Embed Size (px)
Citation preview
1
En una columna cromatografica
Para tener mas platos teoricos
conviene usar particulas mas finas
2
Ecuación de van Deemter
caminos
múltiples
MEJORA CON
PARTICULAS
FINAS.
difusión
longitudinal
tiempo de equilibracion
entre fases MEJORA
CON PARTICULAS
FINAS.
altura plato
teórico
Se usa silica mas fina, y por lo
tanto se precisa mas presión ...
y se sigue por este camino ...
3
... hasta tener una HPLC
Equipos de HPLC
4
HPLC
Las columnas estan empaquetadas con una fase
estacionaria muy fina que obliga a usar altas
presiones.
Por lo tanto hay que usar una bomba capaz de dar esas
altas presiones, y mangueras (tubing) que las pueda
soportar.
Las fase movil es un líquido.
La resolución y el diámetro de las
partículas de la fase estacionaria.
silica 10 micrones silica 5 micrones
5
HPLC es un conjunto de cromatografías,
según las columnas que se usen.
Partes comunes
Válvula de inyección.
Bomba.
Detector
Mezcladores de solvente.
Partes diferenciadas
Columnas de distinto tipo.
Otros accesorios.
6
Válvula de inyección
Poder cargar a
baja presion y
eluir la muestra
a alta presión.
Alta repetibilidad
en cantidad de
muestra inyectada.
Bomba
Generar muy alta
presion (6000 psi
~ 400 Atm).
No tener
pulsaciones.
Poder regular el
caudal y/o la
presión.
Resistir la
corrosión de los
solventes y las
muestras.
7
Detectores
El mas usado:
Detector de absorbancia
Espectros a lo largo de la elusión,
tomados con espectrofotómetro de
matriz de diodos.
La celda tiene muy
pequeño volumen
y paso óptico
normal.
8
Detector de fluorescencia:
muy selectivo y sensitivo
Para los compuestos de alta fluorescencia, el límite de
detección es unas 100 veces menor que los de absorbancia.
El más universal:
Detector de indice de refracción
9
Detectores
electroquímicos
Comparación de detectores
10
¿ Qué columna usar ?
¿ Qué columna usar ?
11
Solventes
Los solventes para HPLC deben ser MUY puros.
“Calidad HPLC” es una de las calidades mas altas.
Las impurezas de un solvente malo producen:
- señal de fondo en el detector
- arruinan las columnas, en especial por partículas
Aun con estas precauciones, se usa una
“precolumna” cortita del mismo tipo que la
columna a usar, pero mas barata.
Solventes - poder de elusiónSerie eluotrópica en cromatografia en fase directa de alúmina o sílica
12
Fase reversa
El pH no debe ser mayor a 7.5 o se destruye la columna !
Fuerza eluotrópica en fase reversa
Smezcla = VaSa + VbSb + ...
13
Gradientes de solventes
Si se tienen 2 bombas, se pueden mezclar 2 o más
solventes en la proporcion que uno quiera.
De esta forma, se comienza con un solvente que eluye
poco, y las substancias mas afines por el solvente salen
rápido.
Las substancias mas afines por la fase estacionaria
se van sacando aumentando la fuerza de elución de
la mezcla con un gradiente.
Aminoacidos derivatizados con o-ftalaldehido
en columna de fase reversa C18
14
Columnas de exclusión molecular
Partículas nanoporosas de sílica o polímeros que
atrapan a las moleculas pequeñas, y las grandes no
entran. En un rango intermedio, las moléculas
pasan tiempos estadisticamente diferentes dentro
de la fase sólida.
Columnas de exclusión molecular
La sílica es mas rígida, soporta mayor presión y T.
Los polimeros pueden sintetizarse de diversas propiedades y
tamaño de poro en 5 órdenes de magnitud
15
Cromatografía de intercambio iónico
Los cationes o aniones presentan diferente afinidad por el
relleno de la columna, permitiendo la cromatografía.
Resinas de intercambio iónico
16
Detectores para cromatografia ionica
CONDUCTIVIDAD CONDUCTANCIA
ELECTRICA
ANIONES Y CATIONES DE
ACIDOS O BASES
MODERADAMENTE
FUERTES (pKa O pKb < 7)
AMPEROMETRIA OXIDAXION/REDUCCION EN
UN ELECTRODO INERTE
ANIONES Y CATIONES
OXIDABLES O REDUCIBLES
UV/VIS ABSORCION DE LUZ ANIONES Y CATIONES QUE
ABSORBEN.
METALES PESADOS
DESPUES DE REACCION CON
COMPLEJANTES QUE DAN
COLOR.
SILICATOS Y FOSFATOS
MEDIANTE REACCION CON
MOLIBDATO.
ALCALINOTERREOS CON
ARSENAZO I
FLUORESCENCIA EMISION MOLECULAR NH4+, AMINOACIDOS,
POLIAMINAS CON
REACCION CON
orto FTALALDEHIDO
Selectividad a diversos iones
17
Cromatografía iónica
mScolumna de
intercambio
aniónico
Columnas supresoras.
columna de
intercambio
aniónico
columna
supresora
(catiónica)mS
mS
sin supresion
con supresion
18
Solventes de elusión
Aplicaciones de la cromatografía iónica
Iones inorgánicos, con columna
supresora y detector conductimétrico alfa-aminoácidos naturales
19
Otros tipos de cromatografías
- de afinidad.
- de exclusión iónica
- de gases (muy usada, la vemos en la próxima clase)
El mejor detector de todos:
el espectrometro de masas.
Los espectrómetros de masa permiten determinar la masa
exacta de moléculas únicas, por lo tanto su identidad química.
Precisan un alto vacío para que las moléculas puedan volar
libremente sin chocar, ya que en eso se basa la separación por
masa molecular.
¿ como conectar un HPLC, cuya salida es un
líquido a T y P ambientes con un sistema de
ultra-alto vacío ?
20
Electrospray
Electrospray
