Dra. Maria Antonia Malajovich - BioTecnologia - Ensino e ... · Observaciones microscópicas de bacterias ... de detergentes que puedan persistir luego ... La teoría de los gérmenes

INTRODUCCIÓN A LAS

TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS

Dra. Maria Antonia Malajovich

1

Maria Antonia Malajovich / Biotecnología: enseñanza y divulgación (http://bteduc.com)

INTRODUCCIÓN A LAS TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS (2015)

Dra. Maria Antonia Malajovich Biotecnología: enseñanza y divulgación http://bteduc.com

PROGRAMA

Unidad 1 Presentación del curso - El laboratorio de Microbiología El nacimiento de la Microbiología: el legado de Semmelweiss; la obra de Pasteur; la teoría de los gérmenes. Normas de bioseguridad. Buenas prácticas de laboratorio.

A1. La distribución de los microorganismos en el ambiente A2. El lavado de las manos A3. Trabajar en condiciones asépticas

Unidad 2 El cuidado del material básico en el laboratorio microbiológico. La composición de los medios de cultivo, técnicas bacteriológicas; condiciones de incubación, esterilización; descarte del material utilizado.

A4. EL pH del medio y el crecimiento microbiano

Unidad 3 Microscopía (revisión) Características morfológicas de bacterias, hongos y algas. Ultraestructura, formas latentes.

A5. Observación y cultivo de hongos y algas A6. Observaciones microscópicas de bacterias – métodos de coloración

Unidad 4 Características bioquímicas de los microorganismos: exigencias nutricionales, producción de enzimas. Los sistemas miniaturizados de diagnóstico. Cultivo y crecimiento de microorganismos. Curva de crecimiento típica. Las colecciones de cultivos (investigación)

A7. Obtención de un cultivo bacteriano puro A8. Caracterización bioquímica de microorganismos A9. El número de microorganismos de un cultivo

Unidad 5 Fundamentos del control de los microorganismos: agentes físicos (revisión) y agentes químicos. Valoración del poder antimicrobiano de desinfectantes y antisépticos. Modo de acción de los antibióticos. Resistencia a los agentes químicos. El control de los microorganismos en lo cotidiano.

A10. Acción de la luz ultravioleta A11. Acción de los desinfectantes A12. Acción de los productos cosméticos (desodorantes) A13. Acción de los productos cosméticos (dentífricos) A14. Antibióticos y antifúngicos

3 INTRODUCCIÓN A LAS TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS


EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

PRECAUCIONES BÁSICAS

El lugar de trabajo debe ser desinfectado con alcohol antes del inicio de cada clase de trabajos prácticos, así como al final de las manipulaciones.

Antes y después de cualquier manipulación, pasarse alcohol por las manos.

Tener cuidado con los cabellos.

En caso de herida accidental con material séptico, desinfectarse inmediatamente con alcohol 70ºC.

No olvidar que toda picadura o ingestión accidental ofrece riesgo.

LOS RECIPIENTES UTILIZADOS

No deben utilizarse recipientes de zinc o cobre. Estos metales se disuelven en los medios de cultivo y entonces se tornan tóxicos. Los recipientes de vidrio son los adecuados.

Las placas de Petri plásticas, estériles, son actualmente cada vez más empleadas. Luego de esterilizarse, las placas de vidrio pueden ser utilizadas nuevamente.

Los medios de cultivo deben conservarse en tubos de diversos tamaños, de acuerdo con el volumen deseado. Su distribución en las placas de Petri se realiza luego de la esterilización de las placas vacías.

Los tubos puede ser cerrados con algodón, por tapas metálicas o cerrados con simples cápsulas metálicas móviles.

Tanto los recipientes como sus tapas debe estar rigurosamente limpios. En la limpieza se debe evitar el uso de detergentes que puedan persistir luego del enjuague. Una vez finalizado el lavado, el pH de los medios no deberá sufrir modificaciones apreciables luego de la agitación en los recipientes.

PIPETEADORES (PERAS)

Las peras son de goma y tienen 3 “bolitas” con las letras “A”, “S” y “E”. La primera sirve para retirar todo el aire antes de ser acoplada a la pipeta; la segunda sirve para que el líquido suba y la última para expulsar el líquido. Además, para expulsar la última gota, cuando se trabaja con pipetas totales, basta con solo apretar el orificio en la extremidad lateral de la pera (al lado de la “bolita” E).

Procedimiento

1. Apriete simultáneamente la letra “A” y la pera al mismo tiempo para retirar todo el aire.

2. Introduzca la pera en la parte superior de la pipeta. 3. Lleve la pipeta hasta el fondo del recipiente, con cuidado de no tocar la parte

inferior en el fondo. 4. Aspire el agua contenida en el vaso de precipitados apretando la letra “S”. 5. Observar elevando la pipeta a la altura de los ojos, verificando cual es la

cantidad aspirada. 6. Llevar la pipeta hasta el recipiente destino y dejar caer (se aprieta la letra “E”)

por la pared lateral. 7. Para expulsar la última gota, cuando se está trabajando con pipetas totales, apretar el orifico de la

extremidad lateral, al lado de la “bolita” E. Atención: mucho cuidado al momento de retirar la pera de la pipeta!



LOS INSTRUMENTOS DE TRABAJO



NORMAS DE SEGURIDAD

Segundo Pedro Teixeira y Silvio Valle, en el libro "Biossegurança, uma abordagem multidisciplinar", Rio de Janeiro, Editora Fiocruz, 1996. Las buenas prácticas en el laboratorio consisten en un conjunto de normas y procedimientos de seguridad, que buscan minimizar los accidentes y aumentar el nivel de conciencia de los profesionales que trabajan en los laboratorios de investigación. A continuación, se encuentran enumeradas algunas de las principales normas de Bioseguridad:

Lavarse las manos antes y después de la jornada de trabajo;

Nunca pipetear con la boca. Usar, siempre que sea posible, pipeteadoras automáticas o peras de goma;

En el laboratorio, no realizar refrigerios o preparar alimentos, no beber, no realizar higiene bucal o maquillarse, no afeitarse, no fumar, no comerse las uñas;

Los artículos de uso personal deben ser guardados en lugares adecuados, nunca en el laboratorio;

No trabajar con calzados abiertos, es decir utilizar zapatos que protejan completamente los pies;

El cuidado con la formación de aerosoles y salpicaduras es importante. Tener siempre un protocolo de procedimiento de seguridad para estos casos;

No trabajar con material patogénico con heridas en la mano;

Cuando utilice guantes evitar abrir puertas y atender el teléfono:

Durante la rutina de trabajo, el profesional deberá utilizar ropas apropiadas para el trabajo que desarrolla como por ejemplo, delantales, chalecos u otros uniformes afines;

El responsable del laboratorio deberá crear una rutina de procedimiento en Bioseguridad, enfocada principalmente en los riesgos a los que está expuesto su equipo:

Las mesadas de trabajo deberán ser lavadas y desinfectadas antes de la rutina de trabajo;

Evitar trabajar solo en el laboratorio.



LOUIS PASTEUR Y LA TEORIA DE LOS GÉRMENES

UN POCO DE HISTORIA Luego de cierto tiempo, un caldo de carne expuesto al aire se pudre. La observación microscópica muestra muchos tipos de microorganismos. Ya que no son observados en el caldo recién cocido, podemos preguntarnos: ¿de dónde vienen? Hasta 1850-1860 se admitía la teoría de la generación espontánea, es decir que los microorganismos podían surgir espontáneamente como consecuencia de alteraciones en los alimentos. En base a sus estudios sobre fermentación, Louis Pasteur consideró inadecuada esta explicación. Para él la alteración de los alimentos era una consecuencia de la presencia de microorganismos. Pero, para convencer a sus contemporáneos, Pasteur tuvo que demostrar de manera inequívoca su teoría. EL POLVO DEL AIRE En 1859 Pasteur analizó el aire de una calle de Paris. La observación microscópica del polvo acumulado en un paño de algodón mostró la presencia de centenares de microorganismos (= gérmenes). A partir de ese momento Pasteur inició una serie de experimentos que demolerán la teoría de la generación espontánea.

