ELECTROFORESIS DE PROTEINAS EN GELES DE POLIACRILAMIDA

ngela Mara Guerrero Geraldin RamirezDaniel Santiago Chvez Goyes Cristian Hincapi Mara Jos Bolaos Hernndez

INFORME DE LABORATORIO DE BIOQUMICAPRESENTADO A: ARLEY CAMILO PATIO

UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIAFACULTAD DE CIENCIAS FARMACEUTICAS Y ALIMENTARIASQUMICA FARMACUTICAMEDELLN2015INTRODUCCINLos geles de poliacrilamida constituyen un excelente medio de soporte para separaciones electroforticas, dado que renen una serie de propiedades idneas: transparencia, elasticidad, porosidad controlable y compatibilidad con una gran variedad de compuestos qumicos. La poliacrilamida se forma por copolimerizacin de dos compuestos, la acrilamida y la bis-acrilamida (N,N'-metiln-bis-acrilamida), en una reaccin iniciada por la tetrametiletilndiamina (TEMED) y el persulfato de amonio. El radical persulfato activa al TEMED, el cual a su vez activa al monmero de acrilamida para que polimerice. Las cadenas de poliacrilamida son entrecruzadas al azar por la bisacrilamida, formndose as una red de porosidad bastante uniforme, que puede ser regulada variando las condiciones de la reaccin y las concentraciones de los monmeros. Entre las diversas tcnicas de electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE, por sus siglas en ingls "polyacrylamide gel electrophoresis"), probablemente la ms utilizada es la modalidad que se lleva a cabo en presencia del detergente duodecilsulfato de sodio (SDSPAGE), tanto para analizar mezclas de protenas, como para ser combinada con tcnicas de inmunoelectrotransferencia (Captulo 14). En la tnica de SDS-PAGE, se mezclan las protenas con el detergente aninico SDS para formar complejos desnaturalizados, cargados negativamente. La cantidad de SDS unido a las protenas es proporcional a su tamao: el SDS se une en una proporcin aproximada de 1,4 g SDS/g protena. Los complejos protena/SDS poseen una estructura elipsoide o de bastn, donde la cadena proteica es distendida y solubilizada por el detergente. Dado que la relacin final carga/masa queda constante para las distintas protenas (se anula su carga intrnseca), estas van a ser separadas en el gel poroso fundamentalmente con base en sus diferencias de peso molecular (PM): a menor tamao, mayor movilidad de la protena, y viceversa.

