El poder de la masa exacta en la

Elucidación Estructural

Jaume C. Morales

Especialista de Producto

Agilent Technologies

Presentación:

Revisión del Hardware

Medida de Masa Exacta

• Sintonizado ó “Tuning”

• Calibración

• Iones referencia

Modos de Operación:

• MS

• Auto MS/MS

• Targeted MS/MS

“Molecular Formula Generation” por MS y MS/MS

“Molecular Structure Correlation”

Agilent QTOF 6550

Ion Beam

Compression and

Shaping

iFunnel technology

Hexapole collision cell

Agilent JetStream

Dual orthogonal

spray

Electronics +

4 GHz digitizer +

ADC detector

Invar flight tube

Sensibilidad

• Mejora espectacular de sus capacidades cuantitativas

• Nuevos flujos de trabajo Qual/Quan

• Alto nivel de detección de metabolitos y proteínas

• Barrido de compuestos No-dirigido (Non-targeted)

Extensiva mejora de prestaciones

• Resolución espectral >40,000

• 50 espectros /seg. MS and 33 espectros/seg. MS/MS

• Rango dinámico de linealidad de 5 ordenes

• Exactitud de masa de <1 ppm MS , <2 ppm MS/MS

• Inigualable sensibilidad

Adquisición de Ultra Alta velocidad Diseño propio de Agilent. Lider en electrónica de alta velocidad (GHz)

• Adquisición de alta resolución a través

del conversor de 4 GHz (8 bit)

adaptado de los Osciloscopios de alta

velocidad de Agilent

Picture of 4GHz board

Goes here

FPGAs

Dual Input Agilent

pre-amplifiers

4 GHz Agilent ADC

• Adquisición a 4 GHz para la

obtención de máxima

resolución y una exactitud de

masa <1ppm

• 5 Decadas in-Spectrum de

rango dinámico a través del

procesador de doble ganancia a

2GHz

6540/50

UHD Q-TOF

6530

Q-TOF

• El coeficiente de expansión de 1ppm/C para el tubo de vuelo

interno elimina virtualmente la deriva en la calibración debido

a la elongación nula del tubo

Mejora en la tecnología de Tubo de Vuelo y Reflectrón

Estable, Sensible, Alta resolución

DC Quad

Octopole 2

Ion Pulser

Ion Mirror

Detector

Turbo

Page 5

• Para el enfoque iónico se utiliza un

espejo iónico de 2º orden formado

por una rejilla de alta transmisión,

aumentando la sensibilidad

iFunnel Technology Captura x10 veces más Iones

Página 6

Hexabore Capillary

• Capilar con 6 entradas.

• Muestrea x10 más gas

rico en iones de la fuente.

• Captura la mayor parte del

gas de la región de la

fuente.

Agilent Jet Stream

• Confinamiento térmico

de la pluma de ESI.

• Muy eficiente

desolvatación para crear

iones en fase gaseosa.

• Crea una zona rica en

iones.

Dual Ion Funnel

• Elimina el gas, pero

captura los iones

• Elimina el ruido de

neutros

• Prolonga la vida útil de

la bomba turbo

4-26m

Nuevo: Agilent Jet Stream. Thermal Gradient Focusing Technology

Gas de

nebulización

Gas de

secado

Entrada LC

Sheath gas

calentado (hasta 400ºC)

Elevada mejora en Sensibilidad.

Mejora en la Nebulización.

Mejora en la Desolvatación.

Iones Focalizados en una zona

colimada por contención térmica y

muy rica en iones.

Mejora en la Eficiencia de la

Ionización y Muestreo.

Página 7

Agilent Jet Stream: La máxima Sensibilidad en

LC/MS

Sin calentar el “Sheath Gas”

Calentando el “Sheath Gas”

Página 8

La ganancias en muestreo de iones es

más dramática con la combinación de

las tecnologías de Agilent Jet

Stream y el ―Hexabore Capillary‖.

Hexabore Sampling Capillary: Capilar de Muestreo con 6

Conductos

* Capilar 18cm 9cm

Página 9

• El muestreo con un capilar de 6 conductos

aumenta la eficiencia de muestreo de iones

hasta x10 veces en comparación con un

capilar de un solo orificio.

