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Rev Inv Vet Per 2008; 19 (1): 15-19
1 Departamento de Produccin Animal, Facultad de Zootecnia,
Universidad Nacional Agraria La Molina(UNALM), Lima2 E-mail:
[email protected]
EFECTO DE DOS MTODOS DE CONGELACIN SOBRE LAVIABILIDAD ESPERMTICA
DE SEMEN DE VERRACO
EFFECT OF TWO FREEZING METHODS ON SPERM VIABILITY OF BOAR
SEMEN
Mateo Carpio C.1, Jos Cadillo C.1 y Edwin Mellisho S.1,2
RESUMEN
El objetivo del presente trabajo fue evaluar el efecto de dos
mtodos de congelacinsobre la viabilidad espermtica de semen de
verraco. Se utilizaron seis eyaculados (dospor macho), de tres
verracos adultos de las razas Hampshire, Duroc y Landrace. Seevalu
el volumen, motilidad y concentracin espermtica de cada eyaculado.
Posterior-mente, el semen fue diluido con solucin BTS (Beltsville
Thawing Solution) y centrifugadoa 1500 rpm por 10 min para retirar
el plasma. El pellet (porcin espermtica) obtenido fueextendido con
dilutor de congelacin (A y B), enfriado y equilibrado a 5 C por 2
horasprevias a la congelacin. El semen equilibrado fue
criopreservado usando dos mtodosde congelamiento: a) en pellets
colocando alcuotas de 0.25 ml de semen equilibrado enagujeros
preparados en la superficie del bloque de hielo seco mantenindolo
por 2 min yluego vertindolo al nitrgeno lquido; y b) en pajillas de
0.5 ml, exponindolas al vaporde nitrgeno lquido a 7 cm de altura
por 10 min (dentro de una caja de tecnopor) paraluego verterlas al
nitrgeno liquido. No se encontr diferencias significativas entre
lamotilidad individual y proporcin de espermatozoides vivos del
semen congelado enpellets (40.1 y 48.8%) vs. pajillas (34.5 y
40.7%), respectivamente.
Palabras clave: verraco, semen, criopreservacin,
espermatozoide
ABSTRACT
The objective of this experiment was to evaluate the effect of
two freezing methodson the spermatic viability of boar semen. Six
collects (2 ejaculates per male) of three adultboars (Hampshire,
Duroc and Landrace) were used. Immediately after the
collection,volume, motility and spermatic concentration of each
ejaculate were evaluated. Then, thesemen was diluted with BTS
solution (Beltsville Thawing Solution) and centrifuged at1500 rpm
for 10 min for plasma withdrawal. The pellet (spermatic portion)
was diluted withfreezing dilutor (A and B), cooled and equilibrated
at 5 C for two hours before freezing.The equilibrated semen was
cryopreserved using two freezing methods: a) in pelletsplacing 0.25
ml aliquota of semen in holes prepared on the surface of a dry ice
block for 20min and then, pouring them in liquid nitrogen; and b)
in straws of 0.5 ml exposing them at7 cm over liquid nitrogen steam
for 10 min (in a styrofoam box). The results showed no
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M. Carpio et al.
statistically differences amongst individual motility and live
spermatozoa percentage insemen frozed in pellets (40.1 and 48.8%)
as compared to straws (34.5 and 40.7%).
Key words: boar, semen, cryopreservation, spermatozoa
INTRODUCCIN
La conservacin a largo plazo del se-men es econmicamente
importante y alta-mente deseable para mantener y
conservargermoplasma, preservar la diversidadgentica y mejorar la
eficiencia reproductivade los animales. La primera vez que se
rea-liz con xito la congelacin de materialseminal fue en 1949
cuando Polge et al. de-mostraron el poder crioprotector del
glicerol.
Los primeros trabajos en congelacinde semen en la especie
porcina datan de hacems de 30 aos (Pursel y Johnson,
1975;Westendorf et al., 1975). Se ha demostradoque los
espermatozoides de verraco son mssensibles a los eventos asociados
a lacriopreservacin, as como a los procesos decongelacin y
descongelacin (Watson, 1995),que otras especies como bovinos y
huma-nos; producindose daos en la membranaplasmtica y organelos de
la clula como re-sultado del estrs osmtico, shock de enfria-miento
y formacin de hielo intracelular(Johnson et al., 2000). La
variabilidad en lastasas de viabilidad espermtica post
descon-gelacin demuestra que an existen factoresno esclarecidos en
esta especie, requirindosede estudios adicionales.
