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Efecto de las gotas citoplásmicas sobre la capacidad fecundante del espermatozoide en el cerdo
Proyecto de Tesis Doctoral
Estudiante:
Germán Gómez L
Director:
Francisco Javier Henao U, DMVZ, MSc, PhD
Asesores evaluadores:
Consuelo Velez A, MSc, PhD
Alejandro Ceballos M, MSc, PhD
Jonatan Rubén Sánchez-Osorio Moreno, PhD
Doctorado en Ciencias Agrarias Facultad de Ciencias Agropecuarias
Universidad de Caldas
Manizales, octubre de 2011
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Tabla de contenido
Jutificación ................................................................................................................................ 3
Planteamiento del problema .............................................................................................. 5
Metodología propuesta ........................................................................................................ 7 Población ............................................................................................................................................ 7 Procedimiento .................................................................................................................................. 9
Etapa I ............................................................................................................................................................. 9 Etapa II experimental ............................................................................................................................. 11
Hipótesis del estudio .......................................................................................................... 16 Etapa estudio caso control: ........................................................................................................16
Marco Teórico ....................................................................................................................... 17
Objetivos ................................................................................................................................. 25 Objetivo general ........................................................................................................................................ 25 Objetivos específicos ............................................................................................................................... 25
Resultados esperados ........................................................................................................ 26
Impactos esperados a partir del uso de los resultados .......................................... 27
Consideraciones éticas del estudio ............................................................................... 28
Cronograma de actividades ............................................................................................. 29
Presupuesto ........................................................................................................................... 30
Compromisos ........................................................................................................................ 30
Bibliografía ............................................................................................................................ 31
3
Efecto de las gotas citoplásmicas sobre la capacidad fecundante del espermatozoide en el cerdo
Estudiante: Germán Gómez L
Director: Francisco Javier Henao U, DMVZ, MSc, PhD
Asesores evaluadores: Consuelo Velez A, MSc, PhD
Jonatan Rubén Sánchez-Osorio Moreno,
Alejandro Ceballos M, MSc, PhD
Jutificación
En un modelo productivo globalizado, los industriales dedicados a
la producción de carne porcina han visualizado la asociatividad,
las escalas competi tivas y la certi f icación de procesos, como
herramientas de desarrol lo. Dentro de la certi f icación de proce sos,
entre otros aspectos, se apunta a mejorar los indicadores en los
centros de inseminación arti f icial para enfrentar una de sus más
graves l imitantes, consistente en la baja calidad seminal, la cual
es causada principalmente por la presencia de remanentes
citoplásmicos denominadas gotas ci toplásmicas (GCs) . En
Colombia, e l esquema de contro l de cal idad seminal en los
centros de inseminación art i f ic ial de porcinos no está definido y
presenta importantes fa lencias manif iestas por la indemostrable
objet ividad de los resul tados. El Inst i tuto Colombiano
Agropecuario ha hecho esfuerzos por a justar la comercial ización
del mater ial seminal s in contro l confiable de la cal idad seminal ,
pero en muchos casos, la medida no ha sido tomada como
mecanismo mejorador de los procesos productivos nacionales. El
desarrol lo de técnicas repl icables, conf iables y objet ivas de
evaluación seminal , es insipiente debido al bajo impacto de la
4
medida de contro l y a l pobre interés del gremio por tener
registros completos de los resul tad os reproductivos de los
verracos. Estas condiciones, l imi tan el desarrol lo de la
porcicul tura nacional por no contar con umbrales de clasi f icación
de cal idad seminal de verracos en las condiciones colombianas.
Esta fa l ta de información predispone a los por cicul tores a ut i l izar
mater ia l seminal de cal idad, buena, regular o mala, en ocasiones
donde se asume que lo que se ut i l iza s iempre es bueno,
exponiendo la productividad y la competi t ividad de la empresa.
La identif icación de factores asociados a la variab il idad en la
frecuencia de presentación de GCs será, por tanto, un aporte
fundamental para prevenir, tratar y controlar la presentación de la
esta al teración espermática , en los centros de inseminación
arti f icial , considerada como la más importante para la industria
porcina. Con esta propuesta se espera generar un sistema integral
de estimación de la ferti l idad del verraco, una matriz explicativa de
causas y efectos de la dinámica de presentación de las GCs en el
porcino, además de formar recurso humano del más alto nivel
académico.