• Longitud capilar reducida en un 50%*:

• minimiza la pérdida de iones de alta movilidad.

• aspira más gas rico iones.

Ion Funnel de 2 Etapas Desalineadas

1ª Etapa: 8-12 Torr 2ª Etapa: 1-3 Torr

• Elimina una elevada carga de gas

• Reduce neutros

• Mejora la robustez

• Transmite iones muy

eficientemente hacia óptica de Q1

2 etapas desalineadas -----: favorece la transmisión de sólo iones

Página

10

¿Cómo Funciona el Ion Funnel?

The RF Voltage

focuses the ions

to the center.

The DC Voltage

accelerates the

ions to the exit.

RF Drive

DC Drive

Unfocused

Ions and Gas

Enter

Focused

Ions Out

La tecnología iFunnel

del 6490 permite una

muy rápida

conmutación (30ms) de

polaridad + / -

Página

11

10-20m

Agilent Ion Beam Compression

Ion Beam Compression and Shaping (IBCS)

12

Ion path innovations to allow greater ion flux

High Sensitivity at

High Resolution

Ion Beam Compression

Beam Shaping

Automated dual mode beam shaper

La Tecnología Ion Beam Compression (IBC) potencia la Alta Resolución

Compresión de iones x10

Salida de la celda de colisión

Hacia el slicer y pulser

El haz comprimido permite una

baja dispersión y Alta Resolución

> 40K

La compresión y enfriamiento del haz de iones garantiza la mejor sensibilidad

en modo de Alta Resolución

Sintonizado y Calibración

• Autotunes disponibles para

– Modos Positivo, Negativo y Switching Pos/Neg

– Diferentes fuentes de ionización

– Quadrupolo

• El Tuning se require tan solo para

– Después de una avería

– Largos períodos entre tunes

• La Calibration para

– Calibrar el eje de masas del tubo de vuelo

– Necesario tan sólo semanalmente

– Puede realizarse diariamente y tarda 2 min.

• Mezcla de sintonizado :

– Mezcla de compuestos perfluorados de amplio rango de masas

– Altamente volatil para mantener un background o ruido de fondo bajo

– Masa menor 118.086255 – Masa mayor 2721.894829

– Las masas pueden verse tanto en Positivo como Negativo para calibrar en ambos modos.

Sintonizado y Calibración

La calibración se

acompaña de una

residual de 7 ordenes ,

lo que permite utilizar

tan solo dos masas

como referencia

Calibración del Eje de Masas

Iones Referncia

Los Iones de referencia pueden introducirse de diferentes

formas :

• Universal Internal Reference Mechanism (UIRM)

• Fuente Dual Spray (ESI y AJS)

• Presentes en cada espectro

• E.g. 922.0098 y 121.0509 en positivo.

• Se puede utilizar cualquier otro compuesto

QTOF – Modos de Operación

• MS Experiments.

– 2GHz o 4GHz.

– 1700 m/z, 3200 m/z or 10,000 m/z mass range

• Data Dependent (Auto) MS/MS Experiments

• Selección del Precursor basada en ―Decision Engine‖

• Listas de excluídos y Preferidos

• Preferencias por diferentes estados de carga

• Directed MS/MS

• Data Directed (Targeted) MS/MS experiments

• Importación de listas de target mass desde software MassHunter Qual, Mass Profiler o Mass Profiler Professional.

• Creación automática de segmentos de tiempo dynamic MS/MS

• Aplicaciones Qual/Quan con 50Hz MS y 33Hz MS/MS

Sensibilidad vs Modos de Adquisición

Análisis de Reserpina: 5pg inyectados

2GHz 4GHz

10Hz

5Hz

3Hz

1Hz

10Hz

5Hz

3Hz

1Hz

AutoMSMS - The Decision Engine (DE)

El Decision Engine (“DE”) toma decisión de qué precursor aislar y fragmentar

Para ello maneja las siguientes variables:

Número variable de Transients (disparos)

• TIC deseado (abundancia TIC en MS/MS)

• Usa el límite de abundancia en MS/MS

• Rechaza precursores que no alcanzen el TIC deseado

Pureza

Modelo Isotópico

AutoMSMS - Aislamiento en el Cuadrupolo

Modos Medium isolation (4 m/z) y Wide isolation (9 m/z)