PRIMER EXPERIMENTO: Un líquido putrescible esterilizado se conserva indefinidamente si no entra en contacto con el aire. Crítica de los defensores de la generación espontánea: en ausencia de aire, los gérmenes no se desarrollan.

SEGUNDO EXPERIMENTO: Un líquido putrescible esterilizado se conserva indefinidamente si entra en contacto con aire esterilizado.



TERCER EXPERIMENTO: Un líquido putrescible esterilizado se conserva indefinidamente en presencia de aire filtrado a lo largo de un tubo curvo. Por consiguiente, los gérmenes no surgen por generación espontánea. Estos se encuentran en el aire y caen en los líquidos donde se desarrollan alterando el medio. Siendo así, ¿cuál sería la distribución de los gérmenes en la atmósfera? CUART0 EXPERIMENTO: Los gérmenes están distribuidos en la atmósfera de forma desigual.

LUGAR DE EXPOSICIÓN

NÚMERO DE FRASCOS CONTAMINADOS

Paris 20/20

Campo 8/20

Montaña 1/20

Crítica de los defensores de la generación espontánea a los experimentos tercero y cuarto: los resultados obtenidos se deben al hecho de haber utilizado hasta ahora líquidos hervidos largamente.

QUINTO EXPERIMENTO: la sangre y orina extraídas de un organismo sano no se alteran cuando son conservados al resguardo del aire. UNA REVOLUCIÓN CIENTÍFICA, TECNOLÓGICA Y SOCIAL Las evidencias experimentales presentadas por Pasteur llevaron a sus contemporáneos a sustituir la teoría de la generación espontánea por la teoría de los gérmenes. Se admite que los gérmenes presentes en el medio ambiente son los responsables de las alteraciones de los medios orgánicos (fermentaciones, putrefacción, enfermedades). La teoría de los gérmenes abrió nuevos caminos en la utilización industrial de los procesos fermentativos, en la conservación de alimentos y en la lucha contra las enfermedades infecciosas.



A1. LA DISTRIBUICIÓN DE LOS MICROORGANISMOS EN EL AMBIENTE “Probablemente, las primeras formas de microorganismos habitaban en el agua. Con el paso del tiempo, el suelo resultó infectado y, ahora, se encuentra allí la mayor parte de ellos. Del suelo pasaron al aire por el viento, que levanta partículas de polvo en las cuales están presentes los microorganismos. Desde que vivimos en contacto con el aire, aspiramos enormes cantidades de microorganismos cada vez que respiramos. El aire se deposita en nuestro cabello, ropa y piel. Del aire pasan a nuestro alimento o bebida. Estamos completamente rodeados por microorganismos y debemos aprender a vivir con ellos. Felizmente, la mayor parte no causa daño. Son relativamente pocos los que causan perjuicios. Es contra los que causan enfermedades o estropean nuestros alimentos que debemos prevenirnos” (Neder R.N. Microbiologia, Sao Paulo, Ed. Nobel, 1992). En esta actividad estudiaremos la distribución de los microorganismos en diferentes ambientes.

MATERIAL por grupo: 1 placa de Petri con medio nutritivo estéril, 1 rotulador.

PROCEDIMIENTO

1. Elegir un punto del aula para colocar la placa de Petri.

2. Marcar la placa con el rotulador, indicando el lugar donde esta será expuesta. En el lugar elegido,

destapar la placa como se indica en el esquema, esperar 15 minutos y cerrarla nuevamente.

3. Incubar la placa en el laboratorio, a temperatura ambiente, hasta observar el crecimiento de colonias

microbianas.

4. En la clase siguiente, contar el número de colonias en la placa.

5. Reunir los datos de los otros grupos para comparar el crecimiento de microorganismos (número de

colonias) en las placas expuestas en diferentes lugares.

Rotular la placa, indicando el grupo y el lugar de

exposición elegido.

Abrir la placa de Petri durante 15 minutos, en un lugar

protegido de las corrientes de aire.

Cerrar la placa y sellar con cinta adhesiva.



RESULTADOS

1. ¿Cuántas colonias se desarrollaron en la placa?

2. Complete la tabla con los datos de la clase.

Tabla: Número de colonias en cada placa.

Grupo 1 2 3 4 5 6 7 8

Lugar de exposición

N0 de colonias

3. Compare sus resultados con los de los otros grupos.

¿Dónde estuvo expuesta la placa que presentó el mayor número de colonias? ¿Dónde fue expuesta la

placa que presentó el menor números de colonias?

4. En función de los resultados obtenidos, ¿cuál es la distribución de los organismos en el ambiente

estudiado?



LA IMPORTANCIA DE LAVARSE LAS MANOS Buscar información en Internet sobre los siguientes temas: o Una vida trágica: Ignaz F. Semmelweiss

o Una mujer peligrosa: Mary “la tifoidea”

O ¿Cuáles son los gérmenes en nuestras manos? En Internet buscar las imágenes disponibles sobre “What germs are in your hands”

o Analizar el procedimiento recomendado por la Organización Mundial de la Salud. Duración de 40 a 60 segundos o el tiempo necesario para cantar dos veces “Que los cumplas feliz”.



A2. COMO LAVARSE LAS MANOS

Objetivo: verificar la eficiencia del lavado de las manos.

Material

Por alumno: 1 placa de Petri con agar nutritivo por alumno.

Por grupo: pila o fuente con agua y jabón, alcohol gel para las manos, 1 rotulador.

Procedimiento

Trabajar en pareja. Uno de los alumnos será el responsable de abrir y cerrar la placa, mientras que el segundo realizará el procedimiento.

1. Anotar en la parte superior de la placa de Petri con medio nutritivo el nombre del alumno. En la parte inferior, delimitar con el rotulador cuatro regiones: A, B, C y D.

2. Con mucho cuidado abrir la placa de Petri para que el alumno apoye el dedo pulgar de la mano dominante sobre la superficie del agar en el sector A. Cerrar la placa.

3. Lavarse las manos con agua. Dejar secar sin tocar absolutamente nada.

4. Con la ayuda del compañero, abrir la placa y apoyar el dedo pulgar de la mano dominante en el sector B. Cerrar la placa.

5. Repetir los puntos 3 y 4, lavándose las manos con agua y jabón y apoyar el pulgar de la mano dominante en el sector C.

6. Repetir los puntos 3 y 4, fregando las manos con alcohol y apoyando el pulgar de la mano dominante en el sector D. Siempre con la ayuda del compañero/a, abrir la placa y apoyar el pulgar de la mano dominante en el sector D. Cerrar la placa.

7. En otra placa, el compañero repetirá el procedimiento, invirtiendo los roles.

Resultados Observar el crecimiento microbiano en las cuatro regiones de las placas.

Alumno Antes de lavarse las manos

Después de lavarse las manos

Agua Agua y jabón Alcohol

-

(0) = ningún crecimiento; (+) poco crecimiento; (++) mucho crecimiento.

Comparar esos resultados con los obtenidos por las otras parejas. ¿Cuál es el tratamiento más eficiente? ¿El alcohol es suficiente para desinfectar las manos? Investigación

No todos los gérmenes son peligrosos. ¿Cuál es la diferencia entre la flora microbiana local y la flora

transitoria? ¿Cuál es peligrosa?3. TRABAJAR EN CONDICIONES ASÉPTICAS



A3. TRABAJAR EN CONDICIONES ASÉPTICAS

Como los microorganismos se encuentran en todas partes, resulta complicado conservar la esterilidad del material y de los medios de cultivo durante las manipulaciones que se realizan en el laboratorio. Por tanto, debemos aprender a trabajar en condiciones de esterilidad ya que esta es la única forma de garantizar que el único microorganismo que crece sea aquel que ha sido inoculado. En esta actividad distribuiremos caldo de carne en condiciones estériles. Material Por alumno: 1 tubo con caldo de carne (10%) estéril, 1 pipeta esterilizada, 3 tubos estériles. Por grupo: 1 gradilla, 1 pote, mechero Bunsen. Procedimiento 1. Con la pipeta, distribuir 2 ml de caldo de carne estéril en cada uno de los tres tubos. 2. Incubar a temperatura ambiente. Resultados ¿Hubo contaminación en algún tubo? ¿En cuál? Discusión 1. ¿Podría decir en qué momento hubo contaminación del material? Justifique su respuesta 3. ¿Qué se entiende por “Buenas Prácticas de Laboratorio”?



