A.A. Propiedades generales de las enzimasPropiedades generales de las enzimas

B. Principios fundamentales de su acción catalítica

Enzimas

C. Introducción a la cinética enzimática

D. Enzimas regulador

A) Propiedades generales de las enzimas

1. Son los catalizadores de las reacciones químicas en

los sistemas biológicos

2. Aceleran muchísimo la velocidad de las reacciones

(106 – 1014 veces).(10 – 10 veces).

3. La actividad

catalítica

depende de la

integridad de la

estructura

nativa

SITIO ACTIVO: SITIO ACTIVO:

Sitio de ligamiento: attracts and positions the substrate

Interacciones no covalentes

Cambios conformacionales

Grupos catalíticos: (the reactive side chains of amino acids or cofactors,which carry out the bond-breaking and bond-formingreactions involved)

HoloenzimaHoloenzima: : ApoenzimaApoenzima (parte (parte proteica, inactiva) +proteica, inactiva) +

Grupo prostético : hemo en los citocromos(unión fuerte, covalente)

Carácter inorgánico (iónes metálicos)

Cofactor (unión debil)

Carácter orgánico (NADH, FAD, Vitaminas, etc): Coenzimas

http://www.biorom.uma.es/contenido/cibertexto/enz/en z3.htm#mm

depa.pquim.unam.mx/proteinas/enzimas/img17.html

4. ESPECIFICIDAD DE SUSTRATO4. ESPECIFICIDAD DE SUSTRATOComplementariedad GeométricaComplementariedad GeométricaComplementariedad electrónica Complementariedad electrónica (grupos(gruposde los de los aaaa que forman el sitio de unión)que forman el sitio de unión)Absolutamente específicaAbsolutamente específicaSólo actúa sobre un sustratoGrupo específicaGrupo específicaActúa sobre moléculas que compartenuna característica estructural una característica estructural (gpo. funcional)Enlace específicaEnlace específicaCataliza una combinación específica deenlacesLas E son Las E son estereoespecíficasestereoespecíficas(en virtud de su (en virtud de su quiralidadquiralidadinherente a L inherente a L aaaa forman sitios activos asimétricos)forman sitios activos asimétricos)Actúa sólo sobre uno de los estereoisómeros(D o L)Las E varían en especificidad geométrica

5. La ACTIVIDAD de las E depende no solo del

mantenimiento de su estructura nativa sino del pH,

temperatura

6. Control regulatorio: 6. Control regulatorio:

Efecto sobre la actividad catalítica por un efector (activador o inhibidor) hasta el control de la expresión y el turnover de proteínas

Las enzimas alteran las velocidades de reacción pero no los equilibrios

(B) E + S ES EP E + P

(A) S P

energia de activación, v

(A) (B) Cambio de energia libre (equilibrio)

∆G fijación

Un equilibrio viene descripto por una constante de equilibrio

K´eq= [P]/ [S]

∆G’° = -RT ln keq

La constante de equilibrio es un reflejo de la variación de energía libre estandar gobal de la reacción

Para una reacción unimolecular la velocidad de una reacción viene Para una reacción unimolecular la velocidad de una reacción viene determinada por la concentración de sustrato (reactivos) y por una constante de velocidad (s-1)

V= k [S]

Si una reacción de primer orden tiene una constante de velocidad de 0,03 se puede interpretar que el 3% de sustrato será convertido en producto en un segundo

De donde De donde viene la viene la energía que energía que proporciona el proporciona el

Interacciones débiles no covalentes entre la

E y el S: puente hidrógeno,

interacciones iónicas e hidrofóbicas

Energía de fijación: es la principal fuente de energía libre utilizada utilizada por las

enzimas para disminuir la energía de activación de las reacciones

Disminuye la entropía

Disminuye la solvatación

Ayuda a la redistribución electrónicaCambios conformacionales: teoría del encaje inducido

Los grupos

La energía obtenida a partir de la formación de una sola interacción debil es entre 4-30 KJ/mol

proporciona el proporciona el descenso descenso espectacular espectacular de la Energía de la Energía de activaciónde activación

Interacciones covalentes entre la E y el S reducen la energía de activación:

Los grupos funcionales catalíticos

pueden formar enlaces covalentes

transitorios

Los grupos funcionales del S pueden transferirse

transitoriamente a la Enzima

La energía de fijación entre enzima y sustrato proporciona especificidad de reacción y

catálisis

30 KJ/molPara una reacción global se necesitan 60-100 kJ/mol

SITIO ACTIVO: SITIO ACTIVO:

Sitio de ligamiento: attracts and positions the substrate

Interacciones no covalentes

Cambios conformacionales

Grupos catalíticos: (the reactive side chains of amino acids or cofactors,which carry out the bond-breaking and bond-formingreactions involved)

Mecanismos Mecanismos catalíticoscatalíticos

Catálisis ácidoCatálisis ácido--basebase

Catálisis covalente o Catálisis covalente o nucleofílicanucleofílica

Intermediario cargado inestableIntermediario cargado inestable

Descomponer en sus Descomponer en sus especies reactivasespecies reactivas

Se puede estabilizar Se puede estabilizar transfiriendo protones transfiriendo protones (agua, (agua, aaaa, , acidosacidosorgánicos)orgánicos)

A-B A + BH2O

A-B + E-X: A-X + B A+X: + BH2O

Catálisis de iones metálicosCatálisis de iones metálicos

Efectos de proximidad y Efectos de proximidad y orientaciónorientación

Unión preferencial del complejo del estado Unión preferencial del complejo del estado de transiciónde transición

1. Por unión a sustratos para orientarlos adecuadamente2. Por mediación de reacciones de oxidoreducción3. Por estabilización electrostática o protección de las cargas negativas

La mayoria de las enzimas utilizan una combinación de estrategias catalíticas para conseguir un incremento de la velocidadGrupos catalíticos específicos contribuyen a la catálisis

Catálisis covalente: ruptura de enlace peptidicoCatálisis básica: grupo hidroxilo actua como nucleófilo

* La presencia de restos aminoacídicos cargados en el centro activo puede estabilizar el estado de transición, y por tanto contribuir a la

catálisis enzimática.La catálisis enzimática debida a un mecanismo de catálisis ácido-base

concertada, es muy frecuente, y como ejemplo podemos ver la hidrólisis de un éster por una esterasa:

Variables o factores que influyen en la velocidad de unareacción enzimática

La cinética enzimática como método para comprender el mecanismo de acción de una enzima

1. Concentración de sustrato2. Concentración de enzima3. pH4. Temperatura5. Efectores (Activadores e Inhibidores)

La concentración de sustrato afecta la velocidad de reacción catalizada por enzimas

+ E + Buffer de pH apropiado

Una cinética hiperbólica implica un proceso saturante:

Hipótesis de Michaelis - Menten

E + S ES E + Pk+1

k-1

k+2

- La primera parte del mecanismo,

La concentración de sustrato afecta la velocidad de una reacción catalizada por Enzimas

E + S ESk+1

k-1

Tiene lugar mucho más rápidamente que la segunda:

ES E + Pk+2

Hipótesis de Michaelis - Menten

E + S ES E + Pk+1

k-1

k2

EQUILIBRIO RÁPIDO

La segunda reacción es la mas lenta. El paso que limita la velocidad de la reacción, es la descomposición del complejo ES

Significado de la constante Km

1. Constante de equilibriode disociación del complejo ES(en condiciones de equilibrio rápido)

2. Medida inversa de la afinidadde la enzima por el sustrato(en condiciones de equilibrio rápido)

3. Mide la función de fijación (en cond.de equilibrio rápido)

4. Concentración de sustrato para la que la velocidad se haceigual a la mitad de la máxima (V0.5)

5. Se define para un complejo enzima-sustrato

6. Se mide en unidades de concentración

Km = (k-1 + k+2)/k+1 en mecanismo de E.E.

E + S ES E + Pk+1

k-1

k+2

Cuando k2 es menor que K-1Km = k-1/k+1

Entonces Km se define como una constante de disociación del complejo ESMuchas veces las reacciones enzimáticas transcurren en pasos múltiples después de la formación del complejo ES, en estos casosKm es una función compleja de muchas constantes de velocidad

� La quimiotripsina,por ejemplo, procede con un mecanismo de este tipo:

K1

Del primer complejo ES se libera velozmente un primer producto P1Mientras el complejo ES' tiende a acumularse en tanto la constantecinetica de trasformacion en E y P2 resulta mas pequeña que la constantecinetica de transformacion del complejo ES in ES' ( k4<<k3).

