Dossier Técnico Septiembre 2017

DOSSIER NUCAPS® 2/19

1 PRESENTACIÓN

NUCAPS@ es una empresa dedicada al desarrollo nanotecnológico creada por un consorcio formado por un centro tecnológico (CNTA), la Universidad de Navarra y una empresa farmacéutica (IDIFARMA).

NUCAPS@ ofrece la aplicación industrial de nuevas soluciones de micro y nanoencapsulación de bioactivos y probióticos basadas en el uso de proteínas alimentarias (GRAS) como caseína o zeína, para la administración oral y la liberación controlada de fármacos/sustancias activas y/o microorganismos con fines nutricionales, alimentarios, cosméticos y farmacéuticos.

La tecnología, protegida por cuatro solicitudes internacionales de patente, ha sido probada satisfactoriamente a escala laboratorio y piloto y escalada con fines comerciales e industriales. La tecnología incluye procesos simples, reproducibles y no costosos.

El tamaño de las nanocápsulas ha sido cuidadosamente ajustado para evitar la calificación de nanomateriales según la definición contenida en la recomendación de la Comisión Europea publicada el 18 de octubre de 2011. Además, completos estudios toxicológicos (agudos y subcrónicos) y ensayos de biodistribución utilizando radioisótopos (125y 67Ga) han evaluado la seguridad de las nanocápsulas desarrolladas.

Las nanocápsulas y biocápsulas desarrolladas son de interés para la encapsulación de diversos activos, compuestos y/o bacterias y el producto final se presenta como un polvo seco que puede ser fácilmente envasado en una cápsula, bolsita o comprimido con el fin de:

Aumentar la vida útil de compuestos rápidamente degradables (por ejemplo para minimizar las oxidaciones activadas por la luz).

Modificación de propiedades físico-químicas con el fin de aumentar la solubilidad de los ingredientes o compuestos activos o formular suspensiones estables (por ejemplo, aumentar la estabilidad de un antioxidante lipofílico dispersado en agua) o para lograr un mayor facilidad de dosificación (por ejemplo, cápsulas, comprimidos, etc.).

Enmascarar sabores o propiedades organolépticas desagradables (por ejemplo, el olor a pescado en el caso de alimentos enriquecidos con ácidos grasos poliinsaturados).

Minimizar las incompatibilidades entre el compuesto encapsulado y otros compuestos químicos presentes en la formulación (por ejemplo, excipientes en formulaciones farmacéuticas o nutracéuticos, etc.)

Mejorar la biodisponibilidad de compuestos de baja solubilidad y/o baja permeabilidad y lograr una liberación controlada (protección contra la barrera gástrica y la liberación en el intestino), aumentando así la eficacia.

Mejorar la estabilidad de almacenamiento de bacterias probióticas a temperatura ambiente en comparación con las liofilizadas (biocápsulas de caseína).

Mejorar la vida útil de las bacterias probióticas con respecto a las liofilizadas a 4 º c (biocápsulas de caseína y soja).

Mejora significativa de la supervivencia en condiciones gastrointestinales (biocápsulas de caseína y soja).

Mejora de la actividad inmunológica Th1 en comparación con el probiótico libre (actividad contra la mayoría de las clases de infecciones intracelulares).

Contacto:

Mariano Oto CEO Nucaps Nanotechnology SL E-mail: mariano.oto@nucapsnanotechnology.com

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2 PRODUCTO NUCAPS

2.1 FORMULACIÓN CON PROTEINAS NATURALES

Las biocápsulas y nanocápsulas de Nucaps® están hechas de proteína natural que se obtiene de la leche, maíz, soja y otros excipientes que se consideran sustancias generalmente reconocidas como seguras (GRAS). Por lo tanto, son adecuadas para su uso en productos alimenticios y nutracéuticos.

Las nanocápsulas y biocápsulas pueden ser de interés para la encapsulación de un gran número de activos, compuestos o bacterias.

• Para aumentar la vida útil de los compuestos rápidamente degradables

• Para minimizar incompatibilidades

• Promover la biodisponibilidad de compuestos de baja solubilidad y baja permeabilidad

• Para mejorar el efecto de los probióticos

2.2 DERECHOS DE PROPIEDAD INTELECTUAL

González Ferrero, C., González Navarro, C.J., Irache Garreta, J.M., Marín Calvo, B., Romo Hualde, A., Virto Resano, R., inventores. Microparticles for encapsulating probiotics, obtaining said microparticles and uses thereof. UNAV, CNTA, concesionarios. Priority: EP15382634.2. (17/12/2015).

Agüeros Bazo, M., Esparza Catalán, I., González Ferrero, C., González Navarro, C.J., Irache Garreta, J.M., Romo Hualde, A., inventors. Nanoparticles for encapsulating compounds, the preparation and uses thereof. ICT, CNTA. Priority: ES201030286 (26/02/2010). International Application No: PCT/ES2011/070118 (24/02/2011). Publication No: WO2011/104410.

