Di r ecci ó n:Di r ecci ó n: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54 +11) 4789-9293

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Tesis de Posgrado

Ensayo de un medio con cianuro deEnsayo de un medio con cianuro desodio para investigar estreptococossodio para investigar estreptococos

en aguas : Estudio bioquímico deen aguas : Estudio bioquímico delos cultivos aislados con miras alos cultivos aislados con miras a

establecer el origen humano oestablecer el origen humano oanimal de la contaminaciónanimal de la contaminación

Deyheralde de Rossi, Alina María F.

1959

Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en CienciasQuímicas de la Universidad de Buenos Aires

Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.

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Cita tipo APA:Deyheralde de Rossi, Alina María F.. (1959). Ensayo de un medio con cianuro de sodio parainvestigar estreptococos en aguas : Estudio bioquímico de los cultivos aislados con miras aestablecer el origen humano o animal de la contaminación. Facultad de Ciencias Exactas yNaturales. Universidad de Buenos Aires.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_1015_DeyheraldedeRossi.pdf

Cita tipo Chicago:Deyheralde de Rossi, Alina María F.. "Ensayo de un medio con cianuro de sodio para investigarestreptococos en aguas : Estudio bioquímico de los cultivos aislados con miras a establecer elorigen humano o animal de la contaminación". Tesis de Doctor. Facultad de Ciencias Exactas yNaturales. Universidad de Buenos Aires. 1959.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_1015_DeyheraldedeRossi.pdf

'35

in

ENSAYO DE UNMEDIO CON CIAHURO QEÍSODIO PARA INVESTIGAR ESTRFPTO­

COCOS EN AGUAS.­

ESTUDIO BIOQUIMICO DE LOS CULTIVOS A SLADOS CON HIBÁS A ESTABLE­

CER EL ORIGEN HUMANO O ANIMAL DE LA CONTAMINACIÓN.­

B B B U M B H

Balcazar de Aztegui y colaboradoras publicaron en 195%un

métodopara el aislamiento selectiüo de estreptococos de la nasofgringe, materias fecales y leche.

ESCeste trabajo, el que ha inducido a ensayar medios a

base de cianuro de sodio para la investigacion de estreptococos en

aguas de diferente origen.

Se ha ensayado la edicion de cianuro de sodio a diversos

medios apropiados para el desarrollo de estreptococos, determinan­do la sensibilidad de los mismosfrente a diluciones de cultivos

puros de estreptococos.

Los medios probados fueron, el caldo glucosado y el caldo

de Todd y el medio de Rothe y otro denominado "A", que es una mod;

ficaéián del medio "S.F." de Hajna y PerrV, cn lOs cuales se reem­I 1.. . , -.rls7o la azifla SOQlCQpor el Cianuro oe socio.

{o se observó diferencias marcadas en la sensibilidad Ce¡A_¡

. Ilos medios for lo que se ag09+o for su simulicidad, el caldo

glucosado adicionado con 25 mgflde cianuro de sodio para emplearlo

en la investigación de estrcptococos en aguas.

Se estudió la eficacia del medio glucosado cianurado com­

parativamente con la del medio "A" examinando 20 nuestras de agua

del Rio de la Plata,56 de rozos semisurgentes y 65 de natatorios.

El medio glucosado cianurado resultó ser alco más sensible

aunque menos selectivo que el medio "i" con 31562,Ïrente a agvas de

rio y pozos y menos sensible y selectivo frente a eflLas de natato­

rios. Hose aconseja por lo tanto emlearlo en sustitución de losnedios a base de azida bien conocidos.

Se determinó paralelamente la presencia de bacterias-coli­formes en todas las muestras examinadas hallandose con relación al

numero de muestras estrcptococos positivas igual cantidad de mues­

tras de Ï“ríóï coliformcs positivas, un número algo mayor de muestras

de pozos coliformes positivas y considerablemente menos aguas denatatorios coliformes positivas. Ademásen aguas de pozos y natato­

rios el %de muestras con Esch.coli resultó muy inferior al de muegtras con estreptococos.

La segundaparte del trabajo, consistió en la clasificaciónde los estreptococos aislados en muestras de aguas de diversa pro­

cedencia tendiente a establecer el origen de la contaminación, siendo esta una cuestión de verdadero interés sanitario.

Siguiendo las técnicas propuestas por Cooper y Ramaqan, se es­

tudiaron 128 cultivos puros de estreptococos aislados de las

diversas muestras examinalas, con el objeto de establecer el ori'lren humanoo animal de los mismos. Los cultivos de estrertococos2o

aislados, fueron clasificados : a) por identificacion de copas

y b) por origen de la contaminación.Los resultados alcanzados por los ensayos bioquímicos

en la clasificacion de estreptococos jor identificacion de cepas

(a),no concordaron totalmente con los hallados por Cooper y Rama­

dan; algunas cepas se apartaron en una o más reacciones de su cogportamiento normal.

Distribuidas las cepas identificadas por (a) de acuerdo

a su origen se observó un predominio en aguas de río, de estreptg

cocos de origen animal, en aguas de pozos, de origen humano y en

aguas de natatorios igual porcentaje de cepas de origen humanoy

animal.1 . . on los resultados alcanzados en la clas1f1cacion de es­

(.31

treptococos por origen de contaminación (b) se obtuvo también un

predominio, en aguas de río de estreptococos de origen animal;en

aguas de pozos y natatorios predominaron las contaminaciones de

orígen humano. '

Comgaradas ambas clasificaciones (a) y (b) se obscrvá

un resultado aproximado en cl orígen de las ceras, en aguas dc río

y pozos. En aguas de natatorios hubo una mayor discrepancia;

Dadala simplicidad de] :étoCo para estableeer el origeno u -. . . 'de la contamlnacñán (b) v el paralellsmo ootenldo en relac1on a

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Tim/5: 1015

II­III ­

VI ­

VII ­

3 U g A R I O

Antecedentes

Ensayo de 1a sensibilidad de medios,con cianuro de sodio

Estudio comparativo entre el medio glucosado cianurado

y el medio "A" eo el aislamiento de estreptococos

Clasificacion de las cepas de estreptococos aisladas

a) - Por identificacion de cepas

b) - Por origen de contaminacion

Resumeny conclusiones

Ap¿nd1ce

Bibliografia

Agradezco la amplia colaboracifin que en todo‘

momento me han dispensado. el Dr. RamonH.

Leiguarda y el Dr. Osvaldo Peso.

Agradecimiento que hago extensivo a las autgridadea del Laboratorio de las Obras Sanita­

rias de la Nacián, que mehan permitido la

realizacion de 1a parte experimental corre;pendiente

-nu . o...

I.ANTECEDENTHS

La determinacion de bacterias coliformes para establecer la

pureza bacteriologica de un agua. continúa siendo el métodomás se­

guro y sencillo de que se dispone para determinar contaminaciones

de origen fecal.

Presenta sin embargoalgunos motivos de critica que impiden

consideratlo comoun métodoideal. Entre ellos: el discutido signi­

ficado sanitario de algunos organismos del grupo coliforme comoel

Aerobacter aerágenes y los bacilos intermediarios cuyo habitat "no;mal" no es la materia fecal.

Uhresultado negativo en la investigaciSn de bacterias co­

liformes. tal comoactualmente se realiza. no constituye de acuerdo

con la experiencia recogida en los ultimos años la prueba absoluta

de ausencia en el agua, de bacterias nocivas para la salud. Se ha

observadocon frecuencia trastornos intestinales originados por la

ingestión de aguas sin bacterias coliformes en las cuales se pone

de manifiesto la existencia de fermentadores lentos de lactosa.bac­

terias anaerobias esporuladas, organismos del genero Pseudomonasetc.

Es asi que, desde hace años y en repetidas oportunidades,

divarsos autores han considerado a los estreptococos comoposiblessustitutos de las bacterias coliformes comoindice de contaminacion

del agua o simplemente comocomplementodel análisisbacteriologico

a fin de facilitar su interpretacion. Ello se debe a que los estreptococos se encuentran siempre en el intestino normal humanoy animal

no hallandose en cambio en lugares fuera del contacto con la vida

animal

El criterio de pureza bacteriolágica del agua.bnsadoen la

investigacion de bacterias intestinales, segun los inVestigadores

Mallmann,Calvert. France y Fuller. deberia modificarse cuando se

trata dc la calidad de aguas de natatorios. En efecto, el uso cada

Vez mayor de los natatorios. ha aumentadola posibilidad de contraer

infecciones originadas por bacterias patogenas provenientes de los

bañistas sean estos enfermos o portadores. Las infecciones produci­

das pueden ser de diferente indole,siendo las más comunes:otitis.

amigdalitis, conjuntivitis. forunculosis, micosis, antrax. fiebresintestinales etc. y dentro de los agentes causantes de los mismos.

los cocos Gran positivos ocupan un lugar destacado. Ello impone por

lo tanto una revision de las normas actuales de pureza.

