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Tesis para egresar de licenciatura
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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CIUDAD JUÁREZ
INSTITUTO DE CIENCIAS BIOMÉDICAS
EFECTO DE LA ADMINISTRACIÓN DE VITAMINA E Y SELENIO SOBRE LA MOTILIDAD Y VIABILIDAD ESPERMATICA DE
SEMEN OVINO DURANTE LA ADAPTACIÓN A 5ᵒC PARA EL PROCESO DE CRIOPRESERVACIÓN
TESIS REMITIDA AL PROGRAMA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA DEL DEPARTAMENTO DE CIENCIAS
VETERINARIAS COMO UN REQUISITO PARA OBTENER EL GRADO DE:
MÉDICO VETERINARIO ZOOTECNISTA
PRESENTA:
CATHIA CECILIA LASTRA GONZÁLEZ
DIRECTOR DE TESIS:
DR. JOSÉ MARIA CARRERA CHÁVEZ
Ciudad Juárez, Chihuahua Mayo de 2014
ii
EFECTO DE LA ADMINISTRACIÓN DE VITAMINA E Y SELENIO
SOBRE LA MOTILIDAD Y VIABILIDAD ESPERMATICA DE SEMEN
OVINO DURANTE LA ADAPTACIÓN A 5ᵒC PARA EL PROCESO DE
CRIOPRESERVACIÓN
TESIS PRESENTADA POR CATHIA CECILIA LASTRA GONZÁLEZ
COMO REQUISITO PARA OBTENER EL GRADO DE:
MÉDICO VETERINARIO ZOOTECNISTA
C.D. Daniel Constandse Cortez Director del Instituto de Ciencias Biomédicas
Ph D. Eduardo Pérez Eguía Jefe del Departamento de Ciencias Veterinarias
Dr. Ramón Rivera Barreno Coordinador del Programa de Medicina Veterinaria y Zootecnia
Mayo de 2014
Ciudad Juárez, Chihuahua
iii
ESTA TESIS FUÉ REALIZADA BAJO LA DIRECCIÓN DEL CONSEJO PARTICULAR INDICADO, HA SIDO APROBADA POR EL MISMO Y ACEPTADA
COMO REQUISITO PARA OBTENER EL GRADO DE:
MÉDICO VETERINARIO ZOOTECNISTA
Ciudad Juárez, Chihuahua. Mayo, 2014
________________________________ Dr. José Maria Carrera Chávez
DIRECTOR DE TESIS
_________________________________ Dr. Andrés Quezada Casasola
SINODAL
__________________________________ M. en C. Federico Pérez Casio
SINODAL
iv
AGRADECIMIENTOS
Agradezco primeramente a mi asesor el Dr. José Maria Carrera por su
apoyo, enseñanza y paciencia a lo largo de este trabajo, así como también al Dr.
Andrés Quezada por su apoyo incondicional y ser pieza fundamental para la
realización de este trabajo. A mis maestros el M. en C. Federico Pérez Casio, al
Dr. Fernando Arechiga, a la Dra. Marcela Beristain, a la M. en C. Imelda Ramos, al
M.V.Z. Jorge Cardona, al M. en C. Zimri Cortes, al Dr. Eduardo Pérez Eguía, al
M.V.Z. Eutimio Apodaca y a cada uno de mis maestros que han sido parte de mi
formación.
Finalmente doy gracias a mis padres y a mis cuatro hermanas por darme el
apoyo y fortaleza para siempre salir adelante, así como a mis amigos y
compañeros que me brindaron su apoyo durante el desarrollo del presente trabajo.
v
DEDICATORIA
Dedico el presente trabajo a todos los animales que hacen de este un mejor
lugar, especialmente a los cuatro sementales que involuntariamente fueron el eje
de esta investigación.
vi
CURRICULUM VITAE
La autora del presente trabajo nació el 22 de Noviembre de 1990 en Ciudad Juárez, Chihuahua, México.
2005-2008 Estudios de Preparatoria en la Preparatoria Bachilleres plantel
No. 5 en Ciudad Juárez, Chihuahua.
2008-2014 Estudios de Licenciatura en el Programa de Medicina Veterinaria
y Zootecnia del Departamento de Ciencias Veterinarias perteneciente al Instituto de Ciencias Biomédicas de la Universidad Autónoma de Ciudad Juárez.
vii
EFECTO DE LA ADMINISTRACION DE VITAMINA E Y SELENIO SOBRE LA
MOTILIDAD Y VIABILIDAD ESPERMATICA DE SEMEN OVINO DURANTE LA
ADAPTACIÓN A 5ᵒC PARA EL PROCESO DE CRIOPRESERVACIÓN
Por:
Cathia Cecilia Lastra González
Médico Veterinario Zootecnista
Departamento de Ciencias Veterinarias
Instituto de Ciencias Biomédicas
Universidad Autónoma de Ciudad Juárez
Asesor: Dr. José Maria Carrera Chávez
RESÚMEN
El presente estudio tuvo como objetivo evaluar la eficacia de la adición de vitamina
E y selenio en semen ovino diluido para disminuir el daño espermático que se
presenta durante el proceso de adaptación a 5°C como paso para la
criopreservación. Se utilizó el semen de cuatro carneros. Los eyaculados se
obtuvieron por medio de electroeyaculador, los cuales fueron mezclados y diluidos
en un extensor a base de Tris-fructosa-glicerol-yema de huevo. Después de ser
diluidos, los eyaculados fueron divididos en cinco tratamientos en los cuales se
adicionó Vitamina E (VE; 1 mg mL-1 diluida en etanol al 100%), Selenio (Se; 2 μg
mL-1), VE/Se, (1 mg mL-1 y 2 μg mL-1) etanol (10 μl/ml) y un grupo control (sin
aditivo) para un total de cinco grupos experimentales. Las muestras de semen
diluido se almacenaron en pajillas y se enfriaron gradualmente durante tres horas
viii
hasta llegar a 5°C. Después de alcanzar esta temperatura las pajillas fueron
sumergidas en agua a 36°C durante 30 segundos para su evaluación. Las
muestras fueron examinadas para determinar la motilidad progresiva y la viabilidad
espermática. Los resultados del presente estudio mostraron una reducción de la
viabilidad de los espermatozoides en los cuales se adicionó etanol en
comparación con el grupo control y selenio. En cambio, aquellos tratamientos a los
que se les agregó etanol y VE no mostraron diferencias significativas (P<0.05). La
motilidad progresiva no fue diferente en ninguno de los tratamientos. Se concluye
que la adición de 1 mg mL-1 de VE diluida en etanol al 100% y 2 μg mL-1 de Se y
su combinación, no mejora la viabilidad ni la motilidad del semen de ovino
adaptado a 5°C; sin embargo, la adición de vitamina E disminuye el efecto tóxico
del etanol sobre el espermatozoide.