Agüeros Bazo, M., Esparza Catalán, I., González Ferrero, C., González Navarro, C.J., Irache Garreta, J.M., Romo Hualde, A., inventors. Nanoparticles for encapsulation of compounds, the production and uses thereof. ICT, CNTA. Priority: ES201031095 (16/07/2010). International Application No: PCT/ES2011/070518 (15/07/2011). Publication No: WO2012/007628.

Agüeros Bazo, M., Esparza Catalán, I., González Ferrero, C., González Navarro, C.J., Irache Garreta, J.M., Romo Hualde, A., inventors. Microparticles for encapsulation of probiotics, their preparation and uses. ICT, CNTA. Priority: ES201231058 (05/07/2012). International Application No: PCT/ES2013/070477 (05/07/2013).

2.3 MULTITUD DE APLICACIONES EN PRODUCTOS DE CONSUMO

Las nanocápsulas y biocápsulas son adecuadas para su uso en la formulación de medicamentos, cosméticos, alimentos y nutracéuticos con bajo pH y, en el caso de biocápsulas, con baja actividad acuosa, tales como:

• nutracéuticos • productos dietéticos • alimentación infantil • recubrimientos comestibles

• productos lácteos • salsas • embutidos • cereales y panadería

• chocolates • infusiones or café • etc.

2.4 SEGURIDAD

El tamaño de las nanocápsulas ha sido ajustado con el fin de no a ser considerado como un nanomaterial como se define en la recomendación de la Comisión Europea publicada el 18 de octubre de 2011. Además, completos estudios toxicológicos de GLP (agudos y subcrónicos) y ensayos de biodistribución utilizando radioisótopos (125y 67Ga) ha evaluado la seguridad de las nanocápsulas desarrolladas.

La toxicidad aguda fue estudiada en un modelo animal siguiendo directrices 425 y LD50 de la OCDE y la estimación fue superior a 2000 mg/Kg bw para las nanocápsulas de caseína y zeína (Gráfico 1).

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Gráfico 1. Estudio de toxicidad aguda: dosis única por vía oral

Posteriormente realizó un estudio subcrónico según las Directrices de la OCDE 407/408 y no reveló signos de toxicidad y efectos adversos (Gráfico 2).

Gráfico 2 . Toxicidad subcrónica: con repetición de dosis.

Por otra parte, se realizó un análisis de biodistribución con el fin de estudiar la ubicación, la magnitud y la cinética. Los resultados tras la administración por vía oral de nanopartículas

67Ga

muestran que son estables in vivo, no siendo absorbidas y eliminadas por el tracto gastrointestinal en menos de 48 h.

Gráfico 3. Imágenes SPECT-CT, muestran biodistribución de nanopartículas 67Ga administradas oralmente

OECD guideline 425• Limit test 2000 mg/Kg bw

• Duration of the study 14 days

• LD50 Estimation

GLP studies

• Weight register

• Irwin Test: behaviour, physiological function

• Blood extraction: hematology, biochemistry

• Histopatology

1 72 14

• Blood samples

• Sacrifice

• Necropsy

W W W W

IT IT IT IT IT IT IT IT IT IT IT IT IT IT

W

IT

Weight register

Irwin Test

Casein NP: LD50 > 2000 mg/kg bw

Zein NP: LD50 > 2000 mg/kg bw

GLP studies

• Weight register (daily)

• Irwin Test: behaviour, physiological function

• Blood extraction: hematology, biochemistry

• Histopathology

OECD guidelines 407 / 408• Three doses, one control:

• 50 mg/kg150 mg/kg, 300 mg/kg

• Control: Drinking water

• Daily administered

• Duration of the study 28 / 90 days

SacrificeW

IT

Weight register

Irwin Test

IT

w w

IT

w w w

IT

w w w

IT

w w w

IT

w w

ITIT

wwwww

0 30 60 90

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2.5 PROPIEDADES FÍSICOQUÍMICAS MEJORADAS DE INGREDIENTES FUNCIONALES/ MOLÉCULAS BIOACTIVAS

Uno de los principales problemas para formular alimentos funcionales es la baja solubilidad de muchos activos, tales como ácidos grasos, flavonoides, etc. Este hecho lleva a la pobre estabilidad de las formulaciones, con precipitación de los activos, dando un aspecto poco agradable y una dosificación incontrolada.

Nucaps® permite la formulación de dispersiones de larga estabilidad incluso con compuestos altamente lipofílicos, como se muestra en el Gráfico 4. Por otra parte, se pueden enmascarar problemas organolépticos conocidos, gustos amargos u olores desagradables, como el olor a "pescado" de productos lácteos enriquecidos con omega3 encapsulando los activos como el DHA.

