeta y mida el volumen obtenido.4. En el vaso de precipitado de 500 ml agregue una relación de 6 ml de agua por ml de sobrenadante obtenido.5. Vierta lentamente el sobrenadante en el agua que está en el vaso de precipitado y girando lentamente con la varilla de madera trate de enrollar los hilos de nucleoproteína.
2) REACCIÓN DE RECONOCIMIENTO DE DNA1. Filtre el precipitado de nucleoproteínas obtenido anteriormente.2. Tome una pequeña cantidad del precipitado y disuélvalo en un tubo de ensaye con 1 ml de NaOH al 4%. 3. Añada 1 ml de reactivo de difenilamina y ponga el tubo durante 15 o 20 minutos en baño maría hirviendo.4. La aparición de una coloración azul indica la presencia de DNA.
AISLAMIENTO DE NUCLEOPROTEINA DE DNA
OBSERVACIONES Y RESULTADOS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Mediante el empleo de esta técnica primero se indujo el rompimiento de las
membranas celulares para liberar los núcleos y después se colocó en una solución
hipertónica (NaCl) lo cual produjo que se estallaran las membranas para que se
liberara el DNA y se centrifugo para que se separara el DNA del resto de los
orgánulos, mediante esta técnica se permite la formación de pequeños hilos de la
nucleoproteína del DNA que se evidencio al colocar el sobrenadante en el medio
acuoso.
CONCLUSION
De acuerdo a lo obtenido experimentalmente se pudo observar la formación de los
pequeños hilos de DNA, que es el propósito principal de la práctica, lo cual comprueba
el proceso para el aislamiento de la nucleoproteína de DNA presente en el hígado y
que posteriormente fue empleada en la siguiente parte experimental.
REACCION DE RECONOCIMIENTO DE DNA
OBSERVACIONES Y RESULTADOS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Después del proceso del aislamiento del DNA, una porción del material aislado se hiso
reaccionar con el reactivo difenilamina el cual origina que la cadena lineal de una
desoxipentosa se convierte a la forma β-hidroxilevulinoaldehido altamente reactiva,
que reacciona con difenilamina para dar un complejo azul, lo cual evidencia la
presencia del ADN.
CONCLUSION
Al término de la parte experimental se puede concluir que mediante esta técnica, se
permitió evidenciar de una forma cualitativa la presencia del DNA mediante la
presencia de una coloración tenue de color azul gracias a la formación de un complejo
con el reactivo de difenilamina, con lo que se puede concluir que se alcanzó en
propósito de la práctica, determinar la presencia del DNA
CUESTIONARIO
1.- ESCRIBA A ESTRUCTURA DE LOS 4 NUCLEÓTIDOS QUE PODEMOS
ENCONTRAR EN EL DNA.
El nucleótido en el ADN consiste en un azúcar (desoxiribosa), una de cuatro bases
(citosina (C), timina (T), adenina (A), guanina (G)), y fosfato. La citosina y la timina son
bases pirimídicas o pirimidinas, mientras que la adenina y la guanina son bases púricas o
purinas. El azúcar y la base juntas, constituyen un nucleósido.
2.- ¿QUÉ FUNCIÓN TIENEN LOS CROMOSOMAS?
La función de los cromosomas consiste en facilitar el reparto de la información
genética contenida en el ADN de la célula madre a las hijas.
3.- ¿CUÁL ES LA COMPOSICIÓN DE LOS CROMOSOMAS?
Los cromosomas son estructuras en forma de bastón que aparecen en el momento de
la reproducción celular, en la división del núcleo. Están constituidas químicamente por
ADN más histonas, puesto que son simplemente cromatina condensada.
4.- ¿QUÉ DIFERENCIA EXISTE ENTRE LOS NUCLEÓTIDOS DE DNA Y LOS DE
RNA?
La adenina y la timina son complementarias (A=T), uniéndose gracias a dos puentes
de hidrógeno, mientras que la guanina y la citocina (G=C) se unen mediante tres
puentes de Hidrógeno, dado que en el ARN no existe TIMINA la complementariedad
se establece entre adenina y URACILO (A=U) mediante dos puentes de hidrógeno.
CONCLUSIÓN GENERAL
De acuerdo con los objetivos planteados se pudo observar al as nucleoproteínas con
la formación de hilos de color blanco en el vaso de precipitado, al agregarle agua; y
también se pudo observar si era DNA o RNA mediante el reactivo de difenilamina
observando un color azul (en peste caso) para DNA. y verde para RNA.
