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Enero 2008 - Diciembre 2008
Clave del Proyecto: 20082402
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas ESCUELA
Análisis de la resistencia a antibióticos en cepas de Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus spp. y Streptococcus pyogenes de origen clínico.
PROYECTO
Técnicas de inmunología y biología molecular aplicadas al estudio de enfermedades infecciosas PROGRAMA
RESPONSABILIDAD TÉCNICA Y ADMINISTRATIVA: Dr. Gerardo Aparicio Ozores
Fecha de elaboración del informe: Viernes, 30 de Enero del 2009
RESUMEN
Introducción: Pseudomonas aeruginosa es un importante patógeno intrahospitalario así como también el principal agente etiológico de infecciones crónicas en vías respiratorias en pacientes con fibrosis quística (FQ). Al problema de la alta incidencia y severidad de las infecciones, se ha sumado, el incremento de la resistencia de este microorganismo a los tratamientos antimicrobianos convencionales. La resistencia en P. aeruginosa es un fenómeno multifactorial reconociéndose 3 mecanismos principales: inactivación del antibiótico, modificaciones en el sitio blanco, así como cambios en la permeabilidad de la membrana por la acción de componentes estructurales o por la activación de sistemas de expulsión (SE). Los SE pueden expulsar un gran número de compuestos como antibióticos, colorantes, detergentes, inhibidores de la biosíntesis de ácidos grasos, solventes orgánicos, homoserin‐lactonas asociadas en la señalización célula‐célula y posiblemente factores de virulencia.
El estreptococo del grupo A (GAS) es un patógeno que aunque coloniza comúnmente la garganta y la piel, es responsable de un gran número de infecciones. Desde mediados de la década de 1980, se ha descrito un incremento en las tasas de mortalidad por estas infecciones, involucrándose diferentes factores de virulencia y patogenicidad. La proteína M representa el principal antígeno de virulencia y ciertos serotipos se han asociado a algunas enfermedades. Aunque es probable que influyan factores del hospedador, se desconoce cual o cuales son, específicamente; las características de virulencia que proveen la capacidad a GAS de amplificar su potencial y provocar, ya sea una leve faringoamigdalitis o una gravísima sepsis, la cual puede conducir hasta la muerte.
Los estafilococos coagulasa negativos (ECN); son parte de la biota normal del humano, sin embargo también han sido aislados como agentes causantes de infecciones intrahospitalarias, esto se debe a la capacidad de resistencia a los antibióticos con los cuales son tratadas las infecciones que producen, es por ello que actualmente son considerados como patógenos. Los macrólidos, las lincosamidas y la estreptogramina B (MLSB) son antibióticos generalmente usados en el tratamiento de infecciones por ECN. La resistencia a macrólidos se puede deber a cualquiera de tres mecanismos: una modificación del sitio blanco, activación de bombas de eflujo o por inactivación enzimática de los antibióticos. Los genes erythomicin ribosome methilation (erm): erm(A), erm(B) y erm(C) son los responsables de la modificación del sitio blanco al codificar para la enzima adenina ‐N‐metiltransferasa, que realiza la metilación postranscripcional del rRNA 23S. Esta modificación está asociada con la resistencia MLSB, causando una disminución en la unión de los antibióticos a sus sitios blancos en el ribosoma. Esta resistencia puede ser de dos tipos: constitutiva (cMLS) con alto nivel de resistencia cruzada a todos los MLSB, o inducible (iMLS) con resistencia a los macrólidos de 14 y 15 átomos (Ej., eritromicina) y susceptible a macrólidos de 16 átomos.
Objetivos, en cepas de P. aeruginosa aisladas de pacientes con infecciones respiratorias crónicas que sufren FQ y de pacientes con infecciones nosocomiales (IN): 1.Determinar la susceptibilidad a los
antibióticos de uso. 2.Detectar fenotípicamente β‐lactamasas de espectro extendido (BLEE) y metalo‐
β‐lactamasas (MBL). 3. Detectar fenotípicamente los sistemas de eflujo. 4. Amplificar y analizar por medio de herramientas bioinformáticas las secuencias de los genes involucrados en la regulación de los sistemas de expulsión: mexR, nalC, nalD, nfxB, mexS, mexT y mexZ. 5. Evaluar la expresión de los genes pertenecientes a los sistemas de expulsión mexA, mexC, mexE y mexX. El propósito de este estudio fue caracterizar fenotípica y genotípicamente cepas de GAS aisladas de pacientes con alguna enfermedad infecciosa y buscar la correlación entre estas características asociadas a la virulencia y el grado de invasividad mostrado en cultivos celulares (línea A549). Realizar el análisis
molecular de los genes erm que están presentes en cepas de S. epidermidis y de S. haemolyticus que fueron aisladas en el Hospital General de Acapulco.
Material y métodos: Se estudiaron cepas de P. aeruginosa aisladas de lavados bronquioalveolares de pacientes con FQ y de pacientes con infección intrahospitalaria de dos hospitales de tercer nivel; cepas de S. pyogenes y Staphylococcus coagulasa negativa . Se determinó la concentración inhibitoria mínima
(CIM) a 22 antibióticos de las familias de β‐lactámicos, fluoroquinolonas y aminoglucósidos utilizando el método de microdilución en caldo sugerido por el Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio.