Hallmann (l) en 1928 y luego Hallmann y Gelpi (2) en 1930

ensayaron los primeros metodos para 1a detcrminación de estreptoco­

cos en piletas de natacion. usando caldo lactosado standard.

Otro medio usado, no selectivo. fué el medio de Todd Hewitt

(3) empleadocn el estudio de las propiedades morfolágicas y bioqu;micas de los estreptococos.

Los métodos de enriquecimiento de estrcptococos a base de

telurito de potasio aparecieron depues de los trabajos de Fleming

(h) del año 1932. en el que se demostro que algunas bacterias no inhg

bidas por la penicilina lo son por el telurito y fueron Perry y Pe­tran (5) en 1932 quienes lo incorporaron a un medio de enriquecimieg

to. El poder inhibidor de la droga sobre bacterias coliformes fue

constatado por Fleming y Youn:(6) en 19H0 y Chapman(7)en l9hh lo

-2­

probo para el aislamiento de estreptococos hemoliticos y no hemoliticos.

En 1937 Hartman (8) empleo un medio con azida sódica pa­

ra suprimir el desarrollo de bacterias Gramnegativas permitiendo

el crecimiento de estreptococos. Snyder y Lichstein ( 9-10 ) lo aplicaron para el aislamiento de cocos Grampositivos en presencia de

bacterias del genero Proteus. Con una concentracián de 0.01 %evi­

taban el extendido característico de dicho microorganismofrenando

al mismotiempo el crecimiento del Esch.coli y gstzphi. Con una

concentracion mayor ( 0.05 %) no obtenían un crecimiento abundante

de estreptococos y algunos grupos podian no desarrollar. InVersa­

mente una concentracion menor (0.008%) traia aparejado un extendido

de bacterias del género Proteus y reproduccion moderada de Esch.co­11.

Mallmann (10) en 19k0 propuso un medio liquido con azida

s‘dica para la determinacion de estreptococos.

Conocida la propiedad de la azida sodica. son varios los

autores que la incorporan a medios liquidos y silidos. Paker (12)

en 19H3ideÉ un medio para el desarrollo de los estreptococos y del

Egysipelotrix rhusiopathiae,aconsejando una concentracion de la drgga de 0,05 % sola o con 0.0002 % de violeta cristal.

Hajna y Perry (13) hicieron un estudio comparativo entre

las bacterias del grupo Coli y el estreptococo fecal.incubando a

temperatura de #5,5QC.a la cual desarrolla el Strentococcus faeca­

lis y no los otros. En efecto el desarrollo y la formabián de ácido

- 3 ­

en el llamado medio "S.F.".os confirmatorio de la presencia del es.

treptococo fecal. Puede usarse inoculandolo directamente con agua.

leche o liquido cloacal o bien sembrándolocon un cultivo.desarro­

llado en un medio presuntivo. comopor ejemplo, caldo lactosado.

White y Sherman (1h) en_l9hh ensayaron un medio para el

aislamiento de enterococos de la leche a base de 0.03 fi de azida

y dg 325 U 0x. de penicilina_por litro. Neuman(15) en el mismoaño

propuso usar la azida en concentraciones de 0.0% - 0,06 % para ais­

lar enterococos en los quesos. Pike (16517) en 1Qk5. estudio la bog

dad de dos métodos a base de 0.006 % de azida. con el agregado de

0.0002 fi de violeta cristal uno de ellos y sin este colorante elotro.

Winter y sandhozer (18) en 1946, modificaron el medio de

White y Sherman mediante el agregado de azul de metileno un conconn

tracion de 0,001 fi, el aumento de las unidades de penicilina a 6500

Oxoporlitro, el empleo de ClNa en la elevada concentracion de 6.5!

y el ajuste del pHa un valor cercano a 9.6. Este medio fue aolica­do exitosamente en la investigacion de enterococoe en agua. liquido

cloacal. heeos etc.

En 19H? Leiguarda, Peso y Kempny(19) ensayaron comparati­

vamentetécnicas para investigar estreptococos en aguas,trabajando

con un medio conteniendo telurito de potasio y con otro a base de

azida sodica preconizado por Hajna y Perry y aplicado por Ostrolenk

y Hunter (2!) en 1946 al estudio de enterococos en heces.En 19h8 Rothe (21) propuso una formula nueva para un medio

- h 9

con azida. el cual es una modificacion de los medios de Mallmanny

Hajna y Perry, en 1950 Mallmann y Seligmann (22) lo ensayaron com­

parativamente para ol desarrollo de estreptococos en agua de rio y

de natatorios. con caldo lactosado.medio azida (Hallfiann) y caldo"S.F." obteniéndose los resultados más eficientes con medio de Rothe

En 1953 Litsky. Mallmanny colaboradores (23) obtuvieron

resultados satisfactorios ensayandouna modificacion del medio "S.F"

de Hajna y Perry.

El efecto toxico del cianuro de sodio en las celulas vege­

tales y animales se conoce desde hace tiempo¡

Claudio Bernard (2h) estudiá la accion de los cianuros so­

bre la respiracián celular.En 1927 Burnet (25) señalo que los estreptococos podian

ser cultivados en medios solidos conteniendo 0.05 í de cianuro de

potasio que actúa comoinhibidor del desarrollo de otras bacterias.

Braun-Guggenhein (26) en 1932 y Braun (27) en 1938-39 no­

taron que cultivos del grupo Klebsiella-Aerobacter se desarrollabanen medio con concentracion de cianuro que inhibian el desarrollo

del Esch.coli.Buttidx (28) en 1953 empleando el medio de Braun. estudio

cultivos de salmonelas y en 195HMoller (29) ideo un medio con cia­

nuro para determinar bacterias del mismogenero.obteniendo resulta­dos favorables.

Balcazar de Aztegui y colaboradoras (3) en 195%. publica­

ron un métodopara el aislamiento selectivo de estreptocococ de na­

¿.5­

sofaringe. materias fecales y leche.

De acuerdo a este trabajo. el empleo del cianuro de sodio

en una concentracián de 35 mg fi. añadido a un medio adecuado (cal­

do glucosado, caldo infusidn dc corazán).permite el aislamiento en

2h horas, de estreptococos de diversas fuentes, siendo recomendable

su empleopara el aislamiento rutinario de estreptococos de la ri­

nofarinae,especialmcnte. cuandose lleva a cabo un estudio epide­mioldgico.

Este trabajo es el que ha inducido a ensayar medios a ba­

se se de cianuro de sodio pana la investigacidn de estreptococos en

agua. Además. dado que durante el transcurso de este ensayo se eran

minarian distintos tipos dc aguas con el consiguiente aislamiento

de estreptococos. se penso en completar el estudio efectuando la

clasificacidn de los cultivos aislados mediante las pruebas propueatas por Cooper y Ramadan(31) con miras a establecer si los mismos

eran de origen humanoo animal; una cuestidn de verdadero interés

sanitario ya que contribuye a aclarar el significado higdenieo dela contaminacion. t

Este problema existe desde que Andrcwes (32) en1906 da ¡1

Enterococcus descripto morfoldgicamente por Ihiemelin en 1899 el

nombre especifico de gtggzjggggggg_ggggglig.

Dible (33) en 1921 contribuyá al estudio de las cepas de

origen fecal considerando.;entre otras reacciones, comofundamenta­

les. la resistencia al calor a 60°C. durante 15 minutos y la fermeg

Cóc'

tacion del manitol.

En 1933 Lancefield (3h) agrupo serolágicamente los dire.­

rentes estreptococos. observando que su grupo "D" de estreptococos

hemoliticos presentaba caracteristicas semejantes a los llamadosenterococos.

Algunos investigadores. entre ellos. Sherman (35) 1937

uso el término de enterococo para designar un'grupo de estreptooo­

cos el cual incluía cepas hemoliticas. no hemoliticas y licuadoras

de gelatina.SStr.ngogenes¡ durans I liguefaciens)

En 19b3 Shattock y A.Mattick (36) consideraron el_g;g¿¿¿r

guefgciens comouna variedad del Str.faecalis;también quedo per­fectamentediferenciado el Str.lactis del Str. faecalis.