Palabras clave: Semen, vitamina E, selenio, etanol, criopreservación, viabilidad
espermática, motilidad progresiva.
ix
EFFECT OF THE ADMINISTRATION OF SELENIUM AND VITAMIN E ON
VIABILITY MOTILITY SPERM SPERM AND SHEEP DURING ADAPTATION
TO 5ᵒ C PROCESS CRYOPRESERVATION
SUMMARY
The present study aimed to evaluate the effectiveness of the addition of vitamin E
and selenium in sheep semen diluted to reduce sperm damage that occurs during
the adaptation to 5°C for cryopreservation. Four rams semen was used. The
ejaculates were obtained by electroejaculator, came together in pool and were
diluted in Tris-based diluent-fructose-egg yolk. After being diluted ejaculates were
divided into five equal aliquots in which vitamin E was added (VE, 1 mg mL-1
diluted in 100% ethanol ), selenium (Se; 2 mg mL-1), VE/Se (1 mg mL-1 and 2 mg
mL-1) ethanol (10 μl) and a control group (no additive) for a total of five
experimental groups. Diluted semen samples were stored in straws and gradually
cooled for three hours to 5°C. After reaching this temperature, the straws were
immersed in water at 36ᵒC for 30 seconds for evaluation. The samples were
examined for sperm motility and viability. The results of this study showed an
increase in mortality of spermatozoa in which ethanol was added in comparison to
the control group and selenium. Instead, those treatments that were added ethanol
and VE showed no significant difference (P < 0.05). Progressive motility was not
different in any of the treatments. It is concluded that addition of 1 mg mL-1of VE
diluted in 100% ethanol and 2 ug mL-1 and its combination is not improving quality
x
of semen seminal adapted 5ᵒC; however the addition of vitamin E if you lower the
toxic effect of ethanol on sperm.
Key words: Semen, vitamin E, selenium, ethanol, cryopreservation, sperm viability,
progressive motility.
xi
CONTENIDO
PORTADA ……………………………………………………………………… i
HOJA DE FIRMAS …………………………………………………………….. ii
AGRADECIMIENTOS ………………………………………………………… iv
DEDICATORIA ………………………………………………………………… v
CURRICULUM VITAE ………………………………………………………… vi
RESÚMEN ……………………………………………………………………... vii
SUMMARY ………………………………..……………………………………. ix
LISTA DE CUADROS ………………………………………………………… xiii
LISTA DE ABREVIATURAS …………………………………………………. xiv
1. INTRODUCCIÓN ................................................................................. 1
2. REVISIÓN DE LITERATURA ............................................................... 3
2.1. Situación de la ovinocultura……...................................................... 3
2.2. Inseminación artificial en ovinos………………................................ 4
2.3. Criopreservación de semen............................................................. 6
2.4. Estrés oxidativo………………………............................................... 7
2.5. Antioxidantes……………………..................................................... 9
3. MATERIALES Y MÉTODOS.................................................................. 12
3.1. Localización del área de estudio..................................................... 12
3.2. Iniciación y duración del experimento……………............................ 12
3.3 Características de las unidades experimentales............................. 12
3.4 Colección de semen…………..………............................................. 13
xii
3.5 Dilución del semen y adición de los tratamientos………….………. 15
3.6 Análisis de parámetros estándar…………….……………………….. 15
3.6.1 Motilidad progresiva................................................................. 16
3.6.2 Viabilidad espermática………………………………..…………. 16
3.7 Variables a evaluar………………………………………….………… 16
3.8 Análisis estadístico…………………………………………..………… 16
4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................ 18
5 CONCLUSIONES ................................................................................ 26
6 LITERATURA CITADA ......................................................................... 27
xiii
LISTA DE CUADROS
CUADRO Página
1. ESCALA BASADA EN EL PORCENTAJE DE CÉLULAS
MÓTILES........................................................................... 14
2. EVALUACIÓN DE LA MOTILIDAD MASAL Y VIABILIDAD
ESPERMATICA DEL SEMEN FRESCO.………………....…….. 19
3. PORCENTAJE DE MOTILIDAD PROGRESIVA Y VIABILIDAD
ESPERMÁTICA TERMINADO EL PROCESO DE
ADAPTACIÓN A 5°C Y DESPUES DE LA ADICIÓN DE VE,
SE, VE/SE Y ETANOL……….………………….......................... 20
4. CONTRASTES ENTRE TRATAMIENTOS DESPUES DE EL
PROCESO DE ADAPTACIÓN A 5°C.……..….…………………. 25
xiv
LISTA DE ABREVIATURAS VE= Vitamina E Se= Selenio IA= Inseminación artificial O2= Oxigeno O2-= Superóxido H2O2= Peróxido de hidrogeno -OH= Radical hidroxilo ROS= Especies reactivas al oxígeno LPO= Peroxidación de lípidos NAC= N-acetil-cisteína GSH= Glutatión reducido GSH-PX= Glutatión peroxidasa CAT= Catalasa SOD= Superóxido dismutasa ATP= Trifosfato de adenosina ADP= Adenosín difosfato AMP= Adenosín monofosfato cíclico
1
1. INTRODUCCIÓN
A nivel mundial, aunque distante de la importancia que tiene la producción
de carne bovina, porcina y de ave, la carne de ovino ocupa el cuarto lugar dentro
del consumo de proteína animal, representando 5% del consumo mundial de
cárnicos (excluyendo el pescado; Carrera et al., 2011).