MARCO TEORICOLa electroforesis es una tcnica de separacin de molculas cargadas por migracin en un campo elctrico. Las molculas se separan en funcin de su carga elctrica, desplazndose al electrodo de carga contraria y a mayor velocidad cuanto mayor es la carga de la molcula. Cada molcula se desplaza en el campo elctrico alcanzando una velocidad constante. En el estado estacionario, la fuerza impulsora (fuerza del campo elctrico) se equilibra con la resistencia al avance (fuerza de friccin hidrodinmica) en el medio en que se desplaza. Se define la movilidad electrofortica como la velocidad de desplazamiento por unidad de campo elctrico. En unas condiciones determinadas de electroforesis, la diferente movilidad de cada molcula define su comportamiento y separacin en el espacio. Diferentes molculas tendrn diferente movilidad electrofortica en un medio determinado. Hay tres tipos de electroforesis: De frente mvil. Zonal. Continua.Se pueden utilizar diferentes medios de soporte para evitar perturbaciones mecnicas y los efectos de las corrientes de conveccin en la separacin. Como medios de soporte se pueden utilizar papel, acetato de celulosa, geles de almidn, geles de agarosa o geles de poliacrilamida. Los geles de poliacrilamida son el resultado de la polimerizacin qumica de una mezcla de acrilamida y bisacrilamida. Controlando la concentracin de ambas obtenemos geles de diferente grado de reticulacin (diferente dimetro de poro). Uno de los mtodos de electroforesis ms comnmente aplicado para protenas es el que emplea geles de poliacrilamida (PAGE = polyacrylamide gel electrophoresis) en presencia del detergente aninico dodecilsulfato sdico (SDS). Esta tcnica es conocida como SDS-PAGE. Para ello se prepara un gel en placa vertical. En la preparacin del gel, la polimerizacin de los monmeros de acrilamida produce cadenas lineales. Al incluir bisacrilamida, sta da lugar a puntos de ramificacin en el polmero, lo que permite formar una matriz tridimensional, dando lugar al gel de poliacrilamida. El tamao de los huecos o poros que forma la retcula del polmero depende de la concentracin de acrilamida y del grado de entrecruzamiento (es decir, de la proporcin de bisacrilamida con respecto al total). As, variando la concentracin de acrilamida y bisacrilamida en la preparacin del gel se consiguen distintos grados de porosidad y, por tanto, distintos intervalos de separacin de protenas. Tambin se aade un tampn (comnmente Tris-HCl). Adems, se aade un agente iniciador de la polimerizacn como el persulfato amnico, que al disolverse en agua genera radicales libres que transforman la acrilamida en radical libre y se inicia la polimerizacin. Tambin se aade al medio TEMED (N,N,N,N-tetrametil-etilenodiamina) como catalizador porque puede existir en forma de radical libre. Las muestras proteicas se tratan, previamente a su fraccionamiento, con SDS a 100 C. Como consecuencia de este tratamiento y de la presencia posterior de SDS durante toda la separacin (tanto en el tampn de electroforesis como en la composicin del gel), las protenas se mantienen desnaturalizadas. El SDS tiene la propiedad de unirse a las cadenas polipeptdicas en una proporcin masa:masa constante (1.4 g SDS/g de protena), de modo que en el complejo SDS-protena la carga de la protena queda enmascarada por la de las mltiples molculas de SDS y sta es proporcional al tamao (n de aminocidos). Esta electroforesis es discontinua pues utiliza dos geles: Un gel concentrador con bajo grado de reticulacin y pH 6,8 ( gel acumulador o stacking gel). Un gel separador con grado de reticulacin mayor con valores entre 6% y 15%, pudindose tambin utilizar gradientes de concentracin de acrilamida (gel separador). En la electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS, la separacin de protenas se hace en funcin de la masa molecular. Tanto es as que la representacin del logaritmo de la masa molecular frente a la distancia migrada obedece a una lnea recta para gran nmero de protenas. Para que esta dependencia sea correcta, es preciso romper los puentes disulfuro intra- e intercatenarios, para lo cual es frecuente aadir durante la preparacin de la muestra un agente reductor, generalmente 2- mercaptoetanol. De este modo, la masa molecular observada corresponde a la de cada subunidad de una protena, no a la protena completa, al existir una relacin lineal. Para aplicar la muestra al gel, se le suele aadir un agente que la haga ms densa, generalmente glicerina o sacarosa. Adems, para seguir el avance de la separacin, se aade un colorante, como azul de bromofenol, que sirve como referencia (tracking dye). ste tiene una movilidad mayor que la de cualquier macromolcula y, por tanto, si se aplica corriente hasta que el colorante est a poca distancia del extremo inferior del gel, se tiene la seguridad de que ninguna macromolcula se ha salido del gel por avance excesivo.

DATOS Y RESULTADOS

CONCLUSIONES

PREGUNTAS

CUAL ES LA INFLUECIA DE:1. EL PH DE APILAMIENTO SOBRE LA CALIDAD DE LAS BANDAS? El gel de apilamiento es un gel de poliacrilamida con tamao de poro grande (4%T). Este gel est preparado con untampndeTris/HClcon unpHde 6,8, dos unidades de pH menor que el tampn de electroforesis (Tris/glicina). Estas condiciones proporcionan un ambiente para las reacciones deKohlrauschque determinan laconductividad molar, y como resultado, las protenas recubiertas con SDS se concentran varias veces, resultando as en pocos minutos una zona de inicio del orden de 19m. Este gel se coloca sobre el gel de resolucin. La altura de la zona correspondiente al gel de apilamiento debe ser superior al doble de la altura y el volumen de la muestra que va a ser aplicada.

2. LA CONSENTRACION DE MONOMERO EN EL GEL DE SEPARACION SOBRE LA CAPACIDAD PARA DIFERENCIAR DOS PROTEINAS CON (pl) MUY PARECIDOS:

BIBLIOGRAFIA