Dentro de las heces humanas. bovinas y ovinas. es común

. encontrar diferentes grupos de estreptococos que difieren del gtrgg

tococcus faecalis tipico en uno o más criterios esenciales y usualmente en otros secundarios.

Puesto que el objeto del trabajo de Óooper y Ramadan(31)

consist15 en clasificar los estreptococos según su origen. se considero conveniente agruparlos, ampliandosu c1asificacián.bajo el

nombrede fitnfaocalis atigicos variedad I. II. III. Iv y v. apli­cándose este nombre a las cepas que difieren en dos o tres caractg

ristiCas standards del Str.faecalis tioico. Esta clasificacián 13cluye a los estreptococoe agrupados como"variantes" del Str,fae­

cglis. así denominados,por algunos investigadores.El aislamiento de estreptococos a partir de materia fecal

- 7 ­

y la clasificación de los mismos. demostro que la variedad de las

cepas aisladas depende en parte del métodode aislamiento utilizadoP por ejemplo: el uso de dos métodos de aislamiento de estrep­

tococos.altamente recomendados. tales comoel método del calenta­

miento o el del telurito, usados comparativamente.acusaronla praSencda de diferentes cepas de estreptococos.

Investigadores tales como; Cooper. Baker. Elliot yWIood

(37) en 19h2 estudiaron otros métodos de aislamiento, recomendan­

do el uso de un medio con tetrationato. Cooper y Linton (38) en

l9k7, demostraronla resistencia de los estreptococos al acetato

de talio. Además. comoya vimos. se estudiaron medios con azida ’

s6dica.

Cooper K.E. y Ramadan(31) en 1955 aislaron estreptococos

a partir de excrementos humanos. vacunos j ovinos,comparando ditg

rentes metodosde aislamiento . a) tetrationato. b) telurito y d)sales de talio.d) calentamiento.

El métododel telurito demostrfiposeer alta eficiencia.

aislándose el 97 % de las cepas de origen humano, vacuno y ovino;

Fué realizado un estudio de las propiedades de las cepas aisladas,

basado en pruebas de resistencia al calor y pruebas bioquímicas.

clasificándose luego las copas.

De acuerdo con este método,H0 fi de los estreptococos de

origen humanofueron agrupados comoStre tococcus faecali ;no se

halld Streptococcus faecalis entre muestras de vacunas u ovinos,El Str. durans fue aislado tambien exclusivamente de heces humanas

y represento el h %de las cepas. El gtg¿_ggggglig_gggigggghligggr_____ac1ensyel hanáronseenun29 fl en heces de origen humano.-8­

La variedad liguefgciens representa el 1k z de origen bg

vino y el 18 % de cepas ovinas. La variedad zzgogenes no se encqg

trd entre los estrcptococos bovinos, pero forma un 6 5 de estregtococos de origen ovino.

Conrespecto a las cepas clasificadas comovariedades del

Strofaecalis se observÉque el Str. fnecgiis atinico I se identif

fic6 en heces dc origen humanoy bovino; la variedad ggigigg_;;

en excrementos humanosy ovinos y las variedades III. :1. x 1 de­muestran origen exclusivamente animal. I

El trabajo realizado por Cooper y Ra‘adan. fue completa­

do luego de seleccionado el medio del telurito de potasio. como

el más conveniente,aislando cepas de estreptococos a partir de

350 muestras de materia fecal de diferente origen t 130 humanaS.

110 vacunas y 110 ovinas. Luego. las cepas aisladas fueron culti­

vadas en caldo bacto peptona (16 horas a 37°C.)-para su examinacián

La'diferenciacion entre las cepas de origen humanoy en;

mal es de naturaleza cuantitativa y queda demostrada realizando

los siguientes tests! Resistencia c lor: por calentamiento a

609G. durante media hora y sub-cultivo en agar sangre al 10 Z.

asistencia calor a1 telurito: las mismasmuestras usadas en

el ensayo anterior. fueron sub-cultivadas en mediotelurito deMmmm<3!) .Luegode realizado el ensayo de standarlizaciSn del colorante con

varias partidas de diferente origen. se utilizfi una denominada

Gurr N9thl.Los resultados obtenidos permitieron reunir las cepas en

-9­

6 grupos. Dentro de los grupos I y II. quedan incluidas las cepde origen humano. 98,5 fl de las cepas de origen animal se situa

ron dentro del grupo III ( 50.% fl vacunas y_h8.l g ovinas) y 9L

en el grupo IV ( 37.6 fl vacunas y 53,k fl ovinas). las cepas con

las caracteristicas de los grupos V y VI carecieron de una fuen1

específica de origen.

De acuerdo a lo expresado anteriormente, la segunda pa:

del presente trabajo trata.con una tecnica similar al la utilizgda por Cooper y Ramadan.de establecer una clasificacion comparativa entre los cultivos de estreptococos aislados a partir de

aguas de diferente procedencia de acuerdo a la identificacián de

las cepas aisladas y de acuerdo a su origen.

Basado en el paralelismo de ambasclasificaciones podri

aplicarSQ ese método sencillo usado por Cooper y Ramadanpara di

fercnciar en agua9¡ la contaminacián de origen humanoo animal

.—-- o o u--­

-10­

'II-EHSAYOS DE LA SEHSIBILIDgQ DE MEDIOS CON CIANURO DE SODIQ

Se comenzóel estudio haciendo una serie de enSayos.tenp

dientes a seleccionar entre varios medios adicionados con 25 mg.%

de cianuro de sodio, el más sensible,para la apreciacifin de estregtococos.

Medios estudiadogo

a).- Medioglucosado (apándice)

b).- Medio Rothe 2

c).— Medio Todd "

d).- Medio "A" (moduicacisn del medio "sm." de

Hajna y Perry)

De acuerdo al trabajo de Balcazar de Aztegui y colaboradg

ras se procedi5 al agregado de cianuro de sodio en el medio glucg

sado y en el medio de Todd. en tanto que en los medios de Rothe y

medio "A" se hizo el reemplazo de la azida sodica por el cianurode sodio en la concentracion antes mencionada.

Qultivos de pruebe.­So aislaron estreptococos a partir de muestras de agua

de río.9embr5ndose en un medio con azida sSdica (Rothe). Se real;

26 una serie de pases. a placas con agar azida. y agar inclinado

tendientes a la obtencián db un cultivo puro. Se ratificó final­

mente la pureza del mismopor una coloracion de Gram.

Iácnicg seguiga.­' Se partio de una suspension del cultivo puro del estrep­

tococo elegido, en agua estéril, realizándose luego sucesivas di­

luciones al dácimo; simultáneamente. se sembraron placas con agar

-11­

nntritivo,dentro de/Éiertas diluciones. con el objeto de conocer

el número de bacterias por ml. contenidas en cada dilucion . _

Lïs ensayos realizados, se efectuaron con aquellas dilu­ciones que contenían de 2 a 20 bacterias por ml. según lo demues­

tren los cuadros NDl. 2. 3 y H. Se sembraron tubos de cada medio

con 1 ml. de las diferentes diluciones. incubándose a 37cc. y rea­

lizándoso la lectura de los mismosa las 2k y #8 horas de incuba­

ciSn. So ratifico el desarrollo de estroptococos de los tubos po­sitivos mediante una coloracián de Granu

Resultados:

Los resultados logrados Se consignan en los cuadros'NQ l.

2. 3_y h y la observacion de los mismos.permite apreciar los si­guientes hechos:

El reemplazo dc 1a azida sodica en el medio de Rothe y en

el medio "A" por el cianuro de sodio, no produfio una major sensi­

bilidad. en el medio,por el contrario. parecia inhibir algo 91 de­sarrollo del cultivo.

El agregado de cianuro de sodio al medio glucoeadoprodujo

un mayor desarrollo. InVcrsamente,o1 medio de Todd cianurado. seg

55 un retardo. Con una concentraciÉn de 15 - 20 bacterias, el de;

saiiollo es perfecto para cualquiera de los mediosutilizados.Cuandode trabaja con una concentración de h bacterias

promedio, el resultado ya no ee ta1.como 1o demuestra el fl de de

sarrollo que aparece en le última columna de los cuadros. .