De acuerdo con los últimos datos publicados por el Sistema de Información
Agropecuaria y Pesquera, en 2011 se contaba con un hato ovino nacional de 8.2
millones de cabezas, destacando en este sentido los estados de Hidalgo y México.
El estado de Chihuahua se encontraba situado en la posición dieciséis en ese
mismo año con 216,227 cabezas (SIAP, 2013).
Las tecnologías disponibles para favorecer el desarrollo de un programa de
mejora genética tienen como base la inseminación artificial, la que sin duda tiene
relación directa con el desarrollo de las técnicas de preservación del semen. La
preservación de semen favorece un uso más eficiente y prolongado de los
carneros asignados a programas de mejoramiento genético, al permitir su
utilización dentro y fuera de la estación reproductiva (Naimn et al., 2009).
Factores ambientales, fisiológicos y genéticos han sido implicados en la
falla reproductiva de sementales ovinos. Por lo tanto, es importante identificar los
factores que afectan al espermatozoide. Entre estos factores se encuentra el
estrés oxidativo al cual se le atribuye afectar la fisiología de los espermatozoides.
El estrés oxidativo se da generalmente cuando especies oxidantes superan en
número a los antioxidantes (Kaur y Bilaspuri, 2011).
2
La vitamina E (VE) y el selenio (Se) son nutrientes importantes que actúan
sinérgicamente y pueden afectar algunos procesos biológicos incluyendo el
metabolismo, la inmunidad, la espermatogénesis y la calidad del semen. La
asociación de la deficiencia de VE con un deterioro del semental se estableció
hace más de tres décadas, y tradicionalmente se le ha nombrado como la
"vitamina anti-esterilidad". El Se es un oligoelemento esencial en la dieta,
necesario para la fertilidad del macho por medio de la biosíntesis de testosterona
(Gamal et al., 2013).
El objetivo del presente trabajo fue evaluar el efecto de la adición de VE, Se
y la combinación de ambos sobre la calidad seminal de semen diluido de ovino
durante el periodo de adaptación a 5ᵒC para el proceso de criopreservación.
3
2. REVISIÓN DE LITERATURA
2.1Situación actual de la ovinocultura
Dado el alto costo de la carne de cordero, una de las tendencias más
significativas en la industria de la carne ovina ha sido el aumento en la
productividad de la industria. Globalmente, la mejora en la productividad es
evidente en las estadísticas de los rebaños y de la producción. Desde 1990 los
números de rebaños a nivel mundial han disminuido en un 11.2%. A pesar de la
caída en los números, la producción de carne ovina ha aumentado. Las
estadísticas de la FAO muestran que China (país con crecimiento más alto)
aumentó más de dos veces su producción de carne ovina desde 1990, mientras el
número de cabezas tan solo aumento el 12% (Molina, 2005).
En México se tienen registradas alrededor de 53,000 unidades de
producción ovina, que están distribuidas aproximadamente de la siguiente forma:
53% en el centro, 24% en el sur-sureste y 23% en el norte. La ovinocultura de
carne se desarrolla bajo un esquema de tipo regional, en la zona central se
producen carne y lana con razas de lana (Suffolk, Hampshire, Rambouillet y
Dorset) y de pelo (Katahdin, Dorper y Pelibuey), la región sur-sureste se basa
principalmente en la producción de carne con razas de pelo (Pelibuey, Black Belly,
Katahdin y Dorper) y produce un poco de lana para uso artesanal con animales
criollos en Oaxaca y Chiapas; la zona norte ahora se dedica a la producción de
carne, no obstante fue la principal proveedora de lana en épocas pasadas, por lo
que aún se mantiene una población de animales de la raza Rambouillet, pero más
4
recientemente se han introducido razas de pelo (Pelibuey, Katahdin y Dorper;
Partida et al., 2013).
Estudios recientes han demostrado que la rentabilidad del ganado ovino de
carne puede incrementarse con el uso de la inseminación artificial así como el uso
de razas prolíficas, aumentando la parición de 1.5 corderos por año (Kukovics et
al., 2011).
2.2 Inseminación Artificial en Ovinos
La inseminación artificial (IA) es la colocación de semen por medios
mecánicos en el tracto reproductor de la hembra (De Lucas y Arbiza, 2003). El
papel principal de la IA en la producción ovina es aumentar la tasa de
mejoramiento genético (Leethongdee, 2009).
El obstáculo más importante en la IA en los ovinos es la estructura
anatómica del tracto reproductivo de la oveja, la cual impide el pasaje transcervical
para la colocación de semen en los cuernos uterinos. Las tasas de concepción
después de la IA vaginal o cervical media, son aceptables, aunque sólo con el
semen recién obtenido el cual está sometido a una mínima manipulación
(Candappa y Bartlewski, 2011).