MICROORGANISMOS: NIVELES DE RIESGO Y BIOSEGURIDAD Textos extraídos del libro "Biossegurança, uma abordagem multidisciplinar", de Pedro Teixeira y Silvio Valle, Río de Janeiro, Editorial Fiocruz, 1996. “Los agentes biológicos presentan un riesgo real o potencial para el hombre y el medio ambiente. Por esta razón, es fundamental crear una estructura que permita la prevención de los riesgos encontrados en los laboratorios de investigación. Los agentes biológicos se dividen en cuatro grupos, donde son considerados como criterios: la patogenicidad para el hombre; la virulencia; el modo de transmisión, la endemicidad y la existencia o no de profilaxis y de terapias eficaces. Según la resolución nº1 de 1988 del Consejo Nacional de Salud, Cap. X art. 64, actualizada en el decreto nº 1914 de 2011 del Ministerio de Salud de Brasil, los microorganismos que afectan al hombre, a los animales y a las plantas pueden ser clasificados en grupos de riesgo de 1 a 4 en orden creciente. Clase de riesgo 1 (bajo riesgo individual y para la comunidad): incluye los agentes biológicos conocidos que no causan enfermedades en el hombre o en los animales adultos sanos. Ejemplos: Lactobacillus sp. y Bacillus subtilis. Clase de riesgo 2 (moderado riesgo individual y limitado riesgo para la comunidad): incluye los agentes biológicos que provocan infecciones en el hombre o en los animales, cuyo potencial de propagación en la comunidad y de diseminación en el medio ambiente es limitado, y para los cuales existen medidas terapéuticas y profilácticas eficaces. Ejemplos: Schistosoma mansoni y el virus de la rubeola. Clase de riesgo 3 (alto riesgo individual y moderado riesgo para la comunidad): incluye los agentes biológicos que poseen capacidad de transmisión por vía respiratoria y que causan patologías humanas o animales, potencialmente letales, para los cuales usualmente existen medidas de tratamiento y/o de prevención. Representan un riesgo si se diseminan en la comunidad y en el medio ambiente, pudiendo propagarse de persona a persona. Ejemplos: Bacillus anthracis y el virus de inmunodeficiencia humana (HIV). Clase de riesgo 4 (alto riesgo individual y para la comunidad): incluye los agentes biológicos con gran poder de transmisibilidad por vía respiratoria o de transmisión desconocida. Hasta el momento no hay ninguna medida profiláctica o terapéutica eficaz contra las infecciones ocasionadas por estos. Causan enfermedades en el hombre y en los animales de gran gravedad, con alta capacidad de diseminación en la comunidad y en el medio ambiente. Esta clase incluye principalmente los virus. Ejemplos: virus del Ébola o virus Lassa.” Investigar: ¿En qué grupo de riesgo se clasifica al agente de la tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis)? El nivel de seguridad (Biosafety Level) de los laboratorios depende de los microorganismos con los cuales se trabaje. La estructura y los métodos de trabajo son diferentes en cada nivel. Vea la presentación de la película OUTBREAK (1996).

EN EL LABORATORIO DE ENSEÑANZA SÓLO SE TRABAJARÁ CON MICROORGANISMOS CLASIFICADOS DENTRO DEL NIVEL DE

RIESGO 1



TRABAJAR EN CONDICIONES ASÉPTICAS: SEMBRADO EN TUBO Toda vez que se realice un sembrado es aconsejable seguir las reglas que recomendamos para que el material no se contamine. Tomando todas las precauciones de esterilidad, como el flameado de las bocas de los tubos, ansas de platino, etc., se introduce una ansada del material a ser sembrado en el tubo. Dejar este material en la pared interna del tubo, justo encima del líquido. Recolocar el tapón, luego flamear la boca del tubo y mezclar por rotación para permitir la mezcla completa del medio con el material sembrado. El ansa y el hilo de platino deben ser flameados antes y después de cualquier operación de sembrado. Para lo cual deben ser calentados hasta su incandescencia y la parte inferior debe ser pasada por la llama dos a tres veces. El material no debe ser tomado con el ansa caliente; esta debe ser enfriada en la pared interna del tubo de ensayo. La posición exacta para flamear el ansa es en ángulo de 45º, en relación con la mesa de trabajo. Debe utilizarse el cono interno de la llama del mechero Bunsen. Toda vez que se realicen sembrados, utilizando tubos de ensayo, se debe flamear la boca de los mismos inmediatamente después de quitar e inmediatamente antes de colocar el tapón de algodón. Este no debe nunca ser dejado sobre la mesa de trabajo; debe ser asegurado con el dedo meñique de la mano derecha.



SEMBRADO EN TUBOS CON MEDIO LÍQUIDO



A5. EL pH DEL MEDIO Y EL CRECIMIENTO MICROBIANO Para la mayoría de las bacterias, el pH óptimo de crecimiento se ubica entre 6,5 y 7,5. Sin embargo, algunos pocos microorganismos pueden desarrollarse en los límites extremos de pH, las variaciones mínimas y máximas están entre pH= 4 y pH= 9. Cuando las bacterias son cultivadas en un medio originalmente ajustado a un pH determinado (pH= 7, por ejemplo), es probable que este pH se altere, como resultado de la presencia de sustancias producidas por los gérmenes, que pueden ser tanto ácidas como básicas. Objetivo: Observar cómo el pH afecta el crecimiento microbiano y cómo el crecimiento microbiano afecta el pH. Material o Test con E.coli: 1 tubo con caldo nutritivo estéril pH = 4, 1 tubo con caldo nutritivo estéril pH = 6, 1 tubo

con caldo nutritivo estéril pH = 8, 1 tubo con caldo nutritivo estéril pH = 10. Un estante, 1 frasco con desinfectante, indicador universal, 1 ansa, mechero Bunsen, rotulador, cultivo de E. Coli.

o Test con S. Cerevisiae: Los mismos elementos, con medio nutritivo con sacarosa y un cultivo de S. Cerevisiae.

o Controles: Preveer dos series de tubos como controles del cambio de color. Procedimiento 1. Rotular los tubos (E.coli o S.Cerevisiae). 2. Colocar 6-8 gotas de indicador en cada tubo. 3. En condiciones asépticas, inocular los tubos correspondientes con E. Coli o con S. Cerevisiae. 5. Incubar los tubos a temperatura ambiente por 24 a 48 horas. Resultados: 1. Complete la tabla indicando el color observado en los tubos:

TUBOS pH4 pH6 pH8 pH10

E.coli

Control

S.Cerevisiae

Control

2. ¿Cómo se sabe que los microorganismos crecieron? ¿Cómo se sabe que hubo algún cambio de pH? Discusión 1. En función de los resultados de la clase, ¿cuál de los dos microorganismos crece entre valores más amplios de pH? 2. Para un microorganismo, ¿cuál sería la ventaja de crecer en una franja de pH más amplia? 3. Sugiera alguna razón para los cambios de pH observados. 4. Investigue alguna aplicación ligada a la tecnología de alimentos.



MICROSCOPÍA / NORMAS DE USO DE LOS MICROSCOPIOS 1. Encienda el microscopio.

2. Aumente la intensidad de la luz hasta una posición media.

3. Baje la platina y coloque el portaobjetos en el chariot, con el cubreobjetos colocado por encima.

4. Acomode la distancia entre las lentes oculares, de manera de trabajar en una posición confortable. A

menos que trabaje individualmente, evite ajustar las lentes oculares a sus ojos.