Los resultados obtenidos son más o menos concordantes pgre los diferentes medios ensayadosgno encontrándose una evidente

-120

superioridad en_ningunode ellas. No obstante. se ha elegido para

el pfesente trabajo. el medio.glucosadoc1anurado,por la simpli­

cidad de su fármula y menor costo. pudiendo ser empleado en aná­lisis do rutina y"el medio "A". uno de los medios úíüimamente es.

tudiados (1953). que comparado con los demás medios. evidenciá un

desarrollo supnfior (mayordep5sito y turbiedad) dentro de las 2hhoras de incubacian.

-13.

CUADRQ fl! 1

ENSAXOS DE SENSIBILIDAD DE MEDIQS QE QULTIVO CON X Sln CIANURO

m. somo

Médica mn bact N0 tub. Desarrollo h Colorac. Desarroll­por tub sembr. 4 3‘7 Greg:

«í 2131. _ Q DOS itiVOS p fi

Todd 15.2o 2o 15 ”* 20 Ha. 20 1005 ++

Todd Ciamu'. 15-20 20 1° M 20 H4. 20 10010 ++

Glucosado 15-20 20 20 H4- 20 +H+ PO 100

G1uc.Cian. 15-20 20 20“H - 20 100

Toda 11-8 20 20 H' 20 H+ 20 100

Ol‘oddCianur. M 20 ig Y 20 +H- 2o 100

Glucosa-1do tha 20 12 204+» 20 100

Gluc. Gian. 14.8 20 12?: 201w» 20 100

4+" n I‘mnmau«¿sus y emanaw a 3an n n«H o Juán»ó l Turháadnd

CUADRO E9 g

DE SODIO

NQbact. N9 tub . CCloraB.DesarrolloMedio. por tub. sambr. 37 Gram negaron

. 2¡+h . l+8h á positivos . fl

1.. 10+ M“ MH- unTodd 12 ¿ k‘+* 4+ 100

Todd Cianur. u.12 un 3211* kh+++ un 100

Glucosado h-12 l+’+ lili-mr“ 1M- 100

Gluc.Cianur. 4-12 un Nh#++ N4+‘++ un 100

++++ a Excelente depásito y turbiedad

H-f a Buen " "

+4 a Depásito

Q a Turbiedad

QUÁDRO HQ 3

DE SODIO

.NDbact. N0 tub. . Desarrollo \Colorac. Desarrollpor tub. senbr. 37o Gram

. ahh . h8h .posifiivos fi

Glucosado 6 5 20 12 11* 2o a+«: 20 100

Gluc.Cianur. 6 20 lï :** 20+++. 20 100

Rothe 6 20 20 +r+ 20+++# 20 100

Rothe Cianur. 6 20 12*:2 20+++á 20 100

19‘9++Medio fl A " 6 20 1 *++ 20++++ 20 100

Medio "A"Cian. 6 20 13*:*‘ 12*:** 20 100

Glucosado 3-k ho 3;::* 37+4+. 37 92,53+

I 35+rr+ 33#+++Gluc.C1anur. 3-” “o 24+* 1k+ 39 97';

Rothe 34+ 1+0 a; 11" 33*3" 38 95

l 284+h 38+e+Rothe Cianur. 3-h no lo ‘* 2 * 38 95

Medio n A n 3-h no 32‘**‘ 3g**** ko 100. - - v

Medio "A"Cian. 3-k ho 3g*:** 3Ï‘II* 39 97.5

+4++ a Excelente defiásito y turbiedad 4+ a Depásito

+,+ t Buen ” " + a Turbiedad

CUADRO no 1+

ENSAYOS .l

DE SODIO

oNobact. Ï'ÏQtub. Desarrollo Colorao .Dggarroll‘Medios por tub sembr. . 37o Gram

o 211-11 . l+8h . pos it ivos %

Todd 10-15= 20 2Qg++ 20+++ i 20 5 100

Todd Cianuro 10-15 20 20 +# 20 ++4 20 100

Glucosado 10-15 20 20 +++ 204-0“ 20 100

G1uchianur. 10-15 20 20+H 20++4# 20 100

Rothe 10-15 20 20+“ 20-M": 20 100

Rotne Ciandro 10-15 20 20r-+ 20+++« 20 100

Medio " A " 10-15 20 20+“.- 20++o+ 20 100

Medio “A"Ciano 10-15 20 lïtï‘ 20+44ó 20 100

Todd 2-h ho 351:“ 3É::** 37 92.5

Todd Cianuro 2-h no Ïg;;* 3g::* _36 9o8o

Glucosado 2-¡+ l+0 3 3gr.“ I 36 90

Glucos. Cianur. 2-’+ 1l-O 3 38-Hfl‘ 38 9.5

QUAQHOun h Scontinuacián)

.NQbact. Nntub Desarrollo Colorac. Desarrol"adios por tub. sembr. . 379 Gram

o o l+8ho eDOSitiVOS í

' hó++ h++ eRothe 24+ 1+0 32‘, 31H," 38 95

24 I

' 2 oRothe Cianur. 2-k HO lg:;* 3QIÏÏ+ 33 82,5

' 8+

Medio w A w 24+ no 316;“ 3g?“ 38 95

Medio "A"Cia.n. 24+ tro 32:“ 3g?” 37 92.5

++++ s Excelente depásito y turbiedad+++ z Buen " N

++ z Depásito

4» l Turbiedad

El estudio comparativo entre el medio glucosado cianurgdo y el medio "A" con el objeto de determinar sus cualidades para la

investigacion de estreptococos en agua. se efectuü examinandodire;

tamente muestras de agua del Río de la Plata (20). de pozos semisu;

gentes de BuenosAires y poblaciones vecinas (56) y de natatorios(65]

En total le examinaronlhl muestras y en todas ellas también se de­termin6 el contenido en bacterias colirormes.

Aislamiento de esgreptococos en agua de río.­

Por tratarse de aguas muycontaminadas se efectuaron dilup

ciones decimales, sembrándoseen este caso. tres tubos por cada di­

lucion comose indios en el esquemasiguiente:

3 tubos sembrados con 10 ml. de muestra

q n a I 1 u n

a n n n o. 1 s n

n n n n o. 01 w In

e II n e o. 001 u I

n n u n o. 0001 o II

Se sembraron en total 60 tubos de cada diluci5n y de cada

medio. que se incubaron a 3790. durante h8_horas. Con material de

todos aquellos tubos considerados positivos (deposito y turbiedad)ser realizo una coloracidn de Gram.a fin de confirmar la presencia

de estreptococos, procediendoss a aislar ds'algméozde estos culti­

vos. cepas de estreptococos mediante siembras en estría sobre pla­

cas de agar nutritivo. una colonia aislada de cada placa fu‘ sombra

-1“­

da en caldo glucosado cianurado y luego de ratificar su pureza por

una coloracifin de Gram. se procedifi a conservar las cepas sembran­

dolas en tubos de agar inclinado y guardándolas en la cámara fria

para su posterior clasificacionrLos resultados alcanzados; que se presentan en el cuadro

No 5,muestran una mayor sensibilidad y selectividad del medio glucgsado oianurado, cuando se examinan aguas marcadamente contaminadas.

En efecto. sobre el total dem360tubos. el medio cianurado indica

un 67.7 5 de tubos positivos comparado con un 63 fl del medio "A".

El fi de tubos confirmados fue de 58.9 fl para el medio glucosado cia

nnrado mientras que para el medio "A" no paso de 52.5 fi.

Aislamiento de estreptococog en aguas ge-pozos X natatorios.­Se procedio'a 1a siembra de estas muestras empleíndose las

siguientes diluciones: .

3 tubos sembrados con 10 ml. de muestra

I I I W 1 R I I

n n II e 0.1» .n a

La confirmacion de los tubos positivos. el aislamiento de

cepas y su conservacionpara la posterior clasificacion. se llevn­ron a cabo con una técnica similar a la utilizada con las aguas derío.

Losresultados relativos a le sensibilidad y selectividadde los medios empleados frente a las muestras de pozos y natatorios

estan consignados en el cuadro No 6 Y de su observacion se estable

ce que en aguas de pozos el medio cianurado posee una mayor sensi­

bilidad. no obstante acusar un 1 mayorde tubos falso positivos que

-15­

el medio "A".

En muestras de natatorios ocurre lo contrario. el medio "A"

demuestra mayor sensibilidad que el medio cianurado. dando un menor

fi de tubos falsos positivos.

En cuanto a la selectividad de los medios. en ambostipos

de agua, la coloración de Gramrevela una mayor pureza en cultivosdel medio "A".

