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Profesor Patrocinante Dra. Carola Otth L. Instituto de Microbiología Clínica Facultad de Medicina Profesor Co-Patrocinante Dra. Margarita Concha G. Instituto de Bioquímica y Microbiología Facultad de Ciencias
EFECTO DE LAS PROTEÍNAS DEL HSV-1, US3 Y VP11/12, SOBRE
LA FOSFORILACIÓN DE LA PROTEÍNA TAU ASOCIADA CON NEURODEGENERACIÓN.
Tesis de Grado presentada como parte de los requisitos para optar al grado de Licenciado en Bioquímica y Título Profesional de Bioquímico
JORGE IGNACIO CAROCA PASTENE
VALDIVIA – CHILE
2015
ii
AGRADECIMIENTOS
Quisiera agradecer en primer lugar a la Dra. Carola, por haberme aceptado como tesista en su
laboratorio, por la paciencia, energía y apoyo. A la Dra. Margarita, por ser crítica y exigir
siempre más.
Unas gracias infinitas a mi tía, porque es mi pilar, porque siempre cree en mí. Sin ella esto no
hubiese sido posible.
Gracias a mi familia, porque pese a todo siempre me apoyaron, siempre estuvieron cuando los
necesite.
Agradecerle a todo el todo el laboratorio de virología, por el apoyo, confianza, consejo y ayuda.
Sobre todo a Melissa por presionarme para exponer, por responder las constantes peticiones de
ayuda, por ser la compañía en el verano cuando todos estaban de vacaciones; a Carolina por saber
tanto y compartir ese conocimiento, por sus consejos sobre el laboratorio y la vida; y a Luis, por
ser el apoyo de género en un laboratorio dominado por mujeres, por siempre tenerme células para
trabajar y estar disponible para responder preguntas.
Gracias a mis amigos: A Gustavo, por compartir un techo, por siempre recordarme y guiarme en
trámites universitarios, por creer en mí; y a Jose y Johanna por siempre estar pendientes y
preocupados, por ser los buenos amigos que son.
El presente trabajo se llevó a cabo en el Laboratorio de Virología Molecular del Instituto de
Microbiología Clínica, Facultad de Medicina, de la Universidad Austral de Chile, y contó con el
financiamiento del proyecto FONDECYT 1120464.
iii
ÍNDICE GENERAL
Página
1. RESUMEN 1
1.1. SUMMARY 2
2. INTRODUCCIÓN 3
2.1 HERPES SIMPLEX VIRUS TIPO 1 3
2.2. HERPES SIMPLEX VIRUS TIPO 1 Y SISTEMA NERVIOSO 6
CENTRAL
2.3. PROTEINA DE TEGUMENTO US3 8
2.4. PROTEINA DE TEGUMENTO VP11/12 9
2.5. PROTEINA ASOCIADA A MICROTUBULO, TAU 9
2.6. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 12
2.7. OBJETIVO GENERAL 13
2.7.1. OBJETIVOS ESPECIFÍCOS 13
iv
3. MATERIALES Y MÉTODOS 14
3.1. MATERIAL BIOLÓGICO. 14
3.1.1. HERPES SIMPLEX VIRUS TIPO 1. 14
3.1.2. LÍNEAS CELULARES. 14
3.1.3. PLÁSMIDOS. 15
3.2. REACTIVOS Y SISTEMAS COMERCIALES. 15
3.3. METODOLOGÍA. 17
3.3.1. PROPAGACIÓN DE HERPES SIMPLEX VIRUS TIPO 1. 17
3.3.2. TITULACIÓN VIRAL. 17
3.3.3. CULTIVO CELULAR. 19
3.3.4. INFECCIÓN CON HSV-1. 19
3.3.5. EXTRACCIÓN DE DNA TOTAL. 20
3.3.6. PCR. 20
3.3.7. DIGESTIÓN DE DNA. 24
3.3.8. LIGACIÓN DE DNA . 24
3.3.9. TRANSFORMACIÓN. 24
3.3.10. EXTRACCIÓN DE DNA PLASMIDIAL. 24
v
3.3.11. TRANSFECCIÓN. 25
3.3.12. INMUNOFLUORESCENCIA. 25
3.3.13. REGISTRO DE IMÁGENES Y CARACTERIZACIÓN 28
FENOTÍPICA.
3.3.14. ANÁLISIS ESTADÍSTICO. 29
4. RESULTADOS 30
4.1. CULTIVOS CELULARES. 30
4.2. CONSTRUCCIÓN DEL VECTOR EGFP-US3 32
4.3. TRANSFECCIÓN DEL VECTOR EGFP-US3 32
4.4 CARACTERIZACIÓN DEL PLÁSMIDO pEYFP-US3. 34
4.5 CARACTERIZACIÓN DEL PLÁSMIDO pGUL46. 34
4.6 DISTRIBICIÓN SUBCELULAR DE EYFP-US3. 36
4.7 DISTRIBICIÓN SUBCELULAR DE VP11/12-EGFP. 38
4.8 MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES DE 40
LA PROTEINA TAU AL EXPRESAR EYFP-US3.
4.9 MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES DE 46
vi
LA PROTEINA TAU AL EXPRESAR VP11/12-EGFP.
4.10 EXPERIMENTOS DE INFECCIÓN NEURONAL CON HSV-1. 50
5. DISCUSIÓN 55
5.1 CONCLUSIONES. 59
6. BIBLIOGRAFÍA 60
7. ANEXO 68
vii
ÍNDICE DE FIGURAS
Página
Figura 1. 5
Transporte viral desde y hacia el sitio inicial de infección durante
una infección productiva a nivel epitelial
Figura 2. 11
Esquema de microtúbulos anormales presentes en la enfermedad
de Alzheimer
Figura 3. 31
Diferenciación de células HT22
Figura 4. 33
Construcción y transfección del vector de expresión EGFP-US3
Figura 5. 35
Caracterización de los plásmidos pEYFP-US3 y pGUL46
Figura 6. 37
Transfección transitoria de EYFP-US3 en células HT22
viii
Figura 7. 39
Transfección transitoria de VP11/12-EGFP en células HT22
Figura 8. 41
Efecto de la expresión transitoria de EYFP-US3 sobre TAU
fosforilada en S404
Figura 9. 43
Efecto de la expresión transitoria de EYFP-US3 sobre TAU total
Figura 10. 45
Efecto de la expresión transitoria de EYFP-US3 sobre TAU
desfosforilada en S202/T205
Figura 11. 47
Efecto de la expresión transitoria de VP11/12-EGFP sobre TAU
fosforilada en S404
Figura 12. 48
Efecto de la expresión transitoria de VP11/12-EGFP sobre TAU total
ix
Figura 13. 49
Efecto de la expresión transitoria de VP11/12-EGFP sobre TAU
desfosforilada en S202/T205
Figura 14. 51
Efecto de la infección de HSV-1 wt, null US3 y null VP11/12 sobre TAU
fosforilada en S404
Figura 15. 52
Efecto de la infección de HSV-1 wt, null US3 y null VP11/12 sobre TAU
desfosforilada en S202/T205
Figura 16. 53
Efecto de la infección de HSV-1 wt, null US3 y null VP11/12 sobre TAU total
Figura 17. 54
Viabilidad de células HT22 infectadas con HSV-1 wt, HSV-1 null US3 o HSV-1
null VP11/12.
x
Figura 18. 68
Viabilidad de células HT22 transfectadas con plásmidos que expresan EGFP,
EYFP-US3 o VP11/12-EGFP.
Figura 19. 69
Controles de transfección transitoria en células HT22
Figura 20. 70
Efecto de la transfección transitoria de VP11/12 sobre TAU fosforilada en S404
en citoplasma
Figura 21. 71
Efecto de la transfección transitoria de US3 sobre TAU fosforilada en S404 en citoplasma
xi
ÍNDICE DE TABLAS
Página
Tabla I. 16
Clasificación alfabética de acuerdo al nombre del fabricante
de los reactivos utilizados en este trabajo.