La criopreservación del semen no ha tenido la misma aplicación en el
ganado ovino que en el bovino, ya que la fertilidad obtenida al inseminar
cervicalmente ha arrojado resultados muy variables, generalmente bajos (menores
a 30%). Los espermatozoides del carnero son muy susceptibles a sufrir daños
acrosomales durante el proceso de criopreservación. Para la utilización de semen
criopreservado, se ha desarrollado la inseminación intrauterina mediante
5
laparoscopía, lo que permite la visualización de los cuernos uterinos y el depósito
del semen en la luz uterina con buenos resultados de fertilidad (Días, 2010).
Ventajas del uso de la IA en ovinos:
1. Mejoramiento genético
2. Mayor difusión de machos superiores en programas de selección y
mejoramiento.
3. Uso de machos más jóvenes (reducción del intervalo generacional).
4. Incremento de la presión de selección.
5. Identificación temprana de machos superiores (Pruebas de progenie).
6. Conservación del material genético
7. Transporte del material genético.
8. Control de enfermedades.
9. Reducción o eliminación de machos en la explotación.
10. Organización del establecimiento y registros.
11. Utilización de machos con incapacidad copulatorías no hereditarias.
12. Reproducción sincronizada y/o fuera de temporada.
13. Uso de otra tecnología.
Desventajas del uso de la IA en ovinos:
1. Inseguridad en la mejora (elección errada de machos).
2. Propagación de enfermedades (infecciosas y/o hereditarias).
3. Costos (estos se convierten en ventajas a la hora de evaluar el beneficio
resultante de buenas prácticas de IA; Aisen, 2004).
6
2.3 Criopreservación de semen
Los programas de IA a gran escala en el siglo XX se enfocaron en la
preservación de espermatozoides bajo condiciones controladas para prolongar su
supervivencia por largos períodos de tiempo. Esto podría lograrse por métodos
que reducen el metabolismo de los espermatozoides, y por lo tanto prolonga su
vida fértil. Hoy en día existe una gran cantidad de información sobre los aspectos
de la conservación de semen ovino, como diluyentes que se han utilizado para
extender el semen, agentes protectores como glicerol y yema de huevo, tasas de
dilución de semen, métodos de refrigeración y adaptación a 5ºC, métodos de
congelación y descongelación (Salomon y Maxwell, 1995).
La fertilidad obtenida con semen congelado es menor a la de semen fresco,
debido principalmente a una baja viabilidad post-descongelamiento y a un
trastorno subletal en la proporción de espermatozoides sobrevivientes (Sandoval
et al., 2007). Se ha sugerido que la dilución, enfriamiento, congelación y
descongelación (proceso de criopreservación) inducen cambios estructurales que
conducen a procesos de capacitación (Marco et al. 2005).
El espermatozoide de los mamíferos domésticos no sobrevive al
enfriamiento rápido hasta 0°C (shock frío) debido a la perdida de cationes y
enzimas (Byrne et al., 2000). El descenso rápido de temperatura también destruye
la permeabilidad selectiva de las membranas del espermatozoide al calcio, lo que
conduce a niveles intracelulares excesivos, los cuales reducen la motilidad y
conducen a necrosis (Bailey et al, 2000). En las mitocondrias de los
espermatozoides durante el enfriamiento a 5°C se puede observar un cambio
7
morfológico en la vaina mitocondrial resultante de la pérdida de proteína (Salomon
y Maxwell, 1995).
Una reducción gradual en la actividad metabólica de los espermatozoides
durante el almacenamiento a 5°C puede limitar la producción de subproductos
perjudiciales y también influye en las funciones espermáticas esenciales tales
como la motilidad. Entre las diferentes alteraciones se encuentra la actividad de la
enzimas intracelulares, la glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa es la primera enzima
que se daña durante el descenso de la temperatura. La concentración intracelular
de ATP se reduce o se pierde y se aumenta el ADP y el AMP cíclico de ahí que la
reducción en la membrana acrosómica en combinación con el daño por el
descenso de temperatura representan la mayor parte de la perdida de fertilidad en
el proceso de criopreservación (Lemma, 2011).
2.4 Estrés oxidativo
El oxígeno (O2) es esencial para la vida de los organismos aerobios y la
mayor parte (98%) es utilizado para la generación de energía, la cual es liberada
durante las oxidaciones biológicas y almacenadas por las células en forma de ATP
(Villa y Ceballos, 2007). De manera habitual, el O2 se encuentra en su forma más
estable, sin embargo por reacciones puramente químicas, por acciones
enzimáticas o por efecto de las radiaciones ionizantes, se pueden producir una
serie de especies químicas o sustancias prooxidantes (moléculas o radicales libres
altamente reactivos) que son capaces de dar lugar a múltiples reacciones con
otros compuestos presentes en el organismo, que llegan a producir daño celular
8
(Venereo, 2002). Una consecuencia directa de este proceso es que en el
intermedio se forman varias moléculas con diferente grado de oxidación, algunas
de las cuales también pueden entregar uno o dos electrones al O2 y producir
intermediarios parcialmente reducidos llamadas “especies reactivas al oxígeno
(ROS)” tales como anión superóxido (O2-), peróxido de hidrógeno (H2O2), radical
hidroxilo (-OH), radicales alcoxi, peroxi y peroxinitritos (Villa y Ceballos, 2007).
Ciertos niveles de radicales libres son necesarios para el funcionamiento normal
de las células espermáticas, incluyendo procesos como la capacitación, la
hiperactivación, la reacción acrosómica, la fusión al ovocito y la fertilización
(Restrepo et al., 2012). Sin embargo, cuando estas especies oxidantes rebasan la
capacidad antioxidante se presenta el estrés oxidativo (Membrillo et al., 2003).