El semen congelado de verraco ha sidoutilizado principalmente
para la introducciny mejoramiento gentico de ncleos de se-leccin
(Holt, 1997), y no tanto para el servi-cio de marranas en las
unidades de produc-cin comerciales. Ello se debe principalmen-te a
que los resultados de fertilidad son msbajos que los obtenidos con
semen fresco ola monta natural (Johnson et al., 2000). En elPer, la
diseminacin de material genticode verracos de alto valor usando
insemina-
cin artificial es muy limitada debido a la fal-ta de un mtodo de
conservacin de semenque otorgue tasas de viabilidad
espermticaaceptables.
Ante esta problemtica, el presente tra-bajo tuvo como objetivo
evaluar el efecto dedos mtodos de congelacin sobre la viabili-dad
espermtica de semen de verraco.
MATERIALES Y MTODOS
Animales
El trabajo se llev a cabo en las instala-ciones del Laboratorio
de BiotecnologaReproductiva y la Granja de Cerdos de laUniversidad
Nacional Agraria La Molina,Lima. Se utilizaron eyaculados de
tresverracos adultos (2 eyaculados por verracocolectados con
intervalo de cuatro das) delas razas Hampshire, Duroc y Landrace
Bel-ga. Los animales fueron mantenidos en co-rrales individuales de
piso de tierra.
Coleccin de Semen
Los verracos fueron trasladados de sucorral individual al rea de
coleccin. A lamonta del maniqu y protrusin del pene, eltcnico sujet
el glande del pene con manoenguantada y presion ligeramente,
estimu-lando la eyaculacin. El semen se recibi enun termo provisto
de dos capas de gasa finacomo filtro. La fraccin espermtica se
re-cuper en el termo y se traslad al laborato-rio donde se realiz
la evaluacin de semeninicial previo al proceso de dilucin. Se
cuan-tific el volumen, la motilidad y la concentra-cin
espermtica.
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Viabilidad espermtica en la congelacin de semen porcino
Preparacin del Dilutor de Semen
Se prepar la solucin BTS (BeltsvilleThawing Solution) como
dilutor de congela-cin que contiene 37 g/l de glucosa, 1.25 g/lde
EDTA, 6 g/l de citrato de sodio, 1.25 g/l debicarbonato de sodio y
0.75 g/l de cloruro depotasio, diluidos en agua destilada
estril(Pursel y Jonson, 1975). A la solucin base,se le adicion 3%
de yema de huevo y se lecentrifug a 2000 rpm por 10 min para
elimi-nar los slidos (grumos). La solucin clarifi-cada se separ en
una primera fraccin, de-nominada dilutor A, y en una segunda
frac-cin denominada dilutor B, a la que se le adi-cion 7% de
glicerol.
Procesamiento de Semen
Se utiliz el mtodo Beltsville (Pursel yJohnson, 1975) modificado
para procesar elsemen de verraco. El semen, a su llegada
allaboratorio, era mezclado 1:1 con el dilutorBTS (sin yema, ni
glicerol), equilibrando por 2horas a 18 - 20 C, para luego remover
lamezcla y se centrifugar a 1500 rpm por 10min. Se recuper la
porcin espermtica librede plasma del fondo del tubo y se diluy
conel dilutor A (BTS). Se inici el descenso con-tinuo de la
temperatura (1 C/min) del semendiluido hasta 4 a 5 C. Se complet la
dilucincon el dilutor B (BTS) para obtener una con-centracin final
de 250 millones/ml. Despus,se realiz el equilibrio de la mezcla a 5
C du-rante 2 horas.
Congelacin de Semen
El semen se congel usando dos mto-dos de congelacin: en pellets
y en pajillas.