Comoya se mencionó. en toda! las muestras examinadas se

determiná el númeromás probable de bacterias coliformes por 100 ml.

y se hizo la diferendiacifin de los mismosen los grupos Esch.coli

y bacdlos intermediarios. aerokenes y cloacal; ee procedid para ello

de acuerdo a la tecnica del Ministerio de Salud Publica de Inglate­

rra modificado por Wilson (39) y adoptado por los laboratorios de

0.3.I. desde hace muchosaños. cuyo fundamento es el siguiente:

Porciones determinadas del agua en examen, se siembran en tubos con

caldo Mac Conkey, que se Sncuba a 37°C. durante H8 horas. La forma­

cidn de ácido y de gas indica la existencia de bacterias coliformesLos tubos positivos se utiliZan en su totalidad. para realizar pa­

ses; 1) tubos con caldo Mac Conkey que se incuba en baño de agua

regulado exactamente a hhflc. (i0.5) temperatura en la cual solo el

B.coli fecal produce ¿cido y gas y 2) a tubos con medio citrato de

Roser. que se incuban a 38°C. durante 72 horas..ESte medio tiene

comoúnica fuente de carbono, citrato de sodio, y en ¿l se desarrg

llan las bacterias coliformes del grupo I.A.C¡

Uh cálculo permite determinar el numero más probable (N.M.P.) de

-16­

bacterias coliformes totales. B. coli fecal tipo I y bacterias co­liformes del grupo I.A.C¡

Todoslos datos referentes a la presencda de estreptococos

y bacterias coliformas en los diversos tipos de aguas examinadosse

condenean en el cuadfio N9 7.

En aguas de rio, tocas las muestras analizadas han acusado

la presencia de contaminacion tanto de estreptococos comode Eggg¿c

coli existiendo por lo tanto un paralelismo en ambostipos de con­taminacion.

En aguas de pozos, si bien se trabajá con aguas que.habian

dado ensayo presuntivo positivo de coliformes, solo se observo en

un 8h fl de los casos paralelismo entre la contaminacion por coli­fornes y estreptococos. E1 fi de muestras con Each coli results mg­

nor que el de muestras con estreptococos.

En aguas de natatorioe 1a falta de concordancia es mayor.

ya que estreptooocoa y coliformes fueron hallados solo en el 80 fi

y 52 fi respectivamente de las muestras examinadaa. alcanzando ape­

nas 15.h 5 las muestras con Each. coli.Es evidente por lo,tanto el mayorvalor del indice de es.

treptococos sobre el de coliformes para Juzgar la calidad bacteria

logica de aguas de natatorioao

-17­

CUADROEQE

Mediocianurado

Medio

"A"

ir

sembr.:

+

confir.fals.

r

sembro;

+

confirfals.

Tubos

sembrados

con

lOml.

60

60

.582

60.

60

573

Tubos

sembrados

con

1ml.

60

60

su6

60

60

519

Tubos

sembrados

con

0.1ml.

60

56

#6lo

60

52

38

Tubos

sembrados

con

0.01ml.

60

39

327

60

39

327

Tubos

sembrados

con

0.001ml.

60'

21+

177

60

12

Tubos

aembrados

con

0.0001ml.

60

5

50

60

Total

detubos

360

2H4

21232

360

227

18938

Resultadostotales

fi

67.7'

58.98.3

63

52.510.5

CUADROga6

PSTUDICOMPARATODELASÜHEIBILIDADYSULECTIVIDADDELMEDIOCIANURADOYDELMEDIO"A"

FRENTEAMUSSTRASDEAGUASDEPOZOSYWATATOBIOS

AguadepozosSemisur.

7

Aguadenatatorios| Ambasprocedencias

MedioCNNa total%

total

fl

Médio"A"lMediocuna

total%

Med10"A"

totalfl

MedioCNNa

totalfl

Medio"A"

totalí

Tubossembradoscon10m.

168

-168

180

6180

-3h8

3h8

gubospositivos

156

92.8137

77:3161

89.h1h6

81,1317

91

283

31.3

Tubosconfirmados

127

75.5116

69

100

55.5129

71.6227

65.2

216

70.“

Tubosfalsospositivos

29

17.221

12.5

61

33.817

9.“9D

25

38

10.9

Tubossembradoscon1ml.

56

60

660

-116

116

Tubospositivos

25

kh,622

39.2

30

so2h

l+055

¡mu

39.6

Tubosconfirmados

18

3218

32.1

19

31.619

31.637

31,8

37

31,8

Tubosfalsospositivos

7

12,54

7.1

ll

18.35

8.3ll

15.5

7.7

UADROn

N9muestrasEstreptococosCaliformeaEach.Coll

positiv.Spositivfpositivfl

Tipodeagua

I

Rio2o20100201002o.100 szos(x)56u783.9561001730.3 Natatorioa6552803k52.31015o1+

(x):SepartiádemuestrascuyoensayopresuntivodeB.coliformes.dióresul­

tadopositivo

IY - CLASIFICACION DH LAS CEPAS D? ESTEEPQOQOCOS

La clasificacion de las diferentes cepas aisladas se llevo

a cabo de acuerdo con las tecnicas seguidas por K.C. Cooper y Rama­dan.

De las cegrs de estreptococos aisladas y conservadas en

tubos de agar inclinado, se efectuaron pases a tubos de caldo bacto

pcptona y luego de una incubacion de 16 horas a 37°C..se efectuaron

las siembras en los siguientes medios diferenciales (ver apéndice)

Los ensayos realizados fueron los siguientes:

1).- Licuacio'IIde la gelatina.­Se sembrá cada una de las cepas aisladas por puncicn en

tubos conteniendo un medio con gelatina, luego de una incubacion le

1h días n la temperatura ambiente se efectu3 la observacion, habieg

do desarrollo filiformc en todos los tubos y licuaciÁn de la gela­tina solo en algunos de ellos.

2).- Eermentacion de azúcares.­Dc cada uno de los tubos de bncto-peptona a clasificar seg

broae un anna (Mmm)en tubos conteniendo 5 ml. de los diferentes

a: carest lactosa. manitol. sacarosa. refinosa. inulinn. glicerina

y sorbitol,realizándose la observacion luego de 2h y #8 horas de

1ncubaci5n a 37°C. La mayoría de los tubos que dieron reaccion po­

sitiva lo hicieron dentro de las yrimoras 2h horas. Los tubos sem­

brados con lactosa dieron todos reaccion positiva.

-18.

3).- Leche gzul de metilenoo­

l Se sembro un ansa de los cultivos a clasificar. en tubos

conteniendo h ml. de leche azul de metileno. Se incubó éstos en ogño de agua a 379G. durante 24 horas. La reaccion fue considerada

positiva cuandolos tubos presentaron reduccion parcial (color ce­

leste) o reduccion total (color blanco)

A1 igual que en el ensayo realizado con la leche azul de

metileno, se sembr6 un ansa de cada uno de los cultivos en tubos

conteniendo N ml. de leche tornasolada. Luego de incubado en baño

de agua a 37°C. durante 2h horas. se hizo la lectura. considerándo

positivos aquellos tubos que dieron reducción parcial (color rosa)o reduccion total (blanco).

s).- gidrolisis del ggpiaSn.­El ensayo para la hidrálisis del almidán se llevo a Gabo

sembríndose en superficie. placas de agar con 0.2 fi de almidon so­

luble. Las placas se incubaron a 37°C. durante 5 días; a1 cabo de

ese tiempo se efectuá la reaccion para determinar la hidráiisis cgbriendo la superficie de la placa con solucion de Lugol. En ningún

caso se observo reaccion positiva.

6).- Qesargo¿;o gg 6.5 z ge ggfigodLa siembra se realizo en superficie. incubándose las pla­

cas conteniendo 6.5 fi de ClNa durante #8 horas a 37°C. En la ma­

yoría de las muestras se observo desarrollo de colonias.

7).- gom511315.—

Se procediá de acuerdo con la tecnica de Brown. Be sembr6

-19­

en profundidad, colocando l m1. del cultivo de bacto poptona de 16

horas de incubacion, en placas y luego se agrego a cada una de ellas

el agar fundido al que previamente se agrego 5 % de sangre de caba­

llo; se mezc15el cultivo con el medio y se dejá enfriar. Las pla­

cas secas se incubaron en posicion invertida a 37°C. durante 2k ho­

ras; luego de examinados se dejaron 2k horas más. efectuándose la

lectura final. Se consideraron positivos todas aquellas placas cu­

yas colonias preoentaron hemfilisis a su alrededor.