Mediante métodos fenotípicos se detectó la producción de BLEE utilizando pruebas E que contenían ceftazidima/ceftazidima ácido clavulánico y cefotaxima/ácido clavulánico y de MBL con el método de sinergismo de doble disco usando discos de ceftazidima, imipenem y diferentes agentes quelantes. La detección fenotípica de los SE se realizó utilizando antibióticos reporteros (carbenicilina, eritromicina,
norfloxacina y gentamicina) y el inhibidor fenil‐arginina‐β‐naftilamida (FAβN). Se diseñaron iniciadores para los genes reguladores de los SE de importancia clínica: mexR, nalC, nalD (mexAB‐oprM), nfxB (mexCD‐oprJ), mexT (mexEF‐oprN) y mexZ (mexXY) y de metalobetalactamasa del tipo VIM. Se obtuvieron las secuencias de estos genes y se analizaron con herramientas bioinformáticas. Seis cepas de ECN, fueron proporcionadas por la Dra. Natividad Castro Alarcón de un lote de más de 100 cepas que fueron colectadas de noviembre del 2000 a septiembre del 2004. Estudios previos por la Dra. Castro, demostraron que únicamente 3 cepas de S. epidermidis y 2 de S. haemolyticus presentaron resistencia inducible y se usó de testigo 1 cepa de S. haemolyticus que presentó resistencia constitutiva a la clindamicina. Se llevó a cabo la confirmación fenotípica, por el método de difusión en doble disco o prueba D. Una vez que se confirmó el carácter inducible, se extrajo el DNA, posteriormente se diseñaron iniciadores específicos con ayuda de los programas “Primer Premier 3.0”. y DNA‐MAN”, para la amplificación por PCR de la región del promotor y de los genes completos erm. Después se obtuvieron las regiones de interés por PCR, se hizo la purificación de las muestras con el kit DNA Clean & Concentrator ‐5 TM de la casa comercial Zymo Research, siguiendo las instrucciones del fabricante. Finalmente las muestras obtenidas fueron procesadas en el Instituto de Fisiología Celular de la UNAM, para la obtención de las secuencias nucleotidicas. La interpretación de los electroferogramas se hizo por medio del programa BioEdit.
Resultados. Las cepas estudiadas mostraron multirresistencia, ninguna de ellas expresó BLEE y en una de
las cepas se observó la producción de MBL. Todas las cepas en presencia de FAβN disminuyeron la CIM a uno de los antibióticos reporteros. De las cepas estudiadas, 10 disminuyeron la CIM a carbenicilina (antibiótico seleccionado para la detección de MexAB‐OprM), en presencia del inhibidor. Para MexCD‐OprJ se utlizó eritromicina cuya CIM disminuyó en 18 de las cepas al igual que la CIM a norfloxacina que fue usada para la detección de MexEF‐OprJ. La actividad de MexXY fue revelada utilizando como sustrato gentamicina, la CIM para este aminoglucósido disminuyó en 9 cepas. El análisis de las secuencias reveló los siguientes cambios: gen mexR V126→E, gen nalC G71→E, A145→V, S209→R y D79→E y nfxB H21→R y G56→D. El impacto de estos cambios sobre la expresión de los SE será evaluado. Los resultados obtenidos muestran la predominancia de la proteína M tipo emm 1, seguido de emm 22, tanto para los aislamientos de origen invasor como para los faríngeos. Se demostró que el gen que codifica para la SPE B se presenta con mayor frecuencia (71%). En el caso de S. pyogenes las pruebas de susceptibilidad, mostraron 100% de sensibilidad a la penicilina y a la clindamicina y se encontraron 7 cepas (9.2%) resistentes a la eritromicina, todas ellas evidenciaron ser fenotipo M y poseer el gen mef. Se obtuvieron 24 patrones electroforéticos diferentes, 13 de ellos estuvieron presentes en las cepas de origen invasor, mientras que 15 en las de origen faríngeo analizadas. El porcentaje de adherencia a las células A549 fue
mayor en las cepas de origen invasor comparado con las de faringe. Se llevó a cabo la caracterización fenotípica de 6 cepas con el método de doble disco o prueba D, para determinar el fenotipo de resistencia inducible para clindamicina. De las cuales 5 cepas resultaron con resistencia inducible a clindamicina y una cepa de S. haemolyticus presentó una resistencia constitutiva. Las cepas con fenotipo de iMLS, fueron utilizadas para la extracción de DNA. Mediante PCR se obtuvieron la amplificación de los genes erm, así mismo las secuencias que regulan su expresión. Posteriormente se enviaron los productos de PCR, cuyo tamaño era el esperado, al Instituto de Fisiología Celular (UNAM), para la obtención de las secuencias nucleotidicas. Una vez que se obtuvieron los resultados de la secuenciación se realizó BLAST para corroborar que realmente las secuencias obtenidas pertenecían a metilasas, contra la base de datos Swiss Prot. Posteriormente se hicieron alineamientos múltiples de las secuencias con el programa Bio Edit y el análisis determinó que el gen erm(A); se encontró en las 2 cepas de S. haemolyticus y no se encontró ninguna mutación en sitios promotores, en el péptido control ni en el gen. El gen erm(B) no se localizó en ninguna de las cepas incluidas en este estudio. El gen erm(C) se localizó en las 3 cepas de S. epidermidis y no se detectó ninguna mutación en sitios promotores ni en el péptido control, sin embargo se localizó una mutación puntual en la secuencia del gen, que corresponde a la posición G2613C. Es importante mencionar que no se encontró combinaciones de los genes erm(A), erm(B) y erm(C) en ninguna de las cepas, incluidas en el presente estudio.
INTRODUCCIÓN:
P. aeruginosa es un patógeno oportunista, agente causal de infecciones nosocomiales, las cuales tienen
impacto directo sobre la mortalidad de pacientes hospitalizados, así mismo participa en las infecciones
crónicas de vías respiratorias que comúnmente presentan los pacientes que sufren FQ, siendo
responsable de la mortalidad del 90% de éstos.