Tabla II. 21
Partidores utilizados en las reacciones de PCR
Tabla III. 22
Componentes de las reacciones de PCR
Tabla IV. 23
Programa de amplificación para PCR
Tabla V. 27
Anticuerpos utilizados
xii
LISTA DE ABREVIATURAS
DMEM: Medio Eagle modificado por Dulbecco
EA: Enfermedad de Alzheimer
EDTA: Ácido etilendiamino tetraacético
EGFP: Enhanced green fluorescent protein (proteína verde fluorescente mejorada)
EYFP: Enhanced yellow fluorescent protein (proteína amarilla fluorescente
mejorada)
HPI: Horas post infección
HSE: Encefalitis por herpes simplex virus
HSV-1: Herpes Simplex Virus tipo 1
IFI: Inmunofluorescencia indirecta
LAT: Transcrito asociado a latencia
MAPT: Proteína TAU asociada a microtúbulo
MOI: Multiplicidad de infección
MTT: Bromuro de 3(4,5 dimetil-2-tiazoil)-2,5-difeniltetrazólico
ORF: Open reading frame (marco de lectura abierto)
xiii
PBS: Tampón fosfato salino
PFA: Paraformaldehído
PFU: Unidades formadoras de placa
PRV: Alfaherpesvirus porcino
SFB: Suero fetal bovino
SNC: Sistema nervioso central
TBE: Tampón Tris/Borato/EDTA
TRIS: Tris (hidroximetil) aminometano
UA: Unidad arbitraria
VZV: Virus varicela zoster
1
1. RESUMEN
El herpes simplex virus tipo 1 (HSV-1) es un patógeno ubicuo y uno de los patógenos humanos
más comunes, ya que es capaz de infectar entre un 40-80% la población mundial. La infección
primaria ocurre con frecuencia en la niñez o adolescencia y es usualmente leve o asintomática en
un hospedero inmunocompetente. Esta infección primaria ocurre en epitelio oral y peri oral,
estableciendo una infección persistente latente en ganglios de neuronas sensoriales. HSV-1 puede
reactivarse en neuronas causando una infección productiva y una enfermedad mucocutánea
episódica a nivel de epitelio. Actualmente se desconoce si existe riesgo asociado con
reactivaciones recurrentes de HSV-1 a nivel del SNC en pacientes portadores asintomáticos, que
puedan desencadenar deterioros progresivos de las funciones neuronales. Estudios previos de
nuestro laboratorio demostraron que la infección por HSV-1 es capaz de gatillar
hiperfosforilacion de la proteína TAU en neuronas, lo cual se asocia con desestabilización de
microtúbulos, y que se ha evidenciado ocurre en demencias tales como la enfermedad de
Alzheimer y otras tauopatias. El objetivo del presente trabajo fue determinar mediante
inmunofluorescencia, si las proteínas de tegumento de HSV-1, US3 y VP11/12, las cuales
presentan actividad regulatoria de vías de señalización celular durante la infección viral, regulan
la fosforilacion de TAU en el residuo serina 404, asociado con la enfermedad de Alzheimer. Los
resultados obtenidos al expresar transitoriamente US3 o VP11/12, o al infectar las células con
HSV-1 mutantes carentes de estas proteínas, muestran que estas proteínas por sí solas no tendrían
un rol importante en gatillar la fosforilación de la proteína TAU, al menos en el residuo serina
404, sugiriendo que otras proteínas virales, o quizás vías de señalización celular activadas durante
la infección viral podrían estar involucradas. Financiamiento FONDECYT 1120464
2
1.1. SUMMARY
The herpes simplex virus type 1 (HSV-1) is an ubiquitous pathogen and one of the most common
human pathogens, which is able to infect 40-80% of world population. Primary infection often
occurs in childhood or adolescence and is usually slight or asymptomatic in an immunocompetent
host. This primary infection occurs in oral and peri oral epithelium, establishing a latent viral
infection in sensory ganglia neurons. HSV-1 can reactivate in neurons causing productive
infection and an episodic mucocutaneous disease at epithelium level. It is currently unknown if
there is risk associated with recurrent reactivation of HSV-1 to the CNS in asymptomatic
patients, which may trigger progressive impairment of neuronal functions. Previous studies from
our laboratory demonstrated that HSV- 1 is able to trigger hyperphosphorylation of the TAU
protein in neurons. This event is associated with destabilization of microtubules, which is
evidenced in dementias such as Alzheimer 's disease and other tauopathies. The aim of this study
was to determine by immunofluorescence, if tegumental proteins of HSV- 1, US3 and VP11/12,
which display regulatory activity on cell signaling pathways during viral infection, regulate the
phosphorylation of TAU at serine residue 404, associated with Alzheimer's. Thus, the results
obtained after transiently expressing US3 or VP11/12, or after infecting cells with HSV-1
mutants lacking these proteins, show that the sole expression of these proteins would not play a
critical role in triggering the phosphorylation of TAU protein, suggesting that other viral proteins,
or perhaps cell signaling pathways activated during viral infection may be involved in this
process. Funding FONDECYT 1120464.
3
2. INTRODUCCIÓN
2.1. HERPES SIMPLEX VIRUS TIPO 1
El herpes simplex virus tipo 1 (HSV-1) es uno de los patógenos humanos más comunes, ya que
es capaz de infectar entre un 40-80% la población mundial (Kelly et al., 2009). Pertenece a la
familia Herpesviridae, subfamilia Alphaherpesvirinae y género Simplexvirus (Mori y Nishiyama,
2005). Es un patógeno ubicuo, cuya manifestación más común son vesículas herpéticas en la
zona facial o aftas labiales en un 20-40% de los individuos infectados. Los viriones de HSV-1
poseen una compleja estructura compuesta por: envoltura, tegumento, cápside y genoma. Su
genoma se compone de un DNA de doble hebra de 152 kpb con más de 81 genes diferentes
(Marconi et al., 1996), este DNA se empaqueta en una cápside de simetría icosahédrica, la cual
se encuentra rodeada por una estructura de características amorfas, llamada tegumento. Por
ultimo la partícula viral es envuelta por una membrana lipídica, derivada del hospedero, que
contiene insertas glicoproteínas virales de superficie (Itzhaki y Wozniak., 2006). La primo
infección o infección primaria ocurre con frecuencia en la niñez o adolescencia y es usualmente
leve o asintomática en un hospedero inmunocompetente (Wuest y Carr, 2009). En esta infección
primaria, luego de infectar la mucosa oral, el virus es capaz de alcanzar terminales de neuronas
sensoriales como ganglio trigémino (Van den Pol et al., 2006), viajar a través de los axones por
transporte retrógrado y establecer una infección latente en el núcleo de estas neuronas, la cual se
caracteriza por no existir replicación del genoma viral ni tampoco traducción de sus proteínas.
Factores asociados con estrés, exposición a luz UV, calor, fiebre, cambios hormonales,
menstruación y traumas neuronales resultan en la reactivación del virus (Jenkins y Turner,
1996), donde éste viaja por transporte axonal anterógrado al sitio inicial de infección o a uno
4
cercano, contribuyendo de ésta manera a la formación de nuevos viriones y por consiguiente a la
propagación del virus (Ortiz et al., 2003), ver Figura 1.
5
Figura 1. Transporte viral desde y hacia el sitio inicial de infección durante una infección productiva a nivel
epitelial.
6
La transcripción del material genético de HSV-1 está catalizada por la enzima RNA polimerasa II
de la célula hospedera (McGeoch et al., 2006). La expresión génica ocurre en una cascada
regulada, la cual comienza en estadíos tempranos de la infección, donde se transcriben genes
denominados inmediatamente tempranos como ICP0, ICP4, ICP22, ICP47 e ICP27.
Posteriormente hay transcripción de genes tempranos tales como la DNA polimerasa viral, ICP8
y timidina quinasa (UL23). Finalmente se produce la transcripción de genes tardíos entre los
cuales se encuentran glicoproteínas de superficie como glicoproteína B (gB) (Jenkins y Turner,
1996). Debido a que la transcripción de genes virales es regulada, requiere que los genes
inmediatamente tempranos se transcriban para que el producto proteico, ejerza su acción sobre la
transcripción de genes tempranos cuyas proteínas ayudarán en la transcripción de genes tardíos.
Una vez que el virus entra en estado de latencia, la infección se caracteriza por ser no productiva
(sin producción de progenie viral ni expresión de proteínas virales). La transcripción se limita
sólo a un gen capaz de codificar moléculas de RNA denominadas transcritos asociados a latencia
(LAT) ubicados en núcleo y citoplasma de neuronas (Li et. al, 2010), los cuales son capaces de
bloquear los genes inmediatamente tempranos que dan inicio a la replicación viral productiva
(Itzhaki y Wozniak, 2008).
2.2. HERPES SIMPLEX VIRUS TIPO 1 Y SISTEMA NERVIOSO CENTRAL
Por razones que hasta la fecha se desconocen, una vez que el virus alcanza las neuronas
sensoriales, específicamente los ganglios, lugar donde establece una infección latente, puede
seguir avanzando por transporte retrogrado hasta llegar a neuronas del sistema nervioso central
(SNC) y ahí establecer una infección latente pudiendo generar daño neuronal, la que en algunos
casos puede producir encefalitis herpética (HSE) (Norgren y Lehman, 1998).
7
HSE es una de las manifestaciones más severas de la infección por HSV-1. Se clasifica como una
encefalitis esporádica (Johnson, 1998), la cual tiene una incidencia anual de 1 caso cada 250.000
- 500.000 habitantes (Whitley y Gnann, 2002) en la que de no recibir un tratamiento antiviral
efectivo, la posibilidad de fallecer es de un 70%. Del 30% restante, un pequeño porcentaje de las
personas recupera la función cerebral normal (Whitley et al., 1986), mientras que el resto
desarrolla deterioro cognitivo, de memoria y personalidad (Levitz, 1998; Tyler, 2004), secuelas
similares a las observadas en la enfermedad de Alzheimer (EA).
Se ha demostrado que HSV-1 alcanza el SNC de personas en edad avanzada posiblemente debido
a que su sistema inmune se ve debilitado con el transcurso de los años por lo que no es capaz de
controlar la infección. Las principales regiones cerebrales afectadas por HSE son lóbulo
temporal, lóbulo frontal y sistema límbico, las mismas regiones que presentan características
neuropatológicas en la EA (Jamieson et. al., 1992). Se han propuesto dos vías por las cuales el
virus podría infectar neuronas del SNC. Una de ellas sería a través de la porción V1 del nervio
trigémino, la cual conecta con las meninges basales. La otra vía de entrada sería a través del
nervio olfatorio, llegando al bulbo olfatorio, región del SNC donde HSV-1 puede alcanzar la
amígdala, ínsula y sustancia perforada, componentes del sistema límbico, lo que puede explicar
las lesiones en este sistema, en pacientes que desarrollan HSE (Perkins, 2002). Independiente de
la vía de entrada del HSV-1, el transporte hacia y desde los ganglios de neuronas sensoriales es
de tipo axonal, en dirección retrógrada y anterógrada respectivamente. Además, el virus es capaz
de diseminarse a través de neuronas conectadas sinápticamente.
La diseminación viral entre células y sinapsis es un complejo proceso que involucra la
participación de varias glicoproteínas virales como gE y gI (Dingwell et. al., 1995, McGraw et.
al., 2009) y proteínas del tegumento como VP26 (Vittonne et. al., 2005).
8
2.3. PROTEINA DE TEGUMENTO US3
US3 corresponde a una serina/treonina (S/T) quinasa viral codificada por el gen US3, la cual se
encuentra conservada entre todos los Alfaherpesvirus. Al ser una serina/treonina quinasa, US3 es
capaz de catalizar la fosforilación de residuos específicos serina o treonina de sus proteínas diana.
La secuencia diana consenso para US3 de Alfaherpesvirus porcino (PRV) fue caracterizada como
RnX(S/T) ZZ, donde n es mayor o igual a 2; X puede estar ausente o ser Arg, Ala, Val, Pro o Ser;
y Z puede ser cualquier aminoácido excepto un residuo acídico (ácido aspártico o glutámico).