En este caso Vmax = K4 [Et]

Por ello es útil definir una constante de velocidad mas general: Kcat para describir la velocidad limitante de cualquier reacción enzimática en condiciones de saturación

[S] << Km v= kcat/km [E] [S]Velocidad de segundo orden

� La kcat es una constante de velocidad limitante de cualquier�reacción en condiciones de saturación.En un mecanismo simple de Michaelis-Menten o Briggs-Haldanekcat = k2 .

� La constanteconstante cataliticacatalitica kk catcat numeronumero dedeturnoverturnover oo recambiorecambio

Cuando la enzima es saturado por el sustrato es decir

[S] >> km :

La comparación de la eficiencia catalítica de diferentes enzimas requiere la selección de parámetros adecuados. La selección de Kcat no es totalmente satisfactoria. DOS E QUE CATALIZAN REACCIONES DIFERENTES PUEDEN TENER LA MISMA kcat

� Un parámetro mas útil es laconstante de especificidad

Para [S] << Km la Para [S] << Km la ecuaciónecuación VmaxVmax

asume la siguiente forma:

El cociente kcat/Km es una constante de velocidad aparente de segundo orden para la formación de E+P a partir de E+S cuando el proceso depende del encuentro de E con S ([S] << Km).

Límite superior de Kcat/Km 108 y 109 M-1 S-1 Perfección catalítica

= Vmax/Km [S]

Representación s -s/v(Eadie - Hofstee)

s/v

0.6

0.8

1.0

1.2

s-20 0 20 40 60 80 100 120

0.0

0.2

0.4

0.6

s

v Vs

K

Vmx

m

mx

= ⋅ +1

-Km

Representación v/s - v(Wong - Hanes)

v

80

100

v Kv

sVm mx= − ⋅ +

Vmax

v/s0 2 4 6 8 10 12 14 16

0

20

40

60

Los enzimas poseen grupos químicos ionizables (carboxilos -COOH; amino -NH2; tiol -SH; imidazol, etc.) en las cadenas laterales de sus aminoácidos. Según el pH del medio, estos grupos pueden tener carga eléctrica positiva, negativa o neutra. Como la

Efecto del pH

neutra. Como la conformación de las proteínas depende, en parte, de sus cargas eléctricas, habrá un pH en el cual la conformación será la más adecuada para la actividad catalítica. Este es el llamado pH óptimo.

COO-

CH2

CH2

COO-

+H3NC

NH

NH

CH

+H N

Arg

Lys

Succinato ycentro activo de SDHpH 7

+H3N

CH

Lys

COOH

CH2

CH2

COOH

+H3NC

NH

NH

CH

+

Succinato ycentro activo de SDH,pH 2

+H3N

CH

COO-

CH2

CH2

COO-

H2NC

NH

NH

CH

H NH2N

CH

Succinato ycentro activo de SDH,pH 13

Efecto de la temperaturaEfecto de la temperatura

Log V

1/T

1. Aceleración de la reacción por la T según la ecuaciónde Arrhenius

k = A exp (-Ea/RT)En condiciones definidas de pH, fuerza iónica y S

log v = log C – Ea/2,3RT

EfectoresEfectoresMuchas sustancias alteran la actividad de una E al combinarseMuchas sustancias alteran la actividad de una E al combinarsecon ella en una forma que influencia la unión con el S, su número con ella en una forma que influencia la unión con el S, su número de recambio o ambosde recambio o ambos

Inhibidor: Efector que hace disminuir la actividad enzimática, a través De interacciones con el centro activo u otros centros específicos(alostéricos).

Esta definición excluye todos aquellos agentes que inactivan ala enzima a través de desnaturalización de la molécula enzimática

De esta forma, habrá dos tipos de inhibidores:

I. Isostéricos: ejercen su acción sobre el centro activoII. Alostéricos: ejercen su acción sobre otra parte de la

molécula, produciendo un cambio conformacional conrepercusión negativa en la actividad enzimática.

