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CINTHYA PAOLA FERNÁNDEZ DE LA PEÑA
Electroforesis capilar (EC)
Historia
Arne Tiselius años 30’s: estudio de proteínas séricas
Nobel en 1948
Método de separación basado en la relación carga-tamaño entre los diferentes analitos en la muestra
Campo eléctrico (dc)
Separación de…
Proteínas
Enzimas
Hormonas
Anticuerpos
Ácidos nucleicos
Técnica
Inyección de muestra en solución amortiguadora (tubo o medio de soporte poroso y plano- papel o gel semisólido)
Aplicación de alto voltaje a lo largo del bufferDos electrodos
Generación de un campoImpulsa a los iones cargados a
migrar hacia uno de los electrodos
¿QUÉ ES?
Electroforesis capilar
Separación de moléculas
Carga
Hidrofobicidad
Estereoespecificidad
Tamaño
Ventajas sobre otras técnicas
Facilidad de operación
Bajo costo
Poder de resolución alto
(Magaña, 2010)
Generalidades
Segunda mitad de los 80’s
Produce separaciones de alta velocidad y alta resolución con vol. De muestra de 0.1-10nl
Las especies separadas son eluídas desde un extremo Utilización de detectores cuantitativos (similar a HPLC)
MOVIMIENTO DE IONESVELOCIDADES DE MIGRACIÓN
ALTURA DE PLATOPRINCIPIOS ELÉCTRICOS
FLUJO ELECTROOSMÓTICO
Fundamentos de las separaciones
electroforéticas
Movimiento de iones
Velocidad de migración de un ión dentro de un campo eléctrico se da por:
ν=μeE
μe: Movilidad electroforética
μe: directamente proporcional a la carga iónica del analito e inversamente proporcional a la fricción
Velocidades de migración
ν de migración de un ión depende de la fuerza del campo eléctrico aplicado
Campo eléctrico proporcional a la magnitud del voltaje aplicado, inversamente proporcional a la longitud sobre la que se aplica
ν=μe*V/L
Altura de plato en EC
Las separaciones en EC se describen similares a la cromatografía
N=μeV/2DD: Coeficiente de difusión del soluto
Resolución aumenta c/mayor número de platos
A mayor voltaje, mayor resolución
Principios eléctricos
Capilar: gran longitud, área transversal pequeña= mucho mayor resistencia de la solución interior
Voltajes mucho más altos, enfriamiento efectivo del capilar
Principios eléctricos
Voltajes de 100-500V/cm
Fuentes de potencia de alto voltaje de 10-25kV
Mejoras en ν y mayor resolución
100,000-200,000 platos vs. 5000-20,000 en HPLC
3,000,000 en ECZ o 10,000,000 para separaciones de polinucleótidos EC en gel
Flujo electroosmótico
Doble capa eléctrica en interfase sílice-solución
pH por encima de 3 carga negativa en pared de sílice por ionización de gpos. Silanol
Flujo de perfil plano
Electroferograma: parecido a cromatograma pero con picos más cortos
PREPARACIÓNINYECCIÓN
Muestra
Preparación de muestra
Razones Concentración Control electrolítico Proteínas Interferentes Materia sólida
Muestras biológicas inyectables directamente Orina Plasma (SDS)
Introducción de la muestra
Inyección electrocinética
Extremo del capilar sobre la muestra
Aplicación de voltaje
Migración iónica y FEO
Volumen controlado por duración de la inyección
Introducción de la muestra
Inyección por presión
Extremo del capilar sobre la muestra momentáneamente
Vacío en el extremo del detector
Cambio de presión
O elevando el extremo que contiene la mezcla (hidrodinámica)
Introducción de la muestra
Puntas de microinyección : capilares estirados
Vol. De muestra en pL
Estudio de aa y neurotransmisores de una sola célula
COLUMNACONDICIONES GENERALES
DETECTORESLECTURA
Instrumentación
Columna
Capilar de sílice fundida recubierto de poliimida
10-100μm de diámetro interno y 30-100cm longitud
Lleno con solución amortiguadora
Conecta entre sí dos recipientes con la misma solución amortiguadora y los electrodos de platino
Condiciones generales
Voltaje de 5-30kV (dc) a los dos electrodos
La polaridad generalmente separa cationes, pero se puede invertir para separar aniones
