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CIBIOGEM, 21 de Junio de 2018
Benito Pereyra-AlférezInstituto de Biotecnología FCB-UANL
El algodón representa alrededor del 40% de la fibranatural a nivel mundial y es cultivado comercialmenteen 78 países. Sin embargo, éste puede ser el blancode >1300 especies de insectos, entre los quedestacan más de 30 especies de lepidópteros,principalmente Helicoverpa zea, Heliothis sp.,Pectinophora gossypiella, y Earias sp. (Benedict yRing. 2004; Naranjo. 2011).
Control: Insecticidas químicos, como piretroides,
organoclorados y organofosforados.
Limitante: Inespecíficos, afectan, no solo a la fauna
silvestre sino también al ser humano.
Alternativa: Organismos enemigos naturales de las
plagas: entomopatógenos y entomófagos.
Proteínas Cyt 40
(Cyt1-Cyt3)
Tabaco Cry1Ab de B. thuringiensis
Genes cryGenes vip
Cu
ltiv
os B
t
J. Econ. Entomol. 2009. 102(6):2011-2025
Cultivos Biotecnológicos Bt registrados en USA
Algodón
Maíz
Cry1Ab
Cry1F
Cry3Bb1
Cry1Ab + Cry3Bb1
Cry34Ab1 + Cry35Ab1
Cry1F + Cry34Ab1 + Cry35Ab1
Cry3A Mod
Cry1Ab + Cry3A Mod
Cry1A.105 + Cry2Ab2
Cry1A.105 + Cry2Ab2 + Cry3Bb1
Vip3Aa20
Cry1Ab + Vip3Aa20
Cry1Ab + Vip3Aa20 + Cry3A
Cry1A.105 + Cry2Ab2 + Cry1F +
Cry3Bb1 + Cry34Ab1 + Cry35Ab1
1995
2001
2003
2003
2005
2005
2006
2007
2008
2008
2008
2009
2009
2009
L
L
C
L, C
C
L, C
C
L, C
L
L, C
L
L
L, C
L, C
Bollgard 3
Cry1Ac L
Cry1Ac + Cry2Ab2 (Bollgard II) L L
Cry1Ac + Cry1F L
Cry1Ab Mod + Vip3Aa19 L
Cry1Ac+ Cry2Ab2+Vip3A L
1995
2002
2004
2008
2015
En las zonas algodoneras del país como Mexicali, BC., LaLaguna, Sonoyta, Son., Delicias, Chih., y Tamaulipas, losinsectos P. gossypiella, H. zea, H. virescens y Spodopteraexigua son las principales plagas del algodón y afectangravemente su producción, causando cuantiosas pérdidasaño con año.
Pectinophora gossypiella
Helicoverpa zea
Spodoptera exigua
Proteínas receptoras de toxinas Cry identificadas en 3 órdenes de insectos
Orden Especie* Proteína receptora
Lepidoptera Ms, Hv, On, Ha, Bm, Pg
Ld
Bm
Ms, Bm, Hv, Ld, Px, Hz
Ms, Hv, Hz
Hv, Tni, Px
Cadherina
Glicoconjugado 270 kDa
P252
APN
ALP
ABCC2
Diptera Ag, Ae,
Ag, Ae, Aq
Ag, Ae, Aq
Aa
Cadherina
APN
ALP
Alfa-glucosidasa
Coleoptera Tm, Dv
Lde
Agr
Cadherina
ADAM 3 metaloproteasa
ALP* Ms, Manduca sexta; Hv, Heliothis virescens; On, Ostrinia nubilalis, Ha, Helicoverpa armígera; Bm,
Bombyx mori; Pg, Pectinophora gosypiella: Ld, Lymantria dispar; Px, Plutella xylostella; Hz,
Helicoverpa zea; Tni, Trichoplusia ni, Ag, Anopheles gambiae, Ag, Anopheles quadrimaculatus,
Anopheles albimanus (Aa), Aedes aegypti (Ae), Tenebrio molitor (Tm), Diabrotica virgifera (Dv),
Anthonomus grandis (Agr), Leptinotarsa decemlineata (Lde).
(Bravo et al., 2011)
• BT-R1 de M. sexta (Vadlamundi, 1993)
• BT-R175 de B. mori (Nagamatsu et al., 1998)• HevCaLP (Gaham et al., 2001)
• 40kDa y 30kDa en S. exigua (Qiu et al., 2015)
Cadherinas
• Receptores de Cry en M. sexta (Knight et al., 1994; Sangadala et al., 1994).