5. Gire el tornillo macrométrico hasta que quede bien próximo al portaobjetos. (ATENCIÓN: esta

operación deberá ser realizada por el lado de afuera y no por el ocular, de este modo evitará quebrar el

portaobjetos, dañando el material y perdiendo tiempo).

6. Mirando por el ocular y girando el tornillo macrométrico en sentido contrario, aproxime lentamente el

cañón hasta ver algo. Si no aparece nada, es porque no centralizó el corte. Use los tornillos del charriot

para mover el portaobjetos y coloque la parte coloreada justo en el paso de la luz.

7. La focalización final deberá hacerse con el tornillo micrométrico, moviéndolo hacia adelante y hacia

atrás hasta conseguir el punto donde la imagen tenga la mayor nitidez, o foco. No gire el tornillo

micrométrico indefinidamente para mover el cañón, ya que podrá dañar su delicado mecanismo. Úselo

solamente para ajustar el foco y para las observaciones de profundidad.

8. Certifique que la región que quiere observar se encuentra en el medio del campo antes de girar el

revólver y pasar al objetivo de medio aumento (10x). Mejore el foco si fuera necesario. Los objetivos

secos son parafocales, es decir que si la estructura está enfocada con uno, estará muy cerca de serlo

con otros.

9. Repita el mismo procedimiento para usar el mayor aumento (40x). Si no logra enfocar, no fuerce el

microscopio. Vuelva al menor aumento, mire si el portaobjetos está levantado e inténtelo otra vez. Si

no lo consigue llame al profesor.

10. Cuando termine el trabajo con el microscopio, retire de la platina lo que estuviera observando, coloque

el objetivo de menor aumento y eleve la platina. Coloque la intensidad de luz al mínimo, verifique que

el condensador se encuentra elevado y el diafragma abierto. Apague el microscopio.

Observación: La finalidad del condensador es la de reunir toda la luz en un haz estrecho, de mayor

intensidad luminosa. Junto al condensador está el diafragma, que funciona del mismo modo que el

diafragma de las máquinas fotográficas, o mejor dicho, que funciona como su iris, aumentando o

disminuyendo el tamaño de la pupila, regulando de este modo la entrada de luz. Sólo mueva el

condensador y el diafragma en condiciones especiales. Normalmente el condensador funciona elevado y el

diafragma abierto.





RECUERDE QUE o El aumento de una imagen vista al microscopio óptico es siempre el producto de los aumentos

proporcionados por el ocular, multiplicado por los aumentos proporcionados por la lente objetivo utilizada. Por lo tanto, si estuviera utilizando un ocular de 10x y un objetivo de 45x, ¿cuántas veces estará aumentada la imagen observada? _____________________

o Toda vez que vaya a usar el microscopio, use siempre el objetivo de menor aumento en primer lugar, ya

que le dará mayor visión del material. En seguida, use el segundo aumento. Tenga en cuenta que cuanto mayor sea el aumento, menor será el área observada.

o El objetivo 100x deberá ser usado en microscopía de inmersión, es decir, colocando sobre el

portaobjetos una gota de aceite de cedro y sobre esta gota se sumerge el objetivo. La función del aceite de cedro es proporcionar mayor iluminación al cañón evitando la dispersión de los haces luminosos.

LOS CUIDADOS CON EL MICROSCOPIO 1. Para transportarlo use las dos manos, una sujetando el brazo del microscopio y la otra sosteniéndolo por

la base. NUNCA cargue el aparato usando solo una de las manos!!! 2. No gire el tornillo micrométrico indefinidamente para mover el cañón, ya que podrá dañar su delicado

mecanismo. Úselo solamente para ajustar el foco y para las observaciones de profundidad. 3. No pase los dedos por las lentes para limpiarlas. El vidrio de las lentes se raya fácilmente (más que el

vidrio común), por tanto, solo debe usarse un papel especial, bien suave, para limpiarlas. 4. Evite mojar el microscopio mientras está trabajando. Si esto ocurriera, séquelo con un paño bien suave. 5. No desmonte cualquier parte del microscopio. Este es un instrumento muy caro, por tanto, todo cuidado

es poco. 6. Cuando termine el trabajo con el microscopio, retire de la platina lo que estuviera observando, coloque

el objetivo de menor aumento y baje el cañón. Guarde el aparato en un lugar adecuado, teniendo cuidado de verificar que está listo para volver a ser usado.



A5. OBSERVACIÓN Y CULTIVO DE HONGOS Y ALGAS

5.1. OBSERVACIÓN DE PREPARADOS LISTOS 5.2 ARMAR UN PREPARADO A PARTIR DE UN CULTIVO DE ALGAS EN MEDIO LÍQUIDO

Material: Portaobjetos, cubreobjetos, papel toalla, papel de filtro, pinza. Procedimiento.

1. Colocar sobre un portaobjetos limpio y desengrasado, una gota de líquido. 2. Tomar un cubreobjetos también limpio y desengrasado, y apoyar uno de los costados sobre el portaobjetos bien próximo a la gota, de modo que el líquido se distribuya sobre toda la extensión del cubreobjetos. 3. Lentamente, bajar el cubreobjetos, y sólo soltarlo cuando el ángulo formado entre el portaobjetos y el cubreobjetos resulte muy pequeño. Haciéndolo así, evitará la formación de burbujas de aire que pueden perjudicar el trabajo. 4. Si hubiera un exceso de agua por fuera del cubreobjetos o si el cubreobjetos estuviera flojo, absorber el exceso de agua con papel de filtro. 5. Repetir el procedimiento hasta conseguir armar preparados sin burbujas. Investigar: ¿Cuál es la composición de un medio

de cultivo líquido para algas? ¿Podríamos cultivar algas en medio sólido?



5.3. OBTENER PREPARADOS A PARTIR DE UN CULTIVO DE HONGOS EN MEDIO SÓLIDO Los hongos y sus esporas se encuentran en las más diversas condiciones ambientales. La recolección, asilamiento y cultivo no representan por tanto dificultades. El problema es, al contrario, evitar contaminar por hongos los cultivos de otros organismos, especialmente bacterias. Los hongos se pueden mantener y crecer en el laboratorio de 3 maneras:

o En el sustrato original, como pan, hojas, frutas en descomposición, cuerpos de insectos

o En o sobre medios fluidos de composición conocida (cite un ejemplo)

o En medios nutritivos sólidos, conteniendo agar como agente de solidificación. Estos medios pueden conseguirse ya preparados en las compañías especializadas. Por tanto, en el laboratorio, resulta a veces más económico, usar un medio como el agar de harina de maíz que se prepara como se indica:

Mezclar 6,0 g de harina de maíz con agua hasta obtener una papilla y hervir hasta obtener una crema. Filtrar por gasa. Agregar 1,5 g de agar. Calentar hasta que el agar quede disuelto. Completar hasta un volumen de 100 ml con agua, distribuir en tubos pequeños y esterilizar en el autoclave (o en olla a presión) durante 20 minutos (121 ºC).

El cultivo en portaobjetos permite acompañar el desarrollo de un hongo sin que las esporas se esparzan por el aire contaminando otros cultivos y eventualmente, desencadenando reacciones alérgicas. El procedimiento más simple es colocar un trozo de cinta durex (cinta adhesiva) sobre las hifas y pegarlo sobre el portaobjetos. No obstante, si quisiéramos observar el crecimiento de hongos, el mejor procedimiento es el siguiente: A. Inocular un tubo con agar nutritivo, líquido y enfriado (45-50 oC), con un cultivo de hongos de pan o

fruta; rotar el tubo entre las palmas de la mano para distribuir bien el inóculo;

B. Flamear un portaobjetos y un cubreobjetos, poner una gota del cultivo sobre el portaobjetos y colocar el cubreobjetos de tal manera que el agar se disperse hasta más o menos 5 mm de sus bordes;

C. Colocar el portaobjetos en una placa de Petri con una “bolita” de algodón embebida en agua; la

humedad del algodón retarda el resecamiento del medio; incubar por 2 a 4 días a temperatura ambiente;

D. Realizar observaciones microscópicas periódicas y dibujar - o fotografiar- el aspecto de los hongos en el

cultivo. Identificar las estructuras.