8)o- te c o 6 9 .­

De acuerdo coo la tecnica seguida en el trabajo de Cooper

y Ramadan, se colocaron 0.5 ml. de cada cultivo en pequeños tubos

de ensayo.manteniéndose durante media hora a una temperatura de 609

C. en baño maria y llevándose luego a un baño de 3790. durante 2

horas. Se comprobosu resistencia al color sembríndose en estria en

placas de agar Sangre al 10 fi e incubando a 3790.durante H6horas.9)o- Qesarrollo en bilis.­

l Se sembrtgen caldo bilis al lO fi incubándose a. 37126.de

te #3 horas. Fueron considerados positivos aquellos tubos que pre­sentaron turbidez y precipitado.

1o).- Hiaro‘nsis gel hinurnto de sodio.­Los estreptococos hidrolizan cl hipurato de sodio transfer

mándolo en ácido benzoico y glicocola.

La presencia de ácido benzoico en cl medio, puede ser de­

mostrada realizando el ensayo del Cl3Fe o de un ¿cido inorgánico.

Sc efectuá el del Cl3Fe por ser el más sensible de los dos.

-29­

I

Se sombrá un ansa de cada cultivo on bacto peptona en un

medio conteniendo hiyurato de sodio y luego de incubado durante #8

horas a 3790. se }rocod15 al ensayo del C13Fe.

Se agrego a le. dél medioutilizado.0.5 ml. de solucion

de Cl3Fe al 7 fl y se agito enéígicumente. La permanencia de un D23

cipitado en la mezsla. significa que el hipurato se desdoblá en

benzoato y glicocola. mientras que si la mezcla qued5 clara dentro

de los 5 a 10 minutos. al hipurato no ha sido hidrolizado.

11).- Crecimiento g ÉH?¡6.- .

El medio correspondiente fuí inoculado con dos ansas de

cada uno do los cultivos on basto pectona. Se incubodurante 2h ho­

ras a 3090y se realizo la lectura correspondiente. El pHinicial

del medio debe ser 9,6 (z 0.02) y no debe variar durante la incubgcion en (1-0.0h unidades). Dobeasegurarse que la temperatura del

medio a1 detorminar el pH son de 1890.

Se sembraron tubos controi con caldo dextrosa y "buffer"

ajustando a pH 7 incubándose con cada una de las cepas examinadas.. QTambifinso incluyeron en cana ensayo controles negativos.

La clasificacion de las diversas Copas de estreptococos

estudiadas con las técnicas moncionadas. so consigna en los cuadros

No 8, 9 y 10. Estos resultados no concuerdan en su totalidad con

los obtenidos por Cooper y Ramadan.

La determinacion de algunas cepas variá en una o dos reac­

ciones, Se observS un comportamiento anormal, por ejemplo. en va­

-2},­

rias cepas que se consideraron pertenecientes a los St; atigieo I;LLH, conrespecto al tomasol. sorbitol y resistencia a 609G.es­

pecialmente en las aguas de río y nntatorios. Similarmente. el fi;;¿qgïüico V sa presento anormal a la reacoi5n de hidrálidis del hi­

purato en los tres tigos de agua y el étr.durggg en el desarrolloa pH9.6 y la prueba de hemálisis.

En agua: de pozos. varias cepas no respondieron satisfac­

toriamente a las reacciones del azul do netileno. Por el contrario

en aguas de rio y natatorios. las reacciones fueron normales.

Afin de establecer en base a esta clasificacion, el ori­gen posible de las.ceyas estudiadas.de acuerdo a lo establecido por

Cooper y Ramadanse conseder5 al Str.fgecn;is gipicu y al 33;. ág­

Egggde origen exclusivamente humano.al Str.atíp1co ¿1;¡;!¡ I y_s_rzbovis,¿eorigenanimalexclusivoyallïaucfgcicnn de origen humano-an'° o

Con los datos obtenidos se construyá el cuadro N9 11 en

el que aparece la distribucion de las cepas de acuerdo a su origenq 0 . o _ oEn Si se observo que -' «¿un de rio presentaron una contaminacion

do origen animal muy superior a la humana.en ggggs dg 20205 predo­

minála contaminacion de origen humano. En cuanto a las ggugs de

natatorios presentaron igual fi dc contaminacián de origen humano

y animal

-00­

.2?­

A - T NT

Simultáneameáfo con los onsayoá realizados con el objeto

-de clasificar las diferentes ¿spas de estreptooocoa aisladaS. socfectuïron otros destinados a determinar el origen. humanoo animal

de la contaminacián de las muestras en estudio,conrormo a las prue­

bas propuestas también por Cooper.y Hamadancon el mismofin.

8a utilizaron los tubos de cultivos en bacto peptona de

16 horas de incubaciáh. nandos para la clasificaciÉn an3erior.roa­lizándose los'siguiontos ensayos:

mega de someter 0.3 m1. dgal cultivo de 16 horas. de cada

una de las cagas a clasificar. a la tenperatura'de 63°C. durante30 minutos y dos horas a 3790. en baño maría.ae Sambrá un anna del

cultivu.en ostría an placas de agar sangre 31.10'fi y_oo.efectu6 laobservacion luego de una incubacián do #8 horas a 1a temperatura de

379C­

2).- Resistencig nl cala; x a; telurito.—i De los tubos expuestos a la temperatura de 6390..ao sen­

br5 an estria en placas con medio de Todd 551140 (se ufilizo medio

de Toddsilido,en reemplazo del medio_deMc.Leod'a utilizado en el

trabajo du Cooper y Ramadan),con 0.0%Zhetelurito de potasio. se 1

incubo a 3790. durante #8 horas. La presencia de colonias negras

indicá reaccion positiva.

3)o- Epacciáh Verde Q. de ¿anns,­'Úú'ansa (É moi del cultivo en caldo bacto poptona de 16

.23-‘

horas de incubacifin, se sombrfi un el medio verde Jahns con una coa

centracián de 1/10.000. Se incub5 durante 16 horas en baño de 37°C.

Se estableció que el Verde Janus se reduce en el siguieg

te crían da coloraci5n; azyl. malva. violeta, rojo oscuro, rojo Y;

no (quinánico) rosa, rosa pálido a incoloro. En este ensayo Se coasideran comotubos positivas aquellos en los cuales se observa el

color rojo qulnánico (forma semireducída) o cualquier otro color

que siga a la obtencián del compuestoleucoïormegsiondo el colorrosa el n55 a menudo observado.

Los tubos tendrán rcacciÉfi negativa cuando el color ests

comprendidoentre el azul y el rojo oscuro. Para evitar confusián

entre el rojo oscuro y elrrojo quinánico, los cultivos son agita­dos antes de examinarse, puesto que 01 02 atmosfÉrico devolverá

ol color violeta al colorante si no_so halla en la forma quinÉnica

En las observaciones efectuadas en este trabajo. se con­

sidurá positivos los tubos con coloruaián; rasa, rosa claro.e 1n­coloro.

Los resultados alcanzados tamïicn se representan en los

cuadros N9 S, 9 y lo. En ellos, de acnerde a Conper y Ramadanse

claSiÍ105 a las cepas en 6 grugos :ansiderando:

Los grupos I y II .áe exigen exclusivamente humano

" " III y IV " " " animal

" " V y VI " " " humano y animal

En el cuadro N9 12 se ¿resentan estos mismos resultados

en relación con ol ti¿o d? agua, pudiendo ohservarsa en las aguas

-21..­

do rio una lavar óbntaninaoifin de origen anima]. 0+2 fi) qu. humano

(5.3 fi) y un elevado percentage ¿e cepas a las que se asigna ambos

origenes (52.7 96), En cambio en aguas de pozos senha-gente! y nata

torios predomina la conteminacián do origen humano.

«pp-O."

-25­

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Grupo17

B°Amno 99. a: R a sx a a

CUADRON98

PORIDENTIFICACICRDECEAS(a)

PORORIGEN(b)

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GrupoV

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Grupo

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CultivosLic.Gelatina.