Cuando el semen se almacena a 4-5°C hay una disminución de la
motilidad, de la integridad funcional de las membranas y de la fertilidad (Mustafa y
Necmettin, 2007). Los espermatozoides producen y envían ROS al medio
extracelular, de los cuales la mayoría son producidos por las mitocondrias y son el
producto de la reducción monovalente del oxígeno molecular durante la
fosforilación oxidativa. Los ROS inactivan enzimas glucolíticas que traen como
consecuencia un bloqueo en la biosíntesis de ATP y la consiguiente pérdida de la
motilidad por falta de combustible necesario para la contracción de los
microtubulos flagelares de los espermatozoides (Cordova et al., 2010).
Uno de los principales procesos biológicos asociado con ROS es la
peroxidación de lípidos (LPO). La susceptibilidad de los espermatozoides de
rumiantes a la LPO es una consecuencia de la abundancia ácidos grasos
poliinsaturados en la membrana plasmática del espermatozoide. Esta da la fluidez
9
a las membranas y la flexibilidad para ayudar a los espermatozoides a participar
en los eventos de fusión de membrana asociados con la fertilización (Kaur y
Bilaspuri, 2011). Los espermatozoides descargan la mayor parte de su citoplasma,
inmediatamente antes de la espermiación y, como consecuencia, pierden la
protección de las células que se basa en enzimas citoplasmáticas (como la
catalasa, superóxido dismutasa y glutatión peroxidasa). La peroxidación lipídica
provoca la pérdida de la integridad de la membrana, inactivación enzimatica y
daño estructural al ADN terminando con la muerte celular (Anghel et al., 2010).
2.5 Antioxidantes
Los antioxidantes son un conjunto de compuestos químicos o productos
biológicos que contrarrestan de una manera directa o indirecta los efectos nocivos
de los radicales libres u oxidaciones. Se han clasificado en dos principales
sistemas, el sistema no enzimático que comprende el glutatión, ácido lipoico, la
bilirrubina, las ubiquinonas, los bioflavonoides, la vitamina E (alfa tocoferol), la
vitamina C (ácido ascórbico), la vitamina A, los carotenoides, acetil-L-carnitina,
coenzima Q10, curcumina, N-acetil-cisteína (NAC), resveratrol, vitamina B;
mientras que los minerales selenio, cobre, zinc y magnesio forman parte de la
estructura molecular de algunas de las enzimas antioxidantes (López et al., 2012).
Por otro lado, el sistema enzimático que corresponde a glutatión reducido (GSH),
glutatión peroxidasa (GSH-PX), catalasa (CAT) y superóxido dismutasa (SOD).
Estos sistemas se han descrito como un mecanismo de defensa contra la
peroxidacion de los lípidos en el semen y son factor determinante en el
10
mantenimiento de la motilidad y viabilidad del espermatozoide (Mustafa et al.,
2008).
La dilución del semen comúnmente utilizado en el proceso de
criopreservación promueve la reducción de la concentración de antioxidantes, lo
que resulta en un desequilibrio entre oxidantes y antioxidantes, y por lo tanto en
estrés celular. Con el fin de reducir los posibles efectos de este desequilibrio se ha
estudiado el efecto de la adición de los extensores junto con la de diversos
antioxidantes (Guerra et al., 2012). El uso de antioxidantes podría constituir una
alternativa para mejorar los protocolos de criopreservación de semen ovino
mediante el bloqueo de la desestabilización espermática y así lograr mejores tasa
de fertilidad (Santiani et al., 2007).
Se ha propuesto que la VE es el principal componente del sistema
antioxidante de los espermatozoides y es uno de los principales protectores de la
membrana espermática contra ROS y LPO (Bansal y Bilaspuri, 2009). Debido a su
liposolubilidad, la VE es la primera línea de defensa contra la peroxidación de los
ácidos grasos poliinsaturados. Está actúa en la rotura de la cadena oxidante en las
membranas, ya que disminuye los radicales libres tales como el anión superóxido,
peróxido de hidrógeno y el radical hidroxilo (Amini et al., 2013).
El Se es un elemento que cumple importantes funciones en los procesos
reproductivos. En el macho cantidades insuficientes de Se en el organismo se ven
reflejadas en hipogonadismo, lo que traerá como consecuencia baja producción y
mala calidad del semen (Seremak et al., 1999). El aumento del microelemento en
los sementales ovinos produce un aumento en la motilidad y en el conteo total de
células en el semen, así como en las proporciones de espermatozoides vivos y
11
normales (Carrillo et al., 2012). El selenio tiene también una función antioxidante
como cofactor de la enzima citoplasmática glutation-peroxidasa, enzima
relacionada con la neutralización y eliminación de los radicales libres de oxígeno
que pueden alterar la integridad celular (Daza, et al., 2000).
12
3. MATERIALES Y METODOS
3.1 Localización del área de estudio
El presente estudio se llevó a cabo en las instalaciones de la Unidad de
Prácticas en Rumiantes así como también en el Laboratorio Multidisciplinario de
Veterinaria pertenecientes al Departamento de Ciencias Veterinarias del Instituto
de Ciencias Biomédicas de la Universidad Autónoma de Ciudad Juárez, ubicado
en Ciudad Juárez, Chihuahua el cual tiene una altitud aproximada de 1133 msnm
(INEGI, 1991), una latitud de 31.746534 y una longitud de 106.443191 (Google
Maps, 2014).
3.2 Iniciación y duración del experimento
La investigación inicio en el mes de septiembre de 2013. El trabajo de
campo se llevó acabo en veintiún días los cuales correspondieron a los meses de
marzo y abril de 2014. La recopilación de información, análisis estadístico y
escritura tuvo una duración de nueve meses.