A6. OBSERVACIONES MICROSCÓPICAS DE BACTERIAS – MÉTODOS DE COLORACIÓN 6.1. EXAMEN MICROSCÓPICO DE PREPARADOS LISTOS 6.2. MÉTODOS DE COLORACIÓN Material Portaobjetos de vidrio, algodón, alcohol 95 o GL, alcohol 90 o GL, papel absorbente, cultivo de Bacillus megatherium, patrones Gram negativos (G-) y Gram positivos (G+), soluciones colorantes (azul de metileno, cristal violeta, fucsina o safranina, lugol), nigrosina (= tinta de la India), mechero Bunsen, ansa de Níquel-cromo, microscopio. Procedimiento

ATENCIÓN!!! Antes de iniciar el trabajo, limpie y desengrase los portaobjetos con un trozo de algodón embebido en alcohol al 90 o GL. Cuando termine el trabajo limpie cuidadosamente el objetivo de inmersión del microscopio con algodón embebido en xilol o solución de éter-cloroformo.

A – ELABORACIÓN DE LOS PREPARADOS 1. Luego de flamear el ansa, colocar una gota de la suspensión mixta de bacterias sobre el portaobjetos

identificado con el nombre del alumno.

2. Dejar secar espontáneamente.

3. Fijar el preparado sobre el portaobjetos, asegurando con una pinza de madera y pasándolo tres veces sobre la llama del mechero Bunsen, con la parte del preparado hacia arriba.

B - MÉTODO DE COLORACIÓN SIMPLE 1. La lámina fijada es tratada con solución de azul de metileno durante 1 a 2 minutos.

2. Lavar ligeramente con agua. Escurrir.

3. Secar entre dos papeles de filtro, con cuidado sin frotar.

4. Agregar sobre el preparado coloreado una pequeña gota de aceite de cedro y examinar al microscopio con el objetivo de inmersión (100x).

5. Comentar brevemente las observaciones.

NOTA: Con otros colorantes como el cristal violeta o la fucsina, el procedimiento puede ser el mismo, siendo necesario alterar el tiempo de tratamiento (2 a 60 segundos con cristal violeta y 15 a 30 segundos con fucsina).



C. MÉTODO DE COLORACIÓN DE GRAM 1. La muestra fijada es tratada con

solución de cristal violeta durante 1 a 2 minutos.


3. Cubrir el preparado con lugol durante 1 a 2 minutos.

4. Decolorar rápidamente con alcohol 95 oGL.


6. Cubrir con solución de fucsina (o safranina), durante 30 segundos para contra- colorear.

7. Lavar.

8. Secar entre dos papeles de filtro, con cuidado, sin frotar .

9. Agregar sobre el preparado una pequeña gota de aceite de cedro y examinar al microscopio con el objetivo de inmersión (100x).

10. Con ayuda de lo patrones, G- y G+, interpretar.

¿Cuáles fueron las dificultades encontradas? Investigar. ¿Cuál es la importancia de la coloración de Gram en el diagnóstico?



LOS MEDIOS DE CULTIVO LOS MEDIOS DE CULTIVO La composición de los medios de cultivo varía hasta el infinito. Sin embargo, podemos groseramente dividir a los medios de cultivo en dos categorías: o Los medios llamados complejos, cuya composición no está bien definida (extracto de carne, de

levadura, de peptona, de malta, etc.) o Los medios sintéticos de composición determinada Los medios que sirven de sustrato para el cultivo bacteriano pueden presentarse como medios líquidos o sólidos. Generalmente se agrega agar como agente solidificante, un azúcar obtenido de algas marinas. Este soporta perfectamente el autoclave (salvo a pH < 4 o a pH > 9), se derrite cuando la temperatura pasa los 90ºC y solidifica cuando la temperatura baja de 50ºC. PREPARACIÓN DE MEDIO DE DILUCIÓN a) Disolver 8,5 g de cloruro de sodio en agua destilada.

b) Adicionar agua destilada hasta completar 1000 ml.

c) Esterilizar.

d) Distribuir asépticamente según se necesite. PREPARACIÓN DE MEDIO LÍQUIDO

Composición del caldo nutritivo (= caldo de carne simple)

Extracto de carne 3 g

Peptona 5 g

Agua destilada 1000 ml

a) Mezclar los componentes en las proporciones indicadas y agregar agua destilada hasta completar el

volumen deseado. Se fuera necesario, para disolver los componentes, calentar en Baño María.

b) Determinar el pH y ajustarlo si fuera necesario.

c) Distribuir el medio en tubos sin llenarlos totalmente.

d) Tapar.

e) Esterilizar. Observación A falta de los componentes mencionados arriba, el caldo puede ser preparado según: Cortar en trozos pequeños 500 g de carne sin grasa, agregar 900 ml de agua y mantener en el refrigerador por 12 horas. Calentar lentamente y hervir por 10 minutos. Agregar 5 g de sal (no iodada). Tirar la espuma, dejar esfriar y filtrar dos veces. Completar el volumen a 1000 ml.



PREPARACIÓN DE MEDIO SÓLIDO

Composición del agar nutritivo (= agar simple)

Extracto de carne 3 g

Peptona 5g

Agar 15 g

Agua destilada 1000 ml

a) Mojar el agar en un poco de agua destilada fría.

b) Calentar el extracto de carne y la peptona en las proporciones indicadas y adicionar agua destilada hasta completar el volumen deseado.

c) Calentar en Baño María hasta disolver los componentes.

d) Determinar el pH y ajustarlo si fuera necesario.

e) Distribuir el medio en erlenmeyers o tubos sin llenarlos totalmente.

f) Tapar.

g) Esterilizar. LA ESTERILIZACIÓN La esterilización puede ser definida como la destrucción completa de todo organismo vivo mediante procesos de calentamiento, filtración o cualquier otro método físico o químico. ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO

Se esteriliza por calor seco el material de vidrio.

La esterilización se realiza en la estufa a 180C durante 2 horas.

ESTERILIZACIÓN POR CALOR HÚMEDO

Se esterilizan por calor húmero los recipientes que contienen medios de cultivo. La esterilización se

realiza en el autoclave o en olla a presión, a 120C, 2 atmósferas, durante 20 minutos.



ESTERILIZACIÓN POR FILTRACIÓN Algunas soluciones (vitaminas, antibióticos, etc.) no pueden ser esterilizadas por calor sin sufrir graves alteraciones. Los preparados que contienen compuestos termolábiles son esterilizados por filtración. Todo el equipamiento de filtración es previamente esterilizado en el autoclave. Las membranas Millipore son esterilizadas por ebullición suave durante 20 minutos en agua destilada; se debe tener cuidado que no toquen las paredes del recipiente. Se deja enfriar, se retiran las membranas del agua con una pinza estéril, colocándolas inmediatamente son el respectivo disco de soporte. Sistema Millipore También se pueden esterilizar medios líquidos con filtros descartables que pueden ser acoplados a jeringas. Este método es de gran utilidad para la preparación de medios de cultivo de células vegetales porque permite esterilizar hormonas sin pérdida de actividad. Investigar: ¿Existen otras formas de esterilización? ¿Cuáles? ¿Cuáles son las ventajas y desventajas de esos métodos?



TRABAJAR EN CONDICIONES ASÉPTICAS: SEMBRADO EN PLACA LA TÉCNICA BÁSICA



LA TÉCNICA DEL AGOTAMIENTO DEL INÓCULO En una muestra de microorganismos tomada de la naturaleza encontraremos diversos tipos mezclados. Para poder caracterizar la actividad de cada uno de ellos debemos estudiar cultivos que contengan un único tipo de microorganismo (cultivo puro).