También, se ha determinado que esta secuencia, en general, es muy similar en HSV-1, HSV-2 y
VZV (varicela zoster) (Jacob et. al., 2011; Daikoku et. al., 1993; Eisfeld et. al., 2006), así como
para la proteína quinasa A (PKA) (Deruelle y Favoreel, 2011; Kato et al., 2009). US3 es capaz de
fosforilar blancos celulares en los mismos sitios que la quinasa celular PKA, así como la
subunidad regulatoria de PKA (Benetti y Roizman, 2004). Entre los sustratos directamente
fosforilados por US3 se encuentran las proteínas virales UL34 y UL31, ambas involucradas en el
egreso viral desde el núcleo; ICP22, que actúa principalmente como regulador transcripcional
(Bruni y Roizman, 1998; Fraser y Rise, 2007); US9, importante para la propagación anterógrada
del virus en el sistema nervioso (Snyder et al., 2008); así como la proteína celular Bad,
importante en el proceso apoptótico celular (Jacob et. al., 2011; Kato et al., 2005).
El silenciamiento del gen US3 revela que la proteína no es esencial para la replicación viral; sin
embargo, los mutantes US3 ven dañada su capacidad de crecer en ciertos tipos celulares y tienen
significativamente alterada la replicación viral y virulencia en modelos animales (Deruelle y
Favoreel, 2011; Walters et al., 2010).
9
2.4. PROTEINA DEL TEGUMENTO VP11/12
Originalmente fue identificada como dos proteínas, VP11 y VP12, basados en su movilidad
relativa en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturantes. Ahora se sabe que es una sola
proteína codificada por el gen viral UL46. VP11/12, a pesar de ser una de las proteínas más
abundantes en el tegumento de HSV-1, carece de una función concreta durante la infección.
Algunos estudios sugieren que se utiliza como sustrato y activador de la tirosina quinasa,
linfocito específica, Lck (Wagner et. al., 2009). También está implicada en potenciar la expresión
de genes virales inmediatamente tempranos aumentando la actividad del activador transcripcional
VP16 (Kato et. al., 2000). Sin embargo, estudios con VP11/12 null, han demostrado que la
presencia de VP11/12 no es requisito para la expresión de genes inmediatamente tempranos en
una infección con HSV. VP11/12 está presente en la fracción membranosa en células infectadas,
a pesar de no estar asociado a la membrana en viriones maduros. Investigaciones sugieren la
posibilidad de que VP11/12 module una o más vías de señalización celular. En este sentido ya se
ha demostrado que VP11/12 es esencial para la activación de la quinasa Akt durante la infección
de HSV-1 (Wagner y Smiley, 2011).
2.5. PROTEINA ASOCIADA A MICROTUBULO, TAU
TAU es una proteína asociada a microtúbulo altamente soluble que se encuentra
predominantemente en neuronas. Un total de seis isoformas de TAU son expresadas en SNC en
humanos adultos vía splicing alternativo del gen MAPT (Proteína TAU asociada a microtúbulo).
Inclusiones reguladas del exón 10 llevan a la expresión de la isoforma TAU con tres (R3) o
cuatro (R4) repeticiones de unión a microtúbulo. En condiciones normales el cerebro humano
10
posee una razón 4R/3R de aproximadamente uno, mientras que en la mayoría de las tauopatias,
esta razón esta alterada. TAU es una proteína fosforilada, que contiene 85 potenciales sitios de
fosforilación en residuos serina (S), treonina (T) y tirosina (Y) (Noble et. al., 2013). La
fosforilación de TAU es regulada por quinasas celulares, incluida la quinasa linfocito especifica
de la familia Src, Lck. En condiciones patológicas, TAU hiperfosforilada forma agregados
intracelulares, inclusiones filamentosas u ovillos neurofibrilares en el cerebro de individuos con
desordenes neurodegenerativos (Ren et. al., 2013). La proteína TAU hiperfosforilada y
ubiquitinada, reduce su afinidad y se disocia de microtúbulos, formando agregados fibrilares
intracelulares, lo que se ha asociado con pérdida de la actividad sináptica y neuronal (Medina et.
al., 2014). En la Figura 2 se muestra un esquema de microtúbulos anormales y ovillos de TAU
presentes en la enfermedad de Alzheimer.
11
Figura 2. Esquema de microtúbulos anormales presentes en la enfermedad de Alzheimer (The
Alzheimer´s Disease Eductional and Referral Center).
12
2.6. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Nuestro laboratorio ha demostrado que cultivos neuronales y gliales infectados con HSV-1 sufren
un deterioro de sus procesos dendríticos y alteración de la dinámica microtúbular, indispensables
para los procesos neuronales. Además de ello, se ha demostrado que HSV-1 induce
hiperfosforilación de TAU en epítopes de tipo Alzheimer.
Teniendo en cuenta estos antecedentes, así como la participación de US3 y VP11/12 en distintas
vías de señalización, resulta interesante conocer si estas proteínas virales estarían implicadas en
regular la fosforilación de TAU. Por esto se plantea la siguiente hipótesis:
“Las proteínas de tegumento de HSV-1, US3 y VP11/12, participan en incrementar la
fosforilación de la proteína TAU en neuronas”.
13
2.7. OBJETIVO GENERAL
Analizar la posible contribución de las proteínas de tegumento de HSV-1, US3 y VP11/12, en la
fosforilación de TAU en cultivos de células neuronales HT22 al expresar transitoriamente dichas
proteínas.
2.7.1. OBJETIVOS ESPECIFICOS
1.- Construir un vector de expresión de la proteína viral US3 fusionada a EGFP.
2.- Evaluar la construcción de los vectores de expresión para EYFP-US3 y VP11/12-EGFP
mediante ensayos de restricción y detección por inmunofluorescencia.
3.- Determinar la localización subcelular de las proteínas EYFP-US3 y VP11/12-EGFP
expresadas en cultivos neuronales HT22.
4.- Evaluar mediante inmunofluorescencia los niveles de fosforilación de TAU en cultivos
neuronales transfectados con vectores que expresan EYFP-US3 o VP11/12-EGFP.
14
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. MATERIAL BIOLÓGICO
3.1.1. HERPES SIMPLEX VIRUS TIPO 1
Se utilizó la cepa F del herpes simplex virus tipo 1, la cual fue donada por el Dr. Bernard
Roizman, Universidad de Chicago, USA. Esta cepa es utilizada como cepa de referencia en
estudios a nivel mundial debido a su reconocida neurovirulencia. Además se utilizaron los
mutantes null US3 y null VP11/12, de la misma cepa viral, también donados por el Dr. Roizman.
3.1.2. LÍNEAS CELULARES
Para el desarrollo de este estudio se utilizaron 2 líneas celulares:
Línea celular VERO E6 (riñón de mono verde africano Cercopithecus aethiops): Línea
epitelial que se utilizó para propagación y titulación viral. Estas células se cultivaron y
mantuvieron en monocapa en medio DMEM suplementado con 10% SFB y 1% v/v
penicilina/estreptomicina (100 U/mL). La incubación se realizó a 37ºC en una atmósfera al 5% de
CO2 y 95% humedad relativa.
Línea celular HT22 (neuronas hipocampales de ratón): Ésta línea celular fue un aporte del Dr.
David Schubert, Salk Institute, USA; la que se utilizó, tanto para realizar la infección, como la
transfección. Estas células se cultivaron y mantuvieron en monocapa en medio DMEM
suplementado con 5% SFB, fungizona y gentamicina. La diferenciación se realizó remplazando
15
el medio DMEM suplementado con Neurobasal, L-glutamina, N2, fungizona y gentamicina en
suero reducido por dos días. La incubación se realizó a 37ºC en una atmósfera al 5% de CO2 y
95% humedad relativa.
3.1.3 PLÁSMIDOS
pGUL46: obsequio del Dr. James Smiley, University of Alberta, Edmonton, Canadá) y contiene
el ORF de UL46 obtenido desde HSV-1 cepa KOS que codifica para VP11/12, el que se
encuentra fusionado a EGFP.
pEYFP-US3: obsequio del Dr. Chunfu Zheng, Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy
of Sciences, Wuhan, China y contiene el ORF de US3 obtenido desde HSV-1 cepa F, acoplado a
EYFP.
3.2. REACTIVOS Y SISTEMAS COMERCIALES
Los reactivos utilizados a lo largo de este trabajo se detallan en la tabla I.
16
TABLA I. Clasificación alfabética de acuerdo al nombre del fabricante de los reactivos
utilizados en este trabajo.
Nombre del Fabricante Reactivos
Ambion, Inc. Agua libre de nucleasas
Axygen AxyPrep™ Multisource Genomic DNA
Miniprep y 1Kb Ladder DNA marker.
Gibco Laboratories Life Technologies, Inc. DMEM, Tripsina 10X, EDTA,
Fungizona, SFB, L-Glutamina 100X y
N2 supplement.
IDT Partidores forward y reverse US3.
Invitrogen AccuPrime™ Pfx DNA Polimerase,
ExpressLink™ T4 DNA Ligase,
Lipofectamine 3000 y SYBR® SafeDNA
gel stain.
Merck Na2HPO4, KH2PO4, NaCl y KCl.
OMEGA bio-tek E.Z.N.A.® Plasmid Mini Kit II y
E.Z.N.A. Gel Extraction Kit.
17
3.3.1. PROPAGACIÓN DE HERPES SIMPLEX VIRUS TIPO 1
Para propagar HSV-1 se utilizaron células VERO, las cuales se mantuvieron en monocapa en
medio DMEM al 10% SFB en botellas de 150 cm2. Éstas se infectaron con 1 mL de stock de
HSV-1. La adsorción del virus se realizó durante una hora a 37 ºC y 5% CO2. Posteriormente se
eliminó el medio y las células se incubaron en medio DMEM al 10% SFB hasta visualizar efecto
citopático en el 95% de las células (48-72 horas post-infección). Una vez visualizado éste efecto,
las células se sometieron a ciclos de congelamiento (-80 °C) y descongelado a temperatura
ambiente, para luego ser centrifugadas a 10.000 rpm durante 5 minutos. A partir del sobrenadante
se obtuvieron los stocks virales utilizados en el presente estudio, los cuales se conservaron en
alícuotas a -80 °C para su posterior titulación.
3.3.2. TITULACIÓN VIRAL
Se prepararon 6 diluciones, en base 10 (X * 10 -y), de una alícuota del virus propagado. Cada
dilución se agregó sobre células VERO crecidas en monocapa en placas de 6 pocillos. Esta placa
se infectó 1 hora a 37 oC al 5% CO2, con agitación manual cada 10 minutos. Pasado ese tiempo,
se adicionó a cada pocillo una mezcla de 1,2% agarosa en agua y DMEM 2X al 1% SFB en una
relación 1:1 y se incubó a 37 °C al 5% CO2 por 72 horas. Luego se le adicionó 37% formalina +
cristal violeta por 30 minutos con el fin de fijar y teñir las células. Finalmente se eliminó la
agarosa de cada pocillo.