- Congelacin de semen en pajillasEl semen equilibrado por 2
horas (5 C) fuevaciado en pajillas de 0.5 ml (Cassou - IMV,Francia)
y sellado con alcohol polivinlico.Las pajillas se colocaron sobre
una rejillaubicada a 7 cm de la superficie del nitr-geno lquido,
dentro de una caja detecnopor de 25 x 20 x 15 cm (largo x an-
cho x alto, respectivamente). Se tapcompletamente y se lo
mantuvo por 10min para que el vapor del nitrgeno l-quido enfriara y
congelara las pajillas desemen. Luego, las pajillas se sumergie-ron
en el nitrgeno lquido y se almace-naron en las canastillas del
tanquecriognico.
- Congelacin de semen en pelletsSe forjaron hoyuelos con
capacidad de0.25 ml en la superficie del bloque dehielo seco (C02
slido). Se coloc 0.25ml de semen equilibrado (5 C), en cadaagujero,
mantenindolo por dos minutos,permitiendo que ocurra la
congelacindel semen. Los pellets resultantes secolocaron en las
canastillas del tanquecriognico y se introdujeron en el nitr-geno
lquido.
Evaluacin de Viabilidad Espermtica
La evaluacin de la viabilidadespermtica post descongelacin se
realizal da siguiente del proceso, la cual se iniciretirando el
pellet del tanque criognico ycolocndolo dentro de un tubo de vidrio
es-tril y seco ubicado en una gradilla en baode agua a 38 C por 60
s, hasta que cambia-se de estado slido a lquido. Luego, se tras-lad
la muestra a bao mara a 35 C, mien-tras se realizaba la
evaluacin.
La viabilidad espermtica post-descon-gelacin se evalu por
triplicado mediantelos parmetros de motilidad individual
pro-gresiva y porcentaje de espermatozoides vi-vos. La motilidad se
evalu en microscopioa 100x colocando una muestra de
semendescongelado encima del portaobjetos y cu-bierto con una
lmina. Los resultados secuantificaron en porcentaje de
esperma-tozoides mtiles y con movimiento progresi-vo. El porcentaje
de espermatozoides vivosse determin con la tcnica de tincin
deeosina y nigrosina. La diferencia de color dela cabeza del
espermatozoide indic la pre-sencia de espermatozoides muertos
(teidosde rosado) o vivos (transparentes).
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M. Carpio et al.
Anlisis Estadstico
Los parmetros de motilidad individualprogresiva y porcentaje de
espermatozoidesvivos, fueron analizados estadsticamentemediante la
prueba de chi-cuadrado a un ni-vel de significancia de ? =0.05 para
determi-nar las diferencias entre los dos mtodos decongelacin.
RESULTADOS Y DISCUSIN
La fraccin espermtica tuvo un volu-men de 140 31 ml, la
concentracinespermtica fue de 352 93 millones/ml y lamotilidad
individual progresiva de 80 2%.Adems, los resultados de motilidad
indivi-dual evaluados durante el procesamiento delsemen mostraron
una reduccin paulatina,pero no marcada, siendo las motilidades
indi-viduales de 80, 77 y 74% en la evaluacininicial, despus de
centrifugar y previa a lacongelacin, respectivamente.
La motilidad individual progresiva y por-centaje de
espermatozoides vivos de semendescongelado fue similar en los dos
mtodosde congelacin (Cuadro 1).
Se han descritos diversos efectos ne-gativos de la congelacin
sobre las caracte-rsticas fisiolgicas de los espermatozoides
deverraco, tales como baja reduccin en lamotilidad, dao acrosomal y
reducida capaci-dad fecundante (Watson y Plumer, 1985; Holt,1997;
Johnson et al., 2000; Pelez et al. ,
2002). En la mayora de los casos, la motilidadde los
espermatozoides de verraco despusde la congelacin y descongelacin
es menoral 50% y su capacidad fecundante fluctaentre el 35 al 40%
(Watson, 1996).
En el presente trabajo, el mtodo decongelacin en pajillas de 0.5
ml (34.5%) opellets (40.1%) no afect la motilidad indivi-dual
espermtica. Motilidades similares enpajillas fueron encontradas por
Crdova-Iz-quierdo et al. (2004); sin embargo, Pursel yJohnson
(1975) reportaron una motilidad su-perior para semen congelado en
pellets (40al 50%) versus pajillas (20 al 40%), sugirien-do que los
mtodos de congelacin influyenen las respuestas de viabilidad
espermtica.