Los inhibidores isostéricos pueden ser de dos tipos:

1. Inhibidor reversible: establece un equilibrio con la enzima libre, con el complejo enzima-substrato o con ambos:

E + I EI

2. Inhibidor irreversible: modifica químicamente a la enzima:

E + I E’

ES + I ESI

Inhibición reversible

(a) El inhibidor se fija al centro activo de la enzima libre, impidiendo la fijación del sustrato: Inhibición Competitiva

(b) El inhibidor se fija a la enzima independientemente de que lohaga o no el sustrato; el inhibidor, por tanto, no impide lafijación del sustrato a la enzima, pero sí impide la acciónfijación del sustrato a la enzima, pero sí impide la accióncatalítica: Inhibición No Competitiva

(c) El inhibidor se fija únicamente al complejo enzima-sustratouna vez formado, impidiendo la acción catalítica; este tipose conoce como Inhibición Anticompetitiva

E ES

EI

I

S

E + P

Se define una constante deequilibrio de disociación delinhibidor:

K i = [E] [I]

[EI]

Inhibición Competitiva

EICaracterísticas:- Las fijaciones de sustrato e inhibidor son mutuamente excluyentes- A muy altasconcentraciones de sustrato desaparece la inhibición- Por lo general, el inhibidor competitivo es un análogo químicodelsustrato.

-El inhibidor es tan específicocomo el sustrato--Un inhibidor competitivo reduce la [E] libre disponible para la unión Un inhibidor competitivo reduce la [E] libre disponible para la unión --con el Scon el S

inhibidor:K i = [EI]

Km aparente = α Km

α= Km aparente/km

α= 12/8 = 1,5

Problema 1: En ausencia de un inhibidor competitivo una E tiene un Km= 8 µ M y en presencia de 3 µ M de inhibidor tiene un km aparente de 12 µ M . Calcule Ki

α= 12/8 = 1,5

α= 1 + [ I ] / ki

Ki = [ I ] / α - 1

Ki = 3/1,5- 1 = 6 µM

Por tanto, en la inhibición competitiva,

1. El efecto cinético del inhibidor es el aumento aparente de laKm, que aparece multiplicada por el factor (1 + I/Ki)

2. La Vmax no aparece modificada; para concentraciones muy 2. La Vmax no aparece modificada; para concentraciones muy altas del sustrato, v = Vmax, igual que en ausencia de inhibidor

3. Cuanto más pequeño sea el valor de Ki mayor será la potenciadel inhibidor competitivo.

COO-

CH2

CH

FAD FADH2COO-

CH

Succinato deshidrogenasa COO-

CH2

COO-

Malonato

Inhibidorescompetitivos

No puede CH2

COO-

CH

COO-

Succinato Fumarato

SDH

COO-

C O

CH2

COO-

Oxalacetato

No puede deshidrogenarse

Un paso más allá en el desarrollo de inhibidores potentes es el concepto de Análogo de Estado de Transición (AET)

- El inhibidor no es estrictamente análogo del sustrato,sino del Estado de Transición de la reacción.sino del Estado de Transición de la reacción.

- La afinidad de las enzimas por los AET es enorme, delorden nM o pM, con lo que la fijación es tan fuerte quepuede considerarse irreversible

O2N OC

O

O

N+H3C

CH3

CH3

Sustrato

O2N OC

ON+

H3CCH3

CH3

-O O-

Estado de transición

H CO

O2N OP

ON+

H3CCH3

CH3

-O O-

O2N OH + ON+

H3C

CH3

CH3

C

O

HO Productos

Análogo deestado de transición

E ESI

S

E + PI

SInhibición

No Competitiva

Inhibición no competitiva

EI ESI

S No Competitiva

El inhibidor se fija indistintamente a la enzima libre Ey al complejo enzima-sustrato ES; ni el complejo EIni el complejo ESI son productivos

αααα’/Vmax

E ES

S

E + PI

Inhibición

Ks K3

KI

ESI

InhibiciónAnticompetitiva

El inhibidor sólo puede fijarse reversiblemente al complejo ES;el complejo ESI no es productivo

αααα’/Vmax

αααα´/Km

Inhibición Irreversible

- Los inhibidores irreversibles reaccionan con un grupoquímico de la enzima, modificándola covalentemente

-Su acción se describe por una constante de velocidad k i:

E + I E’E + I E’

- A diferencia de la inhibición reversible, el efecto de losinhibidores irreversibles depende del tiempo de actuacióndel inhibidor.

- Los inhibidores irreversibles son, por lo general, altamentetóxicos.