El título de la preparación viral se calculó contando el número de placas de lisis que produjo una
determinada dilución de la alícuota viral.
3.3. METODOLOGÍA
18
Cada partícula infecciosa da origen a una placa de lisis y se denomina unidad formadora de placa
(PFU). El título se expresa como PFU/mL o PFU/g, según corresponda.
Ejemplo de cálculo:
Título viral (PFU/mL) = No de placas de lisis
(Volumen virus x dilución del virus)
Título viral (PFU/mL) = 130
(0,5 mL x 10-5)
2,6x107 (PFU/mL) = 130
(0,5 mL x 10-5)
La concentración viral corresponde a 2,6x107 (PFU/mL). Para obtener un MOI de 10, es decir, 10
partículas virales infecciosas por célula, se necesita saber el número de células en la placa. Para
saber la cantidad necesaria de partículas virales para obtener un MOI 10 se realizó el siguiente
cálculo:
10 PFU -------------> 1 célula
X -------------> 1,9*105 células
X = 1,9 * 106 PFU
Al saber la concentración del virus y el número de partículas virales necesarias para obtener un
MOI 10 de infección, se determinó el volumen necesario de virus que se debe agregar al medio.
19
2,6*107 PFU --------> 1mL
1,9*106 PFU --------> X mL
X =0,07 mL
Por lo tanto, con 70 µL del virus por pocillo (placa 24 pocillos) se obtiene un MOI de 10. Los
volúmenes de virus y medio se ajustaron de manera que siempre existió un volumen final de 200
µL para infectar cada pocillo.
3.3.3. CULTIVO CELULAR
Para obtener células HT22 diferenciadas y sincronizadas, éstas se crecieron en DMEM
suplementado con 5% SFB, fungizona y gentamicina. La diferenciación y sincronización se
realizó remplazando el medio DMEM suplementado con Neurobasal, L-glutamina, N2, fungizona
y gentamicina en ausencia de suero por dos días. La incubación se realizó a 37ºC en una
atmósfera al 5% de CO2 y 95% humedad relativa.
3.3.4. INFECCIÓN CON HSV-1
Las células HT22 crecieron sobre cubreobjetos redondos (coverslips) depositados al interior de
placas de cultivo de 40 mm de diámetro hasta alcanzar una confluencia de 1,9 x105 células por
pocillo. Posteriormente se realizó la infección con HSV-1 agregando a las placas de cultivo el
volumen de virus correspondiente para alcanzar un MOI de 10 en un volumen final de 200 µL, el
cual se incubó durante una hora a 37 ºC y 5% CO2. Posteriormente se removió el virus y se
restauró el medio de crecimiento. Una vez transcurridas 8 horas de infección, se extrajo la
20
correspondiente placa de cultivo y respectivo mock, y se puso fin a la infección aspirando el
medio y realizando 3 lavados con PBS 1X.
3.3.5. EXTRACCIÓN DNA TOTAL
La obtención del DNA total se realizó utilizando el kit AxyPrep™ Multisource Genomic DNA
Miniprep, según el protocolo indicado por el fabricante. El DNA total extraído se cuantificó
mediante absorbancia 260 nm, utilizando el espectrofotómetro Nanodrop 2000.
3.3.6. PCR
La síntesis del fragmento que codifica el marco de lectura del gen US3, incluida la metionina
inicial, flanqueado por los sitios de restricción BglII y EcoRI, así como el fragmento que codifica
para US3 sin el codón de termino (US3 –stop), se realizó utilizando la enzima AccuPrime™ Pfx
DNA Polymerase. Las concentraciones de DNA obtenidas fueron de 140 ± 5 ng/µL y 180 ± 5
ng/µL, respectivamente.
Para comprobar la presencia del gen UL46, que codifica para la proteína viral VP11/12, se realizó
un ensayo de PCR para amplificar un fragmento interno del gen, de aproximadamente 186 pb.
Además, para comprobar la presencia del gen US3, que codifica para la proteína viral del mismo
nombre, se realizó un ensayo de PCR para el gen completo de 1464 pb.
Los partidores utilizados se detallan en la tabla II, mientras que los compuestos y concentraciones
utilizadas en todas las reacciones de PCR, así como los programas de amplificación se detallan en
las tablas III y IV respectivamente.
21
TABLA II. Partidores utilizados en las reacciones de PCR
Gen Secuencia (5´- 3´) Tamaño amplicón (pb)
US3 -stop 1461
Directo GGAAGATCTATGGCCTGTCGTAAGTTTTGTC
Reverso GGAGAATTCTTTCTGTTGAAACAGCGG
US3 1464
Directo GGAAGATCTATGGCCTGTCGTAAGTTTTGTC
Reverso GGAGAATTCTCATTTCTGTTGAAACAGCGG
UL46 (Frag. Interno) 186
Directo GCCTTGATGCTCAACTCCAT
Reverso TCACCACGCCCAGTATATCA
22
TABLA III. Componentes de las reacciones de PCR
Master Mix Volumen 1X (µL/tubo) Concentración final
Mezcla de reacción Pfx 10X 5 1X
Partidor Directo 10 µM 1 0,2 µM
Partidor Reverso 10 µM 1 0,2 µM
DNA polimerasa Pfx 5 U/µL 0,5 1,25 U
Agua libre de nucleasas 42
DNA 0,5 310 ng/µL
Volumen total 50
23
TABLA IV. Programa de amplificación para PCR
Etapa de amplificación Temperatura °C Tiempo
Desnaturación inicial 95 2 minutos
Desnaturación 95 15 segundos Repetición
27
Ciclos
Hibridación 56 30 segundos
Extensión 68 2 minutos
24
3.3.7. DIGESTIÓN DE DNA
Para la construcción de los vectores de expresión US3-EGFP y EGFP-US3, tanto los fragmentos
amplificados por PCR, como los plásmidos pEGFP-N1 y pEGFP-C1, fueron tratados con las
enzimas de restricción BglII y EcoRI de la empresa Invitrogen, siguiendo el protocolo indicado
en el manual.
3.3.8. LIGACIÓN DE ADN
El fragmento de interés, US3, fue subclonado en el plásmido pEGFP-C1 utilizando la enzima
ExpressLink™ T4 DNA Ligase según las indicaciones del fabricante. El mismo procedimiento se
repitió para el fragmento US3 –stop y el plásmido pEGFP-N1.
3.3.9. TRANSFORMACIÓN
Se mezclaron 10 µL del producto de ligado con 100 µL de células competentes (E. coli cepa
Top10 F’), se mantuvieron en hielo por 10 minutos; luego se les aplicó un shock térmico de 90
segundos a 42°C. Una vez transcurrido el tiempo se añadieron 800 µL de medio LB y se
incubaron durante una hora a 37 ºC, con agitación constante. Pasado una hora, se vertieron 50 µL
de células transformadas en una placa con medio LB conteniendo 30 µg/mL de kanamicina y se
dejaron crecer a 37 °C toda la noche.
3.3.10. EXTRACCIÓN DE DNA PLASMIDIAL
Para la extracción de DNA plasmidial se utilizó el kit comercial E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit II
siguiendo el protocolo “Plasmid Mini Spin” indicado por el fabricante.
25
3.3.11. TRANSFECCIÓN
Para la transfección de los vectores de expresión EGFP-US3, US3-EGFP, pUL46 y
posteriormente pEYFP-US3, se utilizó el sistema Lipofectamina 3000 (Invitrogen). Las células
HT22 se crecieron sobre cubreobjetos redondos (coverslips) depositados al interior de placas de
cultivo de 40 mm de diámetro hasta alcanzar una confluencia de 65% - 70% de células por
pocillo. Posteriormente se realizó la transfección de la siguiente manera. Se extrajo el medio de
incubación y se agregaron 150 µL de OPTIMEM por pocillo; la placa se mantuvo a 37 °C
mientras se prepararon los reactivos de transfección. Se prepararon dos tubos eppendorf por
separado. Un tubo conteniendo 50 µL de OPTIMEM más 0,5 µg de DNA, por pocillo; y otro
tubo con 50 µL de OPTIMEM más 1,75 µL de Lipofectamina 3000, por pocillo. Ambos tubos se
incubaron por 5 minutos a temperatura ambiente y transcurrido el tiempo, se mezcló el contenido
de ambos tubos e incubó por 20 minutos a temperatura ambiente. Se retiró el OPTIMEM de los
pocillos que contienen los coverslips y se agregaron 100 µL de la mezcla antes mencionada,
procurando cubrir la superficie completa del coverslip. La placa se incubó por 1 hora a 37 °C.
Una vez transcurrido el tiempo de incubación, se eliminó el complejo de transfección y las
células se lavaron 3 veces con PBS 1X, luego se restituyó el medio de diferenciación y se incubó
por 12 horas. Finalizadas las 12 horas, las células se lavaron 3 veces con PBS 1X y se fijaron en
paraformaldehído.
3.3.12. INMUNOFLUORESCENCIA
Las células crecieron sobre cubreobjetos redondos (coverslips) depositados al interior de placas
de cultivo de 40 mm de diámetro. Posterior a la infección o transfección, se fijaron en 4%
paraformaldehído (PFA). Los coverslips fijados en 4% PFA debieron permeabilizarse con 0,2%
26
Tritón X-100 y luego se bloquearon con una solución de EDTA, gelatina de pescado, BSA libre
de IgG, suero de caballo y agua destilada a temperatura ambiente. Posteriormente se incubaron
con el anticuerpo primario (Tabla V) diluido en la misma solución de bloqueo a 37 °C por 30
minutos. Se lavaron con PBS 1X y se incubaron con anticuerpos secundarios a 37 °C por 30
minutos; para luego ser nuevamente lavados e incubados con DAPI. Finalmente los coverslips, se
montaron en preparaciones con medio de montaje especial para fluorescencia y se procedió a su
análisis utilizando microscopio de epifluorescencia Zeiss Axioskope A1.