– 400.0000 m/z, 1+, medium isolation: window centered at 401.7000 m/z, isolates approximately 399.7 to 403.7 m/z

– 400.0000 m/z, 2+, medium isolation: window centered at 401.4000 m/z, isolates approximately 399.4 to 403.4 m/z

– Charge states >3 treated like 3; charge state „unknown‟ (0) treated like 2

Narrrow (1.3 m/z) mode

– Isolation centered at requested m/z value

Values stored in .xml tune file

Center of window = monoisotopic m/z + (charge state * -0.3) + (window width / 2)

399 399.5 400 400.5 401 401.5 402 402.5 403 403.5 404

1+

399 399.5 400 400.5 401 401.5 402 402.5 403 403.5 404

2+

AutoMSMS - Flujo del Decision Engine

Centroid

spectrum

Eliminate peaks

below storage

threshold

Find isotope

groups by

applying isotope

model, determine

charge state

Rank by charge

state and/or

abundance

Profile

spectrum

Eliminate

candidates with

undesired charge

states and below

precursor

threshold

Calculate purity,

apply stringency,

rerank

Apply variable

number of

transients cutoff

Schedule

top N

Apply active

exclusion criteria

Match with

preferred list,

rerank

Limit to

directed list

typical

directed

preferred

AutoMSMS - TIC Target

Bajo TIC target

Mayor veloc adquisición

Alto TIC target

Mayor calidad espectros MS/MS

• Es un concepto de ancho de banda— se trata de conseguir un compromiso :

muchos espectros de baja calidad o pocos de alta calidad

•‗Sólo la calidad suficiente‘

•El valor óptimo difiere entre diferentes modelos

AutoMSMS - Decision Engine

Use MS/MS Accumulation Time Limit

Este es el máximo numero de transients

Desmarcado: el máximo numero de transients es el límite de DE (16383, ~1.5 seconds on a 6530)

AutoMSMS - Decision Engine

Reject Precursors That Cannot Reach Target TIC

•Calcula el númerode transients requeridos para el TIC target de la

abundancia del precursor.

•Si el numero de transients requerido supera el especificado en la pestaña

Spectral Parameters, se descarta el precursor por esperar un espectro de

baja calidad.

AutoMSMS - Decision Engine

Pureza y modelo Isotópico

Objetivo : evitar aislar multiples precursores menores que produzcan un espectro mezcla de todos.

Purity: Porcentaje mínimo aceptable del conjunto de precursores

Stringency: factor ponderado de los iones contaminantes

Purity re-ordena la lista de precursores (mayor pureza por encima de los iones más abundantes con

menor pureza)

600 601 602 603 604 Isolation window

DDA: On-the fly Determination of Precursor Purity

January 24, 2012

30% precursor

purity threshold

Intended precursor must be at least 30%

of precursor signal in the isolation window

600 601 602 603 604

Isolation window

Precursor

below purity

TH. MS/MS

will not be

done

Meets 30%

criteria –

mixed

MS/MS but

can ID

Dominant

precursor –

will give

good

MS/MS

26

DDA: On-the fly Recognition of Peptide Isotope

Patterns

January 24, 2012

Does the precursor look like a peptide?

+2

+3 +4

LKECCDKPLLEK

27

AutoMSMS - Energías de Colisión Multiples

Multiples CEs aplicadas a cada precursor antes del siguiente preursor

―Use fixed Collision Energies‖—10, 20, 40 V para librerías MS/MS

―Use Formula‖—crea multiples rampas de CE , specificando diferentes estados de carga

o ―All‖

Peptidos: Charge state ―all‖, slope 3.6, Offset -4.8

AutoMSMS - Multiple Collision Energies

3 CE fija (e.g., small molecule libraries)

Formula sugerida

para péptidos

Fragmentación más agresiva

para péptidos de carga 2+

AutoMSMS - Directed MS/MS

•Marcado : Directed MS/MS

• Realiza autoMS/MS, pero sólo si el precursosr está en la tabla

•Desmarcado: Preferred MS/MS

• Realiza autoMS/MS, si el precursor está en la tabla, se mueve a la primera posición de

precursores candidatos.