Algunos tipos de inhibidores irreversibles

1. Reactivos de grupos -SH

2. Organofosfóricos2. Organofosfóricos

3. Ligandos de metales

4. Metales pesados

Reactivos de grupos -SH, 1

(a) Agentes alquilantes

E SH E S CH2 COO-

ICH2 COO- IHYodoacetato

(b) Compuestos insaturados

N CH2 CH3

O

O

E SHE S

N CH2 CH3

O

O

N-Etil maleimida (NEM)

Reactivos de grupos -SH, 2

(c) Formadores de mercáptidos

HOHg COO-

E SH E S Hg COO-

p-Hidroximercuribenzoato

E SH E S Hg COO-

(d) Oxidantes

Promueven la oxidación de dos tioles a un disulfuro

Organofosfóricos

CH CH2 OHSer

PF O

CHCH3H3C

CH CH2 O P O

CH

CH

H3C CH3

CH3H3C

Ser

PF O

CHH3C CH3

DFP:diisopropilfluorofosfato

- Actúan sobre enzimas serínicas- Únicamente sobre la Ser activa- Insecticidas: Parathion, Malathion- Inhibidores de la Acetilcolinesterasa- Neurogases

Ligandos de coordinación de metales

Es el caso del ion cianuro, CN-

Se fija con gran afinidad a la sexta posición de coordinacióndel Fe hemínico, impidiendo toda modificación posterior.

Por ello actúa sobre sistemas de Fe hemínico con la sexta posición de coordinación libre, como la citocromo oxidasa, de lo que deriva su elevadísima toxicidad

Inhibidores suicidas(Inhibidores activados enzimáticamente)

- Se trata de moléculas que se unen al centro activo de maneraespecífica, igual que el sustrato o los inhibidores competitivos

- Una vez unidos al centro activo, la enzima transforma lamolécula en una especie química muy reactiva que modificacovalentemente a la enzima, inactivándola

- Tienen por tanto (a) la especificidad del inhibidor competitivola especificidad del inhibidor competitivoy (b) la potencia de los inhibidores irreversiblesla potencia de los inhibidores irreversibles

E + I EI EI* E’ + I*

Modo de acción de los inhibidores suicidas

1 2 3

1. El inhibidor se fija a la enzima igual que el sustrato o un1. El inhibidor se fija a la enzima igual que el sustrato o uninhibidor competitivo convencional

2. La acción catalítica de la enzima convierte al inhibidor Ien una especie altamente reactiva I*

3. I* modifica covalentemente a la enzima, inactivándolade forma definitiva al igual que un inhibidor irreversible.

Ejemplos de inhibidores suicidas, 1

- Sistema de la ββββ-lactamasa bacteriana

La utilización masiva de antibióticos ββββ-lactámicos (penicilinas,sus derivados semisintéticos y cefalosporinas) ha conducido ala aparición de resistencias a los mismos.

Los microorganismos resistentes a estos antibióticos lo son porproducir una enzima, la ββββ-lactamasa, que inactiva a los antibióticos ββββ-lactámicos.

R CO NH S

NO

CH3

CH3

COO-

ββββ-Lactamasa

Penicilina (activa)

R CO NH S

HN

CH3

CH3

COO-

CO

O-

ββββ-Lactamasa

Ác.peniciloico (inactivo)

Muy a menudo los preparados de penicilinas o penicilinassemisintéticas se formulan añadiendo un inhibidor suicidade la ββββ-lactamasa, el ácido clavulánico

O

NO

COO-

CCH2OH

Hββββ-Lactamasa O

HN

COO-

CCH2OH

H

CO

O-

Ác.clavulánico COO

O

HN

COO-

CCH2OH

H

CO

OCH2CHSer

Esta moléculareacciona con la

serina activa de laββββ-lactamasa,

produciendo suinactivación

Ác.clavulánico

Reacciones Reacciones multisustratosmultisustratos

ATP: hexosa fosfotransferasa

Nombre sistemático:

Donador Aceptor

Grupo transferido

Sustrato Km

ATP 0,4

D-glucosa 0,05

D-fructosa 1,5

Grupo 1: OxidorreductasasCatalizan reacciones de oxidorreducción

Ared + Box Aox + Bred

Glucosa + OGlucosa + O2

Grupo 2: Transferasas

Catalizan reacciones de transferencia de grupo:

A-X + B A + B-X

Dador: Aceptor - Grupo transferido - transferasaDador: Aceptor - Grupo transferido - transferasa

ATP: D-Hexosa FosfotransferasaEC 2.7.1.1

Nombre común: hexokinasa

Grupo 6: Ligasas

Catalizan la unión de dos grupos químicos a expensasde la hidrólisis de un enlace de alta energía.