27
TABLA V. Anticuerpos utilizados
Anticuerpo Epitope Host Fuente
TAU5
(TAU total)
Residuos entre 210-
230 (independiente
del estado de
fosforilación)
Ratón Dr. L. Binder
TAU1 Residuos serina 202
y treonina 205
desfosforilados
Ratón Dr. L. Binder
pTAU404 Residuo serina 404
fosforilado
Conejo Abcam
Ab131338
HSV-1 Virus total Conejo Santa Cruz Biotechnology
Ab9533
ICP8 Proteína viral
temprana
Ratón Santa Cruz Biotechnology
Sc53329
28
3.3.13. REGISTRO DE IMÁGENES Y CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA
Una vez finalizada la inmunofluorescencia se procedió a su análisis utilizando el microscopio de
epifluorescencia Zeiss Axioskope A1. Se tomó registro fotográfico de 5 campos visuales por
muestra, repitiendo la unidad experimental completa 3 veces.
Para la caracterización fenotípica de la proteína TAU, las células fueron clasificadas de acuerdo a
la marca de fluorescencia de los anticuerpos pTAU404, TAU5 y TAU1. Para la caracterización
de la infección con HSV-1, células HT22 fueron infectados a un MOI 10, transcurridas las 8
horas de infección las células fueron fijadas y se realizó una IFI. Para efectos de cuantificación de
infectividad y caracterización fenotípica durante la infección productiva, las células fueron
incubadas con anticuerpos específicos para la detección de la proteína viral ICP8 y el virus HSV-
1 completo, como marcadores de infección viral. Para determinación de viabilidad celular, se
tiñeron las células con DAPI, el cual es un marcador nuclear. Posteriormente se utilizaron
anticuerpos específicos contra pTAU404, TAU5 o TAU1. Los coverslips fueron transfectados
con pGUL46 o EYFP-US3 durante 12 horas. Una vez finalizada la transfección, las células se
fijaron en 4% PFA y se realizó una IFI. Todas las imágenes fueron capturadas a 63X de
magnificación y se obtuvieron 5 campos distintos, la unidad experimental se repitió 3 veces con
cultivos celulares diferentes. Una vez obtenidas las imágenes, los núcleos teñidos con DAPI
fueron contados utilizando el programa Image J. Se usó como criterio que una célula viable
corresponde a una célula cuyo núcleo se encuentra teñido. Los resultados obtenidos fueron
graficados usando el programa GraphPad Prism 5.
29
3.3.14 ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Los resultados obtenidos representan al menos tres unidades experimentales independientes. Los
datos obtenidos se procesaron utilizando el programa GraphPad Prism 5 y el análisis estadístico
One-way ANOVA (viabilidad e infectividad) o Two-way ANOVA (caracterización fenotípica).
Un valor de p<0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
30
4. RESULTADOS
4.1 CULTIVOS CELULARES
Para el desarrollo de todos los experimentos realizados en este trabajo, fue necesario realizar un
correcto cultivo de células HT22. Para esto, se observó la morfología celular característica de
cada cultivo. Las células HT22 muestran desarrollo de procesos dendríticos, propios del estado de
diferenciación de las células (Figura 3A). Además, como marcador del estado celular, se evaluó
expresión de MAP2, un marcador neurona-especifico. Así mediante inmunofluorescencia y la
detección de MAP2 se determinó el estado diferenciado de las células (Figura 3B).
31
A B
MAP2
Dapi
MAP2
Dapi
Figura 3. Diferenciación de células HT22: Luego de ser A) diferenciadas o B) no diferenciadas, las células
fueron fijadas con paraformaldehído, los núcleos teñidos con DAPI y se realizó microscopía de fluorescencia
para visualizar faloidina (paneles superiores) o IFI con anticuerpo policlonal MAP2 y detectadas con un
anticuerpo secundario anti conejo conjugado con Alexa 594 (paneles inferiores). Cada imagen es representativa
de tres experimentos independientes.
32
4.2 CONSTRUCCIÓN DEL VECTOR EGFP-US3
Debido a que el laboratorio no contaba con un plásmido que expresase US3, se construyó uno,
que además estuviese acoplado a EGFP para facilitar su visualización. Así, el marco de lectura
abierto de US3, obtenido como producto de PCR, a partir de una alícuota de HSV-1 (Figura 4A),
fue subclonado al vector de expresión pEGFP-C1 para obtener EGFP acoplado al extremo amino
de US3. El plásmido resultante fue tratado con enzimas de restricción, para determinar si la
construcción era correcta (Figura 4B). El producto de ligación sin tratamiento con enzimas de
restricción muestra una marcada banda cerca de los 6000 pb y una banda más discreta sobre
10000 pb coincidiendo con lo esperado para el plásmido sin cortes; la digestión con una o ambas
enzimas de restricción usadas en la construcción del fragmento muestran ya sea la linearización
del plásmido o la liberación del fragmento US3.
4.3 TRANSFECCIÓN DEL VECTOR EGFP-US3
Una vez construido el vector de expresión, se realizaron transfecciones de 3, 6 y 12 horas para
determinar la expresión de la proteína de fusión EGFP-US3 (Figura 4C). Frente al hecho que, tras
varios intentos no se logró visualizar EGFP; junto con intentos también fallidos de la
construcción US3-EGFP; considerando el tiempo invertido; y la afortunada llegada de EYFP-
US3 donada por el Dr Chunfu Zheng, se desestimaron los intentos por hacer funcionar la
construcción.
33
EGFP
Dapi T. 6hrs
EGFP
Dapi T. 12hrs
2000
1500
1000
ST PCR US3A
EGFP
Dapi T. 3hrsC
20001500
Bgl II
ST EcoR I EcoR CtrlB
Figura 4. Construcción y transfección del vector de expresión EGFP-US3 en células HT22: A) Gel de
agarosa 0,8% mostrando el producto de amplificación por PCR, utilizando partidores para el gen US3 a partir
extracto viral. B) Gel de agarosa 0,8% mostrando el ensayo de restricción del plásmido resultante del proceso
de subclonado. C) Las células fueron transfectadas con el plásmido EGFP-US3. Transcurrido el tiempo de
transfección (3, 6 y 12 horas) las células fueron fijadas con paraformaldehído, los núcleos teñidos con DAPI y
se realizó microscopía de fluorescencia para visualizar la proteína viral acoplada a EGFP. Cada imagen es
representativa de tres experimentos independientes.
34
4.4 CARACTERIZACIÓN DEL PLÁSMIDO pEYFP-US3.
Para la caracterización del plásmido pEYFP-US3 el primer paso fue transformar bacterias E. coli
competentes con el plásmido en cuestión, según está descrito en la sección Materiales y Métodos.
El éxito de la técnica se observa mediante la aparición de colonias resistentes a ampicilina.
Finalizada la transformación se guardó un stock de bacterias en glicerol a -80 °C para usos
posteriores. Posteriormente se realizó la extracción y cuantificación del DNA plasmidial, el cual
fue sometido a una reacción de PCR para comprobar que el plásmido contenía el gen de interés.
Para esto se utilizó un set de partidores específicos para el gen completo de US3 correspondiente
a 1446 pb. Los detalles tanto del programa de PCR así como de los partidores se encuentran en la
sección de Materiales y Métodos. Luego, se realizó una electroforesis en gel de agarosa al 0,8%
para visualizar el producto de amplificación (Figura 5A). La presencia de una banda de
aproximadamente 1500 pb en el carril 2 confirma que el gen US3 se encuentra dentro del
plásmido.
4.5 CARACTERIZACIÓN DEL PLASMIDO pGUL46.
Para la caracterización del plásmido pGUL46, se repitió el mismo procedimiento utilizado para
caracterizar el plásmido pEYFP-US3, con la diferencia que se usaron partidores específicos para
un fragmento interno de 186 pb del gen UL46. Los detalles del programa de PCR y de los
partidores se encuentran en la sección de Materiales y Métodos. Posteriormente se corrió un gel
de agarosa al 0,8% para visualizar el producto de amplificación (Figura 5B). La presencia de una
banda de aproximadamente 200 pb en el carril 2 confirma que el gen UL46 se encuentra dentro
del plásmido.
35
A B
15002500
PCR ST
100
200
ST PCR
Figura 5. Caracterización de los plásmidos pEYFP-US3 y pGUL46. Gel de agarosa 0,8% mostrando el
producto de amplificación por PCR, A) utilizando partidores para el gen US3 a partir del plásmido pEYFP. B)
Utilizando partidores para un fragmento interno del gen UL46 a partir del plásmido pGUL46.
36
4.6 DISTRIBICIÓN SUBCELULAR DE US3-EYFP.
Para determinar la distribución subcelular de esta proteína viral, se transfectó la línea celular
HT22 usando el reactivo de transfección Lipofectamina 3000. Posterior a la transfección del
plásmido pEYFP-US3 (como indica Materiales y Métodos, página 25), los núcleos fueron teñidos
con DAPI y mediante microscopía de fluorescencia, según la visualización de EYFP (Figura 6B),
se procedió a cuantificar la eficiencia de transfección a 3, 6, 12 y 18 horas post-transfección. Los
resultados obtenidos señalan que luego de 12 horas no existe mayor variación en la cantidad de
células transfectadas (Figura 6A), por lo tanto los ensayos posteriores se realizaron con
transfecciones de 12 hora. Las células transfectadas muestran que la distribución de US3 es pan-
celular
37
A
B
Figura 6. Transfección transitoria de US3 en células HT22: Las células fueron transfectadas con el
plásmido pEYFP-US3. Transcurrido el tiempo de transfección fueron fijadas con paraformaldehído, los núcleos
teñidos con DAPI y se realizó microscopía de fluorescencia para visualizar la proteína viral acoplada a EYFP.
Cada imagen es representativa de tres experimentos independientes. A) Distribución subcelular de US3,
aumento 63X. B) Eficiencia en cinética de transfección. Para efectos de cálculo, se tomaron fotografías a
quince campos en un aumento del 40X y luego se contaron las células teñidas con DAPI. Posteriormente se
contaron las células que expresaban el plásmido (emisión de fluorescencia 527 nm). Los valores fueron
graficados con el programa GraphPad Prism 5.