Volumen de muestra en nL
Detectores
Para espectrometría Absorción Fluorescencia Lentes térmicas Raman Quimioluminiscencia Espectrometría de
masas
Para electroquímica Conductividad Potenciometría Amperometría
Detector de flourescencia
Incremento de sensibilidad y selectividad para analitos flourescentes
Rayos láser para enfocar radiación excitadora en el capilar
Bajos límites de detección: 10 zeptomoles o 6000 moléculas
Electroforesis DetecciónElectroforesis
(Magaña, 2010)
Lectura
Separación de fragmentos marcados con fluorescencia
Comparación con un marcador de peso molecular
Fragmentos identificados con diferentes colores
(Magaña, 2010)
ECZEN GEL
ISOTACOFORESISISOELECTROENFOQUE
ELECTROCROMATOGRAFÍA
Tipos de EC
Electroforesis capilar de zona (ECZ)
Método más simple Tamaño y carga (se puede modificar con pH)
Analitos pequeños, Aa y péptidos
Antiinflamatorios215nm1. Naproxeno2. Ibuprofeno3. Tolmetina
(Skoog, 2008)
ECZ-Proteínas
pH: 2.7λ=214nm
22kV10μA
(Skoog, 2008)
Electroforesis capilar en gel
Matriz polimérica + Buffer Efecto tamiz
Tipos de geles Poliacrilamida Agarosa Metilcelulosa Alcohol polivinílico Óxido de polietileno Dextrano Polidimetilacrilamida Polietilenglicol
Isotacoforesis capilar
iso=igualtaco=velocidad
Migración depende de velocidad de c/u hasta formar las bandas
Las más rápidas Cerca de tampón conductor
Las más lentas Atrás tampón terminal
Isoelectroenfoque capilar
Separación de especies anfóteras Aa y proteínas
(Zwitterion)Variación de pH
(gradiente)Cátodo: Base fuerte
(NaOH)Ánodo: ácido fuerte
(H2PO3)Migración hasta
alcanzar pI(Skoog, 2008)
(Skoog, 2008)
Electrocromatografía capilar
Híbrido EC y HPLC80’s columna rellena y capilar electrocinética
micelar
(Skoog, 2008)
•Separación de 16 hidrocarburos policíclicos
•Capilar: 33cm y 75μm
•Fase móvil: Acetonitrilo en borato de sodio 4mM
•Fase estacionaria: Partículas de sílice octadecilsililadas 3μm
MEDICINABIOLOGÍA MOLECULAR
FORENSEDOPAJE
ANÁLISIS DE FÁRMACOS
Aplicaciones
Clínicas
Dos áreas del diagnóstico genético Secuenciación Análisis de fragmentos para
detección cuantitativa de dosis génica
Análisis de enfermedades hereditarias Aumento en la longitud por
número de repetidos Variación de la secuencia
Estudio de enfermedades poligénicas Hemocromatosis hereditaria Fibrosis cística Distrofia muscular de Duchenne-
Becker(Magaña, 2010)
Gene scan
Cuantifica fragmentos de DNA
Determina su tamaño comparación con un marcador de peso (se corre simultáneamente)
Cada muestra marcada con un dye diferente, localizado en el primer
Hasta 3 muestras diferentes en la misma reacción, siendo el dye lo que nos permitirá diferenciarlas
(Magaña, 2010)
Forense
Identificación de individuos: Agresores sexuales Asesinos Restos humanos Desastres naturales Guerras Pruebas de paternidad Linajes reales Análisis antropológicos Migraciones
(Magaña, 2010)
Forense
EC-MS y ECZ
Detección de residuos orgánicos e inorgánicos (parcialmente quemados)
Trazas de pólvora por arma de fuego (no limitante de tiempo)
(Magaña, 2010)
Dopaje
Análisis de orina Testosterona Opiáceos Barbitúricos Benzodiazepinas Anfetaminas Morfina
(Magaña, 2010)
Análisis de fármacos
Amitriptilina
Doxepin
Clorpromacina
Psilocibina
Cocaína
Canabinoides
Isómeros de metanfetaminas
16 drogas básicas en 15min(Magaña, 2010)
Referencias
Lunte, M; Radzik, D. (1996) Pharmaceutical and Biomedical Applications of Capillary Electrophoresis. Pergamon. USA
Magaña, J.; Arenas, M.; Gómez, R. (2009) La electroforesis capilar como una nueva estrategia en la medicina y el diagnóstico clínico. Revista médica de Chile. 137:946-956
Skoog, D.; Holler, J.; Crouch, S. (2008) Principios de análisis instrumental. Sexta edición. Cengage Learning. México
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