A + B + ATP A-B + ADP + PiA + B + ATP A-B + ADP + Pi

O bien

C + D + ATP C-D + AMP + PPi

Mecanismos cinéticos de las reacciones con más Mecanismos cinéticos de las reacciones con más

de un sustratode un sustrato

11-- Desplazamiento simple: OrdenadoDesplazamiento simple: Ordenado-- al azaral azar

22-- Doble desplazamiento o ping pongDoble desplazamiento o ping pong

Desplazamiento simple ordenado

SS11= A= A

SS22=B=B

PP11= P= P

PP22= Q= Q

NAD Y NADPH NAD Y NADPH

(SUST.CONDUCTOR o (SUST.CONDUCTOR o

SUSTRATO ADELANTADO)SUSTRATO ADELANTADO)

DESHIDROGENASASDESHIDROGENASAS

AA BB PP QQ

EE

EAEA (EAB)(EAB)--(EPQ)(EPQ)EQEQ EE

AA PP BBQQ

EE

EAEA--EPEP FF FBFB--FQFQ EE

D-GALACTOSA+ATP-Mg+2D-GALACTOSA-1P +ADP -Mg+2

galactoquinasa

Desplazamiento simple al azarDesplazamiento simple al azar

PingPing--PongPong

E

E-N + R-OPO3-2 E-N-PO3

-2

R-OH

ENPO3-2 EN + R*-OPO3-

2

R*OH

fosfogliceromutasa

E-SH + CH3COSCoA E-SHCH3COSCoA ES-COCH3

HSCoA

ESH + RNHCOCH3

RNH2

COOH

CHH2N +

COOH

C O

COOH

CHH2N

COOH

C O +

Aminotransferasas (Transaminasas)

Catalizan la interconversión reversible de aminoácidosy cetoácidos. Utilizan piridoxal fosfato como cofactor

EnzEnz--pirCHOpirCHO

2

R1 R2

CHH2N

R2

C O

R1

+

Su papel es importantísimo en el metabolismo deaminoácidos. En clínica se determinan las siguientes:

EC 2.6.1.1, Aspartato aminotransferasa (AST, GOT)EC 2.6.1.2, Alanina aminotransferasa (ALT, GPT)

COO-

CH+H3N

CH2

COO-

+

COO-

C O

CH2

CH2

COO-

COO-

C

CH2

COO-

O

COO-

CH

CH2

CH2

COO-

+H3N

+

Aspartato aminotransferasa, EC 2.6.1.1 (AST, GOT)

COOCOO-

COOCOO-

Aspartato α-Cetoglutarato Oxalacetato Glutamato

Aparece en citosol y mitocondrias de tejidos metabólicamentemuy activos. Su nivel se eleva en el suero ante afeccioneshepáticas y miocárdicas.

Alanina aminotransferasa, EC 2.6.1.2 (ALT, GPT)

COO-

CH+H3N

CH3

+

COO-

C O

CH2

CH2

COO-

C

CH3

O

COO-

CH

CH2

CH2-

+H3N

+

COO- COO-

α-Cetoglutarato GlutamatoAlanina Piruvato

Enzima citosólica, de elevada concentración en el parénquimahepático. Se considera casi específica de lesión hepática.

CH3

N CH2 COOHCHN

NH2

ATP ADP CH3

N CH2 COCHN

NH2

O P O-

O-

O

Creatina Creatin fosfato

Creatin kinasa, EC 2.7.3.2 (CK, CPK)

Creatina Creatin fosfato

Creatin fosfato es una forma de almacenamiento de enlacesricos en energía en el tejido muscular. Es el prototipo de loscompuestos conocidos como fosfágenos.

v =v =VVmaxmaxss

KKmm + s+ s

VV [[[[[[[[AA]]]]]]]][[[[[[[[BB]]]]]]]]

En un mecanismo de desplazamiento simpleEn un mecanismo de desplazamiento simple

v =v =VVmaxmax 11 [[[[[[[[AA]]]]]]]][[[[[[[[BB]]]]]]]]

KKmm BB [[[[[[[[AA]]]]]]]] + + KmKmAA [[[[[[[[BB]]]]]]]] + + [[[[[[[[AA][][][][][][][][BB]]]]]]]] + + K K ssAA K K mm