Us3
Dapi
Horas post-transfección
3 6 12 18
0
50
100
15%22,3%
29,3% 27,4%
38
4.7 DISTRIBICIÓN SUBCELULAR DE VP11/12-EGFP.
Procediendo de la misma manera antes descrita, se determinaron las horas post-transfección que
presentan un mejor porcentaje de transfección de pUL46, llegando nuevamente a la conclusión
que el mejor tiempo corresponde a 12 horas de transfección, a las 18 horas existe un leve
aumento, pero que no es significativo (Figura 7). La transfección de VP11/12-EGFP muestra que
la distribución de esta proteína se extiende por el citoplasma, con concentración perinuclear y
puntiforme.
39
A
B
Figura 7. Transfección transitoria de VP11/12 en células HT22: Las células fueron transfectadas con el
plásmido pGUL46. Transcurrido el tiempo de transfección fueron fijadas con paraformaldehído, los núcleos
teñidos con DAPI y se realizó microscopía de fluorescencia para visualizar la proteína viral acoplada a EGFP.
Cada imagen es representativa de tres experimentos independientes. A) Distribución subcelular de VP11/12,
aumento 63X. B) Eficiencia en cinética de transfección. Para efectos de cálculo, se tomaron fotografías a
quince campos en un aumento del 40X y luego se contaron las células teñidas con DAPI. Posteriormente se
contaron las células que expresaban el plásmido (emisión de fluorescencia 488 nm). Los valores fueron
graficados con el programa GraphPad Prism 5.
Vp11/12
Dapi
Horas post-transfección
3 6 12 18
0
50
100
15,1%20% 23,1% 24,4%
40
4.8 MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES DE LA PROTEINA TAU AL
EXPRESAR EYFP-US3.
El diseño experimental constó de cuatro grupos de trabajo: células control (no transfectadas),
control de reportero (transfectadas con EYFP), control del vector (transfectadas con el vector
vacío) y células transfectadas (EYFP-US3).
Para determinar la distribución y localización celular de la proteína TAU fosforilada en el residuo
serina 404, los cultivos se mantuvieron en coverslips y se trabajaron según el diseño
experimental, transfectando con el gen de interés o gen reportero por 12 horas, o infectando con
HSV-1 wild-type o HSV-1 mutante por 8 horas. Las células fueron incubadas con anticuerpo
policlonal pTAU404, detectadas con un anticuerpo secundario anti conejo conjugado con Alexa
594 y visualizadas mediante microscopía de fluorescencia.
En el control, se evidencia esta forma fosforilada en toda la célula, pero con mayor presencia en
núcleo (Figura 8A). Al transfectar, tanto con EYFP-US3, como con EYFP se observa una
disminución de la intensidad de fluorescencia relativa de pTAU404 nuclear (Figura 8A), en
comparación a células no transfectadas. Estas diferencias de intensidad se ven graficadas en la
figura 8B, donde podemos observar la fluorescencia total corregida para 15 células individuales
de cada grupo de trabajo (control y transfectadas, ya sea con US3 acoplado a EYFP o EYFP
sola).
41
A B
Contr
ol
EYFP
-US3
EYFP
0
5.0 10 6
1.0 10 7
1.5 10 7
* *
Control EYFP-US3 EYFP
Dapi
pTau404
EYFP
Merge
Figura 8. Efecto de la expresión transitoria de EYFP-US3 sobre TAU fosforilada en S404: A)
Transfección de células HT22 con: Control = control sin transfectar; T. US3 = plásmido pEYFP-US3 (codifica
para US3 acoplada a EYFP); y T. EYFP = plásmido pEYFP-N1 (codifica para EYFP) durante 12 horas.
Transcurrido el tiempo de transfección las células fueron fijadas con paraformaldehído, los núcleos teñidos con
DAPI y se realizó una IFI con anticuerpo policlonal pTAU404 y detectadas con un anticuerpo secundario anti
IgG de conejo conjugado con Alexa 594. Se visualizó mediante microscopía de inmunofluorescencia. B)
Representación gráfica de la intensidad de fluorescencia nuclear de pTAU404. Se consideraron 15 células
individuales para cada experimento (*p<0,05 comparado con el control sin transfectar). Cada imagen es
representativa de tres experimentos independientes. Aumento 63x. Los gráficos fueron realizados usando el
programa GraphPad Prism 5.
42
Para determinar si la disminución en intensidad de fluorescencia de pTAU404 en el núcleo de las
células transfectadas se debe a la disminución en la expresión de TAU, una relocalización o a una
modificación en su estado de fosforilación, se realizaron los mismos ensayos, pero esta vez las
células fueron incubadas con anticuerpo monoclonal TAU5 y detectadas con un anticuerpo
secundario anti IgG de ratón conjugado con Alexa 594. TAU5 sirve como marcador de TAU
total.
Ya sea en los distintos controles, como en las células transfectadas con US3 acoplado a EYFP o
EYFP sola (Figura 9), no existe una diferencia significativa en la intensidad de fluorescencia
relativa o en la localización de TAU5.
43
A B
Int.
de f
luo
rescen
cia
(U
A)
Contr
ol
EYFP
-US3
EYFP
Control EYFP-US3 EYFP
Dapi
Tau5
EYFP
Merge
Figura 9. Efecto de la expresión transitoria de EYFP-US3 sobre TAU total: Transfección de células HT22
con A) Control = control sin transfectar; T. US3 = plásmido pEYFP-US3 (codifica para US3 acoplada a
EYFP); y T. EYFP = plásmido pEYFP-N1 (codifica para EYFP) durante 12 horas. Transcurrido el tiempo de
transfección las células fueron fijadas con paraformaldehído, los núcleos teñidos con DAPI y se realizó una IFI
con anticuerpo monoclonal TAU5 y detectadas con un anticuerpo secundario anti IgG de ratón conjugado con
Alexa 594. Se visualizó mediante microscopía de inmunofluorescencia. B) Representación gráfica de la
intensidad de fluorescencia total de TAU5. Se consideraron 15 células individuales para cada experimento. Se
utilizó para formaldehído como fijador. Cada imagen es representativa de tres experimentos independientes.
Aumento 63x. Los gráficos fueron realizados usando el programa GraphPad Prism 5.
44
Debido a que algunos investigadores han demostrado el aumento del marcador TAU1 (que
reconoce los residuos S202/T205 cuando están desfosforilados) en situaciones de estrés celular,
se decidió determinar si la disminución en la intensidad de fluorescencia relativa de pTAU404 se
relacionaba con un aumento en la intensidad de TAU1. Así, se realizaron los mismos ensayos,
pero esta vez las células fueron incubadas con anticuerpo monoclonal TAU1 y detectadas con un
anticuerpo secundario anti ratón conjugado con Alexa 594. De forma similar a lo ocurrido con TAU5,
TAU1 no muestras diferencias significativas entre los controles y las células expresando US3
acoplado a EYFP o EYFP sola (Figura 10).
45
A B
Control EYFP-US3 EYFP
Dapi
Tau1
EYFP
Merge
Int.
de f
luo
rescen
cia
(U
A)
Contr
ol
EYFP
-US3
EYFP
0
5.0 10 6
1.0 10 7
1.5 10 7
2.0 10 7
2.5 10 7
Figura 10. Efecto de la expresión transitoria de EYFP-US3 sobre TAU desfosforilada en S202 y T205:
Transfección de células HT22 con A) Control = control sin transfectar; T. US3 = plásmido pEYFP-US3
(codifica para US3 acoplada a EYFP); y T. EYFP = plásmido pEYFP-N1 (codifica para EYFP) durante 12
horas. Transcurrido el tiempo de transfección las células fueron fijadas con paraformaldehído, los núcleos
teñidos con DAPI y se realizó una IFI con anticuerpo monoclonal TAU5 y detectadas con un anticuerpo
secundario anti IgG de ratón conjugado con Alexa 594. Se visualizó mediante microscopía de
inmunofluorescencia. B) Representación gráfica de la intensidad de fluorescencia total de TAU5. Se
consideraron 15 células individuales para cada exprimento. Se utilizó para formaldehído como fijador. Cada
imagen es representativa de tres experimentos independientes. Aumento 63x. Los gráficos fueron realizados
usando el programa GraphPad Prism 5.
46
4.9 MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES DE LA PROTEINA TAU AL
EXPRESAR VP11/12-EGFP.
Para determinar si VP11/12 ejerce el mismo efecto o uno distinto al de US3 y EYFP se utilizó el
mismo diseño experimental con tres grupos de trabajo: células control (no transfectadas), control
de reportero (transfectadas con EGFP) y células transfectadas (VP11/12-EGFP).
El procedimiento se realizó de igual manera que con US3 y los resultados fueron los mismos
(Figura 11). Es decir, al transfectar, tanto con VP11/12 acoplado a EGFP, como con EGFP sola,
existe una disminución significativa de la intensidad de pTAU404 nuclear respecto al control
(Figura 11). Mientras que no se observa un cambio significativo en la intensidad de fluorescencia
relativa, ya sea de TAU5 (Figura 12) o TAU1 (Figura 13).
47
A B
Control VP11/12-EGFP EGFP
Dapi
pTau404
EGFP
Merge
Int.
de f
luo
rescen
cia
(U
A)
Contr
ol
VP11
/12-
EG
FP
EG
FP
0
5.0 10 6
1.0 10 7
1.5 10 7
* *
Figura 11. Efecto de la expresión transitoria de VP11/12-EGFP sobre TAU fosforilada en S404: A)
Transfección de células HT22 con: Control = control sin transfectar; T. VP11/12 = plásmido pGUL46 (codifica
para VP11/12 acoplada a EGFP); y T. EGFP = plásmido pEGFP-N1 (codifica para EGFP) durante 12 horas.
Transcurrido el tiempo de transfección las células fueron fijadas con paraformaldehído, los núcleos teñidos con
DAPI y se realizó una IFI con anticuerpo policlonal pTAU404 y detectadas con un anticuerpo secundario anti
conejo conjugado con Alexa 594. Se visualizó mediante microscopía de inmunofluorescencia. B)
Representación gráfica de la intensidad de fluorescencia nuclear de pTAU404. Se consideraron 15 células
individuales para cada experimento (*p<0,05 comparado con el control sin transfectar). Cada imagen es
representativa de tres experimentos independientes. Aumento 63x. Los gráficos fueron realizados usando el
programa GraphPad Prism 5.