•Cancepto Alternativo—targeted MS/MS pero utilizando los criterios de selección AutoMS/MS

Use Prefered….

Targeted MSMS

Como lista de inclusión desde Mass Profiler . Mtra 1 vs Mtra 4. EL gráfico muestra los posibles compuestos o “features” que aumentan en Mtra.4

respecto a Mtra1.

Targeted MSMS

Los compuestos significativamente diferentes pueden ser exportados como una lista de in clusión. Esta lista se importa al QTOF y utilizarla en modo Traget

MS/MS.

Cálculo de la Masa exacta y el Error en la

Masa Medida

Error si se omite el e-

NH

N

O OO

O

OO

O O

O

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

H

HH

Reserpine (C33H40N2O9)

Atom Mass of Atom # of Atoms Sum

Hydrogen 1.00783 40 40.31300

Carbon 12.00000 33 396.00000

Nitrogen 14.00307 2 28.00615

Oxygen 15.99492 9 143.95424

Total 608.27338

Plus H 1.00783 1 1.00783

Total 609.28121

Minus e- 0.00055 1 0.00055

609.28066

Calculated = exact or theoretical

(609.28121 - 609.28066) x 1.000.000

609.28066

= 0.902 ppm

Ión = Reserpina + H+

Ión ≠ Reserpina + H

H+ = H – 1e-

La masa exacta convierte el ―mass defect‖ en un

parámetro importante

X Hydrogen H 1 1.0078 99.99 0.0078

D or 2H 2 2.0141 0.01 0.0141

X+1 Carbon 12C 12 12 98.91 0

13C 13 13.0034 1.1 1.1nC 0.0060nC2 0.0034

X+1 Nitrogen 14N 14 14.0031 99.6 0.003115N 15 15.0001 0.4 0.37nN 0.0001

X+2 Oxygen 16O 16 15.9949 99.76 -0.005117O 17 16.9991 0.04 0.04nO -0.000918O 18 17.9992 0.2 0.20nO -0.0008

X Fluorine F 19 18.9984 100 -0.0016

X+2 Silicon 28Si 28 27.9769 92.2 -0.023129Si 29 28.9765 4.7 5.1nSi -0.023530Si 30 29.9738 3.1 3.4nSi -0.0262

X Phosphorus P 31 30.9738 100 -0.0262

X+2 Sulfur 32S 32 31.9721 95.02 -0.027933S 33 32.9715 0.76 0.8nS -0.028534S 34 33.9679 4.22 4.4nS -0.0321

X+2 Chlorine 35Cl 35 34.9689 75.77 -0.031137Cl 37 36.9659 24.23 32.5nCl -0.0341

X+2 Bromine 79Br 79 78.9183 50.5 -0.081781Br 81 80.9163 49.5 98.0nBr -0.0837

X Iodine I 127 126.9045 100 -0.0955

X+1

Factor

X+2

Factor

Mass

DefectType Element Symbol Abundance

Integer

Mass

Exact

Mass

El Q-TOF 7200 revaloriza el ―mass defect‖

X Hydrogen H 1 1.0078 99.99 0.0078

D or 2H 2 2.0141 0.01 0.0141

X+1 Carbon 12C 12 12 98.91 0

13C 13 13.0034 1.1 1.1nC 0.0060nC2 0.0034

X+1 Nitrogen 14N 14 14.0031 99.6 0.003115N 15 15.0001 0.4 0.37nN 0.0001

X+2 Oxygen 16O 16 15.9949 99.76 -0.005117O 17 16.9991 0.04 0.04nO -0.000918O 18 17.9992 0.2 0.20nO -0.0008

X Fluorine F 19 18.9984 100 -0.0016

X+2 Silicon 28Si 28 27.9769 92.2 -0.023129Si 29 28.9765 4.7 5.1nSi -0.023530Si 30 29.9738 3.1 3.4nSi -0.0262

X Phosphorus P 31 30.9738 100 -0.0262

X+2 Sulfur 32S 32 31.9721 95.02 -0.027933S 33 32.9715 0.76 0.8nS -0.028534S 34 33.9679 4.22 4.4nS -0.0321

X+2 Chlorine 35Cl 35 34.9689 75.77 -0.031137Cl 37 36.9659 24.23 32.5nCl -0.0341

X+2 Bromine 79Br 79 78.9183 50.5 -0.081781Br 81 80.9163 49.5 98.0nBr -0.0837

X Iodine I 127 126.9045 100 -0.0955

X+1

Factor

X+2

Factor

Mass

DefectType Element Symbol Abundance

Integer

Mass

Exact

Mass

Para m/z 614,

¿que efecto tiene 1 ppm = 0.00061 a diferentes átomos?