Gráfico 4. Estudio de dispersión de un antioxidante lipofílico en agua o directamente libre (compuesto A) o encapsulado en nanopartículas (B). La imagen demuestra que el antioxidante se dispersa bien y no presenta agregados o sólidos precipitados (C) imágenes SEM de nanocápsulas de DHA (ácido docosahexaenoico)

2.6 BIODISPONIBILIDAD MEJORADA DE INGREDIENTES FUNCIONALES/MOLÉCULAS BIOACTIVAS

Con frecuencia, algunos compuestos activos presentan una pobre biodisponibilidad, debido a su degradación en lumen gástrico o a sus propiedades fisicoquímicas, llevando a la ausencia o a una muy baja actividad. Los activos encapsulados de Nucaps® han demostrado un aumento significativo en la biodisponibilidad oral, que propician el incremento en las concentraciones en suero o plasma, desde el doble, en el caso del ácido fólico, hasta 30 veces en el caso del resveratrol (Gráfico 5).

Por otra parte, la encapsulación produce una cinética de separación más lenta y con niveles sostenidos durante largos períodos de tiempo, mejorando la dosificación y la adherencia.

Este objetivo se ha logrado mediante el diseño de nanocápsulas, con un tamaño desde c. 150 a c. 350 nm, consiguiendo muy buenas especificaciones farmacocinéticas.

Tabla 1. Especificaciones fisicoquímicas de algunas nanopartículas de Nucaps®. EE: eficacia de encapsulación (masa de activo encapsulado / masa total de activo en la formulación)

NP Proteina Activo Tamaño (nm) PDI Potencial Zeta

(mV) Carga Activa (µg/mg NP) EE (%)

FA-CNP Caseína Ácido Folico 122±2 0.26±0.02 -17.0±1.2 23.8±1.3 32.49 FA-ZNP Zeína Ácido Folico 193±3 0.16±0.02 -29.1±3.3 53.6±6.5 57.90 RES-C-NP Caseína Resveratrol 220±17 0.20±0.03 -19.4±0.4 37.3±0.8 84.2 RES-Z-NP Zeína Resveratrol 322±10 0.20±0.03 -49.6±2.4 116.2±1.9 94.5 QUER-C-NP Caseína Quercetina 251±9 0.26±0.02 -14.3±1.1 22.3±0.3 79.4 QUER-Z-NP Zeína Quercetina 378±7 0.21±0.01 -45.2±2.1 76.1±2.9 93.4

A B C

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Gráfico 5. Estudios PK para nanocápsulas de Ácido Fólico (A), Resveratrol (B) y Quercetina (c). Las Tablas muestran las dosis y algunos parámetros PK. AUC: Área bajo la curva. FR: fracción biodisponible en comparación con la administración libre.

0

100

200

300

400

500

0 5 10 15 20 25

Sse

rum

co

nce

ntr

atio

n (

ng

/ml)

Time (h)

Oral solutionFA-CNPFA-ZNP

0

100

200

300

400

500

0 5 10 15 20 25

Pla

sma

con

cen

trat

ion

(n

g/m

l)

Time (h)

RES solutionRES-C-NPRES-Z-NP

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

0 5 10 15 20 25

Pla

sma

con

cen

trat

ion

(n

g/m

l)

Time (h)

SuspensionSolution PEG:waterC-NP-QUERZ-NP-QUER

Wistar rats Dosis: 1 mg/kg

Cmax (µg/ml)

AUC (µg

h/ml) Fr (%)

FA solution 0.12 1.3 36 FA-CNP 0.24 1.9 52 FA-Z-NP 0.43 2.5 71

Wistar rats Dosis: 10 mg/kg

Cmax (mg/ml)

AUC (mg

h/ml)

Fr (%)

RES solution 0.10 0.19 1.4 RES-C-NP 0.23 3.51 28

RES-Z-NP 0.40 6.20 50

Wistar rats Dosis: 25 mg/kg

Cmax (mg/ml)

AUC (mg

h/ml) Fr (%)

QUER suspension 0.4 0.7 0.3 QUER solution 1.3 7 3.8 C-NP-QUER 2.2 20 11.2

Z-NP-QUER 3.1 61 39.6

A

B

C

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2.7 AUMENTO DE ESTABILIDAD EN PROBIÓTICOS

Los probióticos se definen como suplementos alimentarios microbianos vivos que afectan beneficiosamente al huésped mejorando el balance microbiano intestinal. Las bacterias del ácido láctico (LAB) son los organismos más utilizados como probióticos. La investigación ha demostrado que contribuyen a la salud gastrointestinal a través de sus propiedades anti- patógenas, antiinflamatorias y otras. Sin embargo, para que consigan su efecto, deben adaptarse al ambiente intestinal hostil y ser capaces de sobrevivir en el tracto intestinal durante el suficiente tiempo cuando se administran por vía oral. El PH gástrico, la exposición a las enzimas digestivas, a sales biliares y su capacidad para adherirse a las células epiteliales intestinales son factores que determinan su supervivencia en el tracto gastrointestinal. Para ello, Nucaps® ha desarrollado diferentes sistemas naturales para entregar los probióticos en el intestino, además de conservar sus propiedades benéficas a lo largo de la cadena del fabricante al consumidor. Las biocápsulas desarrolladas por Nucaps® con L-Plantarum y L-Casei, no sólo mejoran la estabilidad de almacenamiento de los probióticos a temperatura ambiente sino que también las protegen contra el líquido gástrico, mejoran la viabilidad de los microorganismos en el tracto intestinal, haciéndolos por lo tanto más eficaces

2.7.1 TAMAÑO DE LAS PARTICULAS

El tamaño y forma de las partículas se determinó mediante el análisis con microscopio electrónico (MEB) y microscopio de fluorescencia (figura 6). Las cargas de L-Plantarum y L-Casei fueron 109 UFC/g y el tamaño de partícula fue 7 μm ± 4, asegurando así las concentraciones de probiótico (> 107 UFC/g) y la prevención de cualquier problema gustativo.