El mecanismo de patogenicidad de este microorganismo es multifactorial y se ha observado que el
fracaso de las terapias antimicrobianas es debido a la gran cantidad de mecanismos de resistencia que
posee entre los cuales se destaca la participación de sistemas de expulsión. Los sistemas de expulsión
están codificados en operones cuya sobreexpresión se ha relacionado con la presencia de mutaciones
en sus regiones reguladoras. Hasta ahora se sabe que una de las causas de la multirresistencia que
presenta este patógeno se debe a la baja permeabilidad de la membrana externa, por la presencia de
sistemas de eflujo de la familia Resistencia Nodulación División (RND), y uno de los sistemas
involucrados es MexXY el cual le confiere resistencia a los aminoglucósidos, este operón se encuentra
regulado por el gen mexZ responsable de la expresión y/o sobreexpresión del operón, resultando de
nuestro interés conocer el impacto de cambios en la secuencia nucleotídica de mexZ en el fenómeno de
multirresistencia de cepas aisladas de pacientes mexicanos con infecciones nosocomiales y de pacientes
con FQ.
Debido a lo anterior surge la necesidad de conocer el comportamiento de cepas multirresistentes
aisladas de pacientes, analizando las secuencias reguladoras y expresión de los genes que conforman a
estos sistemas de expulsión, con la finalidad de entender su papel en el fenómeno de resistencia a los
diferentes grupos de antibióticos que distingue a P. aeruginosa. Por lo que es de nuestro interés conocer
si existen mutaciones en los genes reguladores de los operones que codifican para una bomba de
expulsión, la cual le puede conferir a este microorganismo la resistencia a diferentes antibióticos.
La diseminación de genes de resistencia a los antibióticos entre las bacterias, incluida P. aeruginosa, es
un problema de salud pública muy serio. Los genes de resistencia están localizados en el cromosoma
bacteriano o en elementos móviles como son los fagos, los plásmidos y los transposones, los cuales
están involucrados en la transferencia horizontal de material genético entre diferentes especies
bacterianas. En décadas recientes se ha descrito un sistema de captura de información genética que
integra casetes de resistencia, por lo cual recibe el nombre de integrón. Esta unidad genética no es
móvil por si misma y puede estar localizada en el cromosoma bacteriano, en plásmidos o en
transposones por lo que su movilidad está asociada a plásmidos conjugativos que presentan un
intervalo amplio de hospederos y a transposones que pueden transferirse entre las bacterias. Los
integrones median la integración de los casetes de resistencia por un mecanismo de recombinación sitio
específica, además de presentar una estructura general, aunque se sabe que pueden ser de tipo
diferente. Los integrones de resistencia consisten de 2 regiones conservadas de DNA separadas por una
región variable que contiene de uno a 10 genes de resistencia integrados como casetes. En
experimentos de hibridación, utilizando sondas dirigidas contra las secuencias conservadas, se ha
demostrado que la presencia de estos elementos es frecuente en las bacterias de origen clínico. El uso
de la PCR y la secuenciación nucleotídica de los genes de resistencia ha proveído el conocimiento de
combinaciones diferentes, así como una aproximación a la forma en la que han evolucionado estos
elementos entre los aislamientos clínicos. La caracterización de los integrones presentes en bacterias de
origen hospitalario es una herramienta epidemiológica valiosa que permite entender la evolución y
repercusión de los elementos genéticos asociados a la multirresistencia, así como la distribución de los
casetes génicos de resistencia y su relación en el uso y abuso de los antibióticos. Además, esto es de
gran interés por su implicación en la resistencia a nuevos antibióticos de amplio espectro como los
carbapenemes, ya que no se cuenta actualmente con inhibidores terapéuticos de metalo‐β‐lactamasas y
aunado a esto en nuestro país contamos con información escasa al respecto.
La producción de beta‐lactamasas es el mecanismo más común de resistencia bacteriana. Estas enzimas
son numerosas y presentan mutaciones continuamente en respuesta a la alta presión del uso de
antibióticos. La síntesis de beta‐lactamasas puede ser tanto cromosomal o mediada por algún elemento
móvil como son los plásmidos o los transposones; en el caso de los elementos móviles, éstos facilitan la
transferencia de la resistencia a otras bacterias, siendo responsables de algunos brotes de resistencia,
especialmente cuando las medidas de control de una infección hospitalaria no han sido adecuadas o
suficientes. Las beta‐lactamasas pueden inactivar el anillo beta‐lactámico por medio de dos
mecanismos. Uno de ellos está mediado por enzimas que tienen un mecanismo de acción basado en la
serina, es decir, en su sitio activo presentan un residuo de serina por lo cual reciben el nombre de serin‐
beta‐lactamasas; dicho residuo reacciona irreversiblemente con el carbono carbonilo del anillo beta‐
lactámico, rompiendo el anillo e inactivando el antibiótico. Estas enzimas están clasificadas en las clases
A, C y D con base en su secuencia de aminoácidos y presentan actividad contra varias penicilinas,
cefalosporinas y monobactames. El segundo mecanismo, mediado por la clase B de β‐lactamasas, es
menos común; las enzimas de esta clase emplean un ión metálico de transición, principalmente el zinc,
por lo cual son denominadas metalo‐β‐lactamasas; dicho ión está unido a histidina y/o cisteína y
reaccionan con el grupo carbonilo del enlace amida de la mayoría de las penicilinas, cefalosporinas y de
los carbapenemes, pero no con un monobactame. Principalmente dos grupos de beta‐lactamasas son
expresadas por P. aeruginosa, las beta‐lactamasas de espectro extendido (ESBL) y las metalo beta‐
lactamasas (MBL). Dentro de estos grupos encontramos diferentes tipos de enzimas, los cuales son
establecidos en base a su secuencia nucleotídica y su preferencia por hidrolizar algún sustrato. Algunos
tipos de enzimas al parecer se encuentran delimitados geográficamente, mientras que otros se han
diseminado alrededor del mundo ocasionando diversos brotes en nosocomios. Los diferentes tipos de
beta‐lactamasas de un grupo presentan variantes alélicas, las cuales consisten en pequeñas mutaciones
en posiciones específicas dentro de la secuencia del gen de la �‐lactamasa, pudiendo originar cambios
en su punto isoeléctrico y su espectro de hidrólisis.
MATERIALES Y MÉTODOS:
MATERIAL BIOLÓGICO.