One 16 O

- 8 ppm

One 35 Cl

- 51 ppm

One 1 H

+ 13 ppm

Varias fórmulas posibles con MSD SQ, TQ or IT Pero sólo unas pocas con QTOF

1

10

100

1000

10000

0.1 1 10 100 1000

# P

oss

ible

Ch

emic

al F

orm

ula

s

mass uncertainty, ppm

Possible Number of Chemical Formulas at m/z 272

Formulas made of:

C,H,N,O,F, & Cl

mass uncertainty

ppm amu # of Possible

Formulas 1000 0.3 7657

368 0.1 4050 100 0.03 1223

37 0.01 466 10 0.003 120

4 0.001 43 1 0.0003 11

0.4 0.0001 5 0.1 0.00003 2

Octafluoronaphthalene (CAS

313-72-4)

C10F8 = 271.98667

La masa exacta reduce el riesgo de confundir compuestos de masa similiar

TOF: Masa exacta en molécula pequeña

Reserpine (C33H40N2O9) has a protonated ion at 609.28066

Single quad reports mass to +/- 0.1 = 165 ppm

Number of possible formulas using only C, H, O & N:

• 165 ppm (quad) 209

• 10 ppm 13

• 5 ppm 7

• 3 ppm 4

• 2 ppm 2

Molecular Formula Generator

Select adduct,

elements and ion

electron state

Set maximum mass,

Minimum score,

Maximum mass

error, maximum

number of hits

Select Charge state

and isotope model

Scoring weighting,

Mass,

Isotope abundance,

Isotope spacing

Molecular Formula Generator

Monoisotopic mass

(varies in ppm)

Isotope spacing

(varies in ppm)

Isotope abundance

(varies in %)

Scoring based on Mass Match +

Abund. Match +

Spacing

Match =

Overall Score

Formula Generation using Accurate Mass MS data

Molecular Formula Generator

Formula Generation using Accurate Mass MS data

Similar accurate masses are discriminated

using isotope abundance and isotope

spacing scores

Molecular Formula Generator

Formula Generation using MS and MS-MS data provides fewer potential formulas and better discrimination

MS Spectrum

MS Score based on: - Mass main Isotope

- Isotope Pattern

- Mass M+1 and M+2

MS-MS Spectrum

MS/MS Score based on: - Being able to calculate molecular formulas for each

fragment and the corresponding neutral loss which add up

to the predicted formula for the precursor ion.

Accurate mass

information used:

- From precursor ion

- From isotopes M+1, M+2

- From each fragment ion

- From each neutral loss Accurate Mass

of Fragment ion

Accurate mass of Neutral Loss

Más allá del Molecular Formula Generation (MFG)…..

Molecular Structure Correlator (MSC)

• Encaje de los fragmentos obtenidos experimentalmente, en las estructuras propuestas via

un nuevo enfoque basado en trabajos publicados por Alastair Hill, et al, RCM 2005;

19:3111-3118 “A novel systematic bond breaking approach”.

• Cuantos menos enlaces sea necesario romper, mayor es la probabilidad de que un

fragmento propuesto se vea en el espectro MS/MS. Romper dobles enlaces o anillos

aromáticos tienen asignados mayor penalización que un enlace simple.

• MSC es mucho más rápido que otros productos en el mercado y permite la comparación

entre diferentes estructuras propuestas.

Correlate

Structure TOF

Generate

Formula

MS Q-TOF

MS/MS MS/MS

MassHunter Molecular Structure Correlator (MSC) Confirmación de estructuras propuestas y ayuda de verdaderos desconocidos

• Proporciona una mayor confianza en la confirmación de estructuras propuestas en

minutos en lugar de horas

• CASO 1: Asigna iones fragmento a sub-estructuras de una estructura padre

propuesta. (Metabolite ID, Metabolomics, Screening)

• CASO 2: Ayuda a la determinación de compuestos desconocidos reales via MSC

de todas las estructuras encontradas para una única formula molecular.