Gráfico 6. (A) Imagen SEM de Biocápsulas de caseína cargadas con L-Plantarum antes (izquierda) y después de cambiar el pH del medio. Los círculos rojos indican la liberación de bacterias al medio. (B) imagen de microscopio de fluorescencia de las Biocápsulas de caseína cargadas con L-Plantarum después de su marcado con yoduro de propidio.

A

B

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En el caso las biocápsulas de SPI (proteína de soja aislada) cargadas con 109 UFC/g de L-Plantarum y L-Casei, el tamaño determinado por microscopio óptico fue de 10 ± 5 μm (Gráfico 7). Por lo tanto, son lo bastante pequeñas como para no afectar las propiedades organolépticas de los alimentos mientras que, al mismo tiempo, garantizan la entrega de las concentraciones de probiótico deseado en el tracto intestinal.

Gráfico 7. Imagen de microscopio óptico de Biocápsulas de soja cargadas con L-Plantarum.

Para las biocápsulas de SPI, la distribución del tamaño de partículas se determinó midiendo el diámetro de cien partículas al azar, utilizando el software de la cámara acoplada al microscopio (Gráfico 8).

Gráfico 8. Distribución del tamaño de biocápsulas de SPI cargadas con L-Plantarum (n=100).

Fre

quen

cy

Particle diameter (µm)

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2.7.2 ESTABILIDAD

La estabilidad en el almacenamiento de las biocápsulas y de las bacterias probióticas encapsuladas en ellas fue estudiada en comparación con la de las bacterias no encapsuladas. Para comparar su viabilidad, distintas formulaciones de las biocápsulas que contienen la bacteria y dos formas diferentes de las bacterias probióticas no encapsuladas (liofilizada y en suspensión en medio de cultivo) se colocaron en recipientes de vidrio resistente al agua a temperatura ambiente (gráfico 9).

La suspensión sólo era viable durante unos días, mientras que la liofilizada presentó una concentración bacteriana de 107 UFC/g durante tres meses. Las biocápsulas viables fueron mayores de 107 UFC/g para un período superior a ocho meses.

Gráfico 9. Estabilidad de almacenamiento de L-Plantarum libre (liofilizada y en suspensión) u de las biocápsulas cargadas con L-Plantarum (diferentes formulaciones: Ap-Dp).

De manera similar, la L-Casei también fue encapsulada y se estudió su estabilidad de almacenamiento (gráfico 10). En este caso, también se observó una mejora de la estabilidad con respecto a L-Casei libre. Las viables fueron mayores de 107 UFC/g durante más de seis meses.

Gráfico 10. Estabilidad en el almacenamiento de L-Casei (liofilizada y en suspensión) y de biocápsulas cargadas con L-Casei (diferentes formulaciones: Ac-Cc).

-10

-9

-8

-7

-6

-5

-4

-3

-2

-1

0

1

0 50 100 150 200 250

Lo

g (

Nt/N

0)

Time (days)

L. plantarum - RT (glass containers)

Ap

Bp

Cp

Dp

Lyophile

Suspension

-6

-5

-4

-3

-2

-1

0

1

0 50 100 150 200 250 300

Lo

g (

Nt/N

0)

Time (days)

L. casei - RT (glass containers)

Ac

Bc

Cc

Dc

Ec

Lyophile

Suspension

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Por lo tanto, las biocápsulas de caseína desarrolladas por Nucaps® mejoran la estabilidad de almacenamiento de las bacterias L-Plantarum y L-Casei con respecto a las formas libres, en suspensión y liofilizadas.

En el caso de las biocápsulas de SPI (soja), se realizó el estudio de estabilidad de almacenamiento en envases de polipropileno en condiciones controladas de temperatura y humedad relativa (25º c, 60% H.R.). El gráfico 11 y gráfico 12 muestran la fracción de supervivencia de L-Plantarum libre y de las micropartículas cargadas de SPI Lp; los resultados del estudio fueron similares en al caso de los cultivos de L-Casei.

Gráfico 11. Estabilidad de almacenamiento de L-Plantarum (liofilizada y en suspensión) y de las biocápsulas Sp cargadas con L-Plantarum.

Gráfico 12. Estabilidad de almacenamiento de L-Casei (liofilizada y en suspensión) y de las biocápsulas Sc cargadas con L-Casei.