P. aeruginosa. Los aislados de IN fueron obtenidas de 3 hospitales: de pacientes del Instituto Nacional
de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán (INCMNSZ), del Centro Médico “La Raza” y del
Instituto Nacional de Pediatría (INP). Las cepas de FQ fueron obtenidas de lavados bronqueoalveolares
de pacientes pediátricos. Como cepa de referencia se utilizó la cepa de la colección ATCC de P.
aeruginosa 27853.
ECN. Los aislados fueron obtenidos del Hospital General de Acapulco, Guerrero.
76 cepas de GAS aisladas de pacientes con alguna enfermedad estreptocócica. Se consideraron cepas de
GAS invasoras cuando el aislamiento de la bacteria se hizo a partir de un sitio estéril como sangre, LCR,
aspirados, tejidos profundos, etc., así mismo; fueron incluidas en este grupo cepas de GAS aisladas de
sitios no estériles, como lo es piel, vagina o abscesos. Por otro lado, se incluyó un grupo de cepas (n=38),
que fueron obtenidas a partir de exudados faríngeos y éstas fueron catalogadas como no invasoras.
Dichos aislamientos se mantienen almacenados a –70 °C, por lo que fueron descongelados y validados
MÉTODOS PARA CONFIRMAR LA IDENTIDAD.
Se realizó coloración de Gram, prueba de oxidasa y catalasa, así como el crecimiento de las cepas en
agar MacConkey, agar sangre de carnero y medio O/F incubándose a 37°C por 24 horas, en donde se
observaron las características típicas de cada grupo. Después fueron identificadas a nivel de especie por
pruebas convencionales o semiautomatizadas (CRYSTAL).
DETERMINACIÓN DE LA CIM A LOS ANTIBIÓTICOS
En este ensayo se probó la susceptibilidad a las quinolonas de las cepas aisladas en donde se determinó
la CIM, que se expresa en μg/mL El método para determinar la sensibilidad a estas familias de
antibióticos fue el de microdilución seriada en caldo y de difusión en disco de acuerdo a las
recomendaciones de CLSI (2005).
PREPARACIÓN DEL ANTIBIÓTICO.
Se utilizaron sales de los siguientes antibióticos: clorhidrato de ciprofloxacina, levofloxacina,
norfloxacina, ofloxacina y gatifloxacina. Para preparar las soluciones de trabajo se siguió el esquema de
preparación de diluciones para pruebas de susceptibilidad en dilución en caldo sugeridos por el CLSI
(CLSI, 2005). Todos los agentes fueron evaluados por unidades de actividad (potencia), ya que las
unidades del ensayo pueden diferir ampliamente del peso real de la droga pura y a menudo pueden
cambiar entre los lotes de producción de la droga. Por lo tanto, cada laboratorio debe estandarizar sus
sales de antimicrobianos basados en las pruebas de los lotes de antimicrobianos deshidratados en uso,
utilizando la siguiente fórmula:
Peso (mg)= ó
/1000
A partir de un cultivo de 18‐24 h de P. aeruginosa en AMH se seleccionaron de 2‐3 colonias y se
resuspendieron en solución salina isotónica, hasta alcanzar la turbidez equivalente al tubo 0.5 del
nefelómetro de McFarland. Simultáneamente en una microplaca de fondo cónico de 96 pozos, se
colocaron 50 µL del caldo Mueller Hinton (CMH) con cationes de las hileras 2‐12 y de la A‐H, se
añadieron 50 µL del antibiótico en las hileras 1 y 2 y de la A‐H obteniéndose una dilución 1:2. A partir de
la hilera 2 (Volumen final=100 µL) se mezcló con la micropipeta de 7‐8 veces dentro del mismo pozo, se
aspiraron 50 µL y se depositaron en la hilera 3, de esta manera se realizaron diluciones dobles hasta la
hilera 11, desechando los últimos 50 µL. La hilera 12 se incluyó como control de crecimiento de la cepa
problema. Se incubó a 37°C de 16‐24 h. Se preparó una placa por cada antibiótico de prueba, con la
cepa control P. aeruginosa ATCC 27853 en cada microplaca.
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS. Se interpretó como la CIM la menor concentración de
antibiótico que fue capaz de inhibir el crecimiento bacteriano. Las cepas se catalogaron como sensibles,
con sensibilidad disminuida (intermedio) o resistentes tomando como parámetros los puntos de corte
descritos por el CLSI. Para la valoración del método, se tomó como referencia los límites aceptables por
el CLSI 2005.
Estándares de interpretación de la CIM para fluoroquinolonas por el método de microdilución en caldo
para P. aeruginosa de acuerdo con el CLSI 2005. Ej.:
Valores de CIM esperados para P. aeruginosa ATCC 27853.
AGENTE ANTIMICROBIANO P. aeruginosa ATCC 27853
Ciprofloxacina 0.25‐1 µg/mL
Ofloxacina 1‐8 µg/mL
Levofloxacina 0.5‐4 µg/mL
Gatifloxacina 0.5‐2 µg/mL
Antibiótico S I R
Ciprofloxacina ≤ 1 2 ≥ 4
Levofloxacina ≤ 2 4 ≥ 8
Gatifloxacina ≤ 2 4 ≥ 8
Ofloxacina ≤ 2 4 ≥ 8
DETECCIÓN FENOTÍPICA DE SISTEMAS DE EXPULSIÓN EN CEPAS DE P. aeruginosa.
Para la detección se realizó el método de microdilución en caldo para eritromicina a una concentración
de 512 µg/mL como se describió anteriormente, agregando 50 µl de MC‐207,110 a una concentración
de 50 g/L, en los pozos del 1 al 11. Se determinó que una cepa poseía sistemas de eflujo si la CIM a
eritromicina disminuía 2 diluciones dobles en presencia del inhibidor.
EXTRACCIÓN DEL DNA.