3.3 Características de las unidades experimentales
Se utilizaron cuatro carneros con encaste de las razas Black-belly,
Katahdin, Pelibuey y Dorper de aproximadamente de 2 años de edad. Contaban
con un peso de 60 kg aproximadamente y una condición corporal de 4 (en una
escala de 1 a 5; Thompson y Meyer, 1994). La alimentación de los animales
durante la realización del estudio se basó principalmente en heno de alfalfa y
maíz.
13
Antes de iniciar el experimento se realizó una prueba de fertilidad a cada
uno de ellos para determinar sin eran aptos para el experimento; ésta consistió en
una evaluación física, evaluación del tamaño y tono testicular, evaluación del pene
y prepucio, y evaluación seminal.
3.4 Colección de semen
Los eyaculados fueron evaluados e incluidos en el estudio solamente si
cumplían las siguientes características: volumen de 0.3-1.5 ml, concentración de
1x109 espermatozoides por ml y motilidad masal del 70% (Azawi y Hussein, 2013).
En total se obtuvieron 26 eyaculados con la utilización de electroeyaculador. Los
eyaculados se obtuvieron cada tercer día durante tres semanas. Para la
evaluación seminal se consideró el volumen el cual se midió con un tubo
graduado; la concentración, la cual se obtuvo a través del conteo espermático con
la cámara de Neubauer con el método descrito por la Universidad de Wisconsin
(UW, 2014); la motilidad se determinó por apreciación visual de ondas, utilizando
la clasificación elaborada por Hafez (2000; Cuadro 1); y por último, para conocer el
porcentaje de viabilidad se realizó una tinción basada en eosina-nigrosina (eosina
1% y nigrosina 5% en solución salina). Para realizar la tinción se utilizó un
portaobjetos atemperado a 34ᵒC en cual se colocaron 30 μl de semen y la misma
cantidad de tinción, se mezcló y se dejó reposar 50 segundos y se realizó el frotis.
Una vez seco, el frotis se observó al microscopio con objetivo de 60X, se eligió un
campo al azar y se contabilizaron 100 células. Las células teñidas de rosa
representan el porcentaje de mortalidad y las no teñidas se consideran células
viables (Chemineau y Cagnié, 1991).
14
CUADRO 1. ESCALA BASADA EN EL PORCENTAJE DE CÉLULAS MÓTILES.
Valor
descriptivo Aspecto del modelo
% de células
móviles Criterio evaluativo
Muy buena Movimiento en ondas
vigorosas y en remolinos
rápidos
80-90% ++++
Buena Remolinos y ondas más
lentas
60-80% +++
Regular Sin remolinos, pero con
oscilaciones generalizadas
40-60% ++
Mala Escasa o ninguna
motilidad
0-40% + o -
15
3.5 Dilución del semen y adición los tratamientos
Para la dilución de las muestras de semen se utilizó un diluyente comercial
a base de Tris-fructosa-glicerol-yema de huevo (Triladyl®) en una proporción de
20% de diluyente, 20% de yema de huevo y 60% de agua. Después de la adición
de diluyente al semen, la muestra se evaluó nuevamente para asegurar que la
dilución no afectara la calidad seminal.
Los eyaculados se manejaron en conjunto, se mezclaron y fueron
divididos en cinco alícuotas iguales de 3 ml en las cuales se adicionó VE (1 mg
mL-1 debido a la insolubilidad de la vitamina E en agua se utilizó etanol al 100%
para diluirla; Azawi y Hussein, 2013), Se (2 μg mL-1; Dorostkar et al., 2012),
VE/Se, (1 mg/ml y 2 μg mL-1,) etanol (10 μl mL-1; Upreti et al., 1997) y sin aditivo
(control) para un total de cinco grupos experimentales, los cuales tenían una
concentración final de 80x106 espermatozoides por ml (D’Alessandro et al., 2001).
Las alícuotas fueron distribuidas y almacenadas en pajillas francesas de 0.5 ml las
cuales fueron selladas por calor y refrigeradas durante tres horas hasta que su
temperatura descendió de 36°C a 5°C.
3.6 Análisis de parámetros estándar del semen
Después del almacenamiento del semen a 5°C, las pajillas fueron
sumergidas durante 30 segundos en un baño de agua a 36°C para la evaluación
de los parámetros estándar (Ahmet et al., 2008).
16
3.6.1 Motilidad progresiva
La motilidad progresiva se evaluó colocando 40 μl de semen diluido sobre
un portaobjetos a temperado a 36°C, la gota se cubrió con un cubreobjeto también
atemperado y se observó en el microscopio con objetivo de 40X. Las estimaciones
de la motilidad de los espermatozoides se llevaron a cabo en tres campos
microscópicos diferentes para cada muestra de semen. La media de las tres
estimaciones sucesivas se registró como la puntuación de la motilidad final
(Mustafa y Necmettin, 2007).
3.6.2 Viabilidad espermática
La viabilidad espermática se evaluó con la tinción eosina-nigrosina
utilizando la metodología previamente descrita.
3.7 Variables a evaluar
a) Motilidad progresiva.
Porcentaje de espermatozoides con movimiento lineal progresivo después del
proceso de refrigeración.
b) Viabilidad espermática.
Porcentaje de espermatozoides vivos después del proceso de refrigeración.
3.8 Análisis estadístico
Los efectos del tratamiento sobre la tasa de motilidad progresiva y la tasa
de viabilidad se analizaron a través de un diseño completamente al azar utilizando
17
el procedimiento GENMOD de SAS y se realizaron contrastes simples entre los
tratamientos.