En ambos casos, las biocápsulas SPI muestran una vida útil más corta que la de la liofilizada. Sin embargo, la encapsulación de bacterias probióticas utilizando proteínas de soja aislada mejora la supervivencia de los microorganismos en el medio ambiente gástrico, como se muestra a continuación. Por tanto las biocápsulas SPI ofrecen una ventaja competitiva con respecto a los productos actualmente en el mercado.

-7

-6

-5

-4

-3

-2

-1

0

1

0 50 100 150

Lo

g (

Nt/N

0)

Time (days)

L. plantarum- 25 ºC/60% HR (PP containers)

Sp

Lyophile

Suspension

-7

-6

-5

-4

-3

-2

-1

0

1

0 50 100 150

Lo

g (

Nt/N

0)

Time (days)

L. casei - 25 ºC/60% HR (PP)

Sc

Lyophile

Suspension

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2.7.3 SUPERVIVENCIA EN MEDIO GÁSTRICO E INTESTINAL

Se realizó el estudio de la supervivencia de la bacteria liofilizada y de distintas formulaciones de biocápsulas en medios gastrointestinales simulados con fluidos simulados preparados según farmacopea.

La liofilizada y las micropartículas fueron suspendidas en un fluido gástrico simulado a 37º c que contiene cloruro de sodio, ácido pepsina y cloruro. El pH se ajustó a 2.5. Las muestras permanecieron en estas condiciones durante dos horas. Luego, fueron trasladadas al fluido intestinal simulado (que contiene tampón fosfato a pH 6,8 y pancreatina), donde fueron dejados hasta ocho horas.

La encapsulación mejora significativamente la supervivencia de las bacterias en condiciones gastrointestinales. La capa de la proteína protege a las bacterias desde el estómago y los probióticos se liberan a nivel intestinal. El gráfico 13 muestra cómo las biocápsulas se descomponen durante los ensayos y liberan L.-Plantarum y L-Casei, respectivamente, en condiciones intestinales.

Gráfico 13. Biopartículas de caseína cargadas con L-Casei antes del ensayo gastrointestinal (izquierda) and después de ser expuestas bajo condiciones gastrointestinales in vitro (derecha).

La fracción sobreviviente fue evaluada en diferentes momentos. En el gráfico 14, las formulaciones Ap y Dp presentaron un aumento significativo de los recuentos viables en relación con la liofilizada después de estar en condiciones estomacales. Por otro lado, al final del ensayo, se mostró que todas las formulaciones mejoraron significativamente la supervivencia de las bacterias en medios gastrointestinales.

Gráfico 2. Supervivencia de L-Plantarum en fluido gastrointestinal simulado. * Diferencias significativas con respecto a la liofilizada.

-6

-5

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-1

0

1

0 0.5 2 2.1 5 8

Lo

g (

Nt/N

0)

Time (h)

Lyophile

Ap

Bp

Cp

Dp

SGF, pH 2,5 SGF, pH 6,8 *

*

*

* * *

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El gráfico 15 muestra los resultados observados para L-Casei liofilizada y biocápsulas de caseína que contienen esta bacteria. En este caso, después de dos horas, las tres formulaciones mejoraron significativamente la supervivencia de L-Casei; resultando al final del experimento que las formulaciones de Ac y Bc protegieron a la L-Casei más eficientemente contra el fluido intestinal simulado.

Gráfico 15. Supervivencia de L-Casei en fluido gastrointestinal simulado * Diferencias significativas (p<0.05) con respecto a la liofilizada.

La biocápsulas SPI también mejoran la sobrevivencia tanto de L-Plantarum (Gráfico 16) y L-Casei (Gráfico 17) con relación a sus formas liófilas.

Gráfico 16. Supervivencia de L-Plantarum en fluido gastrointestinal simulado * Diferencias significativas (p<0.05) con respecto a la liofilizada.

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0 0.5 2 2.1 5 8

Lo

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Nt/N

0)

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Cc

SGF, pH 2,5 SGF, pH 6,8

*

*

* *

*

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1

0 0.5 2 2.1 5 8

Lo

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Nt/

N0)

Time (h)

Lyophile

Sp

SGF, pH 2,5 SGF, pH 6,8

* *

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Gráfico 17. Supervivencia de L-Casei en fluido gastrointestinal simulado * Diferencias significativas (p<0.05) con respecto a la liofilizada.

Estos resultados demuestran el efecto protector conferido por el recubrimiento natural desarrollado por Nucaps®.

2.8 EFICACIA MEJORADA PROBIOTICOS: EVALUACIÓN IN VIVO DE RESPUESTA INMUNE

Se realizaron estudios in vivo utilizando ratones ICR-CD1 como modelo animal, para confirmar uno de los efectos más notables observados por la encapsulación: la protección contra el líquido gástrico.

Para ello, a tres grupos de ratones les fueron administradas dosis de 107 cfu/día durante 21 días. El estudio implicó administrar una mezcla física de L-Plantarum y biocápsulas vacías al primer grupo; biocápsulas de caseína conteniendo L-Plantarum al segundo; y una suspensión de L-Plantarum no encapsulada al tercero.