5
Planteamiento del problema
Las GCs son pequeños remanentes del ci toplasma original del
espermatozoide, que quedan adheridos al espermatozoide después
de la espermatogénesis (Fischer et al., 2003b; Kaplan et al .,
1984a); estas estructuras migran desde la porción proximal del
tracto intermedio del espermatozoide a la porción distal, durante el
paso por el epidídimo, en el proceso de maduración (Fischer et al.,
2005a; Kuster et al., 2004b), para luego el iminarse (Kaplan et al .,
1984b) (KATO et al., 1996) y (Harayama et al., 1996), encontraron
que su el iminación ocurre uno a dos minutos después de la
eyaculación, cuando los espermatozoides se mezclan con
componentes del plasma seminal (PS) como la fructosa y el
adenosín monofosfato cícl ico (AMPc) . Se considera que un macho
tiene persistencia de GCs, cuando permanentemente presenta un
porcentaje ≥ a 20% de éstas, después del proceso natural de
eliminación. Es común encontrar defectos estructurales de la cola
asociados a GCs, denominados, reflejo distal de la pieza media y
ovi l lo-gota; el primero consiste en el plegamiento de la cola
entorno a la gota, en un ángulo de 180° (Fischer et al ., 2005a); y el
segundo se da por el enrol lamiento total o parcial de la cola sobre
la gota ci toplásmica (Bonet, 1990; Bonet et al ., 1993).
Las gotas citoplásmicas (GCs) son la al teración espermática más
frecuente en machos porcinos destinados a procesos de
reproducción controlada, encontrándose que una elevada
proporción de estas, estan claramente correlacionada con bajos
niveles de ferti l idad; asi mismo, se ha identif icado variabil idad en
la frecuencia de presentación de GCs entre machos, a lo largo de
la vida úti l de los mismos y su persistencia en otros. La presencia
temporal o permanente, de un elevado porcentaje de Gcs, l imitan
parcial o definitivamente la uti l ización del macho afectado en
reproducción, bien sea para uti l izarlo en monta natural o pa
6
inseminación arti f icial (Gómez, 2010). En Colombia se han
realizado reportes relacionados con Por las razones anter iores se
formula la presente propuesta con el propósito de buscar
respuesta a los siguientes interrogantes:
¿Cuáles son los factores asociados con la presentación de
gotas en verracos activos reproductivamente?
¿Cuál es el efecto de las gotas ci toplasmáticas sobre la
capacidad fecundante del espermatozoide en el cerdo?
¿Cuales son las al ternativas de inducción, prevención y
tratamiento de las gotas basadas en los factores asociados?
7
Metodología propuesta
Población
En el estudio se uti l izarán 40 machos reproductores ubicados en
las siguientes granjas porcicolas comerciales del centro-occidente
de Colombia: 6 en la Pradera, 2 en Agrinsa, 6 en Mandalay, 5 en la
Cabañita, 3 en Terranova y 20 en CERVALLE, los cuales estarán
sometidos a las condiciones de explotación particulares de cada
una de las granjas; y 10 machos con propósitos experimentales,
elegidos de lotes de ceba de una granja comercial, los cuales
serán sometidos a condiciones sanitarias y nu tricionales
homogéneas. Las muestras seminales las colectarán operarios
capacitados mediante la técnica de la mano enguantada entre las
04:00 y 06:00 horas. De cada macho se obtendrá una muestr a de
semen di luido y sin di luir.a las que se les realizarán las siguientes
pruebas:
Valoración de la movil idad mediante un equipo Sperm Class
Analyzer® (SCA®) de la casa comercial Microptic, de
acuerdo con las siguientes pautas: velocidad curvi l ínea
(µm/s), velocidad promedio de la trayectoria (µm/s), amplitud
del desplazamiento lateral de la cabeza (µm/s), l inealidad de
la trayectoria promedio, l inealidad de la trayectoria
curvi l ínea, osci lación y frecuencia de batida. (Quintero, 2003)
Determinación de la concentración mediante la camara de
Bürker y microscopio de campo claro Nikon YS2 a
magnificación 400X, con 5 µl de una di lución 1:200 de semen
y solución salina formolada (2,25 g NaCl. + 249,25 ml de
agua estéri l , desti lada y desionizada + 0,75 ml formol).
(Pérez-Llano et al., 2001) (Johnson et al., 2000)
8
Morfología por f i jación con solución salina formolada en
di lución 1:1, determinando porcentaje de GCs simples los
defectos de cabeza (suelta, macro, micro, piri forme), tracto
intermedio (doble, lazo, engrosado), cola (latigo, lazo,
escalera) y gota citoplasmica (distal, proximal, ovi l lo gota,
reflejo distal) . (Fazeli et al ., 1997; Hancock, 1952; Nagy et
al., 2003; Pursel and Johnson, 1974; Pursel et al., 1972;
Rozeboom et al., 2000; Vazquez et al ., 1992).