18
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En el cuadro 2 se observa la motilidad masal y la viabilidad de los
eyaculados antes de la dilución del semen y la adición de los tratamientos. Al
comparar los resultados obtenidos en el control (cuadro 3) con la motilidad inicial
antes de la dilución del semen (cuadro 2) se obtuvo una diferencia del 15%,
resultado no muy diferente al descrito por Cámara et al. (2011) quienes obtuvieron
una diferencia de 9%. La diferencia de la viabilidad del control en comparación con
el semen antes de la dilución es de 9%, la cual coincide con los resultados de
Mustafa et al. (2007).
La motilidad progresiva observada con el uso de VE no mostro diferencias
significativas en comparación con el control. Estos resultados no coinciden con los
descritos por Amini et al. (2013) quienes compararon el efecto de la VE a
diferentes dosis sobre el semen de carnero en el proceso de adaptación a 5ᵒC
encontrando un incremento significativo de un 20% en la motilidad progresiva con
la adición de 1 mg mL-1 de VE, similar a lo reportado por Azawi y Hussein (2013)
quienes utilizando la misma dosis de 1 mg mL-1 reportaron un incremento de
motilidad en un 10% a las 120 horas a 5°C. Ball et al. (2001) añadieron Tempo
(análogo de VE) y VE en el semen de equino utilizando dosis de 1 mg mL-1 y 0.5
mg mL-1 el cual se almacenó por 72 horas a 5°C, sin observar diferencias en los
tratamientos. La dosis de 1 mg de VE mL-1 de semen diluido fue la que mostró el
mayor incremento en la motilidad progresiva en los artículos consultados, razón
por la que fue seleccionada para el presente estudio.
19
CUADRO 2. EVALUACIÓN DE LA MOTILIDAD MASAL Y VIABILIDAD ESPERMÄTICA DEL SEMEN FRESCO.
Repetición Motilidad Masal (%) Viabilidad (%)
1 70 87
2 80 85
3 87 83
4 87 91
5 90 80
6
Media
80
82.33 ±2.97
90
86.00±1.71
20
CUADRO 3. PORCENTAJE DE MOTILIDAD PROGRESIVA Y VIABILIDAD
ESPERMÁTICA TERMINADO EL PROCESO DE ADAPTACIÓN A 5°C Y DESPUES DE LA ADICIÓN DE VE, SE, VE/SE Y ETANOL (MEDIA±EE).
Tratamiento Motilidad (%) Viabilidad (%)
Control 67.00±2.84a 76.67±3.24a
Vitamina E 65.50±2.29a 73.00±4.42ab
Vitamina E/Selenio 64.83±1.70a 73.33±3.89ab
Selenio 67.67±3.49a 75.50±4.30a
Etanol 63.50±2.83a 68.33±4.12b
Los valores medios de cada parámetro en la misma columna con distinta letra (a, b)
son significativamente diferentes (P <0.05).
.
21
Los resultados del cuadro 3 muestran que la motilidad progresiva es igual
en el control que en los espermatozoides tratados con Se, mientras que los demás
tratamientos muestran una motilidad menor, sin mostrar diferencia significativa en
ninguno de los casos (P˃0.05). Scott et al. (1998) estudiaron el efecto del Se
suplementado oralmente a hombres de 32 años, los cuales tomaron 100 μg de Se
al día. En los resultados se observó que aquellos hombres que fueron
suplementados con Se tenían hasta 9% más de motilidad espermática que los
hombres del grupo control. Por otra parte, Dorostkar et al., (2012) utilizaron
diversas dosis de Se adicionándolo directamente sobre el semen de búfalo
(Bubalus bubalis) adaptado a 5°C, encontrando diferencias significativas en el
semen al agregar 2 μg mL-1 de Se; por esta razón y la escasa información sobre el
efecto directo del Se en el espermatozoide, se decidió utilizar esta dosis. Sin
embargo, Seramak et al., (1999) obtuvieron resultados muy similares a los
obtenidos en el presente estudio, sin diferencias significativas comparando
diversas dosis de Se (1 y 10 μg mL-1) en el semen de carnero criopreservado.
Con la combinación de los tratamientos de VE y Se no se observaron
diferencias en comparación con el control y los demás tratamientos. Vezina et al.
(1996) describieron que al suministrar por vía oral 100 μg de Se y 200 mg de VE a
hombres de 31 años de edad durante 180 días se observó un incremento de 17%
en la motilidad en comparación con el día 0. Guzmán et al (2000) también
observaron diferencias significativas en su investigación sobre semen de cerdos a
los cuales se les agrego a la dieta 0.5 ppm de Se y 220 UI/kg de VE. Por otra
parte Kolodziej y Jacyno (2005) adicionaron 0.2 mg de Se y 30 mg de VE en la
22
ración diaria de verracos durante 110 días sin obtener alguna mejoría en la
motilidad espermática.
El tratamiento experimental de etanol se llevó a cabo debido a la
insolubilidad de la VE en agua (Febles et al., 2002), por ello todos los grupos
experimentales con VE fueron diluidos en etanol. La motilidad progresiva del
control en comparación con el tratamiento de etanol, pese ser la más distante de
todos los tratamientos con 3% menos de motilidad, no es una diferencia
estadísticamente significativa. Los resultados encontrados acerca del efecto del
etanol son contradictorios. Upreti et al. (1997) diluyeron 10 μl de etanol por cada
mililitro de diluyente con semen de carnero, y reportan que obtuvieron 3% más
motilidad en el tratamiento de etanol que en el grupo control. Por otro lado Nasiri
et al. (2011) reportan diferencias significativas al adicionar 5 μl mL-1 de etanol en
semen de toro, reduciendo la motilidad progresiva en un 17% en comparación al
control.