Solamente con el sembrado en placa pueden obtenerse colonias aisladas. Es una pérdida de tiempo y material simplemente distribuir la muestra sobre la placa, esperando realizar un diagnóstico bacteriológico. El arte del sembrado solo se aprende a través de prácticas diarias repetidas.

La técnica del agotamiento del inóculo es una técnica de rutina para el aislamiento de bacterias en cultivos puros. Si el sembrado no fuera satisfactorio, no se obtienen colonias aisladas, debiéndose requerir de una nueva muestra.

La placa de Petri debe contener un medio de cultivo, en el cual el microorganismo a ser aislado crezca característicamente. El medio de cultivo debe estar bien seco, ya que si estuviera húmedo, el agua de condensación puede arrastrar las bacterias sobre la superficie de la placa.

Las placas de Petri deberán abrirse próximas al mechero Bunsen, para evitar la contaminación con gérmenes del aire. La Figura de abajo muestra las tres formas posibles de sujetar la placa durante el procedimiento. Pruebe las tres formas posibles con una placa vacía antes de elegir cuál es la que se adapta mejor a sus posibilidades.

Una ansada del material a ser sembrado es colocada en la parte superior del medio de cultivo. Tocar solamente la superficie del medio, tratar de no perforar el agar. Ese es el llamado inóculo inicial.

Flamear el ansa de platino y, a partir del inóculo inicial, sembrar en ángulos perpendiculares al inóculo, realizando líneas de sembrado paralelas entre sí. Girar la placa y sembrar en ángulo perpendicular a las líneas paralelas ya hechas, de modo que el resultado sea una serie de líneas que formen pequeños cuadrados sobre la superficie del medio.

Las colonias aisladas deben aparecer al final del sembrado. Si hubiera crecimiento de bacterias en los centros de los cuadrados formados en el proceso de sembrado, obviamente se tratará de una contaminación.

Una vez sembradas las placas, deben ser incubadas con la tapa, en posición invertida.



A7. OBTENCIÓN DE UN CULTIVO BACTERIANO PURO Objetivo: obtener colonias a partir de una suspensión bacteriana mixta Material Placa de Petri con medio de cultivo, tubo con solución salina estéril, pipeta estéril, ansa de níquel-cromo, rotulador pilot, mechero Bunsen, suspensión mixta de bacterias. Procedimiento 1. Transferir, con una pipeta estéril, 0,1 ml de la suspensión mixta de bacterias a un tubo con 4,9 ml de

solución salina estéril (dilución 1:50).

2. Agitar bien y homogeneizar.

3. Flamear el ansa y retirar una gota pequeña de la suspensión mixta de bacterias diluida y sembrarla sobre la superficie de un medio sólido (agar simple).

ATENCIÓN: El sembrado debe ser realizado por estriado, de acuerdo con el esquema presentado anteriormente (método de agotamiento). Entre un sector y otro, el ansa debe ser esterilizada.

4. Rotular la placa e incubarla a temperatura ambiente, durante 24 horas. Resultados 1. Dibuje el aspecto de la placa (o fotografíe la placa) mostrando la distribución del material inoculado. 2. Describa las diferentes colonias aisladas, caracterizándolas respecto al tamaño, bordes, elevación y color. Utilice los criterios descriptos en la página siguiente. 3. Comparar los resultados obtenidos por los diferentes grupos. Desafío ¿Cómo haría para obtener un cultivo puro de una de las colonias observadas?



LOS CRITERIOS UTILIZADOS



A8. CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA DE MICROORGANISMOS

Los seres vivos visibles al ojo son relativamente fáciles de clasificar por sus características morfológicas. Los microorganismos pueden ser vistos con ayuda del microscopio y siendo muy parecidos resulta imposible diferenciarlos. Por ello es necesario estudiar las características metabólicas, es decir, la manera mediante la cual el microorganismo desarrolla los procesos bioquímicos vitales. Actualmente, el uso de sistemas miniaturizados simplifica la tarea. Objetivo: Utilizar algunos tests bioquímicos para caracterizar diferentes microorganismos (E. coli, B. subtilis y M. luteus). Material 3 cultivos bacterianos diferentes (A, B y C), placas de Petri con agar nutritivo, placa de Petri con agar leche, placa de Petri con agar almidón, 3 tubos con caldo glucosado e indicador de pH, 3 tubos con caldo lactosado e indicador de pH, 3 tubos con caldo con sacarosa e indicador de pH, solución desinfectante, ansa, pipetas Pasteur estériles, mechero Bunsen, cinta adhesiva, rotulador pilot. Procedimiento A. INOCULACIÓN DE LAS PLACAS.

1. Dividir cada placa de Petri en 4 secciones (A, B, C y D).

2. En condiciones asépticas sembrar con el ansa el cultivo A en el sector correspondiente de las 3 placas que contienen agar nutritivo, agar- leche y agar almidón, respectivamente.

3. Repetir el punto anterior con el cultivo B.

4. Repetir el punto 2 con el cultivo C.

5. Incubar el material a temperatura ambiente.

B. INOCULACIÓN DE LOS TUBOS.

1. Rotular los tubos.

2. En condiciones asépticas, inocular con la pipeta Pasteur el cultivo A en los tres tubos con caldo glucosado, caldo lactosado y caldo con sacarosa, respectivamente.

3. Repetir el punto anterior con el cultivo B.

4. Repetir el punto 2 con el cultivo C.

5. Incubar el material a temperatura ambiente. . Resultados 1. Describa las colonias A, B y C.

2. ¿Cuáles de los 3 cultivos producen amilasa?

3. ¿Cuáles de los 3 cultivos producen proteasa?

4. ¿Hubo fermentación de carbohidratos? ¿Cómo puede ser observada?

5. Reúna la información obtenida en la tabla siguiente:



Cultivo

Morfología

de las colonias

Producción de amilasa

Producción de

proteasa

Fermentación

de lactosa

Fermentación

de glucosa

Fermentación de sacarosa

A

B

C

Discusión Identifique los cultivos A, B y C sabiendo que las colonias de E. coli y B. subtilis son blancas y las de M. luteus son amarillas; M. luteus y B. subtilis producen proteasas y fermentan la sacarosa; B. subtilis produce amilasas; M. luteus, B. subtilis y E. coli fermentan la glucose; E. coli fermenta la lactosa.



A9. EL NÚMERO DE MICROORGANISMOS DE UN CULTIVO El número de microorganismos de un cultivo puede ser estimado colocando un volumen determinado del mismo en agar nutritivo a 37ºC de manera que cada célula pueda multiplicarse dando origen a una colonia. Después de 24 a 48 horas de incubación podremos observar y contar las colonias. Aceptando que cada una de ellas resulta de la multiplicación de un individuo aislado es posible calcular el número de microorganismos en el cultivo. Material: cultivo de E.coli (dilución / 10-4), placas de Petri con medio nutritivo, 5 tubos de ensayo con 4,5

ml de agua destilada estéril, 1 tubo de solución salina, desinfectante, jeringa de 1 ml, pipeta Pasteur calibrada, cinta adhesiva, rotulador pilot, estufa a 370.C.

Procedimiento 1. Rotular el cultivo (A) y los tubos de ensayo (B, C, D,

E y F).

2. Transferir con la jeringa 0,5 ml de la muestra de (A) a (B). Mezclar el contenido de (B). ¿Por qué se debe mezclar bien el contenido del tubo después de la dilución?

3. Transferir con la jeringa 0,5 ml de líquido de (B) a (C). Mezclar el contenido de (C).

4. Continuar la serie de diluciones hasta (F).

5. Secar la placa de Petri en la estufa, y rotularla como se indica.

6. Evitando contaminaciones, retirar con la pipeta calibrada una pequeña cantidad de líquido de (F). Abrir la placa de Petri y dejar caer una gota en el lugar correspondiente. Cerrar la placa y devolver el exceso de líquido a (F).

7. Repetir el procedimiento con los tubos (E, D, C, B y A). Descartar la pipeta en el desinfectante. ¿Por qué las diluciones son sembradas en el orden F, E, D, C, B y A?