BB

En mecanismo al azar K K ssAA K K mmBB = K K ssBB K K mmAA

VV [[[[[[[[PP]]]]]]]][[[[[[[[QQ]]]]]]]]

PARA LA REACCION EN SENTIDO CONTRARIOPARA LA REACCION EN SENTIDO CONTRARIO

v =v =VVmaxmax 11 [[[[[[[[PP]]]]]]]][[[[[[[[QQ]]]]]]]]

KKmm QQ [[[[[[[[PP]]]]]]]] + + KmKmPP [[[[[[[[QQ]]]]]]]] + + [[[[[[[[PP][][][][][][][][QQ]]]]]]]] + + K K ssQQ K K mm

PP

En mecanismo al azar K K ssAA K K mmBB = K K ssBB K K mmAA

Para A variable y B constante y saturantePara A variable y B constante y saturante

REPRESENTACION GRAFICA DE 1/V EN F DE 1/A A CONCENTRACION FIJA DE B

v =v =VVmaxmax [[[[[[[[AA]]]]]]]][[[[[[[[BB]]]]]]]]

KKmm BB [[[[[[[[AA]]]]]]]] + + KmKmAA [[[[[[[[BB]]]]]]]] + + [[[[[[[[AA][][][][][][][][BB]]]]]]]] + + K K ssAA K K mm

BB

v =v =VVmaxmax [[[[[[[[AA]]]]]]]][[[[[[[[BB]]]]]]]]

KKmm BB [[[[[[[[AA]]]]]]]] + + KmKmAA [[[[[[[[BB]]]]]]]] + + [[[[[[[[AA][][][][][][][][BB]]]]]]]]

Doble desplazamiento o ping pongDoble desplazamiento o ping pong

KKmm BB [[[[[[[[AA]]]]]]]] + + KmKmAA [[[[[[[[BB]]]]]]]] + + [[[[[[[[AA][][][][][][][][BB]]]]]]]]

11

vv=

K mK mAA

VmaxVmax

11

[[[[[[[[AA]]]]]]]]++

11

VmaxVmax

((((((((1 + K m1 + K mBB))

[[[[[[[[BB]]]]]]]]

11

vv=

K mK mAA

VmaxVmax

11

[[[[[[[[AA]]]]]]]]++

11

VmaxVmax

((((((((1 + K m1 + K mBB))

[[[[[[[[BB]]]]]]]]

Mecanismo Producto inhibidor

Sustrato variable

A B

Ordenado P NC NC

Los mecanismos de reacción pueden caracterizarse además medianteestudios de inhibición por los productos de reacción

Ordenado P NC NC

Q C NC

Al azar P C C

Q C C

Ping-Pong P NC C

Q C NC

Enzimas reguladorasEnzimas reguladoras1. Enzimas 1. Enzimas alostéricasalostéricas

Son reguladas por unión noSon reguladas por unión no--covalente de covalente de moduladoresmoduladoresmoduladoresmoduladores

2. Enzimas reguladas por 2. Enzimas reguladas por modificación covalentemodificación covalente

Retroalimentación negativa en vías metabólicas, 1

Thr α-cetobutirato IleTreonina

desaminasa

Síntesis de Isoleucina

desaminasa

El producto final de la ruta, Isoleucina, inhibe a la primeraenzima de la misma, Treonina desaminasa

Retroalimentación negativa en vías metabólicas

Asp + CP Carbamil aspartato CTP

Síntesis de pirimidinas

ATCasa

ATP+

ATCasa

El producto final de la vía, CTP (citidin trifosfato) inhibe a laprimera enzima de la ruta metabólica, Aspartato transcarbamilasa

Al mismo tiempo, dicha enzima puede ser activadapor ATP

Rutas metabólicas controladas por retroalimentación

Glicolisis Fosfofructokinasa ATPNeoglucogénesis FBP fosfatasa AMPBios. Ács. Grasos AcetilCoA carboxilasa AcilCoA

Ruta Enzima Inhibidor

Bios. Ács. Grasos AcetilCoA carboxilasa AcilCoABios. Colesterol HMGCoA reductasa ColesterolBios. Purinas PRPP sintetasa AMP,GMP,IMP

1 2

1: Arogenato deshidratasa: inhibida por Phe y activada por Tyr

2: Arogenato deshidrogenasa inhibida por Tyr

En el estudio de las enzimas controladas por realimentaciónnegativa, se comprobaron una serie de regularidades en las mismas:

1. Primer paso de una ruta metabólica o punto de ramificación2. Enzimas de naturaleza compleja: subunidades; la enzima puede

desensibilizarse a sus inhibidores por diversos métodos.3. Los inhibidores se comportan como competitivos (elevan el valor

de la K aparente, pero sin embargo no son análogos estructuralesde la Km aparente, pero sin embargo no son análogos estructuralesdel sustrato

Estas últimas características lleva al concepto de alosterismo:Una acción sobre la actividad enzimática que se desarrollafuera en el sitio de fijación fuera del sitio catalítico (Jacob y Monod, 1960)

Modelo de simetría- Modelo secuencial

s si

Centroactivo

Centroalostérico

Centroalostérico

Centroactivo

En ausencia de inhibidor,el sustrato se fija normal-mente al centro activo

Cuando el inhibidor ocupael centro alostérico, tienelugar un cambio conformacionalen el centro activo que impide lafijación del sustrato

Inhibición alostérica

Acción de un activador alostérico

(esquema de una subunidad)

Acción de un inhibidor alostérico

(esquema de una subunidad)

Otra característica importante de las enzimas alostéricases que presentan cinéticas anómalas, normalmentecinéticas sigmoides:

v

s

La presencia de unasigmoide implicala existencia decooperatividaden lafijación del substrato

Un incremento pequeño en la concentración de SSe pueden asociar con grandes cambios en la actividad De la E

La cooperatividad (positiva) consiste en que la fijación de unamolécula de sustrato favorece la fijación del siguiente, y asíhasta ocuparse toda la molécula

s s s ss ss

ss s

+ + +

1 2 3s s s1 2 3

En términos de Km veríamos que Km1 > Km2 > Km3

Existe también cooperatividad negativa, cuando la fijación deuna molécula de sustrato dificulta la fijación del siguiente.

El comportamiento cooperativo implica:

1. Que hay más de un sitio de fijación de sustratopor molécula de enzima (estr.cuaternaria)

2. Que hay interacciones entre los sitios de fijación

Efecto de moduladores positivos y

Enzima homotrópica S es el efector

Efecto de moduladores positivos y negativos que no afectan la Vmax

Efecto de moduladores positivos y negativos que no afectan la K0,5 pero si la Vmax

Enzimas reguladoras

2. Modulación covalente reversible

• Fosforilación

• Adenililación

• Uridililación

• ADP-ribosilación

• Metilación

• Carbamilación

Formas de modificación covalente, 1

Fosforilación: Protein kinasas

Ser

ATP ADP

Ser

C

NC

C CH OHO

H

R H

H

CN

CC CH O

O

HR

P O-

O

H

H

Sobre residuos de Ser, Thr y Tyr

Ser SerC

NC

CN

CH2OH

HO

R'H

H

H

CN

CC

N

CH2OH

OR'

H

P O-

O-

H

H

Formas de modificación covalente, 2

Defosforilación: Protein fosfatasas

Ser Ser

C

NCO

H

R HC

NCO

H

R

-

O

HH2O Pi

Sobre residuos previamente fosforilados: Ser-P, Thr-P, Tyr-P

Ser Ser CN

CC

N

CH2OHH

OR'

H

H

H

CN

CC

N

CH2OH

OR'

H

P O-

O-

H

H

Formas de modificación covalente, 3

Adenilación: Sistema de la Glutamina sintetasa

N N

N

H2NC

N

CO

HR

O

H

Tyr O

OH OH

N NC

CN

C

CN

O

H

O

R'H

CH2 O P

O-

O CH2H

H

Formas de modificación covalente, 4

ADP-ribosilación: actúa NAD+ como donador delgrupo ADP-ribosa

HH2N

CR H

H

H

O

OH OH

N

N N

N

+

CN

CC

NC

CN

OH

R

HO

R'H

NHC

NH2

N

O

OH OHCH2 O P O P O CH2

O O

O-O-H

Activación de la Rubisco por carbamilación

Formas de modificación covalente, 5

Rotura proteolítica:

Proteinasa

N C Zimógeno

Proteinasaespecífica

+N N CC

Enzima activada

Protrombina (II)

Protrombinasa

Precursores,vía intrínseca

Fase 1Fase 2

Fibrinógeno (I)Monómero

de fibrina (Ia)Polímerode fibrina

Trombina (IIa)

Precursores,vía extrínseca

Fase 3