ImitolSacarosa

ReinosaInulina

Glicerinasorbitol

A.¡etilenoH.Almidbn

Hemólisis

Resist.60°

Reaiat.Clfla

Red.TermalHidr.H1purato

Lactosa

Desarr.BililDosarr.pH9,6

Clasificación

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Res.I

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CUADROH"2

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PORIDENTIFICACICNDECERES(a)

PORORIGEN(b)

humanooanimal

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Cultivos

Lico Manitol

Sacarosu

Rafinosa

InulinaGlicerina

SorbitolA.Metileno

H.Almid6n

Eemólisis

Resist.60°

Resist.Clfia

Red.Tornasol

Hdr.Hipurato

Lactosa

DGSBIT.Desarr.pH9.6

Clasificación

LecheV.Janus

ReSi‘Jto63°

Res.Teluritoycelor

Clasificación

(B)SHE!)zaAmovommmmn03

QSOGVTSIVSODOOOJHHH

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l

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ISE'EUSOAIMTHDHU

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CUADROno10

CLASIFICACIONDe:=CULTIVOSmeEmmmxmcosAISLADOSmn,AGUADE¡”amamos

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PORIDENTIFICACIQYDECEPAS(a)PORORIGEN(b)

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CUADRON911

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V- RESUMEN Y CONCLUSIONES

1).- Se ha ensayado 1a adicián de cianuro de sodio a diversos medios

apropiados para el desarrollo de estreptococos determinando la sen­

sibilidad de los mismosfrente a diluciones de cultivos puros deestreptococos.

2).- Los medios probados fueron el caldo glucosado y el caldo de

Todd;y el medio de Rothe y otro denominado medio "A". que es una mg

dificación del medio "S.F." de Hajna y Parry. en los cuales se reegplazo la azida sodiza por el cianuro de sodio.

3).- No se observo diferencias marcadas en 1a sensibilidad de dichos

medios por lo que se adopto, por su simplicidad. el caldo glucosado

adicionado con 25 mg.fl de cianuro de sodio para emplearlo en la in­

vestigacion de estreptococos en aguas.

h).- Se estudiá la eficacia del medioglucosado cianurado comparati

vamente con la del medio "A" exaninando 20 muestras de agua del Riode la Plata,56 de pozos semisurgentes y 65 de natatorios.

5).- El medio glucosado cianurado resulto ser algo más sensible aunque menos selectivo que el medio "A" con azida.fronte a aguas de rio

y pozos y menossensible y selectivo frente a aguas de natatorios.

No se aconseja por lo tanto emplearlo en sustitucián de los medios abase de azida bien conocidos.

6).- Se detcrminá paralelamente la presencia de bacterias coliformesen todas las muestras examinadas hallándose con relacion al núme­

ro de muestras estrcptococos positiVas igual cantidad de muestras

- 26 ­

de pozos coliformes positivas y considerablemente menos aguas de

natatorios coliformes positivas. Ademásen aguas de pozos y natatg;

rios el fi de muestras con Esgn. coli resulto muyinferior al de I

muostras con ostreJtococos. " I.7).- So estudiaron siguiendo las técnicas propuestas por Copper y

Ramadan128 cultivos puros de estreptococos aislados de las diver­

sas muestras examinados, con el objeto de establecer ol origen ngmanoo animal de las mismos. Los cultivos de estreytococoa aísla;

dos, fueron 01a51ficacdosz por identificacion de cepas (a) y por

origen de contaminaclÉn (b).

8).- Los resultados alcanzados por los ensayos bioquíhicoa en la

clasificacion de entreptococos por identificacion de capas (a)no

concordaron totalmente con los hallados por Cooper y Ramadan;ll­

gunas copas se aportaron en una o más reacciones de su comporta­

miento normal.

9).—Distribuida: las copas identificadas por (a) de acuerdo a su

origen, se obacryÉ un predominio en aguas dc río. de estroptococoa

de origen.aniaml; en aguas de pozos de orígen humanoy en aguas de

natatorios igual porcentaje de copas de origen humanoy lnilil

10).- En los resultados alcanzados en la clasificacion de estrop­tocooos por origen de contaminacion (b) se obtuvo tambiéh un prg

dominio,en aguas de río de estreptococos de origen animal. en

aguas de pozos y natatorios yredominoron las contaminacionoa de cgi1

gen humano.

11).. Comparadasambas cla31f1caciones (a) y (b) se observs un

resultado aproximado en al origen de las cepas, en aguas de río

y pozos. En aguas de natatorios hubo una mayor discrepancia.

1:2).- Dadala simplicidad del mátado para establecer el origende la contaminaciSn (b) y el paralelismo obtenido an relación a

la clasificacián por capas (h) sería posible determinar por media

de la clasificacián (b) la naturaleza de la contaninacifin por es­

troptococos en aguas de diferents origen.

cun-I.o o p-..

.28­

Medio de godd sálido S32.­

Iármula: Infusián de corazán 1000 ml.

Neopeptona 10 B.

Clfla 5 go

Ajustar 1a raccián con NaOHN/l a_pH 8.h. Hervir durante

5 minutos y agregar a 2 % de agar en polvo. Dejar en la marmita l hg

ra a 1 1/2 hora de modode fundir el agar y facilitar la filtracián.Filtrar a través de algodány distribuir en frascos. Esterilizar en.el autoclave 20 minutos a 1169c. El pHfinal debe ser de 7.8.

Medio de Todd liquido Q3].­

Fármula l Infusián de corazán 1000 ml.

Neopeptona 20 z.

ClNa 2 Ro

CO3HNa 2 g.

POHHNaZ 0. 11- g o

Glucosa 2 g.

Pregaraaión ¡Sacar 1a mayor cantidad de grasa de un coraz‘n de vaca

Picar la carne cn máquina y agregar 1050 cc. de agua por cada libre

de carne. Agitnr y retirar con espátula las pequeñas particulas de g

grasa que quedan en la superficie. Poner la mezcla de agua y carne

en la heladera durante una noche. A la mañanasiguiente calentar du

rante media hora a una temperatura de 859G. Filtrar por papel.Agregar

neopeptana y ajustar el pH a 8.0 con NaOHN. y agregar el resto do

los componentes.-29­

Hervir durante 15 minutos y filtrar a traves de papel.

Entubar en porciones de lO ml. y esterilizar en autoclave durante

l hora tres días sucesivos. El pHfinal debe ser 7,8.

Medio de Rothe {simula} S212.­

Fármula s Triptosa 15 z.

Extracto de carne 4.5 g.

Dextrosa 15 z­

ClNa 15 2.

Azida sodica 0.2 g.

Aguadestilada c.s.lOOO ml.

Calentar los componenteshasta disolucion. Agregar la dex­

trosa y la azida sodica Filtrar por papel. Ajustar el pHa 7.2 con

NaOHN. Colocar en tubos de ensayo y esterilizar en autoclave a

11090. durante 15 minutos.

edio " " simjle P .­

F6rmula a Triptosa 20 g.

Dextrosa 15 . go

ClNa 5 zo

P01+HK2 2.7 a.

PohHZK 2.7 zo

Azida sodica 0.2 g.

Aguadestilada eos. 1000 ml.

Calentar los componenteshasta disolucián. Agregar la dex­

trosa y la azida sádica. Filtrar por papel. Ajustar el pHa 7.2 conNaUHN. Colocar en tubos de ensayo y esterilizar en autoclave a llODC

-30­

durante 15 minutos.

gelatina nutritiva (H1).­Fórmula a Extracto de carne 3 g.

Peptona 5 K­

Gelatina 120 z.

Agua destilada c. a 19'00 m1.Calentar en el esterilizador a vapor hasta disolucián. de­

Jar enfriar hasta 30°C. y ajustar el pHa 7,6 - 7.8.Agregar un tercio

de clara de huevo por cada litro de medio, calentar a fuego directo

hasta ebulliciÉn y filtrar en caliente por papel de filtro. Dejarenfriar hasta 3090. y ajustar el pHa 7.2 .Se distribuye en tubos a

razón de 10 ml. esterilizando en autoclave a 11090. durante 15 minu­

tos. Enfriar rapidamente. Este medio debera ser perfectamente limpi­

do y tener un pH de 7,2 a la temperatura ambiente.

Leche tornasolada {#1}.­

DeJar en 1a heladera durante 18 horas. leche fresca cruda

de buena calidad. Retirar la crema y agregar luego 10 %de eolucián

de tintura de tornasol con lo que se obtiene un color azul púrpura.

Colocar en tubos de ensayo y esterilizar a lOOOC.durante 30 minu­

tos tres días oonsecutivvs.