Fragmentación de DNA con kit t ipo Halomax. (Fernández et
al., 2003; Wells and Awa, 1970)
Integridad acrosómica por f i jación con glutaraldehído al 2%
en di lución 1:1, en microscopio de alta re solución de
contraste de interferencia diferencial (DIC) y contraste de
fases en magnificación de 1000X, y por f luorescencia con
Fluoroscein Isothiocyanate Peanut Agglutinin , visualizado en
microscopio Nikon ecl ipse 80i equipado con epifluorescencia
y en 400X de magnificación.( Wells and Awa, 1970)(Fazeli et
al., 1997; Hancock, 1952; Nagy et al ., 2003; Pursel and
Johnson, 1974; Pursel et al ., 1972).
Funcionalidad bioquímica de membrana: con la prueba de
endosmosis (HOST o Hypoosmotic Swelling Test ): por
incubación en una solución de 100 mOsm/L. (Quintero, 2003)
Prueba de penetración de ovoci tos homólogos: consisti rá en
una combinación de los protocolos empleados por: (Caballero
et al., 2005; Gadea and Matas, 2000; Gadea et al., 1998;
Gadea et al ., 2004a; Lucas et al ., 2003).
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Supervivencia espermática por dos técnicas así: con un
extendido de Eosina – Nigrosina en di lución 1:1, en
microscopio de campo claro a 400X de magnificación; y con
fluorescencia con Ioduro de Propidio, en microscopio Nikon
ecl ipse 80i equipado con epifluorescencia a 400X de
magnificación. (Quintero, 2003)
Determinación de temperatura y pH.
Procedimiento
Etapa I
1. Mediante un Estudio de Caso y Control (Dohoo et al., 2009) se
realizará el Monitoreo por tiempo, del comportamiento
reproductivo de los 40 cerdos, durante un año, mediante
espermogramas completos cada 45 días, con los que se
elaborará una base de datos. Se tomarán como casos, los
cerdos de la base de datos, que presenten cuatro o mas de
cuatro de un total de ocho evaluaciones, con un porcentaje total
de gotas ≥ al 25% de gotas ci toplásmicas y se usarán como
control , los cerdos de la base de datos que presenten de
manera constante un porcentaje total de gotas < al 25%.
2. Se realizará la determinación y evaluación de los factores
asociados a la presentación de las gotas citoplásmicas,
mediante una ficha de seguimiento de los machos en granja,
la cual contempla: Granja (ubicación, temperatura, humedad,
altura sobre el nivel del mar), edad del macho y tiempo de
servicio, genotipo, operario (tiempo con el cerdo, hora de
toma), planes sanitarios, al imentación, (hora, tipo, cantidad y
calidad), frecuencia de eyaculación, tipo de alojamiento,
(Dimensiones, y características estructurales), uso de
10
pesticidas en los animales en el ambiente y en los
alrededores, uso de medicamentos, a lteraciones sanitarias
(f iebres, cojeras, tratamientos).
3. Con la metodología de Metaanálisis (Sargeant and Rajic,
2006) se determinará la consistencia y la precisión de los
factores asociados a la presentación de las gotas
citoplásmicas reportados en la l i teratura. Se l levará a cabo
una búsqueda de l i teratura en medios electrónicos y no
electrónicos uti l izando el servidor de la Universidad de
Caldas, para identif icar los estudios primarios realizados; no
habrá restricciones de revistas y las publicaciones elegibles
incluyen resúmenes, actas de congresos, capítulos de l ibros
y tesis. Igualmente se extraerá la información relacionada
con la cal idad del estudio, la que estará determinada por la
descripción del diseño experimental . La información será
extraída doblemente por dos personas, lo que permitirá
verif icar la confiabil idad de los datos obtenidos y de la base
de datos que se haya creado. Posteriormente los datos serán
tabulados usando el EpiData Entry y se transferirá al
programa estadístico Stata versión 12.0. Posteriormente se
hará el resumen de la información para presentar la revisión
sistemática.
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Etapa II experimental
Una vez identif icados los factores asociados a la presentación de
las gotas ci toplásmicas, se diseñará un experimento con el o los
factores mas relevantes usando como material experimental los 10
machos comerciales. El propósito de esta etapa es evaluar las
alternativas de inducción, prevención y tratamiento de las gotas
citoplásmicas.
Se realizará regresión logística mixta, donde se evalúan los
factores de riesgo y su asociación con la presentación de las gotas
citoplásmicas, donde el macho se considera como factor aleatorio
y los factores asociados como factores fi jos.
La unidad experimental en los análisis será el macho, con cada
eyaculado evaluado como una medida repetida en el tiempo. Se
realizarán los ajustes necesarios de acuerdo con: edad del macho,
edad de la hembra, método de colección y procesamiento,
nutrición, estado sanitario, región geográfica, y aquellos que se
identif iquen como efectos significativos sobre las variables a
predecir.