• Niveles bajos en BBMV de H. zea (Caccia, et al., 2012)
APN
•Receptores de Cry en H. virescens (Jurat-Fuentes y Adang, 2004) y M. sexta (Arenas et al., 2010)
•HaALP1 y HaALP2 en H. armigera (Wu et al., 2010)
•Niveles bajos en BBMV de H. virescens, H. armigera, S. frugiperda (Jurat-Fuentes et al., 2011) y M. sexta (Arenas et al., 2010).
ALP
Keller et al., 1996
Oppert et al., 1997
Li et al., 2004
Ferré & Van Rie, 2002
Heckel et al., 2007
Gahan et al., 2001, 2010
Ma et al., 2011
Gunning et al.,2005
Hernández-Martínez et al., 2010
Raham et al., 2004
Mecanismo de Resistencia a las Toxinas Cry
Línea AR que resiste 100
veces LC50 (Anilkumar et al., 2008)
Factores:
• Densidad poblacional
• Expresión variada
• Edad y estrés de la planta
(Greenplate et al., 1999; Adamczyck
et al., 2001; Jackson et al., 2004)
No-recesiva, acelerando el proceso
de evolución de la misma (Anilkumar
y Moar, 2006)
Resistencia cruzada a Cry1Ac
y Cry2Ab en H. zea (Lutrell et al., 1999; Burd et al., 2003
Medina (2014) obtuvo una línea
resistente a 20x LC50 (1.3
oEn nuestro país la Secretaría de Agricultura,Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación(SAGARPA) en asociación con la ComisiónIntersecretarial de Bioseguridad de OrganismosGenéticamente Modificados (CIBIOGEM)solicitaron revisar el estado de la entomofaunaasociada al algodón biotecnológico,especialmente Bollgard II® (CIBIOGEM. 2011).
El conocimiento de la fisiología, bioquímica y genética para el desarrollo de resistencia en insectos es esencial para designar estrategias efectivas para el manejo de plagas resistentes, la investigación en esta área tiene como objetivo aportar información sobre las características de unión implicadas principalmente, de acuerdo a estudios realizados, en el comportamiento de la resistencia hacia la toxina Cry1Ac de Bt sobre H. zea como insecto plaga de los algodoneros de México.
La presión constante de la δ-endotoxina Cry1Ac y
Cry2Ab en una población de H. zea podría generar en el
insecto una resistencia progresiva a dichas toxinas.
Objetivo General
• Obtener colonias de H. zea resistentes a la protoxina Cry1Ac e
incrementar el conocimiento sobre la resistencia de esta plaga a la
proteína Cry presente en los cultivos transgénicos de algodón de
nuestro país.
Objetivos Específicos
1. Analizar la susceptibilidad de H. zea presente en la zona algodonera
de México hacia la protoxina Cry1Ac de Bacillus thuringiensis HD-73.
2. Determinar la LC50 de la protoxina Cry1Ac en la población de H. zea
presente en el laboratorio de cría de insectos del Instituto de
Biotecnología, UANL.
3. Obtener colonias resistencia inducida en laboratorio hacia la protoxina
Cry1Ac en la población de H. zea.
4. Identificar la forma de herencia de la resistencia a Cry1Ac en H. zea.
5. Detectar el gen para cadherina, y aminopeptidasa N en las colonias
resistentes y susceptibles a Cy1Ac.
BIOSEG-2011-1
Demanda 1: Manejo de la resistencia asociada al cultivo de organismos
genéticamente modificados en México: el caso del algodón
Pectinophora gossypiella
Anthonomus grandis
Helicoverpa zea
270 km
La Laguna
Actividad 1: Evaluación de la frecuencia de alelos de
resistencia a las -endotoxina Cry1Ac de B. thuringiensis y
susceptibilidad a otras toxinas Cry en insectos del orden
lepidóptera en la zona de cultivo de algodón transgénico.
Mexicali, BC.
Sonoita, Son.
UANL
Expresión de Toxina Cry1Ac, Cry2Ab y resistencia a glifosato (CP4 EPSPS)
Mexicali, BC.
6 sembradíos con algodón Bt
1 con algodón NO Bt
Trampas para A. grandis
Sonoita, Son.
La LagunaSan Pedro de las
Colonias, Coah.
Cry 1Ac: B. thuringiensis cepa HD-73. Cepario propio
Cry2Ab: Cepa ECE-126 de E. coli (BGSC)
Línea susceptible de H. zea. Bellavista, San Pedro de las Colonias, Coah. Dr. Concepción
Rodríguez
Anti-cadherina. Dra. Alejandra Bravo (IBT/UNAM).