Gráfico 18. Ratio de células CD4/CD8 en sangre para los tres grupos tratados. Mezcla física: mezcla de L-Plantarum y biocápsulas vacías; LP-BC: biocápsulas conteniendo L-Plantarum; LP free: suspensión libre de la bacteria.

-7

-6

-5

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-3

-2

-1

0

1

0 0.5 2 2.1 5 8

Lo

g N

t/N

0

Time (h)

Lyophile

Sc

0

1

2

3

4

5

6

Physical mixture LP-BC LP free

CD

4/C

D8

*

*

Basal level

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Los ratios de células CD4 sobre células CD8 y de IFNγ sobre IL-6 en sangre fueron analizados al final de los ensayos. La relación CD4/CD8 estuvo por debajo del nivel básico para los tres grupos (gráfico 198). Este resultado confirma los datos encontrados en la literatura

Sin embargo, cuando se analizó el ratio IFNγ/IL-6, se observó un aumento significativo en el caso de animales alimentados con las biocápsulas (gráfico 19). Este hecho confirma que las biocápsulas protegen a los microorganismos y son capaces de prolongar su supervivencia en el tracto intestinal cuando se administran por vía oral.

En cuanto a productos con mayor actividad de agua (yogur, zumos, leche, etc.) sería necesario realizar ensayos específicos para establecer la viabilidad de las bacterias en los productos, así como para la mejora de la supervivencia gastrointestinal proporcionada por la encapsulación.

Gráfico 19. Ratio entre citoquinas interferon gamma and IL6. Physical mixture: mezcla L-Plantarum y biocápsulas vacías; LP-BC: biocápsulas conteniendo L-Plantarum; LP free: suspensión libre bacteria.

2.9 CÓMO FUNCIONAN ESTOS CARRIERS?

Las Nanocápsulas y Biocápsulas de Nucaps® han sido diseñadas para ser estables en condiciones ácidas (es decir, en pH gástrico) y disolverse por un aumento en pH medio (es decir, cuando llegan al lumen del intestino), proporcionando así una forma de protección y dosificación para compuestos lábiles o de pobre solubilidad (gráfico 20).

Gráfico 20. Cinética de liberación de nanocápsulas de ácido fólico. SGF: Fluido gástrico simulado. SIF: Fluido intestinal simulado.

0

20

40

60

80

100

0 5 10 15 20 25

Cu

mu

lati

ve F

A r

elea

sed

(%

)

Time (min)

SIF; pH 6,8

SG

F;

pH

1.0

Swelling digestion

IFNγ/

IL-6

Physical mixture Lp - Casein BP Lp - Free

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Esto proporciona ventajas durante el almacenamiento dado que la carga está protegida contra la degradación debida al ambiente gástrico. Una vez que las partículas alcanzan el intestino, pueden interactuar con el epitelio y liberar la carga activa, asegurando la entrega de dosis controladas (gráfico 21).

Gráfico 21. Imagen SEM de nanopartículas de zeína (izquierda) y su comportamiento en el intestino (derecha). Las nanopartículas serían capaces de alcanzar la superficie de las células absorbentes y, entonces, liberar su carga de forma sostenida.

2.10 EL PROCESO

La tecnología ha sido probada y testada a escala laboratorio y piloto y ahora se ha escalado para fines comerciales e industriales. La tecnología comprende procedimientos simples, reproducibles y no costosos (gráfico 22).

Gráfico 22. Resumen del proceso de producción de las Nanocápsulas y Biocápsulas de Nucaps®.

Coacervation Desolvation

Casein aqueous

solution

Zein ethanol

solution

Casein

nanoparticles

Zein

nanoparticles

Purification /Concentration

Drying

Casein/polysaccarid+

bacteria

BiocapsulesCoacervation

Pilot batches from

mg to kg

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Se ha optimizado un proceso de producción continua con el fin de ajustar el tamaño del lote a las necesidades de los diferentes productos. La escala actual del proceso permite la fabricación desde unos gramos para las fases de desarrollo de nuestros clientes, hasta decenas de kilos para satisfacer sus necesidades de consumo.

La tecnología garantiza los estándares de calidad del sector al que estén destinados (farmacéutica, nutracéutica, cosmética, alimentos). IDIFARMA certifica la calidad realizando análisis físico-químicos de los productos finales.

La tecnología de proceso utilizada permite la aplicación de procesos suaves, convenientes para el manejo de los productos sensibles. El sistema de secado utilizado permite el uso de solventes orgánicos y atmósferas inertes dependiendo de las necesidades del producto.

Los componentes de los productos NUCAPS, que están disponibles en proveedores industriales, son sustancias consideradas seguras (GRAS). Los solventes utilizados en el proceso (agua, etanol, etc.) son seguros y cumplen con la normativa vigente.