Las cepas fueron cultivadas en tubos cónicos estériles con 20 mL de CMH a 37°C durante 18 horas en
agitación, se centrifugó a 4000 rpm durante 10 minutos. En cada caso se eliminó el medio de cultivo y el
sedimento se resuspendió en 100 μL de una solución STE sin lisozima a una concentración de 10 μg/mL,
se homogenizó y se colocó una solución de lisozima a una concentración de 10 µg/mL. Se incubó a 37°C
durante 45 minutos y se añadieron 300 μL de Tris‐HCl 1 M pH 8.0, de EDTA 0.5 M, SDS 10% Proteinasa K
20 µg/mL incubándose durante 60 min a 50°C. Al finalizar la incubación se realizó la extracción con 200
μL de fenol saturado y equilibrado con Tris a un pH de 8 y se centrifugó durante 5 minutos a 13,000 rpm
para posteriormente separar la fase acuosa evitando tocar la interfase. Se prosiguió extrayendo con
fenol‐cloroformo (100µl +100µl) y se mezcló para centrifugarse a 13000 rpm durante 5 minutos. Se
separó la fase acuosa y se añadió 200 µL de cloroformo, se invirtió 4 veces y se centrifugó a durante 5
minutos a 13,000 x g. Se adicionó 1/10 de volumen de acetato de sodio 3M para la precipitación del
DNA, se mezclaron y se añadió 2.5 a 3 volúmenes de etanol absoluto frío (‐20° C), dejándose precipitar
toda la noche a una temperatura de ‐20°C. Como siguiente paso se centrifugó durante 10 min a 13,000 x
g eliminando el etanol absoluto y lavando el DNA con 300 µl de etanol al 70% frío, se decantó el etanol y
se eliminó secándolo en Speed Vac® durante 10 minutos, se añadió 1 µl de RNasa para incubarse a 37°C
durante 30 minutos. El DNA se disolvió en 50 μl de agua desionizada y estéril para proseguir con el
análisis de la integridad, lo cual se realizó por una electroforesis en el gel de agarosa al 0.8% con una
corriente de 90 voltios durante 90 minutos, para posteriormente ser teñido con bromuro de etidio. Las
bandas de DNA genómico se visualizaron y digitalizaron.
DISEÑO DE INICIADORES PARA PCR.
El diseño de los iniciadores se realizó mediante la herramienta bioinformática Primer3 utilizando como
referencia el genoma de P. aeruginosa PAO1 y de Staphylococcus epidermidis, la secuencia de los genes
de interés se localizaron en la página del National Center for Biotechnology Information (NCBI),
disponible en la siguiente dirección: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.
TÉCNICA DE REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR).
La mezcla de reacción utilizada para cada ensayo se estandarizó a 25 μL, en la cual se utilizaron 17 μL de
agua Tipo I libre de endonucleasas; 0.75 μL regulador de amplificación 10 X, 2.5 μL de MgCl2 50 mM, 2.5
μL de DNTP’s, 0.5 μL de cada iniciador a una concentración de 30 pmol, 0.25 μL de Taq polimerasa
(Invitrogen™) y 1 μL de DNA diluido 1:50. Las condiciones de amplificación (Termo Hybaid ™) fueron las
siguientes: un ciclo de desnaturalización inicial a 94 ºC durante 5 min., seguidos de 30 ciclos con
temperaturas de desnaturalización, alineación y polimerización de 94 ºC por 30 segundos, 60 ºC por 30
segundos y 70 ºC por 30 segundos, respectivamente y un ciclo de polimerización final a 70ºC durante 5
min.
PURIFICACIÓN Y SECUENCIACIÓN.
Los productos de la amplificación se purificaron con el kit de extracción y purificación de DNA QIA Quick
Qiagen®. La secuenciación se realizó mediante un sistema automatizado usando el servicio que ofrece el
Instituto de Fisiología de la UNAM.
RESULTADOS:
AAA.
Detección fenotípica de los sistemas de eflujo La impermeabilidad de la membrana en P. aeruginosa es debida en parte a los sistemas de
eflujo (SE), complejos enzimáticos que le confieren a las bacterias ventajas para sobrevivir en
diferentes ambientes, ya que expulsan compuestos que le pueden resultar tóxicos, ejemplo de
estos son los diferentes antimicrobianos. P. aeruginosa posee un gran número de sistemas de
eflujo, los cuales se encuentran organizados en operones y su sobreexpresión ha sido
relacionada con el fenómeno de multirresistencia.
Por otro lado se han sintetizado algunos compuestos capaces de inhibir a estos sistemas, a la
fecha no se ha encontrado alguno que pueda utilizarse en el tratamiento de las infecciones por
P. aeruginosa, sin embargo, han sido útiles para la detección de la SE.
Se realizó la detección fenotípica de estos SE a las 21 cepas utilizando diferentes antibióticos
como sustratos específicos para cada los cuatro SE con más importancia clínica: carbencilina
512 μg/μL (MexAB-OprM); eritromicina 128 μg/μL (MexCD-OprJ), norfloxacina 64 μg/μL (Mex
EF-OprN), y gentamicina 32 μg/μL (MexXY).Se uso como inhibidor PaβN (Sigma) a una
concentración de 50 mg/L.
Todas las cepas evaluadas presentan disminuyen la CIM a uno de los sustratos en presencia
de PAβN, sugiriendo que existen SE que expulsan a estos antibióticos, lo que contribuye
directamente en la multirresistencia. De las cepas estudiadas 10/21 disminuyeron la CIM para
carbenicilina en presencia de PaβN. En algunas cepas la CIM para este antibiótico varió 2
diluciones (cepas: 3,4 y11), estos resultados son .similares a los descritos por Mesaros y col.
en los que cepas de origen clínico y con sospecha de sobreexpresar MexAB disminuyen la CIM
de 128 μg/μL a 32 μg/μL. Es importante destacar que algunas de las cepas como la 1, 5, 17,18
y 19 presentan la disminución de CIM hasta en 9 diluciones y que se relaciona con la marcada
resistencia a β-lactámicos (principalmente penicilinas y cefalosporinas).