48
A B
Control VP11/12-EGFP EGFP
Dapi
Tau5
EGFP
Merge
Figura 12. Efecto de la expresión transitoria de VP11/12-EGFP sobre TAU total: Transfección de células
HT22 con A) Control = control sin transfectar; T. VP11/12 = plásmido pGUL46 (codifica para VP11/12
acoplada a EGFP); y T. EGFP = plásmido pEGFP-N1 (codifica para EGFP) durante 12 horas. Transcurrido el
tiempo de transfección las células fueron fijadas con paraformaldehído, los núcleos teñidos con DAPI y se
realizó una IFI con anticuerpo monoclonal TAU5 y detectadas con un anticuerpo secundario anti ratón
conjugado con Alexa 594. Se visualizó mediante microscopía de inmunofluorescencia. B) Representación
gráfica de la intensidad de fluorescencia total de TAU5. Se consideraron 15 células individuales para cada
experimento. Cada imagen es representativa de tres experimentos independientes. Aumento 63x. Los gráficos
fueron realizados usando el programa GraphPad Prism 5.
49
A B
Control VP11/12-EGFP EGFP
Dapi
Tau1
EGFP
Merge
Int.
de f
luo
rescen
cia
(U
A)
Contr
ol
VP11
/12-
EGFP
EG
FP
Figura 13. Efecto de la expresión transitoria de VP11/12-EGFP sobre TAU desfosforilada en S202/T205:
Transfección de células HT22 con A) Control = control sin transfectar; T. VP11/12 = plásmido pGUL46
(codifica para VP11/12 acoplada a EGFP); y T. EGFP = plásmido pEGFP-N1 (codifica para EGFP) durante 12
horas. Transcurrido el tiempo de transfección las células fueron fijadas con paraformaldehído, los núcleos
teñidos con DAPI y se realizó una IFI con anticuerpo monoclonal TAU1 y detectadas con un anticuerpo
secundario anti ratón conjugado con Alexa 594. Se visualizó mediante microscopía de inmunofluorescencia. B)
Representación gráfica de la intensidad de fluorescencia total de TAU1. Se consideraron 15 células
individuales para cada experimento. Cada imagen es representativa de tres experimentos independientes.
Aumento 63x. Los gráficos fueron realizados usando el programa GraphPad Prism 5.
50
4.10 EXPERIMENTOS DE INFECCIÓN NEURONAL CON HSV-1.
Para complementar los resultados obtenidos de las transfecciones se realizó la infección tanto con
HSV-1 wild-type o utilizando HSV-1 mutantes nulos para una u otra proteína (null VP11/12 y
null US3). Lo primero que se observa es un mayor grado infección por parte del virus wild-type,
las células están prácticamente en su totalidad con su citoplasma retraído hacia el núcleo, carecen
completamente de proyecciones y el número de células se ha reducido considerablemente. En el
caso de las células infectadas con el virus null US3 o null VP1/12, aunque también se pueden
apreciar células en estado picnótico, estas son menos en relación a la gran mayoría que aún
conservan citoplasma evidente, incluidas algunas proyecciones. También es evidente el mayor
número de células en comparación con las células infectadas con wild-type (Figuras 14, 15 y 16).
Aun así la distribución de las proteínas analizadas no varía de mayor manera entre una y otra
infección. Ante la infección con las distintas formas del virus: pTAU404 (Figura 14) muestra un
aumento general en intensidad de fluorescencia además de una acumulación perinucear
focalizada. Este foco perinuclear es mucho más evidente en las células infectadas con los virus
mutantes; TAU1 (Figura 15), también presenta un incremento general de la intensidad de
fluorescencia del marcador y la aparición de estos focos perinucleares; TAU5 pareciera mostrar
un aumento en intensidad de fluorescencia relativa, mas este aparente aumento se debe a la
disminución del área que contiene la fluorescencia. Cabe mencionar que en algunos casos, TAU5
presenta el mismo foco perinuclear observado con los dos marcadores anteriores.
La figura 17 muestra los porcentajes de viabilidad generados por la infección del virus wild-type
o mutantes nulos para US3 y VP11/12.
51
A B
Control WT Null US3 Null VP11/12
Dapi
Tau404
HSV-1
Merge
Int.
de f
luo
rescen
cia
(U
A)
Contr
olW
T
Null
US3
Null
VP11
/12
0
5.0 10 6
1.0 10 7
1.5 10 7
* * *
Figura 14. Efecto de la infección de neuronas con HSV-1 wt, null US3 o null VP11/12 sobre TAU
fosforilada en S404: Las células HT22 fueron infectadas con los virus wild-type (WT), Null US3 o Null
VP11/12, durante 8 horas. Transcurrido el tiempo de infección las células fueron fijadas con paraformaldehído,
los núcleos teñidos con DAPI y se realizó una doble IFI con anticuerpo policlonal pTAU404 y anticuerpo
monoclonal anti ICP8, como marcador de infección; y detectadas con anticuerpos secundarios anti IgG de
conejo conjugado con Alexa 594 y anti IgG de ratón conjugado con Alexa 488 respectivamente. Se visualizó
mediante microscopía de inmunofluorescencia. B) Representación gráfica de la intensidad de fluorescencia
total de pTAU404. Se consideraron 15 células individuales para cada experimento. Se utilizó para
formaldehído como fijador. Cada imagen es representativa de tres experimentos independientes. Aumento 63x.
Los gráficos fueron realizados usando el programa GraphPad Prism 5.
52
A B
Control WT Null US3 Null VP11/12
Dapi
Tau1
HSV-1
MergeContr
olW
T
Null
US3
Null
VP11
/12
Figura 15. Efecto de la infección de neuronas con HSV-1 wt, null US3 o null VP11/12 sobre TAU
desfosforilada en S202/T205: Las células HT22 fueron infectadas con los virus wild-type (WT), Null US3 o
Null VP11/12, durante 8 horas. Transcurrido el tiempo de infección las células fueron fijadas con
paraformaldehído, los núcleos teñidos con DAPI y se realizó una doble IFI con anticuerpo monoclonal TAU1 y
anticuerpo policlonal anti HSV-1, como marcador de infección; y detectadas con anticuerpos secundarios anti
IgG de ratón conjugado con Alexa 594 y anti IgG de conejo conjugado con Alexa 488 respectivamente. Se
visualizó mediante microscopía de inmunofluorescencia. B) Representación gráfica de la intensidad de
fluorescencia total de TAU1. Se consideraron 15 células individuales para cada experimento. Se utilizó para
formaldehído como fijador. Cada imagen es representativa de tres experimentos independientes. Aumento 63x.
Los gráficos fueron realizados usando el programa GraphPad Prism 5.
53
A B
Int.
de f
luo
rescen
cia
(U
A)
Contr
olW
T
Null
US3
Null
VpP
11/1
2
Control WT Null US3 Null VP11/12
Dapi
Tau5
HSV-1
Merge
Figura 16. Efecto de la infección de neuronas con HSV-1 wt, null US3 o null VP11/12 sobre TAU total:
A) Las células HT22 fueron infectadas con los virus wild-type (WT), Null US3 o Null VP11/12, durante 8
horas. Transcurrido el tiempo de infección las células fueron fijadas con paraformaldehído, los núcleos teñidos
con DAPI y se realizó una doble IFI con anticuerpo monoclonal TAU5 y anticuerpo policlonal anti HSV-1,
como marcador de infección; y detectadas con anticuerpos secundarios anti IgG de ratón conjugado con Alexa
594 y anti IgG de conejo conjugado con Alexa 488 respectivamente. Se visualizó mediante microscopía de
inmunofluorescencia. B) Representación gráfica de la intensidad de fluorescencia total de TAU5. Se
consideraron 15 células individuales para cada experimento. Se utilizó para formaldehído como fijador. Cada
imagen es representativa de tres experimentos independientes. Aumento 63x. Los gráficos fueron realizados
usando el programa GraphPad Prism 5.
54
Figure 17. Viabilidad de células HT22 infectadas con HSV-1 wt, HSV-1 null US3 o HSV-1 null VP11/12:
Cultivos de células HT22 fueron infectados con cada uno de los distintos virus por 8 horas y luego se realizó
una IFI. Las células fueron teñidas con anticuerpos específicos para ICP8 o virus total como marcador de
infección, DAPI como marcador de células vivas. Los resultados corresponden a 15 experimentos
independientes y fueron graficados usando el programa GraphPad Prism 5.
55
5. DISCUSIÓN
El objetivo del presente trabajo consistió en determinar si la expresión de las proteínas del HSV-1
US3 y VP11/12 en células neuronales, genera cambios en el estado de fosforilación de la proteína
TAU, esta hipótesis nace de los resultados obtenidos por nuestro laboratorio, que señalan que en
cultivos neuronales, HSV-1 gatilla la hiperfosforilación de TAU en, al menos, los residuos
S202/T205 y S396/S404 (Zambrano et. al., 2008). Además se ha descrito que las proteínas
virales US3 y VP11/12 tienen actividad quinasa y/o modulan vías de señalización celular
(Deruelle y Favoreel, 2011; Wagner y Smiley, 2011).
Como ya se mencionó, la primera parte de este trabajo de tesis, consistió en construir un vector
de expresión para US3 acoplada a la proteína fluorescente verde, pero, a pesar de que la correcta
construcción del vector resultante, la cual se confirmó por digestión con las enzimas de
restricción y por secuenciación, su transfección, utilizando distintos protocolos, no resultó en
expresión de la proteína de fusión, por lo tanto, se trabajó con el plásmido pEYFP-US3, que
expresa US3 acoplado a la proteína fluorescente amarilla (aporte del Dr. Zheng).
Durante el proceso de optimización de la transfección, el siguiente resultado que se observó fue
la distribución de US3 y VP11/12. US3 es una proteína multifuncional con presencia, tanto
nuclear como citoplasmática. Walters y colaboradores, el año 2010, demostraron que US3 es
capaz de fosforilar la histona desacetilasa 1 en ausencia de otras proteínas virales. En el
citoplasma, US3 participa, por ejemplo en el reordenamiento del citoesqueleto y procesos anti
apoptoticos (Deruelle y Favoreel, 2011). Este aspecto multifuncional con presencia en ambos
compartimientos, se condice con lo observado en este trabajo, ya que, la proteína de fusión
EGFP-US3 se observa de forma pan-celular, lo cual también fue evidenciado por Xing y
colaboradores el año 2011 en transfecciones de células de riñón. Por su parte, VP11/12-EGFP, se
56
observó claramente distribuida en el citoplasma con concentración perinuclear y puntiforme. Esta
localización subcelular ya ha sido descrita con anterioridad por Kato y col. (2000), quienes
observaron la distribución de esta proteína en células VERO infectadas con HSV-2 y
transfectadas con VP11/12. Willard y col. (2002) estudió la trayectoria de VP11/12 durante
infección, observando un complejo patrón de movimiento que podría involucrar a VP11/12 en la
entrega de componentes virales a sitios de procesamiento citoplasmático y/o remoción de
componentes desde la zona perinuclear.