=> unico de MassHunter MSC

MassHunter MSC – CASO 1 Confirma estructura propuesta via MS/MS de masa exacta

Todos los fragmentos muestran scores muy altos (pocos enlaces rotos) aunque hay varios estructuras candidatas isoméricas posibles, e.g. 14 para 171.6961.

Muestra las estructuras individuales con sus penalizaciones para 197.0752

Score Total muy alto (97.1) debido a los altos scores individuales y su encaje o explicación de todos los iones fragmento más intensos

MSC calcula todas las formulas posibles para cada ion fragmento con el error en masa en mDa

Score MFG basado en masa exacta de cada fragmento MS/MS y las perdidas neutras del precursor

MSC calcula la formula molecular (MFG) basado en los iones precursor y fragmentos (unico!).

MassHunter MSC – CASO 2 Correlaciona un desconido total con un largo grupo de posibles estructuras

Click Search button para: 1) Conectar a ChemSpider 2) Cargar todas las estructuras para la fórmula C23H31NO2 3) Ejecutar MSC en todas las estructuras encontradas 4) Filtrar todos los compuestos con un score < 60.0 5) Mostrar los compuestos ordenados por overall score

Carga de un espectro MS/MS de masa exacta de un compuesto desconocido con M=353.2364 determinado por MFE.

Lista de fragmentos en el espectro de MS/MS del compuesto desconocido con precursor de masa M=353.2364

MassHunter MSC – Auto Web Search Correlaciona un desconido total con un largo grupo de posibles estructuras

¡RESULTADOS EN 40 SEGUNDOS ! 1) Conectar a ChemSpider 2) Cargar las 588 estructuras para C23H31NO2 3) Ejecutar MSC en las 588 estructuras 4) Filtrar los compuestos con score < 60.0 5) Mostrar los mejores 40 compuestos ordenados por overall score

Fragmentos representando el 94% de la intensidad total de todos los fragmentos, incluyendo los 10 fragmentos más intensos, could be explained by the MSC, resultando un overall score de 80.97

Carga de un espectro MS/MS de masa exacta de un compuesto desconocido con M=353.2364 determinado por MFE.

MassHunter MSC – Busqueda en PCD y PCDL

Correlaciona un desconido total con un largo grupo de posibles estructuras

Además de ChemSpider, el usuario puede utilizar tamién una base de datos (PCD) o librería (PCDL) de masa exacta como fuente de estructuras que encaje con la formula. Tambien soporta formatos SDF y MOL.

Molecular Structure Correlator Tool (MSC)

Correlación de espectros MS/MS de masa exacta con

estructuras propuestas Resumen

• MassHunter MSC puede utilizarse para:

− Confirmar estructuras para metabolitos esperados via asignación de subestructuras a fragmentos de masa exacta del espectro MS/MS.

− Ayuda en la elucidación estructural compuestos desconocidos reales, que no pueden encontrarse en una base de datos de masa exacta o librerías espectrales MS/MS.

• Basado en un enfoque de rotura de enlaces sistemático.

• UNICO: Calcula el overall correlation score de los scores individuales de cada fragmento y muestra las subestructuras candidatas sobre la estructura padre.

• UNICO: Calcula Formulas Moleculares a partir de la masa exacta del ion precursor, iones fragmento y pérdidas neutras del espectro MS/MS de un desconocido.

• UNICO: Puede buscar y cargar cientos de estructuras para una formula molecular desde la red (Chemspider) o PCD(L) y ejecuta las comparaciones MSC en pocos minutos.

RESUMEN

• El diseño instrumental proporciona medidas de masa exacta robustas y de confianza

• Los modos de adquisición se ajustan a Flujos de trabajo (workflows).

• Molecular Formula Generation trabaja tanto en niveles de datos MS como MS/MS para obtener una mayor confianza en la asignación de la fórmula molecular.

• Molecular Structure Correlation permite tanto la confirmación de una estructura propuestas como la confirmación sobre posibles estrucuturas a partir de una masa exacta no identificada via PCD(L) y búsquedas basadas en WEB.

Gracias