(BSA) Cry1Ac
M 0.25 mg -1.5 mg 0.28 0.3
Protoxina
Protoxina
BIOENSAYOS DE
SELECCIÓN
EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
PURIFICACIÓN DE VESÍCULAS
LÍNEA RESISTENTE
PCR punto finalRT-PCR
ELISAWestern-blot(Cadherina)
Actividad enzimática(ALP y APN)
Zimografía
Cría Intoxicación
Saúl Andrés Martínez Morales
♀♂
Fotoperíodo 14:1060% Humedad
25-28°C ~1 mes
Fecha LíneaSensibles
expuestasSobrevivientes Pupas Adultos
%
sobrevivencia
04/10/2013
Hz10-F1 360 101 62 (31♀ y 31♂)-20* 33 28.06
Hz20-F1 360 93 85 (35♀ y 50♂) 20 25.83
22/11/2013
Hz10-F2 192 58 ?? ?? 30.21
Hz10♂ x Wt♀-F1 264 77 ?? ?? 29.17
10-14/01/2014
Hz10♂ x Wt♀-F2 - 133 56 (22♀ y 34♂) 46 (19♀ y 28♂) -
Hz20-F2 - 135 110 (54♀ y 56♂) 94 (44♀ y 50♂) -
26/02/2014 Hz20-F3 240 119 ?? ?? 49.58
30/05/2014
Hz10-F1' 240 138 86 64(24♀ y 40♂) 57.50
Hz20-F1' 240 111 71 38 46.25
Hz50-F1 65 38 16 -
14/11/2014 Hz susceptible** - - 57 (28♀ y 29♂) 54 (27♀ y 27♂) -
01/12/2014 Hz20b-F1 936 654200 (110♀ y 90♂)-
20*135 (77♀ y 58♂) 69.87
24/01/2015
Hz20b-F2 672 117 44 (23♀ y 21♂) (16♀ y 18♂) 17.41
Hz20b♀ x Wt♂ 192 30 18 (8♀ y 10♂) 15 15.63
17/02/2015 Hz20b-F3 227 106 41 (23♀ y 28♂) - 46.70
11/05/2015 Hz20b-F4 480 93 - - 19.38
20 mg 10 mgLarvas Sobrevivencia Larvas Sobrevivencia
216 79 (36.6%) 216 127 (58.8%)
LC50= 1.309 mg / g
LC50 2.17 - 2.28 mg/mlAli et al (2006). J. Econ. Entomol. 99: 164-175
LC50 0.870 mg/g – 5.28 m/gSivasupramaniam et al. (2008) 101:546-554.
Pupas 45 Pupas 62
29 ♂ - 16 ♀ 42 ♂ - 20 ♀
F1 8 ♂ - 7 ♀ 11 ♂ - 6 ♀
Colonia
130 larvas ---- 67 Pupas 191 ------- 113 Pupas
44 ♂ - 23 ♀ 71 ♂ - 42 ♀
57 Adultos (23 ♂ - 34 ♀) 95 Adultos (35 ♂ - 60 ♀)
F2 TOTAL 91 131
Cruza de colonias
Determinación de sexos en H. zea del lado izquierdo se encuentra una hembra y del lado derecho un macho.
Hembra Macho
Los individuos de líneas resistentespresentaron un retraso de hasta 10días en estado larvario, y de 5 díashasta que emergiera el 1er adulto.
Si fuese dominante, hacia la F1 la gran mayoría serían individuos
resistentes homocigotos y heterocigotos (RR y RS).
Wt = SS; RS; RR x HzR = RS; RR
F1 = RS; RR
Si la resistencia a Cry1Ac estuvieran ligados al sexo. En uno de los casos la
resistencia se heredaría a través del cromosoma “Z”, y tanto machos (ZZ)
como hembras (ZW) resistentes producirían progenie resistente.
ZRZS x ZRW; ZSW
F1 = ZRZS; ZRW
ZSZS; ZRZS x ZRW
F1 = ZRZS; ZRW
Por otro lado, si se hereda por vía materna, toda la progenie de
hembras resistentes sería también resistente, mientras que la de los
machos resistentes sería susceptible, ergo, la transmisión de la
resistencia a la F1 estaría restringida a las hembras, ya que son
hemicigóticas en los cromosomas sexuales (Ma et al., 2005).
HR (ZW) x MS (ZZ)
F1 = HR (ZW); MR (ZZ)
HS (ZW) x MR (ZZ)
F1 = HS (ZW); MS (ZZ)
Las cruzas fueron realizadas con 10 machos y 10 hembras. La
F1, 240 larvas por cruza fueron sometidas a bioensayos utilizando
20 µg/ml de Cry1Ac y posteriormente se transfirieron a cría.