Amplificación de los genes reguladores de los SE Con el programa Primer3 se diseñaron los iniciadores para los genes reguladores mexR, nfxB y
mexZ. Para el gen mexZ no se logró diseñar un par de iniciadores que permitieran abarcar todo
el gen por lo que se diseñó un par adicional para lograr este objetivo. La amplificación para
cada uno de los genes se estandarizó, las características generales de cada iniciador y las
condiciones óptimas para cada amplificación se muestran en la tabla.
Tabla. Características de los iniciadores diseñados y condiciones de las amplificaciones
Gen Iniciador Longitud bp
GC% Ciclos Desnaturalización Alineamiento Tamaño
mexR MEXR1 21 42
30 94°C 59°C 501
MEXR2 20 45
nfxB NFXB1 20 50 30 94°C 60°C 964
Siguiendo las condiciones señaladas en la tabla se logró la amplificación de los genes blanco,
como se muestra en la figura:
Figura. Electroferograma de los amplificados del mexZA. Carril 1: MPM; Carril2: Cepa 12
Carril 3: Cepa 1; Carril4: Cepa 2; Carril 5: Cepa 3 Carril6: Cepa 4;Carril 7: Cepa 5; Carril 8: Cepa 18. Fragmento esperado 198 bp
Análisis de las secuencias En primer lugar se utilizó el programa BLAST para verificar que los amplificados
correspondieran a los genes reguladores (Figura 21), posteriormente se utilizaron diferentes
programas para alinear las secuencias (Bioedit. ChromasPro, ClustalX, GeneDoc) con el fin de
observar los cambios en las secuencias.
JCV.
Detección de genes de betalactamasas por PCR Una vez realizada la obtención de DNA genómico de las 11 cepas de P. aeruginosa, se analizó
mediante un gel de agarosa al 0.8 %, para determinar la presencia y calidad del mismo. En la
figura siguiente, como ejemplo, se puede observar que la calidad e integridad del DNA obtenido
para tres de las cepas en estudio fue adecuada.
NFXB2 20 55
mexZ
MEXZ1A 20 55 30 94°C 60°C
198
MEXZ2A 20 60
MEXZ1B 20 55 30 94°C 59°C 581
MEXZ2B 19 57
200 bp 100 bp
198 bp
1 2 3 4 5 6 7 8
Figura. DNA genómico de las cepas 201, 204 y 208 de P. aeruginosa, carril 1: cepa 201,
carril 2: cepa 204, carril 3: cepa 208 y carril 4: Marcador de tamaño molecular 1 Kpb. La flecha
indica el DNA total.
Se emplearon los iniciadores descritos por Yatsuyanagi y colaboradores (2003), los cuales se
muestran en la tabla 1. Se amplificó un fragmento de aproximadamente 3 Kpb, en la cepa 208;
el cual se purificó mediante un kit comercial “QIAquick PCR purification kit (Qiagen)” y se
secuenció a través de un método automatizado. Las secuencias obtenidas se compararon con
la base de datos del GeneBank y mediante un Blast se corroboró que en el extremo 5’ se
trataba del gen completo intI1 presente en integrones de clase I; mientras que en el extremo 3’
de dicha fragmento amplificado se identificó al gen qacΔE1, estos genes forman parte de las
regiones conservadas presentes en los integrones. Posteriormente se diseñaron iniciadores a
partir la secuencia parcial obtenida, para que, mediante secuenciación en avanzada,
conociéramos los casetes génicos presentes en la región central del fragmento de 3 Kpb. Las
secuencias generadas mostraron la presencia de los casetes génicos: aacA4, el cual está
localizado junto al gen intI1 y los casetes génicos blaOXA y aacA1 localizados junto a qacΔE1
figura:
Figura. Representación esquemática (no a escala), del fragmento de 3 Kb del integrón de la cepa de P. aeruginosa 208. Los casetes génicos están
representados por rectángulos. Las flechas indican la orientación de la
transcripción. El sitio attI1 está representado por un circulo negro y el
elemento de 59 pb, está representado por círculos grises. Los iniciadores
utilizados se muestran bajo la estructura del integrón.
GFR.
RESULTADOS DE INHIBICIÓN DE BOMBAS DE EXPULSIÓN.
aacA4 aacA1 qacΔE1 IntF IntF‐F IntR IntR‐F Int1R
En la tabla siguiente se muestra la disminución de la CIM al colocar el inhibidor MC-207,110
SIGMA ®, todas las cepas disminuyeron más de dos diluciones dobles la CIM a eritromicina en
presencia del inhibidor. La cepa 5F mostró una de las disminuciones más altas, la cual fue de
128 veces. Las cepas 1F y 4F a pesar de que fueron ambas susceptibles a las 4 quinolonas
probadas, hubo una disminución de la CIM a eritromicina de 16 y 4 veces respectivamente.
Una de las cepas (3.8%) disminuyó la CIM a eritromicina 128 veces de 64 �g/mL a 0.5 �g/mL,
el 7.6% de las cepas 32 veces, el 11.5% 16 veces, 30.7% 8 veces, 30.7% 4 veces y el 11.5% 2
veces.
Tabla. CIM a eritromicina con y sin MC-207,110 (SIGMA ®).