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Variables Gotas Citoplásmicas
NOMBRE DEFINICIÓN
OPERACIONAL NATURALEZA
NIVEL DE
MEDICIÓN CATEGORÍAS
Valoración de Motilidad seminal
Mediante un equipo Sperm Class Analyzer valorar: ve loc idad curvi l ínea (µm/s), ve loc idad promedio de la trayector ia (µm/s), ampli tud del desplazamiento latera l de la cabeza (µm/s), l ineal idad de la trayector ia promedio, l ineal idad de la trayector ia curvi l ínea, osc i lac ión y f recuenc ia de bat ida.
Cuantitativa Razón Velocidad de desplazamiento.
Concentración espermática
mediante la camara de Bürker y microscopio de campo c laro Nikon YS2 a magnif icac ión 400X, con 5 µ l de una d i luc ión 1:200 de semen y soluc ión sal ina formolada
Cuantitativa Razón
Espermatozoides /ml
Morfología
por f i jac ión con soluc ión sal ina formolada en d i luc ión 1:1, determinando porcentaje de GCs s imples los defectos de cabeza (suelta, macro, micro, p ir i forme), trac to intermedio (doble, lazo, engrosado), co la ( lat igo, lazo, escalera) y gota
Cualitativa Nominal Normales y anormales. Anormales: cabeza, pieza intermedia y cola.
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citoplasmica (d ista l, prox imal, ovi l lo gota, ref lejo d is tal)
Fragmentación de DNA
Espermatozoides con DNA fragmentado , utilizando el kit Halomax
Cualitativa. Nominal
Fragmentados si-no y no fragmentados si-no.
Vitalidad Microscopia de florescencia con kit duo vital.
Cualitativa Nominal Espermatozoides reactivos si-no.
Integridad acrosómica
Fi jación con g lutara ldehído a l 2% en d i luc ión 1:1, en microscopio de a lta resoluc ión de contraste de interferenc ia d iferenc ia l (DIC) y contraste de fases en magnif icac ión de 1000X, y por f luorescenc ia con Fluoroscein Isoth iocyanate Peanut Agglut in in, v isua l izado en microscopio Nikon ec l ipse 80i equipado con epif luorescenc ia y en 400X de magnif icac ión.
Cualitativa Nominal Espermatozoides con acrosoma integro.
HOST
Funcional idad b ioquímica de membrana: con la prueba de endosmosis (HOST o Hypoosmotic Swel l ing Test ) : por incubac ión en una soluc ión de 100 mOsm/L
Cuantitativa Nominal Espermatozoides reactivos si-no.
Penetración de oocitos homólogos
Prueba de penetrac ión de ovoc i tos homólogos: cons is t irá en una combinac ión de los protocolos empleados por: (Gadea and Matas, 2000; Gadea et a l . ,
1998) (Lucas et
Cualitativa Nominal Penetración si-no.
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al., 2003); (Caballero et a l . , 2005).
Supervivencia espermática
Eosina – Nigros ina en d i luc ión 1:1, en microscopio de campo c laro a 400X de magnif icac ión; y con f luorescenc ia con Ioduro de Propid io, en microscopio Nikon ec l ipse 80i equipado con epif luorescenc ia a 400X de magnif icac ión
Cualitativa Nominal Espermatozoides vivos si-no.
Factores Asociados
NOMBRE DEFINICION
OPERACIONAL NATURALEZA
NIVEL DE
MEDICIÓN CATEGORÍAS
Genéticos Asociac ión entre a lterac iones genét icas y cambios en la cal idad seminal .
Cualitativa Nominal Presencia de espermatozoides anormales
Ambientales: Temperatura Humedad. Altitud
Inc idendec ia de factores medio ambientales sobre la cal idad del eyaculado.
Cualitativa Nominal Presencia de espermatozoides anormales
Sanitarios Efecto de agentes infecc iosos (v ira les y bacter ianos), sobre la cal idad del eyaculado.
Cualitativa Nominal Presencia de espermatozoides anormales
Frecuencia de eyaculación
Asociac ión negat iva entre la f recuenc ia de recolecc ión y la cal idad seminal .
Cualitativa Nominal Presencia de espermatozoides anormales
Técnicas de conservación del semen
Relac ión entre las técnicas de conservac ión del semen y la presenc ia de a lterac iones espermát icas.
Cualitativa Nominal Presencia de espermatozoides anormales
Tóxicos Efecto adverso de agentes tóx icos sobre la cal idad seminal .