♂ Susceptible X ♀ Resistentes
♀ Susceptible X ♂ Resistente
♀ Resistente X ♂ Resistente
♀ Susceptible X ♂ Susceptible
Cruza de colonias
F2
La cruza de colonias fue realizada entre colonias resistentes de 20 μg/g (machos y hembras) y 10 μg/g (machos y hembras) con colonias susceptibles
Segunda cruza de colonias
La segunda cruza de colonias fue realizada entre colonias resistentes de 20 μg/g (machos y hembras) y 10 μg/g (machos y hembras) con colonias susceptibles
18 ♀ X 12 ♂ 20 ♀ x 10 ♂
F2 No Progenie(8-10 larvas)
20 mg/ml 10 mg/ml
370 larvas 98 121
Pupas 14 ♂ 5 ♀ 18 ♂ 7 ♀
Adultos 3 ♂ 3 ♀ 7♂ 5 ♀
Larvas 80 270
Pupas 12 ♂ 7 ♀ 24 ♂ 15 ♀
HzRF169.87%
(654)
100 H 80 M
9.4%
M:H
1:1
100%
(210)
88.9% Adultos
100% Adultos
HzR Control HzR
MS x HR Control MS x HR
Los individuos de líneas resistentespresentaron un retraso de hasta 10días en estado larvario, y de 5 díashasta que emergiera el 1er adulto.
Zimmografía
Actividad enzimática (Jurat-Fuentes., Adang. 2004)◦ ALP: pNPP 1.25mM, Buffer ALP (Tris .1M/.1NaCl/5mM MgCl2
pH 9.5, 1μg BBMV. Incubar x 5 min y leer Abs405nm
◦ APN: L-leucina-p-nitroanilina 0.8mM, PBS pH 7.5, 1 μg
BBMV. Incubar a 37°C x 5 min y leer Abs405nm
◦ 1U= cantidad de enzima que convierte 1 μM de sustrato a
producto x minuto.
ELISA y Western-blot(cadherina)
Saúl Andrés Martínez Morales
T Tni S R Stx Rtx T Se S R Stx Rtx
Muestras HzS y HzR20-F2’, Izquierda y HzSPC y HzR2-F1 Derecha. Con excepción de
tripsina, (0.5 µg), en cada ensayo se usaron 5 mg de proteína total. Se puede observar el
barrido en cada muestra además de las 2 bandas que anteriormente se observaron en la
línea HzS y HzR20-F2’. Incluso se puede observar una tercera banda en el carril 5 (HzSPC
intoxicadas)
APN ALP
5 min 20 min 50 min 5 min 20 min 50 min
Sus 133.848 1783.584 9218.88 120.62 1210.64 5535.2
SusTx 129.492 1774.08 9321.84 63.64 695.6 3441
Res 93.852 1300.464 7258.68 126.54 1311.28 5823.8
ResTx 78.012 1104.048 6280.56 52.54 600.88 2989.6
Primers:
Directo / Reverso (5’-3’)
CadLHz ATGGAGGAAACTGCGATGACCCTG
CTCTGGCACTTCGAAGTCCAGCAT
APN1 AATTCCAGCCTGGCCACGCTC
GCGCTCCATGACTTCCAAGAGA
APN2 CACATGTGGTTCGGTAACCTGG
CGAGAAGATGCTCAGTCATTCTG
ALP1* CGGGATCCATGGTGACACTGTTCCCGT
CCGCTCGAGTTATCGCAGTAAAATGGAAGTGA
*Ning, Gao (2010)
APN1 APN2
L P A L P A
Cadherina
Cadherina Apn2Apn1
cadL B-actin
HousekeepingCadherin-likeAminopeptidasa 1
RT-PCR a partir de muestras del intestino medio
apn1 cDNA
1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8
ProductoTotal de bases
alineadas (pb)
% de
alineamiento
% de
identidadCadherina (DNA-g) 425 92.5 89.9
Secuencias S 349 76.5 49Secuencias I 327 69 34.3Secuencias I
x S307 79.4 69.6
Apn1 (DNA-g) 559 81.4 80.6Secuencias S 179 72.3 42.7Secuencias I 89 72.3 44.4Secuencias I
x S78 74.3 66.7
Resumen de Bioensayos
Protoxina Sobrevivientes / Tratadas %Cry1Ac (mg)
10 720 / 1392 51.72 (F= 0.52)
20 412 / 1527 26.98 (F= 0.23)
50 142 / 956 14.85 (F= 0.025)
RR= 50% RR
50% RS
RS= 25% RR
50% RS
25% SS
SS= 50% RS
50% SS
RS RR= 100% RR
RS= 50% RR
50% RS
SS= 100% RS
RR
SS
RR= 100% RS
RS= 50% RS
50% SS
SS= 100% SS
Jakson et al. 2006. J. Econ. Entomol. 99:1790-1797
El (los) gen(es) de Resistencia está(n) presente(s) en la población silvestre
Resultados del cambio de protoxinas a las líneas resistentes.