Las diferencias entre los valores demotilidad individual con el
porcentaje deespermatozoides vivos podra deberse a que,en el primer
caso, la evaluacin tiene un ca-rcter subjetivo por parte del
evaluador.Salisbury et al. (1978) indica que la subjetivi-dad del
examen de motilidad espermtica desemen descongelado hace que muchas
ve-ces la correlacin con la fertilidad sea baja, apesar de que se
trata de un parmetro am-pliamente utilizado en los centros de
insemi-nacin. Por otro lado, las pruebas de
tincin(eosina-nigrosina) producen informacin con-cerniente a la
integridad de membranaespermtica de la cabeza, dando mayor
in-formacin de la viabilidad espermtica (Chanet al., 1991). Guthrie
y Welch (2005) repor-tan estas mismas diferencias al congelar
se-men de verraco con dilutor BTS 25.8% demotilidad individual y
44.2% espermatozoidesvivos.
Cuadro 1. Viabilidad espermtica de semen porcino criopreservado
en hielo seco (pellets) y nitrgeno lquido (pajillas)
Mtodos de congelacin N Motilidad individual (%)
Espermatozoides vivos (%)
Pajilla de 0.5 ml 6 34.5 5.7a 40.7 5.6a
Pel lets de 0.25 ml 6 40.1 5.5a 48.8 4.9a a,b Letras diferentes
dentro de columnas indican diferencia s significativas (p
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Viabilidad espermtica en la congelacin de semen porcino
CONCLUSIONES
Se obtuvo buenas tasas de viabilidadespermtica en la
criopreservacin de semende verraco mediante la congelacin en
pelletsy en pajillas.
LITERATURA CITADA
1. Chan PJ, Tredway DR, Corselli J,Pang S, Su BC. 1991.
Combinedsupravital staining and hypoosmoticswelling. Hum Reprod 6:
1115-1118.
2. Crdova-Izquierdo A, Crdova-JimnezM, Crdova-Jimnez C,
Prez-GutirrezJ, Martn-Rillo S. 2005. Congelacin desemen de verraco
en dos tipos de pajillas ycapacidad fecundante in vitro de
losespermatozoides. Cienc Ergo Sum 12(3):271-272.
3. Guthrie HD, Welch GR. 2005. Impactof storage prior to
cryopreservation on plas-ma membrane function and fertility of
boarsperm. Theriogenology 63: 396-410.
4. Holt WV. 1997. Alternative strategies forthe long-term
preservation ofspermatozoa. Reprod Fert Develop 9:309-319.
5. Jhonson LA, Weitze KF, Fiser P,Maxwell WMC. 2000. Storage of
boarsemen. Anim Reprod Sci 62: 143-172.
6. Pelez J, Domnguez JC, Pea FJ,Robles P, Ferraras A, Alegre B.
2002.Conceptos bsicos en criobiologa del es-permatozoide. Porci.
Aula Veterinaria.Monografa de Actualidad. Tratado deGanado Porcino
72: 23-36.
7. Polge C, Smith AV, Parkes AS. 1949.Revival of spermatozoa
after vitrificationand dehydration at low temperatures.Nature 164:
666-668.
8. Pursel VG, Johnson LA. 1975. Freezingof boar spermatozoa:
fertilizing capacitywith concentrated semen and a newthawing
procedure. J Anim Sci 40: 99-102.
9. Watson PF. 1995. Recent developmentand concepts in the
cryopreservation ofspermatozoa and the assessment of
theirpost-thawing function. Reprod FertDevelop 7: 871-891.
10. Watson PF. 1996. Cooling ofspermatozoa and fertilizing
capacity.Reprod Dom Anim 31: 135-140.
11. Watson PF, Plumer JM. 1985. Theresponses of boar sperm
membranes tocold shock and cooling. Proc First InternatConference
on Deep Freezing of BoarSemen. Uppsala, Sweden. p 113-127.
12. Westendorf P, Richter L, Treu H. 1975.Deep freezing of boar
semen: laboratoryfindings and insemination results with
theHlsenberger Pailleten technique. DeutTierarztl Woch 82:
261-300.