Cualitativa Nominal Presencia de espermatozoides anormales
Alimenticios Asociac ión entre la cal idad del
Cualitativa Nominal Presencia de espermatozoides
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alimento y la cal idad del eyaculado.
anormales
Tipo de alojamiento
El d iseño del corral inf luye sobre e l b ienestar del reproductor.
Cualitativa Nominal Presencia de espermatozoides anormales
Medicamentos La ut i l izac ión de a lgunos t ipos de medicamentos pueden produc ir a lterac iones seminales.
Cualitativa Nominal Presencia de espermatozoides anormales
Granja.
Part icu lar idades administrat ivas de la granja pueden generar cambios en e l comportamiento reproduct ivo en los machos.
Cualitativa Nominal Presencia de espermatozoides anormales
Planes vacunales
La ut i l izac ión de a lgunas vacunas pueden generar a lterac iones seminales.
Cualitativa Nominal Presencia de espermatozoides anormales
Alteraciones sanitarias.
Alterac iones que afecten la salud del reproductor pueden generar a lterac iones seminales.
Cualitativa Nominal Presencia de espermatozoides anormales
Ejercicio. La ut i l izac ión de pract icas asoc iadas a l b ienestar animal.
Cualitativa Nominal Presencia de espermatozoides anormales
Operario. El operar io (s) puede generar fenómenos de estrés que comprometan la producc ión de espermatozoides.
Cualitativa Nominal Presencia de espermatozoides anormales
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Hipótesis del estudio
Etapa estudio caso control:
Hipótesis nula:
No existe diferencia estadísticamente significativa entre los
factores asociados con la presentación de gotas ci toplasmáticas en
los casos comparados con los controles.
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Marco Teórico
En reproducción de porcinos, una hembra aporta un poco más de
dos camadas al año, en tanto que un macho supera con creces
esta cifra, considerando la inseminación arti f icial como
herramienta de cruzamiento. Los indicadores reproductivos
resultantes de la aplicación de la inseminación arti f icial dependen
de múltiples factores, entre el los: medio ambiente (Suriyasomboon
A et al ., 2005), nutrición (Louis et al ., 1994); (Wilson et al., 2004)
sanidad (Madsen, 2005) momento de la inseminación (Knox, 2001)
y cal idad seminal (Waberski et al., 1994); (Flowers, 2002)
(Lovercamp et al., 2007b)
En el control de la cal idad seminal de porcinos aún se desconoce
la dinámica de las alteraciones espermáticas, principalmente la de
las gotas ci toplásmicas (GCs) . Hasta ahora solo se han realizado
aproximaciones al diagnóstico objetivo de las GCs y su rela ción
con la ferti l idad (Fischer et al ., 2005b); (Lovercamp et al., 2007a)
(Lovercamp et al ., 2007b) pero con técnicas costosas y de dif íci l
implementación en países donde el desarrol lo en investigación e
infraestructura es l imitado, como es el caso de Colombia.
La ferti l idad de un macho depende básicamente de la elaboración
de gametos viables en la espermatogénesis. Este proceso se
efectúa en tres etapas: prol i ferativa o mitótica
(espermatoci togénesis), meiótica (reducción c romosómica) y de
diferenciación (espermiogénesis) (Franca et al., 2005). La
espermatogénesis es regulada por múltiples factores, entre el los:
la función del eje hipotálamo-pitui taria-testículos, células
testiculares (de Leydig, de Sertol i y Germinales), conductos
deferentes, epidídimo (O'Donnel et al., 2001) y la expresión de
aproximadamente 100 genes que juegan un rol importante en la
función testicular (Schlecht et al., 2004)
18
Las GCs se forman en el momento mismo en que los gametos en
desarrol lo se dirigen a la luz del epitel io seminífero. En este
proceso se reduce el ci toplasma de 500 a 10 µm3, el núcleo toma
su forma y aparece la cola (Copper T G et al ., 2004); (Pruneda et
al., 2005). Las GCs están compuestas de citosol, elementos
vesiculares internos derivados de la membrana como remanentes
de Golgi y otros organelos de la espermátide degradados en el
estado final espermiogénico (Kaplan et al ., 1984b); (Oko et al.,
1993); (Fischer et al., 2003a) y poseen actividad enzimática
hidrolítica (Dott and Dingle, 1968); (Briz, 1996); (Kuster et al .,
2004a). En un proceso de gametogénesis normal, las GCs son
absorbidas en gran proporción por el epidídimo, pueden ser
l iberadas antes, durante, inmediatamente después del eyaculado
(Briz, 1996) (Fischer et al ., 2005b); (Pruneda et al ., 2005) o
presentarse de forma l ibre en el eyaculado (Kaplan et al., 1984b).