Cepa Eritromicina (�g/mL)
Eritromicina (�g/mL)/MC-207,110
Número de veces que disminuyó la CIM
1F 128 8 16
2F 128 16 8
3F 128 8 16
4F 128 32 4
5F 64 0.5 128
6F 128 32 4
1N 128 64 2
2N 256 8 32
3N 256 32 8
4N 128 16 8
5N 128 16 8
6N 128 32 4
7N 128 16 8
8N 128 32 4
9N 128 64 2
10N 128 32 4
11N 128 8 16
12N 128 32 4
13N 128 64 2
14N 128 32 4
15N 256 8 32
16N 256 256 0
17N 256 32 8
18N 256 32 8
19N 256 32 8
20N 256 64 4
En este experimento se observó una disminución de la CIM a eritromicina al colocar el inhibidor MC-207,110 SIGMA ®, lo cual indica que efectivamente, están presentes las bombas de
expulsión que se encuentran confiriendo la resistencia a las quinolonas a excepción de la cepa
16N que no mostró disminución alguna.
Alineamiento de las secuencias del amplicón de 954pb de nfxB amplificadas:
El análisis de la secuencia del fragmento de 954 pb de nfxB se realizó utilizando el programa
BioEdit para observar los cambios a nivel nucleotídico y a nivel aminoacídico, éstos se señalan
en la siguiente figura, donde se indican con flechas negras y rojas las posiciones y los cambios
en los aminoácidos del gen nfxB de las doce cepas secuenciadas y comparadas con el de una
cepa sensible (P. aeruginosa UCBPP-PA14). Se muestra en la posición 21 el cambio de H→R
(histidina a arginina) y en la posición 56 el cambio de G→D (glicina a ácido aspártico).
Figura: Alineamiento de las secuencias nucleotídicas del fragmento de 954 pb de nfxB. Se
muestra la región del gen en donde se presentan los cambios A/G y GC/AT en el gen nfxB de
las 12 cepas analizadas (flechas negras).
MGV.
La resistencia bacteriana a los antibióticos puede estar mediada por diversos mecanismos
bioquímicos, resaltándose la producción de BETA lactamasas, las cuales pueden ser de
espectro extendido o metalo BETA lactamasas (MBL). El objetivo de este estudio fue
demostrar la presencia de MBL en cepas de //P. aeruginosa// y //Stenotrophomonas
maltophilia// aisladas de pacientes con FQ. La determinación de la resistencia al imipenem, a
cefalosporinas de 3a generación, a quinolonas y a un aminoglucósido se realizó por los
métodos de difusión en discos de papel filtro y dilución seriada en placa. Se analizaron 148
cepas, 147 de //P. aeruginosa// y una de //S. maltophilia//, encontrándose resistencia a
imipenem en 22 cepas de //P. aeruginosa// y en la cepa de //S. maltophilia//. Las 23 cepas
resistentes al imipenem se sometieron a la prueba de sinergismo que permite detectar a las
MBL, obteniéndose 11/23 positivas. Adicionalmente se efectuó una prueba genotípica por
medio de PCR para detectar 4 tipos de genes de MBL, //bla//IMP, //bla//VIM, //bla//SPM, //bla//GIM en
las 23 cepas. Sólo se obtuvieron amplificados con los iniciadores diseñados para detectar
//bla//VIM en 7 cepas de //P. aeruginosa// y en la de //S. maltophilia//. Se determinó la secuencia
nucleotídica de 3 de los amplificados y el análisis bioinformático reveló la identidad con //bla//VIM
y una similitud del 99% con las variantes //bla//VIM-3, //bla//VIM-6 y //bla//VIM-11, lo cual deberá ser
diferenciado posteriormente con la secuencia de los genes completos.
VJR.
Ensayos de adherencia e invasividad a cultivos celulares.- Se realizó la estandarización de la técnica utilizando una modificación para determinar los
tiempos mínimos requeridos para la adhesión e internalización de las células de GAS,
procediendo a adherir las células (A549) a un cubreobjetos, antes de iniciar los ensayos, con lo
cual pudimos observar al microscopio los resultados de todos los periodos de incubación. Se
fijaron y tiñeron todos estos cubreobjetos mediante la técnica de Gram.
Se realizaron ensayos por triplicado utilizando 10 cepas de GAS, 5 del grupo de origen invasor
(2 de hemocultivo, 2 de absceso cervical y 1 LCR) y 5 del faríngeo. Observamos que la
adherencia de GAS a las células respiratorias utilizadas se inició rápidamente
(aproximadamente a los 20 min) y alcanzó su máximo a los 60 min. Se observó que la
penetración bacteriana al citoplasma de las células respiratorias se llevó a cabo alrededor de
los 120 min. El porcentaje de adherencia para las invasoras fue de 23.4%, en tanto que para
las faríngeas fue 14.4%. Mientras que los porcentajes de internalización fueron de 0.8 % y
0.5% respectivamente.
A B
Figura. Línea celular A 549 (epitelio alveolar tipo II). A) Normal y B) infectada con GAS. EMG.
Experimentos de Conjugación Se realizaron experimentos de conjugación para determinar si la resistencia a los antibióticos
estaba codificada en plásmidos o transposones conjugativos.
Para ello, se utilizó como marcador de selección, la no fermentación de lactosa, en cepas de P.
aeruginosa y la fermentación del azúcar por E. coli, en agar Mac Conkey, debido a que la cepa
de P. aeruginosa 208 presenta un fenotipo de multirresistencia incluyendo la rifampicina que
sería el marcador de selección en las cepas transconjugantes; por lo que se decidió incluir un
medio selectivo y diferencial.
Con la finalidad de encontrar la dilución en la cual obtuviéramos colonias aisladas, se
realizaron una serie de diluciones desde 10-1 hasta 10-9, encontrando que en las diluciones 10-
4, 10-5 y 10-6 se observaron colonias aisladas. Las cepas transconjugantes serían, cepas lactosa
positiva con un crecimiento cercano a los sensidiscos; sin embargo los resultados que se
obtuvieron fueron: cepas lactosa negativa con un crecimiento cercano a los sensidiscos y
cepas lactosa positiva, con crecimiento alejado de los sensidiscos. La tasa de trasferencia de
plásmidos conjugativos en P. aeruginosa es muy baja lo que correlaciona con los resultados
obtenidos. Por lo que se sugiere que esta cepa no presenta plásmidos conjugativos.