8. Cerrar la placa y colocarla en la estufa. Resultados 1. Algunas gotas tienen entre 10 y 20 colonias. ¿Cuáles?

2. ¿Todas las colonias tienen la misma apariencia?

3. ¿Cuántas veces el cultivo original fue diluido en esa gota? (Pista: de A a B el cultivo fue diluido 10 veces).

4. Conociendo el volumen de la gota sembrada en la placa de Petri calcule el número de microorganismos existentes en el cultivo (A).

Discusión: Sugiera diferentes aplicaciones para esta técnica. ¿Cómo podría mejorarla? Prepare un protocolo apropiado.



A10. ACCIÓN DE LA LUZ ULTRAVIOLETA Lámparas especiales que emiten luz UV con longitud de onda microbicida son utilizadas para reducir el número de microorganismos en el aire, en superficies de salas quirúrgicas y en salas asépticas donde los productos esterilizados son fraccionados en botellas o ampollas estériles. En esta actividad, estudiaremos la acción germicida de la luz ultravioleta sobre diferentes tipos de microorganismos, tales como E. coli, B. subtilis, M. luteus, S. cerevisiae o Rhodotorula. Material (por grupo): 4 placas de Petri estériles con medio nutritivo para las bacterias y con medio nutritivo

con sacarosa para las levaduras; hisopo estéril; 1 pipeta Pasteur estéril, cultivos de varios microorganismos, 4 cartones de cartulina negra, flujo laminar con luz UV.

Procedimiento: 1. Rotular una placa como C (control) y enumerar las otras

tres. 2. Con un hisopo en condiciones asépticas, inocular la

superficie del agar de todas las placas, sembrando un césped del microorganismo.

3. Colocar las 4 placas en el flujo laminar. 4. Sustituir la tapa de vidrio de las placas 1 a 3 por los cartones

recortados, como se indica en el esquema. Dejar la placa 4 con su tapa de vidrio respectiva.

5. Exponer las placas a luz UV durante 1 min. (placa 1), 5 min. (placa 2), 10 min. (placa 3) y 20 min. (placa

4). 6. Incubar las placas a temperatura adecuada por 24-48 h. Resultados 1. Observe el crecimiento de los microorganismos en la región de la placa correspondiente al área

recortada de los cartones. Registre las observaciones de su grupo en el cuadro siguiente. Microorganismo _________________________________

TIEMPO

1 min.

10 min.

20 min.

20 min. (con tapa)

CRECIMIENTO

( ++) : crecimiento normal (+) : crecimiento intermedio ( 0 ) : ausencia de crecimiento



2. Complete agregando los datos de los otros grupos:

MICROORGANISMO

1 min.

10 min.

20 min.

20 min. (c/tapa)

( ++) : crecimiento normal (+) : crecimiento intermedio ( 0 ) : ausencia de crecimiento Discusión 1. Caracterice la luz UV desde el punto de vista físico.

2. ¿Cual es el mecanismo de acción de la luz UV que explica su acción germicida? 3. ¿Cuáles los factores que modifican el efecto de la luz UV? 4. ¿La luz UV actuó del mismo modo sobre los diferentes microorganismos? Si la respuesta fuera negativa,

explique. 5. Un lápiz de luz UV es utilizado en algunos países para decontaminar los teléfonos celulares. ¿Usted

encuentra este método adecuado?



A11. ACCIÓN DE LOS DESINFECTANTES La publicidad de muchos desinfectantes se refiere a “acción germicida” de dichos productos. En esta actividad vamos a analizar la acción de diversas concentraciones de un desinfectante sobre cultivos de Escherichia coli. Material (por grupo): Discos de papel de filtro de 5 mm de diámetro, agua lavandina o lejía (dilución 50%), 1 placa de Petri con agar nutritivo estéril, 4 tubos con 1,5 ml de agua esterilizada, 1 pipeta de 1 ml estéril, 1 pipeta Pasteur estéril, desinfectante, 1 tubo con 5 ml de agar nutritivo estéril (agar blando), pinzas, mechero Bunsen,

estufa a 30C, cultivo puro de Escherichia coli, rotulador (pilot). Observación 1: con otros desinfectantes se recomienda partir de 0,2 ml y preparar la dilución seriada en tubos con 1,8 ml de agua esterilizada. Observación 2: el agar se derrite cuando la temperatura pasa los 90ºC y solidifica cuando baja de 50ºC. Procedimiento A. PREPARACIÓN DE LOS DISCOS

Esterilizar los discos por inmersión en etanol 96 0 durante una noche. Secar. B. PREPARACIÓN DE LA PLACA

En condiciones asépticas

1. Inocular el tubo con agar nutritivo líquido (agar blando) con 1 ml de un cultivo puro de Escherichia coli. Mezclar bien.

2. Verter el contenido del tubo en la placa. Dejar solidificar.

C. PREPARACIÓN DE LAS DILUCIONES

1. Rotular los tubos de ensayo. Colocar desinfectante en el tubo D.

2. Con la pipeta volumétrica estéril, transferir 1,5 ml del desinfectante al tubo. Agitar bien.

3. Continuar la serie de diluciones (tubos 2, 3 y 4) con la misma pipeta.

D. EL TEST

Después de rotular la placa dividida en 5 sectores, trabajar en condiciones asépticas:

1. Agregar en el centro de la placa un disco-control.

2. Mojar un disco con el desinfectante diluido (tubo 4), abrir la placa y colocarlo en la superficie del medio.

3. Repetir el procedimiento con las otras diluciones del desinfectante (tubos 3, 2 y 1).

4. Incubar a 30C durante 48 horas antes de proceder a la lectura del test.



Resultados

1. Realice un dibujo (o fotografíe) mostrando la apariencia de la placa e indicando el diámetro de las zonas

de inhibición alrededor de los discos. 2. ¿En cuáles diluciones no se observó crecimiento microbiano? 3. ¿Qué ocurrió alrededor del control? Discusión 1. ¿Cuál es la diferencia entre un antiséptico y un desinfectante?

2. ¿Cuál es el uso doméstico de los desinfectantes? 3. ¿El desinfectante estudiado es eficiente cuando está concentrado? 4. ¿El desinfectante estudiado es eficiente en la dilución recomendada en el envase del producto? 5. La descarga de agua en el retrete o inodoro diluye los desinfectantes. Comente en función de sus

resultados. 6. Compare los resultados obtenidos en la clase con otros desinfectantes.



A12. ACCIÓN DE LOS PRODUCTOS COSMÉTICOS (DESODORANTES) Diferentes tipos de microorganismos se desarrollan en la piel, esto ocurre en los pliegues y las partes más húmedas asociadas a las glándulas sudoríparas. El olor de la transpiración es el resultado de la acción de estos microorganismos. Los desodorantes inhiben el crecimiento de los microorganismos responsables del olor a la transpiración. En esta actividad estudiaremos la acción de diferentes desodorantes sobre el crecimiento de Micrococcus luteus. Material 1 placa con agar nutritivo estéril, 1 cultivo de Micrococcus luteus, 1 pipeta estéril, 1 ansa de Drigalsky, 3 desodorantes diferentes (A, B y C), 4 discos de filtro esterilizados, 1 pinza estéril, rotulador o pilot, mechero Bunsen. Procedimiento 1. Dividir la parte inferior de la placa de Petri en 4 sectores (A, B, C y D).

2. En condiciones asépticas, colocar unas gotas del cultivo de Micrococcus luteus sobre el agar nutritivo de la placa de Petri. Distribuir con el ansa de Drigalsky o con un hisopo.

3. En condiciones asépticas, colocar con la pinza en el sector D un disco de papel de filtro estéril (control).

4. En condiciones asépticas colocar con la pinza en el sector A un disco de papel de filtro mojado con el desodorante A. Lavar la pinza con agua y esterilizar en la llama del mechero Bunsen durante 2 a 3 segundos.