Se realizan estudios de estabilidad de los diferentes productos para determinar su vida útil y las condiciones de almacenamiento del producto.

Los productos NUCAPS son ingredientes utilizados por nuestros clientes en las formulaciones de sus productos. En general, las microcápsulas se diluyen con diluyentes que permitan un fácil manejo en los siguientes procesos de producción. Es posible personalizar la composición final de los productos NUCAPS a las necesidades tecnológicas y legales del sector en el que actúen nuestros clientes.

Si lo requiere la normativa aplicable, NUCAPS puede realizar los estudios de validación necesarios y elaborar la documentación requerida para presentar a las agencias reguladoras.

2.11 PUBLICACIONES

Peñalva R, González-Navarro CJ, Gamazo C, Esparza I, Irache JM. Zein nanoparticles for oral delivery of quercetin: Pharmacokinetic studies and preventive anti-inflammatory effects in a mouse model of endotoxemia. Nanomedicine: NBM. 2016. In press. Accepted: August 29, 2016. Published online: September 08, 2016. DOI: 10.1016/j.nano.2016.08.033.

Penalva, R.; Esparza, I.; Gonzalez-Navarro, C.J.; Quincoces, G., Peñuelas, I.; Irache, Juan M. Zein nanoparticles for oral folic acid delivery. Journal of Drug Delivery Science and Technology (2015). DOI: 10.1016/j.jddst.2015.06.012

Penalva, Rebeca; Esparza, I.; Larraneta, Eneko; Gonzalez-Navarro, C.J.; Gamazo, C.; Irache, J. M. Zein-Based Nanoparticles Improve the Oral Bioavailability of Resveratrol and Its Anti-inflammatory Effects in a Mouse Model of Endotoxic Shock. J. Agric. Food Chem. (2015) DOI: DOI: 10.1021/jf505694e.

Penalva, R.; Esparza., I.; Agüeros, M.; González-Navarro, C.J.; Gonzalez-Ferrero, C; Irache, J.M. Casein nanoparticles as carriers for the oral delivery of folic acid, Food Hydrocolloids, 2015; 44: 399-406, DOI: 10.1016/j.foodhyd.2014.10.004.

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3 NUCAPS®: LOS PARTNERS

3.1 UNIVERSIDAD DE NAVARRA

La Universidad de Navarra (UNAV), fundada en 1952, se ha consolidado como una Universidad de investigación, con enseñanzas innovadoras, con un enfoque interdisciplinario tanto en sus investigaciones como en las diferentes escuelas, con una dimensión internacional y una importante participación social.

La investigación propia ha producido una cartera de 17 patentes activas, 13 solicitudes de patentes y más de 850 publicaciones en el último año. El 77% de esas publicaciones están relacionadas con áreas biomédicas y ciencias biológicas.

La UNAV busca diferenciarse entre otras instituciones españolas a través de la transferencia de conocimiento a la sociedad, haciendo hincapié en su valorización, tanto en el ámbito nacional como en el ámbito internacional.

Su amplia experiencia en investigación farmacéutica y nutrición construye una plataforma multidisciplinar que cubre todo el proceso necesario para el desarrollo de alimentos funcionales nutracéuticos y el apoyo científico para los expedientes de claims de salud.

El Área de la nutrición está dedicada, desde 1997, a desarrollar investigación relacionada con problemas nutricionales y su impacto en la obesidad y patologías asociadas al metabolismo (hipertensión, dislipemia, resistencia a la insulina, etcétera). Esta actividad ha llevado a una trayectoria de reconocido prestigio internacional en el campo de la obesidad, sobrepeso y asociados con más de 165 artículos, obteniendo más de 3.000 citas entre 2006 y 2011 (Web of Science).

Por otra parte, tiene amplia experiencia en trabajar con la industria, habiendo desarrollado un gran número de proyectos con empresas y participando en algunos de los proyectos más importantes de nutrición nacionales (PRONAOS, HIGEA, SENIFOOD, INCOMES, etc.) o a nivel internacional (DIOGENES, NUGENOB, SEAFOOD Plus, FOOD4ME, PREVIEW).

La estrategia del centro se basa en proyectos de investigación aplicada, apoyados por el conocimiento generado por la investigación básica en cuatro áreas:

• Nutridinámica • Biomarcadores • Compuestos bioactivos • Personalizado de nutrición

Más específicamente, el centro concentra sus esfuerzos en un número de áreas de investigación considerados claves en el desarrollo y prevención de la obesidad y sus comorbilidades y en la búsqueda de compuestos bioactivos que pueden llevar al desarrollo de nutracéuticos o alimentos funcionales.

Además, el centro incluye una Unidad Metabólica que cubre todo el proceso de estudio de intervención nutricional en humanos bajo la normativa legal y científica de la declaración de Helsinki, en cumplimiento de las directrices para buenas prácticas clínicas (GCP) y las directrices de CONSORT (normas consolidadas en los informes de ensayos).