Las GCs que se encuentran unidas a los espermatozoides
eyaculados se consideran patológicas.
Las GCs son consideras vesículas residuales del ci toplasma de
aproximadamente 2 μm de diámetro fáci lmente visibles en
microscopio de luz convencional a 400X de magnificación (Kaplan
et al ., 1984b); (Oko et al., 1993). Según su posición, las GCs se
clasif ican como proximales cuando están cerca de la cabeza, y
como distales cuando están en la porción final de la pieza
intermedia (Bonet, 1990; 1993). Bonet (1990; 1993) reportó
espermatozoides con la cola enrol lada parcial o totalmente sobre
una porción de citoplasma característico a una GC. La cola
doblada en un ángulo de 180º sobre la GC es un defecto conocido
como reflejo distal de la pieza media (Fischer et al ., 2005b);
(Lovercamp et al., 2007a); (Lovercamp et al., 2007b). En la zona
de la GC se genera un debil i tamiento estructural por acción
enzimática y desorganización de los componentes estructurales de
la cola, propiciando el enrol lamiento o plegamiento de la col a
sobre la GC (Briz, 1996) y se ha reportado que estas tienen una
19
correlación negativa con la tasa de partos (Lovercamp et al .,
2007b).
La al ta frecuencia de eyaculaciones cambia el micro ambiente del
epidídimo al al terar la velocidad de paso de los espermatozoides,
el patrón de absorción y secreción de los fluidos, propiciando la
presentación de anormalidades espermáticas, principalmente Gcs
(Pruneda et al., 2005), por tanto, la participación del epidídimo en
la cal idad seminal es fundamental. El epi tel io del epidídimo esta
compuesto de células principales y basales, en él se crea un
ambiente complejo alrededor del espermatozoide (Dacheux et al.,
2005). En condiciones normales, en la cabeza del epidídimo se
reabsorben hasta el 90% de los fluidos provenientes de los
conductos anteriores a este (O'Donnel et al., 2001). Al ser al terada
la exposición, duración y transi to del espermatozoide por el
epididimo, se hacen manifiestas las GC, las cuales son
consideradas como un signo de inmadurez espermática (Briz,
1996). El epidídimo como órgano fundamental en el proceso
espermiogénico, aporta maduración funcional y remoción de
espermatozoides defectuosos y GCs, además de ofrecer la
especificad de temperatura, tensión de oxígeno, pH y energía
necesarios (Marengo, 2008).
En el verraco se consideran normales los eyaculados a partir de
los seis meses de edad (Flowers, 2004a), con la edad avanzada,
disminuye la concentración y la viabil idad espermática y se
incrementa el porcentaje de anormalidades morfológicas
(Rozeboom et al ., 2000); (Serniene et al ., 2002), por tanto la
concentración espermática depende de la eficiencia
espermatogénica, del diámetro y longitud de los tubos seminíferos
y del tamaño testicular (Fuentes et al., 1989); (Rathje et al., 1995).
20
Las al teraciones en la morfología espermática están
significativamente relacionadas con el reducido tamaño de camada
y con bajas tasas de no retorno (Sutkeviciene and Zil inskas, 2004 ).
Según (Flowers, 2004b), cualquier alteración funcional o
estructural del espermatozoide afecta la movil idad espermá tica y
altera la ferti l idad. En la l i teratura se reportan una serie de
factores asociados a la presentación de alteraciones seminales,
como genéticos, ambientales, sanitarios, frecuencias de
eyaculación, técnicas de conservación, y tóxicos que a
continuación se presentan:
Factor Alteración Descripción Autores
Genéticos:
Poliploidía familiar como generadora de falla en la espermatogénesis. Traslocación autosómica en aves: Su efecto sobre la fertilidad y características del semen. Esterilidad hereditaria por cola corta en espermatozoides en cerdos York. Cambios en la motilidad y en la morfología generados por la edad en Ratas Noruegas Pardas.
Asociación entre alteraciones cromosómicas y malformaciones en semen en humanos. Se examinaron 10 características seminales diferentes en gallos que presentaron traslocaciónes cromosómicas, encontrándose que estas no afectaron los procesos de espermatogénesis. Se reporta un nuevo síndrome de infertilidad en verracos Yorkshire que genera malformaciones en la cola y alteraciones en la motilidad espermática. Se evaluó el efecto de la edad sobre cambios patológicos es testículos, epidídimo y próstata, encontrándose que la edad posee efectos deletéreos en la calidad seminal y
(Benzacken B et al., 2001). (Blazak W F and S, 1979) (Skura A et al., 2002). (Syntin P and B, 2001)
21
espermatogenésis,
Ambientales
Efecto del fotoperiodo sobre la calidad seminal en verracos destinados a la inseminación artificial. Morfología espermática durante las estaciones en caballos pura sangre en Japón. Efecto de la temperatura y humedad sobre la morfología espermática en cerdos Duroc bajo diferentes condiciones de alojamiento en Tailandia. Variación anual de la calidad de semen porcino y su relación con parámetros reproductivos. Cambios reproductivos en toros antes y durante la exposición a temperaturas ambientales elevadas.