• Evaluación del cambio en la aptitud biológica
1) Larva tratada (2
mm), sensible (15
mm).
2) Pupa línea
resistente (15 mm) y
línea sensible (19
mm).
3) Emergencia de un
adulto tratado.
4) Muerte por necrosis
de una larva tratada.
5) y 6) Fallo en el
proceso de
pupación.
7) Adulto con
malformaciones en las
alas
Conclusiones
1. No encontramos P. gossypiella ni H. zea, asociadas a algodón-Bt
en las localidades de Mexicali, BC., Sonoita, Son. y La Laguna
2. Todos los cultivares de algodón son genéticamente modificados,
al menos con la resistencia a herbicidas (RR: Glifosato)
3. La colonia original de H. zea, tuvo una LC50 1.309 µg/g de dieta
para Cry1Ac y 4.2 µg/ml para Cry2Ab
4. La colonia resistente a Cry1Ac generó una progenie of 2:1
machos:hembras a nivel pupa
5. La F2, cruza machos sensible X hembras resistentes generó
huevos no fértiles
6. La F2, cruza machos resistentes X hembras sensible generó
huevos fértiles, pero la progenie tuvo retraso en el desarrollo a
nivel larva y pupa
1. Nuestros resultados sugieren que, para Cry1Ac, la resistencia en H. zea es
parcialmente dominante
2. La resistencia podría estar asociada a un(os) gen(es) ligado(s) a las
hembras
3. Los esfuerzos para obtener colonias resistentes a concentraciones
superiores a 50 μg / g dieron resultados modestos
1. De un total de 1104 larvas tratadas por separado con 10 µg de las
protoxinas solubilizadas de Cry1Ac y Cry2Ab por ml de dieta, solo
un 12.13% y un 29.56% lograron sobrevivir hasta la fase de adulto
respectivamente.
2. La colonia de H. zea sensible demostró menor susceptibilidad para
la toxina Cry2Ab frente a Cry1Ac.
3. Aunque existe el costo en la aptitud biológica frente a la
adquisición de resistencia, este costo no fue suficiente para evitar
la sobrevivencia de las líneas resistentes.
4. La resistencia a la toxina Cry2Ab representa un menor costo en la
aptitud biológica en comparación con la resistencia a Cry1Ac.
5. La colonia sensible de H. zea no fue capaz de sobrevivir cuando las
dos toxinas se encuentran presentes en la dieta por lo que no hay
resistencia cruzada.
6. Una resistencia asimétrica se presentó al seleccionar la colonia con
Cry2Ab confiriéndole una ligera pero significativa resistencia frente
a la selección con Cry1Ac.
7. El algodón Bollgard II® logra evitar de manera efectiva el desarrollo
de resistencia gracias al apilamiento de genes.
1. El perfil de proteasas demostró ser un método directo para
determinar poblaciones potencialmente resistentes.
2. Helicoverpa zea expresa al menos 2 tipos diferentes de
cadherinas: una de 40 kDa y otra de ~28 kDa, pero no se
puede afirmar que estén implicadas en la resistencia a
Cry1Ac.
3. El ensayo de APN es mejor que el de ALP para determinar
una potencial resistencia.
4. La resistencia a Cry1Ac en Helicoverpa zea se asocia a un
alto costo de aptitud biológica, pero no lo suficiente como
para evitar que sobreviva y transmita los genes resistentes.
5. Todos estos resultados apuntan a que la resistencia a
Cry1Ac en Helicoverpa zea es de carácter poligénico.
EstudiantesJesús O. Medina López
Saúl A. Martínez
Miguel A. Muro Campillo
MonsantoDr. Juan Manuel De la Fuente
Ing. Ari Mateos (Mexicali - Sonoita)
Ing. Alejandro Esparza (La Laguna)
Ing. Víctor Martínez (La Laguna)
Correo electrónico: [email protected]
GRACIAS
Benito Pereyra-AlférezInstituto de Biotecnología FCB-UANL