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3.2 Centro Nacional de Tecnología Agroalimentaria (CNTA)

El Centro Nacional de Tecnología Agroalimentaria (CNTA) es un centro tecnológico cuya Misión es a ofrecer servicios tecnológicos avanzados para el desarrollo del sector agroalimentario, a través de la calidad y la innovación, bajo el principio de la seguridad de los alimentos.

CNTA interactúa con las empresas y actores del sector, a través de un modelo integrado basado en la actividad que hace posible dar respuesta a cualquier necesidad tecnológica.

CNTA colabora con el medio empresarial, tecnológico y científico así como con la administración pública bajo las modalidades de empresa asociada o de empresa cliente.

"Nuevos ingredientes y aditivos" es una de la líneas de I+D de CNTA, con especial interés en las técnicas de micro-encapsulado y su uso en nuevos ingredientes y aditivos.

CNTA está oficialmente aprobado y autorizado como autoridad de proceso para la FDA (administración de alimentos y medicamentos). También está reconocido como:

• Centro Tecnológico (T.T.C.), registrado con nº. 13 en el registro de Centros Tecnológicos y Centros de Apoyo a la Innovación Tecnológica del MICINN (Ministerio Español de Ciencias e innovación).

• Oficina de transferencia de resultados de investigación (OTRI) Reg Nº 84 del libro de la Secretaría General para el Plan Nacional I+D+I.

• Colaborador del Ministerio Español de Medio Ambiente en vertidos al dominio hidráulico público.

CNTA está acreditado y certificado como:

• Laboratorio de Ensayos acreditado autorizado por ENAC (centro nacional de acreditación) según estándar, UNE-EN ISO/IEC 17025: 2005 (LE Nº 108/283 y LE Nº 108/1469). El alcance de la acreditación puede ser consultado en www.cnta.es.

• Centro certificado por LRQA (Lloyd’s Register Quality Assurance) según los estándares de Sistemas de Gestión de la Calidad ISO UNE-EN-ISO 9001: 2008 aplicable a "Prestación de Servicios de Asistencia técnica, información, análisis y proyectos I+D+i en el área agroalimentaria".

• Centro certificado por LRQA (Lloyd’s Register Quality Assurance) según los estándares de Sistemas de Gestión Ambiental ISO UNE-EN-ISO 14001: 2004 aplicable a "Prestación de Servicios de Asistencia técnica, información, análisis y proyectos I+D+i en el área agroalimentaria".

3.4 IDIFARMA

Idifarma es un laboratorio farmacéutico fundado en Navarra en 2001 y dedicado a la prestación de servicios de desarrollo y fabricación de medicamentos (CDMO).

IDIFARMA es una compañía especializada en el desarrollo y fabricación de medicamentos para terceros, con especialización en alta actividad. Es un laboratorio autorizado y cuenta con certificaciones de Good Manufacturing Practices (GMP) and Good Laboratory Practices (GLP).

Hay cuatro elementos clave en cualquier desarrollo farmacéutico realizado por IDIFARMA para alguno de sus más de 100 clientes: confidencialidad, cumplimiento con los requisitos regulatorios, transferibilidad a la industrialización y conocimiento de la panorama general de la patente para cada proyecto.

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IDIFARMA, con más de 100 empleados, la mayoría licenciados universitarios, ofrece un servicio de "One-stop shop" para cualquier desarrollo farmacéutico: formulación de medicamentos, desarrollo y validación de métodos analíticos, control de calidad control y liberación de lotes en la UE, fabricación GMP, estudios de estabilidad ICH, gestión logística de ensayos clínicos y apoyo regulatorio. Sus áreas prioritarias:

Desde las fases iniciales de formulación hasta la fabricación del producto comercial, ofrecemos todas las actividades dentro del proceso de desarrollo del medicamento, de acuerdo a requerimientos regulatorios de la EMA o FDA.

• Alta actividad: IDIFARMA está especializada, con amplia experiencia, en el desarrollo de medicamentos de alta actividad; sus avanzadas instalaciones están especialmente diseñadas y autorizadas para el manejo de sustancias de alta actividad como citotóxicos tanto en actividades de desarrollo como en fabricación bajo GMP de medicamentos en diferentes formas de dosificación (oral, inyectable, etcétera.).

• Especialidad CMO: IDIFARMA cuenta con las autorizaciones necesarias para la fabricación GMP en fase de investigación y lotes clínicos e industriales. Las características de sus instalaciones de vanguardia especialmente diseñadas para permitir fabricar sólidos orales, incluyendo cápsulas y comprimidos tanto de liberación inmediata como controlada, tanto para medicamentos convencionales, como de alta actividad, así como placebo.

• Tecnología Spray Drying: En su continuo esfuerzo por encontrar las soluciones tecnológicas apropiadas para los retos en formulación, IDIFARMA dispone de equipamiento con esta tecnología que le permite ofrecer una solución integral a proyectos con problemas de solubilidad, estabilidad o biodisponibilidad desde la escala laboratorio hasta el escalado para fabricación aplicando tecnologías de microencapsulación, amorfización, coprecipitación, entre otras.