Se encontró que la luz natural o artificial no ejerce ningún efecto significativo sobre las anomalías morfológicas del semen, el sistema endocrino del verraco se adapta a los cambios de luz y la luz no ejerce ningún efecto sobre la capacidad de conservación del semen. Se analizaron 299 eyaculados y se reportan las gotas citoplásmicas como la alteración de mayor presentación. La morfología espermática es afectada moderadamente por el tipo de alojamiento, las altas temperaturas y la humedad. Se encontró una asociación entre la calidad seminal y la estacionalidad, así como que las variables climatológicas afectan la calidad espermática y los parámetros de producción de lechones. La exposición de toros a alta temperatura ambiental afecta la calidad seminal, reduce la producción espermática e incrementa el porcentaje de espermatozoides alterados
(Rivera del Álamo, 2003) (Koyago et al., 2008) (Suriyasomboon A et al., 2005) (Hernandez, 1998) (Meyerhoeffer D C et al., 1985)
22
Sanitarias:
El efecto de Pseudorabia sobre la fertilidad en cerdos adultos. La inoculación del virus de la enfermedad del ojo azul en verracos de la raza pelón Mexicano. Virus de transmisión sexual: relación semen y virus.
La inoculación experimental del virus generó alteraciones en la espermatogénesis e infertilidad El virus de la enfermedad del ojo azul en verracos produjo la presencia de nódulos granulomatosos en la cabeza del epidídimo. Se describen los mecanismos de infección de algunos virus a las fracciones seminales con el fin de entender como los virus de transmisión sexual afectan al semen.
(Hall L B et al., 1984) (Ramirez et al., 1999) (Zea-Mazo et al., 2010)
Frecuencia de eyaculación:
Estudio del eyaculado de un verraco estresado por la frecuencia de recogidas en inseminación artificial. Efecto de colecciones repetidas sobre las características del semen de alpacas.
Asociación negativa entre la elevada frecuencia de recogida y la calidad del semen en verracos presentándose aumento superior al 60% en las formas inmaduras, en especial de gotas citoplásmicas. Se encontró que la elevada frecuencia de eyaculación afecta la negativamente la calidad seminal, en especial la concentración, el % de anormalidades de cabeza y cola y la consistencia del semen.
(Bonet, 1987) (Bravo P W et al., 1997)
Técnicas de conservación:
Caracterización cuali-cuantitativa de patologías espermáticas: estudio comparativo de la incidencia de anormalidades espermáticas en semen porcino fresco y refrigerado.
Se reporta una mayor incidencia (6% mayor) de patologías seminales en semen refrigerado que en semen fresco, en especial alteraciones de la cabeza.
(Torretta M E et al.)
23
Tóxicos:
Efecto de los herbicidas Atrazina y Fenoxaprop-etil en la capacitación y la reacción acrosomal in vitro en espermatozoides del cerdo. La Turnera diffusa en el desarrollo testicular de cerdos prepuberes. Efecto de los insecticidas y dos herbicidas sobre los patrones de movilidad espermática, analizada por computador. Efecto de la polución ambiental sobre la calidad espermática. Debilitamiento de la calidad seminal asociada con exposición ambiental de DDT en hombres jóvenes que viven en área de malaria en la provincia de Limpopo, Sur África Retención de gotas citoplásmicas en cabeza de epidídimo en ratas después del tratamiento con agentes cytotoxicos y xenobioticos.
Herbicidas como la Fenoxaprop-etil y la Atrazina, aceleran el proceso de la capacitación y la reacción acrosomal afectando el poder fertilizante del espermatozoide del cerdo. Plantas como la Turnera diffusa suministrada a cerdos prepuberes estimula el desarrollo testicular y el epidídimo en peso, volumen longitud y perímetro. Utilizando un sistema asistido por computador se determinó como se afecta la movilidad espermática por efecto de agentes tóxicos. Se demostró como la contaminación ambiental afecta la calidad seminal en humanos. En una provincia de Sur África se determinó una asociación negativa entre la exposición de hombres al DDT y la calidad del eyaculado. La exposición de ratas a insecticidas organofosforados y matathion generó un aumento en la retención de gotas entre un 65% y 95% así como la inhibición del
(Maravilla, 2009) (Mendez et al., 2005) (Resendiz, 2003) (Hansen C et al., 2010) (Aneck-Hahn N et al., 2007) (Akbarsha M.A et al., 2000)
24
Alteraciones espermáticas, gotas citoplasmáticas y baja motilidad como principales indicadores de la baja calidad espermática debida a pesticidas organofosforados en ratas.
movimiento. Se demostró que la exposición de ratas a organofosforados afecta la calidad seminal, en especial se incrementa la presencia de gotas citoplásmicas y la motilidad.