La VE en comparación con el control presentó 3% menos de viabilidad, lo
cual no representa una diferencia. Marti et al. (2008) diluyeron semen de carnero
en leche, a la cual añadieron 1 mg/ml de VE y realizaron el proceso de
criopreservación; así mismo, Bansal y Bilaspuri (2009) trabajaron con semen de
toro agregando 0.5, 1, y 1.25 mg mL-1 de VE incubando el semen a 37ᵒC. En
ambos estudios no se obtuvieron diferencias, coincidiendo los resultados con los
obtenidos en este estudio. Por otra parte Anghel et al. (2010) obtuvieron 14% más
de viabilidad en semen de ciervo (Cervus elaphus) al agregar 1 mg mL-1 de VE en
comparación con su control. La VE es agregada al semen con la finalidad de crear
un efecto protector en el espermatozoide, este efecto es debido a su
23
liposolubilidad, lo que crea una línea de defensa contra la peroxidacion lipídica
(Febles et al., 2002).
En cuanto a viabilidad, en la comparación hecha entre el control y el
tratamiento de Se no se observaron diferencias. Sin embargo, en el tratamiento
con etanol se observa 9% menos de viabilidad espermática. Al igual que los
resultados obtenidos, Dorostkar et al., (2012) mencionan que no encontraron
diferencias en cuanto a viabilidad al agregar 2 μg mL-1 de Se en el semen de
búfalo (Bubalus bubalis). Kendall et al. (2000) describen que ofrecer bolos de
minerales como selenio, zinc y cobalto mejora significativamente la viabilidad del
espermatozoide después de 79 días de ofrecer el bolo. La importancia del Se en
el semen es debido a la función como cofactor de la enzima GSH-PX, la cual se
encarga de la eliminación de radicales libres a través de la presencia de la
selenoproteina glutation capsular (Agarwal y Sekhon, 2010).
La viabilidad espermática, al adicionar la combinación de VE/Se no mostró
diferencias. Por el contrario, Segerson y Johnson (1980) al aplicar 680 UI de VE y
50 mg de Se de forma parenteral a toros, obtuvieron un descenso en la viabilidad
de 3% en comparación al grupo control, en cambio Mahmoud et al. (2013)
observaron 14% más de viabilidad en el semen de carnero al aplicar de manera
intramuscular 5 mg de selenito de sodio y 450 mg de VE dos veces en 30 días. La
combinación de VE y Se se justifica debido a su función sinérgica como
antiperoxidantes. La VE es la base de la quelación del Se, es por ello que
sinérgicamente la VE potencializa el efecto del Se como antioxidante (Agarwal y
Sekhon, 2010).
24
Al comparar los resultados obtenidos en el presente estudio se pueden
observar diferencias en el tratamiento de etanol con 8% menos de viabilidad en
comparación con el control y el tratamiento de Se. Nasiri et al. (2011) describen
que al agregar 0.5 μl de etanol en el semen de toros y después del proceso de
criopreservación obtuvieron 19% menos viabilidad que en su control, lo cual
coincide con los resultados del presente estudio. La mortalidad y la disminución de
la motilidad de los espermatozoides al agregar etanol al semen se explica debido
a las interacciones de la membrana celular con proteínas las cuales se modifican
por la acción de etanol en la membrana. El etanol actúa sobre la membrana
celular estresándola mecánicamente (Rivera y Lima, 2013). Sin embargo, se
observó que al adicionar etanol con VE, el efecto tóxico del etanol disminuye, ya
que tanto en los tratamientos de VE y VE/Se, no se observaron diferencias en la
motilidad progresiva y viabilidad en comparación al control como la que si se
observó en el tratamiento de etanol.
En el cuadro 4 se muestran los valores de probabilidad de los
contrastes entre tratamientos. Respecto a la motilidad progresiva, aunque no
existieron diferencias estadísticamente significativas, la mayor diferencia se
observó entre los tratamientos de etanol y selenio. El control tuvo una tendencia
similar al selenio.
En la viabilidad espermática se observaron diferencias entre los
tratamientos de control contra etanol y Se contra etanol, mientras que los
tratamientos con VE (solo VE y VE/Se) y etanol no mostraron diferencias.
25
CUADRO 4. CONTRASTES ENTRE TRATAMIENTOS DESPUES DE EL
PROCESO DE ADAPTACIÓN A 5ᵒC.
Tratamientos Motilidad Progresiva
Probabilidad
Viabilidad
Probabilidad
T1 - T2 0.80 0.63
T1 - T3 0.43 0.18
T1 – T4 0.58 0.14
T1 - T5 0.20 <0.01
T2 - T3 0.30 0.39
T2 - T4 0.42 0.32
T2 - T5 0.13 <0.01
T3 - T4 0.81 0.90
T3 - T5 0.63 0.06
T4 - T5 0.47 0.08
T1 Control T2 Selenio T3 Vitamina E/Selenio T4 Vitamina E T5 Etanol
26
5. CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en el presente estudio indican que la adición de 1
mg mL-1 de VE y 2 μg mL-1 de Se y su combinación no aumentan la viabilidad ni
la motilidad progresiva de los espermatozoides durante la adaptación a 5°C para
el proceso de criopreservación.
La adición de 10 μl mL-1 de etanol al semen diluido afecta la viabilidad de
los espermatozoides. Sin embargo la adición de VE disminuye el efecto toxico del
etanol sobre el espermatozoide, ya que en los tratamientos VE y VE/Se se
observó un efecto protector de la VE sobre el espermatozoide expuesto al etanol.
En trabajos posteriores, se recomienda disminuir la cantidad de etanol
como diluyente de la VE o evaluar diferentes alternativas para realizar la dilución
de la VE sin el uso de etanol. Otra alternativa es evaluar el incremento de la dosis
de VE, con el objetivo de disminuir el efecto toxico del etanol sobre el
espermatozoide.
27
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