LOM.
Prueba de difusión por doble disco o prueba D. Se realizó la prueba de difusión por doble disco o prueba D, para determinar el fenotipo iMLSB
en las cepas de S. epidermidis y de S. haemolyticus de origen intrahospitalario, como se
describió durante la metodología. De las 6 cepas analizadas se encontró que las 3 cepas de S.
epidermidis y 2 cepas de S. haemolyticus presentaron perfiles de resistencia de tipo inducible a
clindamicina o iMLSB, ya que se observó el halo achatado en la zona de inhibición a la
clindamicina, próxima al disco de eritromicina (efecto zona D), como se muestra en la figura, la
cual fue comparada con la cepa de S. haemolyticus que mostró un fenotipo sensible.
A
B
Figura. Perfiles de resistencia en las cepas de S. haemolyticus y S. epidermidis. A. Se muestra el fenotipo de resistencia inducible (iMLSB) para clindamicina por la prueba D,
en donde se observa el achatamiento de la zona de inhibición del crecimiento (efecto zona D).
B. Testigo. En el que se observa una zona de susceptibilidad.
Amplificación por PCR del gen erm(C). Se llevó a cabo la reacción de PCR y se obtuvo un amplicón, con un tamaño de 1071pb
(Figura), los productos corresponden a las regiones seleccionadas para el gen erm(C) en las 3
cepas de S. epidermidis. No se observó ningún amplicón en el DNA de las 2 cepas de S.
haemolyticus.
M 100pb 1 2 3
1000pb 1071pb
Eritromicina
15µg
Clindamicina 2µg
Estreptograminas 15µg
Eritromicina Clindamicina 2µg
Estreptograminas 15µg
Figura. Productos de la amplificación por PCR del gen erm(C). Los productos de PCR de
erm(C) se corrieron en geles de agarosa al 1.5%. M100pb: Marcador de peso molecular en
escalera de 100 pares de bases. Los carriles 1 -3 presentaron el amplicón de 1071pb.
IRM.
Detección de beta lactamasas por método fenotípico
Es importante mencionar que pese a que la producción de estas enzimas ha cobrado
importancia como mecanismo de resistencia en brotes intrahospitalarios, no existe un método
sugerido por el CLSI para la detección de BLEE en bacilos Gram negativos no fermentadores,
dentro de los cuales se incluye a P. aeruginosa. Existen reportes alrededor de todo el mundo,
incluyendo algunos países de Latinoamérica como Argentina y Brasil, en los que empleando
métodos fenotípicos y genotípicos para la detección de BLEE, se ha determinado que un
porcentaje importante de las cepas involucradas en algunos botes intrahospitalarios,
resistentes a un gran número de antibióticos β-lactámicos eran productoras de estas enzimas.
Otro de los mecanismos enzimáticos presentes en P. aeruginosa y que le confieren resistencia
contra antibióticos β-lactámicos son las MBL, con el método de sinergismo por doble disco fue
detectado un halo de inhibición con IMP y EDTA en la cepa 8, se observa que este fenómeno
no se repitió con ningún otro de los inhibidores probados.
Figura. Detección de MBL en cepas de P. aeruginosa
LRG.
Tabla. Inhibición logarítmica de la resistencia a gentamicina de P. aeruginosa debida a
bombas de expulsión en cepas aisladas de pacientes con FQ e IN
Muestras Gentamicina Gentamicinacon
PbβN Logaritmos
1F 8 0.031 2
2F 4 0.25 1
3F 2 0.25 0
5F 1 0.031 0
6F 0.25 0.25 0
7F 4 0.25 1
1N 16 16 0
2N 32 32 0
3N 32 32 0
4N 16 0.125 2
5N 16 8 0
6N 16 0.125 2
7N 32 32 0
8N 16 16 0
9N 0.25 0.062 0
10N 16 16 0
11N 0.25 0.125 0
12N 8 0.031 2
13N 8 0.031 2
14N 32 32 0
La tabla muestra los valores obtenidos para gentamicina, en donde se observa en la
segunda columna que la mayoría de las cepas fueron resistentes al antibiótico y al
adicionar el compuesto Fenilalanina-Arginina-β-Naftilamida (tercera columna)
disminuyó significativamente su resistencia para algunas cepas, en la cuarta columna
se observa las disminución del antibiótico en presencia del inhibidor en forma
logarítmica, por lo que nos permite apreciar que hay una disminución del un logaritmo
para las cepas 2F y 7F, siendo de nuestro interés la disminución de 2 logaritmos para
las cepas 1F, 4N, 6N, 12N, y 13N, lo que sugiere que la resistencia para estas cepas
se debió a bombas de expulsión.
Figura. Análisis bioinformático de la región mexZA (arbitraria) de gen mexZ de
P. aeruginosa PAO1 con la región mexZA de las cepas 9N, 11N y 12N.
En la figura se muestra el alineamiento del gen mexZ de P. aeruginosa PAO1 con las
cepas 9N, 11N y 12N utilizando los programas de BioEdit y Clustal W, y apreciándose
que existen eliminaciones por ejemplo en la base 24 se perdió la adenina para las
cepas 9N y 11N, inserción en la base 63 se insertó una adenina en la cepa 12N y
cambios de los pares de bases en algunos casos es el mismo cambio de base
nuleotídica por ejemplo en la base 94 es un cambio de una citosina a timina en las tres
cepas, a la fecha tres de las cepas analizadas presentan cambios.
IMPACTO: El impacto del proyecto radica en conocer con precisión y a nivel molecular el funcionamiento
de los mecanismos de resistencia que presentan las bacterias, para así proponer
recomendaciones en los equipos interdisciplinarios de salud, para que se mejoren las prácticas
en la administración de los antibióticos que permitan revertir el efecto actual de presión
selectiva que ejerce el uso indiscriminado o abuso de los antibióticos.