(Okamura A et al., 2009)
En la actualidad se considera que la evaluación convencional de la
cal idad seminal tiene baja relación con los resultados de ferti l idad
en campo, pero aporta información del estado del eyaculado en un
momento dado (Gadea et al ., 2004b); (Ruiz-Sanchez et al., 2006).
Técnicas modernas que evalúan la penetración espermática en
ovocitos homólogos, la integridad del DNA y de la membrana del
espermatozoide, y la valoración objetiva de la cinética espermática
pueden tener mayor relación con la ferti l idad en campo.
25
Objetivos
Objetivo general
Determinar el efecto de las gotas citoplásmicas sobre la
capacidad fecundante del espermatozoide en el cerdo.
Objetivos específicos
Establecer los factores asociados con la presentación de
gotas distales y proximales en verracos
activos reproductivamente.
Evaluar el efecto de las gotas distales y proximales sobre la
capacidad fecundante del espermatozoide mediante la
valoración de la tasa de penetración in vitro de ovocitos
homólogos.
Valorar la relación de las gotas distales y proximales con la
integridad del DNA y de la membrana del espermatozoide.
Valorar la relación de las gotas distales y proximales con la
cinética espermática medida mediante un sistema asistido
con computador.
Realizar un metaanálisis de los factores asociados
reportados en la l i teratura.
26
Evaluar diferentes opciones para provocar el desprendimiento
de las gotas ci toplásmica distales y proximales antes y
después de la eyaculación, con base en el control de
factores asociados.
Resultados esperados
Las GCs son la malformación espermática de mayor impacto
económico y su prevención y tratamiento son aún materia de
investigación. Este proyecto se orienta con especificidad a
desarrol lar al ternativas de prevención y tratamiento de esta
afección, tratando de corregir, de paso, la gran debil idad predictiva
de las valoraciones seminales in vitro convencionales. En razón de
esto, se esperan los siguientes resultados:
1. Un sistema integral de estimación de la ferti l idad del verraco
con base en protocolos convenc ionales y de alta resolución de
apreciación morfofisiológica y de penetración de ovocitos
homólogos in vitro .
2. Una matriz explicativa de causas y efectos de la dinámica de
presentación de las gotas citoplásmicas en el porcino,
construida a partir de diferentes aproximaciones
experimentales de prevención y tratamiento de esta
malformación.
3. La ejecución del proyecto es la base de una tesis doctoral, de
la cual se espera formar un Doctor en Ciencias – Ciencias
Agrarias.
27
Impactos esperados a partir del uso de los resultados
Con la matriz explicativa de las causas y efectos de la dinámica de
presentación de gotas ci toplásmicas se generarán posibi l idades
concretas de prevención, tratamiento y control de las gotas
citoplásmicas.
Formación de un investigador de alto nivel para fortalecer la
actividad científ ica en el área de la biología de la reproducción
porcina en Colombia.
28
Consideraciones éticas del estudio Basados en la ley 84 de 1989, el estudio respetará los principio
éticos consagrados en dicha Ley, en especial lo contenido en el
capitulo VI, artículo 24, y contará con la aprobación del comité de
ética para experimentación con animales de la Universidad de
Caldas, (Resolución de Rectoría 000259 de marzo del 2008).
29
Cronograma de actividades
Actividad TRIMESTRE
I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII
Planteamiento
del proyecto. X X
Examen de
candidatura X
Metaanálisis X X X X X X
Evaluación de
muestras X X X X X X X
Ensayos de
Laboratorio X X X X X X
X X
Análisis
estadísticos X X X
X X X
Divulgación
de resultados X X X X
X
Sustentación
de resultados
X X
30
Presupuesto
Valor total del proyecto: $ 558.500.000. Valor sol icitado y asignado en la convocatoria con recursos VIP: $ 9.500.000.
Compromisos
Un proyecto de tesis doctoral .
Comisión de estudios por tres años.
Dos artículos para publicación en una revista indexada u homologada por COLCIENCIAS.
Un informe técnico anual
Un informe técnico final, según la duración de l proyecto y siguiendo un formato preestablecido para este fin.
31
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