Una vez establecido el tiempo óptimo de transfección para los plásmidos que expresan VP11/12-
EGFP y EYFP-US3, se analizó el efecto de la expresión de estas proteínas virales sobre TAU
hiperfosforilada (pTAU404).
Como observamos en las figura 8 y 11 la forma fosforilada de TAU S404 se encuentra
concentrada en el núcleo de las células control. Como se mencionó con anterioridad TAU es una
proteína comúnmente asociada a microtúbulos, pero Loomis y col. el año 1990 ya describían la
presencia de esta proteína en el núcleo de células de neuroblastoma humano. Experimentos
realizados en fibroblastoma humano por Rossi y col. señalan que la forma fosforilada de TAU es
predominante en el núcleo de estas células.
Luego de la transfección, tanto con VP11/12 como con US3, podemos observar como la
intensidad de fluorescencia relativa de TAU S404 disminuye significativamente (Figuras 8 y 11),
sin variación de los niveles de intensidad de TAU total (determinado con anticuerpo TAU5), por
lo que podemos inferir que esta disminución no corresponde a una relocalización de la proteína,
sino a una modificación post-traduccional, al menos la desfosforilación del residuo S404. Este
resultado coincide con lo señalado por Lu y col. (2013), quienes sugieren la presencia de distintas
57
isoformas de TAU entre núcleo y citoplasma y que estas pueden sufrir modificaciones de su
estado de fosforilación independientemente una de la otra.
El cambio observado se reprodujo en células transfectadas con las proteínas fluorescentes
individualmente, de modo que no se puede atribuir el efecto a VP11/12 o US3. Llama la atención
el que las proteínas fluorescentes generen un cambio en la fosforilación de TAU, y a pesar de que
este efecto en particular no está descrito, si se han reportado diversos efectos de la expresión de
GFP en distintas líneas celulares. Baens y col. (2006) reportaron que tanto EGFP como
proteínas fusionadas con EGFP inhiben la poliubiquitinación de algunas proteínas, modificación
que controla una amplia variedad de procesos celulares, como la activación de quinasas o la
degradación de proteínas por proteosomas. Recientemente Koike y col. (2013) sugirieron que la
expresión de EGFP así como su variante EYFP induce en la célula una condición de estrés que
genera, obviamente, una respuesta celular. Por otro lado Sultan y col. (2010), señalaron el efecto
protector de TAU frente a fuentes de estrés oxidativo o hipertérmico en neuronas embrionarias y
adultas de ratón, en que estas condiciones inducen la acumulación nuclear de TAU
desfosforilado. Estos antecedentes y los resultados obtenidos, sugieren que la disminución en la
intensidad de fluorescencia de las proteínas reporteras podría significar una respuesta celular ante
una situación de estrés, gatillada por la expresión de la proteína de fusión o las proteínas
fluorescentes por si solas. Por lo tanto, este experimento no permitió determinar si US3 o
VP11/12 están involucradas en la fosforilación o desfosforilación de TAU. Esto se podría
solucionar transfectando con las proteínas US3 y VP11/12 no acopladas a genes reporteros y
visualizándolas por anticuerpos específicos.
Por otro lado estos resultados corroboran que EGFP no es un marcador inocuo y su uso ha de ser
evaluado cuidadosamente a la hora de diseñar una investigación e interpretar los resultados.
58
De forma complementaria, se infectaron células HT22 tanto con el virus wild-type como con
los mutantes null UL46 o null US3. Estos ensayos mostraron como la ausencia de las proteínas
US3 o VP11/12 reducen la capacidad infecciosa del virus wild-type, efecto que se ve reflejado en
una mayor cantidad de células viables por campo, es decir, menor muerte celular; y en que las
células muestran un menor grado de avance en el proceso infeccioso, prácticamente todas las
células infectadas con el virus wild-type mostraron una completa retracción del citoplasma,
mientras que las células infectadas con los mutantes este efecto se vio retrasado, se visualizó
citoplasma e incluso proyecciones celulares. Sin embargo ya sea en infección con el virus wild-
type, null US3 o null UL46, se observaron los mismos patrones respecto a las especies de TAU
analizadas, esto es: no varió la intensidad de fluorescencia relativa del marcador TAU5, que
representa a TAU total, mientras que los marcadores pTAU404 y TAU1 muestran una
redistribución de TAU hacia una zona perinuclear y un significativo aumento en la intensidad de
fluorescencia. El año 2008, Zambrano y colaboradores ya habían reportado para cultivos de
neuronas corticales, que HSV-1 induce un incremento en la fosforilación de TAU en los residuos
S396 / S404.
Considerando que GSK-3b es una de las principales quinasas de TAU en el SNC, y que la sobre-
expresión de GSK-3b se relaciona con la hiperfosforilación y formación de agregados fibrilares
de TAU (Fuster-Matanzo et. al, 2012); que HSV-1 induce la sobre-activación de GSK-3b
(Wozniak et. al, 2009); y que GSK-3b muestra la mayor afinidad y fosforilación de los epitopes
S396 y S404 (Augustinack et. al, 2001); podríamos inferir que la sobre-activación de GSK-3b
por parte del virus generaría la hiperfosforilación del residuo S404.
Por otra parte, Bertrand y colaboradores el año 2010 sugirieron que la fosforilación de los
residuos S202 y T205 seria parte de un mecanismos regulador de la célula respecto a los niveles
59
de TAU fosforilado, es decir, este sitio se fosforilaría o desfosforilaría de manera contraria a la
forma predominante. Así, el aumento en la intensidad de fluorescencia relativa de TAU1
observado, podría ser la célula tratando de equilibrar las formas de TAU.
Analizando los datos obtenidos, y basado principalmente en los resultados obtenidos por las
infecciones con virus mutantes, se podría sugerir que las proteínas US3 y VP11/12 no participan,
al menos de forma directa, en la hiperfosforilación de TAU en el resido serina 404. Esto debido a
que la ausencia de estas proteínas en el virus no modifica la capacidad de éste de hiperfosforilar
TAU. Sin embargo, los problemas técnicos presentados por las proteínas fluorescentes no
permiten dar una respuesta más concreta, debido a que su expresión podría incluso estar
enmascarando un efecto más discreto de las proteínas virales.
5.1 CONCLUSIONES
Por lo anteriormente expuesto, los resultados del presente trabajo de tesis indicarían que la
hipótesis planteada es falsa. Los resultados sugieren que las proteínas de tegumento de HSV-1,
US3 y V11/12 no estarían implicadas, al menos, directamente en la fosforilación de la proteína
TAU en el residuo analizado, debido a que su expresión en células de la línea HT22 no muestran
un aumento de la forma fosforilada S404, sino más bien una disminución en respuesta a la
expresión de las proteínas de fusión; sumado a que la ausencia de cualquiera de ambas proteínas
en virus mutantes, no altera la capacidad del virus de inducir la fosforilación de TAU.
60
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cytoskeletal dynamic modification and neurodegeneration induced by infection with herpes
simplex virus type 1. J Alzheimers Dis, 14: 1–11.
68
7. ANEXO
Figura 18. Viabilidad de células HT22 transfectadas con plásmidos que expresan EGFP, EYFP-US3 o
VP11/12-EGFP: Cultivos de células HT22 fueron transfectados con pEGFP-N1 por 12 horas y luego se realizó
una IFI. Las células fueron teñidas con DAPI como marcador de células vivas. Los resultados corresponden a
5 experimentos independientes y fueron graficados usando el programa GraphPad Prism 5.
69
Control T. sin DNA T. pcDNA3.1 T. VP11/12
Dapi
pTau404
EGFP
Merge
Figura 19. Controles de transfección transitoria en células HT22: Células HT22 fueron transfectadas con
A) Control = control sin transfectar; T. sin DNA = reactivos de transfección sin DNA; T. pcDNA3.1 = vector
vacío; y T. VP 11/12 = plásmido pGUL46 (codifica para VP11/12 acoplada a EGFP) durante 12 horas.
Transcurrido el tiempo de transfección se realizó una IFI con anticuerpo anti-pTAU404 policlonal, detectadas
con Alexa 594. Se visualizó mediante microscopía de inmunofluorescencia. Se utilizó para formaldehído como
fijador. Cada imagen es representativa de tres experimentos independientes. Aumento 63x.
70
Figura 20. Efecto de la transfección transitoria de VP11/12-EGFP sobre TAU fosforilada en S404 en
citoplasma: Representación gráfica de la intensidad de fluorescencia citoplasmatica de pTAU404. Se
consideraron 15 células individuales para cada experimento (*p<0,05 comparado con el control sin transfectar).
Se utilizó para formaldehído como fijador. Cada imagen es representativa de tres experimentos independientes.
Aumento 63x. Los gráficos fueron realizados usando el programa GraphPad Prism 5.
Int.
de f
luo
rescen
cia
(U
A)
Contr
ol
VP11
/12-
EGFP
0
5.0 10 6
1.0 10 7
1.5 10 7
71
Figura 21. Efecto de la transfección transitoria de EYFP-US3 sobre TAU fosforilada en S404 en
citoplasma: Representación gráfica de la intensidad de fluorescencia citoplasmatica de pTAU404. Se
consideraron 15 células individuales para cada experimento (*p<0,05 comparado con el control sin transfectar).
Se utilizó para formaldehído como fijador. Cada imagen es representativa de tres experimentos independientes.
Aumento 63x. Los gráficos fueron realizados usando el programa GraphPad Prism 5.
Int.
de f
luo
rescen
cia
(U
A)
Contr
ol
EYFP-U
S3
0
5.0 10 6
1.0 10 7
1.5 10 7