Leche azul de metileno gli-1).­

Leche desengrasada con 0,1 fi de azul de metileno. Entubar

y esterilizar comoen el caso anterior.Leche verde B. de Janus l .­

Preparar una solucián del colorante verde de Janua en agua

-31­

destilada (dimetil safranina azodimetil anilina) al 1%. calentando

en baño maría a 8090. durante 15 minutos. Agregar a la leche desen­

grasada estéril en una concantracián de l/l0.000. Distribuir 5 ml.en tubos pequeños de 10 ml.

galdo nutritivo {caldo bacto oeptonaz {#2}.­

Ffirmula a Extracto de carne 6 g.

, Peptona 10 z.

Aguadestilada c.s. 1000 'ml.

Calentar lentamente y agitando. en baño maria a 6590. hasta

disoluci5n del extracto de carne y de la peptona. Recuperar el volu­

menperdido.agregando agua destilada y ajustar el pH en forma tal

que despuás de la esterilizaciÉn se halle comprendidoentre 6.“ y

7.0 prbferiblemente 6.9 (azul de bromatimol). LLevar a ebullicidn

a llama directa y luego dejar enfriar hasta 25 SCJ Recuperar nueva­

menteeltpeso perdido con agua destilada y clarificar por filtracidna traves de papel de filtro.

Distribuir en envases deseados y esterilizar en autoclaVe

a 12000. durante 15 minutos.

¿gar nutritivo 543).­Fármula t Extracto de carne 3 g.

Peptona 5 Bo

Ala-1' 15 Bo

Aguadestilada c.s 1000 ml.

Disolver el extracto de carne y la peptona en el agua desti

- 32 ­

lada calentando en esterilizador a vapor. Ajustar la reaccián (a la

temperatura ambiente) a un pH7.h (rojo fenol). Cortar el agar si

es necesario, colocarlo en un saco de gasa o mdselina y lavarlo en

una corriente de agua durante 15 minutos. Una vez bien escurrido se

agrega a la solucion de peptona y extracto de carne y se lleva a

autoclave a 12090. durante 20 minutos. filtfándose en caliente. Dig

tribuir en tubos o frascos y esterilizar en autocloVe-durante 20 minutos a 12000. La reaccion final e la temperatura ambiente.deberá

ser DH7.2.

Mediopara determinar la. hidrolisis del almidán. (531.­Se use agar nutritivo el cual se agrega antes de esterili­

zar 0.2 Z de almidon soluble. Se procede luego a su esterilizacián

en forma similar a la preparacián del agar nutritivo. El medioeete­ril se vierte en placas.

InhibiciSn nor 6.5 2 de Clfla {#3}.­

Se usa agar extracto de carne al cual se le agrega entes de

ser esterilizado 6,5 5 de ClNa. Esterilizado el medio se coloca en

placas.

caldo bilis Sh2).­Caldo nutritivo con 10 5 de bilis pura. Se entuba en por­

. cionea de 10 ml.

Hiourato de sodio {kk}.­

Fármula | Peptona 10 g.

Pepsina 5 go

Cl2Ca 0,03 g.

Eipurato de sodio lo g.

Cl3Fe a1 1% 1 gota

Aguadestilada c.s. 1000 al.

Se disuelve en al agua la peptona, pepsina y el Clnaa ca­

lentando a ebullicidn. se deja enfriar y agrega luego el hipurato.

filtrar y ajustar el pH. Se esteriliza en autoclave 20 minutos a

1169C. Ajustar el pH a 7.1

grecimiento g QR2.6 {k5}.­

Fdrmula 8 1) Caldo doztrosa

Dextrosa 10 g.

Extracto de carne 10 g.

Pcptona 10 g.

ClNa 5 a.

Asundestilada c.s. 1000 ml.

Ajustar el pHa 7,0 . Bsterilizar en autoclave 20 minutos.2) Solución buffer.

Glicocola. 7o505 80

ClNa. 5:85 En

Agua destilada 1000 ml.

Mezclar 6 partes de la solucidn (2) con h partes de NaOH

Nilo. A 900 ml. de medio (1) agregar 100 ml. del medio (2) y ajustar

el pH a 9.8 con NaOHNi guardar en frasco cerrado durante una nochepara precipitar completamente. Distribuir con precaucidn en tubos

chicos dejando el mínimode espacio libre.

Este medio debe usarse dentro de las H8horas. Bs esencial

- 3h ­

que el pH sea determinado electrométricamente antes y después de la

incubacion, debiendo existir una diferencia de solo 0.0h unidades.

Mediode telurito S32.­

Se uso medio dc Todd solido al que se agregá antes de ver­

ter en placas, 0.0%%de telurito de potasio.

Agar sangre al 10 fi {#3}.­

Se agrega al agar nutritivo lo fl de sangre de caballo,est5­

ril, antes de Verter el medioen placas de petri.Caldo lucosado al l Ml -.

Formula t Extracto de carne 3 n.

Glucosa 10 g.

Peatona 5 EO

Aguadestilada c.s. 1000 ml.

Disolver pa peptona y el extracto de carne en caliente, en­

friar un pocoy filtrar. Agregarla glucosa. Esterilizar y ajustarel pHa 7,h - 7.8.

Hedios cianurados.—

La preparacion de los medios cianurados de Todd. Rothe.me­

dio "A" y glucosado se efectúa agregando 25 mg % de cianuro de sodio

una vez que el medio ha sido esterilizado, momentosantes de ser usa

do.difitr1buy¿ndose luego en los tubos que ya contienen 1a muestra a

investigar. E1 cierre de los tubos debe ser hermético para evitar

el desprendimiento de CNH(tapones de corcho o gomaparafinados).

Fermcntacián de hidratos de carbono Shlï.­

Indicador de Andrade.

-35­

Fármula s Fucsina ácida 0.5 g.

Agua destilada 100 m1.

NaOh N/l 20 m1.

DisOIVerla fucsina en el agua. Agregar el alcali y dejara la temperatura ambiente durante la noche. Filtrar por papel defiltro.

¿ggg de ueptqggr(h61.oFórmula a Peptona 10 g.

ClNa 5 2­

Agua destilada c.s. 1000 m1.

DisOIVBrla peptona y el ClNa en el agua calentando en

esterilizador a vapor. Filtrar en caliente a través de papel y ajugtar el pH a 6.8 - 7.0. Agregar el indicador de Andrade 1 %y este­

rilizar a 12000. durante 20 minutos. Preparar en agua destilada unasolucián del azúcar deseada al 10%y esterilizar a 10090. durante

30 minutos. Agregar asebticamente 5 m1. de la solucifin de azúcar

a 100 ml. de agua de peptona con indicador de Andrade. Repartir en

tubos de ensayo can campanita (tubo de Durham)y esterilizar a 1009

durante 30 minutas. nl medio deberá tener un pH de 7,H e 7.6.

Agar sgggre nara hemálisisfihzl.­Agar peptona con sanáre de caballo (recogida asápticamente)

al 5 %. El agar nutritivo contiene.2 fi de agar. l %de peptona. 1%

de extracto de carne y 0,5 fl de ClNa.

Se procede comoen la preparacián del agar nutritivo y se

agrega la sangre esteril antes de verter el medio en placas.

aldo M Ï Conke #6 .­

Fármula t Taurocolato de sodio 5 g.

Lactosa 10 g.

Peptona 20 3.,

ClNa 5 z.

Aguadestilada c.s. 1000 m1.

Calentar en esterilizador a vapor durante dos horas y luggo colocar en la heladera durante la noche. Filtrar en frío al dia

siguiente y ajustar el pHa 7.H (rojo fenol);agregar 10 ml. de una

solución acuosa de rojo-neutro al 1%, distribuir en cantidades de

5 ml. en tubos de ensayo provistos de tubitos de fermentacián (Du­

rham) y finalmente esterilizar en autoclave a 11500. durante 15 mi

nutos, o a 10096. durante 30 minutos tres días sucesivos. Este me­

dio deberá ser.1impido, de color rojo clarote. libre de amarillo

o anaranjado.

MedioCitratgi(48).­Fármula a Cloruro de sodio puro 5 g.

Sulfato de magnesio 0,2 g.

Fosfato monoamánico l a.

Fosfato dipotásico 1 g.

Aguadestilada c.s. 1000 ml.

DisoIVer agitando, hasta obtener una solucián limpida.

Agregar 2 g. de ácido cítrico. Lchar a pH6,8 (azul de bromoti­

mol) con eolucián de WaOHN. Distribuir en tubos y esterilizar en

autoclaüe a 12090. durante 10 minutos.

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