5. Repetir el procedimiento con los desodorantes B y C.

6. Rotular la placa e incubar a temperatura ambiente durante 48 a 72 horas. Observar el crecimiento bacteriano en la placa.

Resultados Dibuje esquemáticamente (o fotografíe) el aspecto de la placa de Petri. Discusión 1. ¿Los desodorantes estudiados tienen alguna acción sobre las bacterias? 2. ¿Cuál es la principal función de los desodorantes?

3. ¿Cuál es la composición de los desodorantes?



A13. ACCIÓN DE LOS PRODUCTOS COSMÉTICOS (DENTíFRICOS) Diferentes tipos de microorganismos se desarrollan en la cavidad oral. Muchos son inofensivos, otros no. Algunas bacterias fermentan los carbohidratos (predominantemente la sacarosa) produciendo ácido que disuelve las sales de calcio, en un proceso de desmineralización. La destrucción localizada del tejido dental forma la caries dental. En esta actividad estudiaremos la acción de diferentes dentífricos sobre el crecimiento de Micrococcus luteus. Material 1 placa con agar nutritivo estéril, 1 cultivo de Micrococcus luteus, 1 pipeta estéril, 1 ansa de Drigalsky, 3 dentífricos o soluciones anti-placa bacteriana diferentes (A, B y C), 4 discos de filtro esterilizados, 1 pinza estéril, rotulador, mechero Bunsen. Procedimiento 1. Dividir la parte inferior de la placa de Petri en 4 sectores (A, B, C y D).

2. En condiciones asépticas, colocar unas gotas del cultivo de Micrococcus luteus sobre el agar nutritivo de la placa de Petri. Distribuir con el ansa de Drigalsky o con un hisopo.

3. En condiciones asépticas, colocar con la pinza en el sector D un disco de papel de filtro estéril (control).

4. En condiciones asépticas colocar con la pinza en el sector A un disco de papel de filtro mojado con el dentífrico A. Lavar la pinza con agua y esterilizar en la llama del mechero Bunsen durante 2 a 3 segundos.

5. Repetir el procedimiento con los dentífricos B y C.

6. Rotular la placa e incubar a temperatura ambiente durante 48 a 72 horas. Observar el crecimiento bacteriano en la placa.

Resultado Dibuje esquemáticamente (o fotografíe) el aspecto de la placa de Petri. Discusión 1. ¿Los dentífricos estudiados tienen alguna acción sobre las bacterias? ¿Cuál es el más eficiente? 2. Algunos dentífricos contienen sustancias que inhiben el crecimiento bacteriano. ¿Cuáles son los otros

ingredientes de un dentífrico y cuál es su función?



A14. ANTIBIÓTICOS Y ANTIFÚNGICOS En la naturaleza, la producción de sustancias antibióticas por los microorganismos desempeña un papel importante en la competencia interespecífica, ya sea porque matan a otros microorganismos o porque inhiben su crecimiento o su reproducción. El hombre utilizó dicha propiedad para desarrollar medicamentos que le permitieron luchar contra las infecciones. El uso indiscriminado de los antibióticos en la clínica tuvo como consecuencia un aumento de formas resistentes, dificultando el combate contra los microorganismos. Actualmente, en Brasil, la venta de antibióticos sólo es posible con receta médica. Entonces, cómo evaluar la acción germicida en el laboratorio de enseñanza? Desinfectantes, dentífricos y desodorantes representan algunas de las opciones posibles, otra posibilidad son las soluciones antifúngicas de uso tópico destinadas al tratamiento de micosis superficiales, de bajo costo y venta libre en las farmacias. Estos productos pueden ser testeados utilizando Saccharomyces cerevisiae, una levadura que se vende comercialmente y es utilizada habitualmente en las actividades prácticas por no presentar ningún riesgo. ¿Desvío de la función de un producto comercial? No, si tuviéramos en cuenta que NO tenemos la pretensión de evaluar su eficiencia. Para ello, la sociedad cuenta con organizaciones específicas que siguen protocolos estrictos antes de dar la autorización correspondiente. Objetivo Evidenciar la acción germicida de una solución antifúngica de uso tópico y venta libre en las farmacias. Materiales Una placa con agar nutritivo estéril (Sabouraud), 1 cultivo en caldo de Saccharomyces cerevisiae, 1 pipeta estéril, 1 hisopo estéril, una solución antifúngica, 5 discos de papel de filtro estériles, 1 pinza estéril, rotulador. Procedimiento 1. Rotular la placa y dividir la parte inferior en 4 sectores (A, B, C y D). 2. En condiciones asépticas, colocar unas gotas de cultivo de Saccharomyces cerevisiae sobre el agar

nutritivo y distribuirlo con un hisopo. 3. En condiciones asépticas, colocar con la pinza un disco de papel de filtro estéril (control) en el centro de

la placa. 4. Manteniendo la asepsia, colocar con la pinza un disco de papel de filtro embebido en el producto en

cada sector (A, B, C y D).

5. Incubar la placa a temperatura ambiente (30 C aproximadamente) durante 48 a 72 horas. Observar el crecimiento de las levaduras y la aparición de halos de inhibición.

Preguntas ¿El producto testeado mostró alguna acción germicida sobre las levaduras? ¿Cuál es la función del papel colocado en el centro de la placa? ¿Cuál es la función de las repeticiones B, C y D? ¿Cómo interpretaría la eventual aparición de colonias dentro del halo de inhibición?



BIBLIOGRAFÍA

MALAJOVICH M.A. Microrganismos. Capítulo 3 del libro “Biotecnologia 2011”. Biotecnologia: ensino e divulgação http://bteduc.com VERMELHO A.B. Práticas de Microbiologia. Rio de Janeiro, Guanabara Koogan 2006. PELCZAR M., REID R e KRIEG N. R. Microbiologia. São Paulo, Makron Books, 1996.

WYMER P. Practical Microbiology and Biotechnology for Schools. London, Mac Donald and Co., 1987. SITIOS DE INTERÉS EN INTERNET AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY HTTP://WWW.ASM.ORG/ ANBIO (ASSOCIAÇÃO NACIONAL DE BIOSSEGURANÇA) HTTP://WWW.ANBIO.ORG.BR BIOTECNOLOGIA: ENSINO E DIVULGAÇÃO HTTP://BTEDUC.COM EXPLORATORIUM MICROSCOPE IMAGING

HTTP://WWW.EXPLORATORIUM.EDU/IMAGING_STATION/INDEX.PHP FUNDAMENTALS OF MICROBIOLOGY (UNIVERSITY OF WASHINGTON)

HTTP://WWW.SLIC2.WSU.EDU:82/HURLBERT/MICRO101/PAGES/101HMPG.HTML MICROBIOLOGY ONLINE HTTP://WWW.MICROBIOLOGYONLINE.ORG.UK/ SCIENCE IN THE REAL WORLD: MICROBES IN ACTION HTTP://WWW.UMSL.EDU/%7EMICROBES/ THE BIG PICTURE BOOK OF VIRUSES

HTTP://WWW.TULANE.EDU/%7EDMSANDER/BIG_VIROLOGY/BVHOMEPAGE.HTML VIRTUAL MUSEUM OF BACTERIA HTTP://WWW.BACTERIAMUSEUM.ORG/ YOU TUBE HTTP://YOUTUBE.COM

ESCO SAFE USE OS BIOLOGICAL CABINET VIDEO.URL

http://www.asm.org/

http://www.exploratorium.edu/imaging_station/index.php

http://www.slic2.wsu.edu:82/hurlbert/micro101/pages/101hmpg.html

http://www.microbiologyonline.org.uk/

http://www.umsl.edu/~microbes/

http://www.tulane.edu/~dmsander/Big_Virology/BVHomePage.html

http://www.bacteriamuseum.org/

http://youtube.com/

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Dra. Maria Antonia Malajovich - BioTecnologia - Ensino e ... · Observaciones microscópicas de bacterias ... de detergentes que puedan persistir luego ... La teoría de los gérmenes