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Uso de Enzimas de restricción
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ENZIMAS DE RESTRICCINENZIMAS DE RESTRICCIN
Vector de clonacin digerido con EcoRI y
PvuII
ADNLigasa
Extremos cohesivos Extremos romos
Sitio de corte
ADN cromosmico
Sitio de corteSecuencias de reconocimiento
Tipos de enzimas de restriccin
Tipo IIs: Reconocen secuencias no palindrmicas, 4-7 pb. Sitio de corte en la secuencia y hasta 20 pb de distancia
Restriccin-modificacin
mG-A-A-T-T-CC-T-T-A-A-G
mEcoRIEcoRI
mG-A-A-T-T-CC-T-T-A-A-Gm
mG-A-A-T-T-CC-T-T-A-A-Gm
EcoRIEcoRI
G-A-A-T-T-CC-T-T-A-A-GEcoRIEcoRI
G-A-A-T-T-CC-T-T-A-A-G
G A-A-T-T-CC-T-T-A-A G
Plantas: metilacin m5CG y m5CNG.
Uso de endonucleasas con diferente sensibilidad a metilacin:McClelland M. 1983. The frequency and distribution of methylatable DNA sequences in leguminous plant protein coding genes. J. Mol. Biol. 19: 346-354
Vertebrados: metilacin de la C en secuencias CG en el C5, generando 5-metilcitosina: m5CG. Secuencias (islas) CpG, implicadas en regulacin de la transcripcin.HpaII, MspI: isosquizmeros, reconocen C/CGG
La metilacin del ADN en eucariotas superiores est relacionada con la regulacin de la transcripcin. El uso de algunas enzimas de restriccin especficas permite distinguir entre ADN metilado y no metilado, obtenindose de esta manera informacin sobre la posible regulacin de la expresin de un gen por metilacin del ADN
Metilacin del ADN y digestin con enzimas de restriccin
Sistema dam: metila la A de la secuencia GATC en el N6, generando 6-metiladenina: Gm6ATC.PvuI, BamHI, BclI, BglII, XhoII, MboI y Sau3AI (/GATC)ClaI: AT/CG*ATXbaI: T/CTAG*A
Sistema dcm: metila la C interna de la secuencia CC(A/T)GG en el C5, generando 5-metilcitosina: Cm5CWGGEcoRII: /CCWGG, BstNI: CC/WGGStuI: AGG/C*CT
DpnI: Es una enzima de restriccin que corta en la secuencia GATC slo si est metilada por dam (Gm6ATC). Utilizada en algunos protocolos de PCR para eliminar ADN plasmdico proveniente de la bacteria sin afectar al sintetizado in vitro.
ENZIMAS DE RESTRICCIN
Reconocen secuencias concretas
Simetra (palndromes)
Ejemplos de palndromes
Dabale arroz a la zorra el abad La ruta natural A man, a plan, a canal: Panama
Enzimas de restriccin
Reconocen secuencias concretas Simetra (palndromes) Nmero de nucletidos en la secuencia
44
N1N2N3N4N5N6N1N2N3N4 N1N2N3N4N5N6N7N8
46 48
256 4096 65536
Sitios de corte de las endonucleasas de restriccin del tipo II
Tipo IIs: MboII
Extremos protuberantes
GAATTCCTTAAG
G-3CTTAA-5
5-AATTC3-G
EcoRI
5 protuberantes
Extremos protuberantes
CTGCAGGACGTC
CTGCA-3G-5
5-G3-GACGTC
PstI
3 protuberantes
Extremos romos
CCCGGGGGGCCC
CCC-3GGG-5
5-GGG3-CCC
SmaI
Extremos compatibles (I)
GAATTCCTTAAG
GAATTCCTTAAG
EcoRI
GAATTCCTTAAG
EcoRI
Extremos compatibles (II)
GTCGAGCAGCTC
GTCGACCAGCTG
SalI
CTCGAGGAGCTC
XhoI
Extremos romos (siempre compatibles)
CCCATCGGGTAG
CCCGGGGGGCCC
SmaI
GATATCCTATAG
EcoRV
Extremos no compatibles rellenados, transformados en romos (siempre compatibles)
GAATTCCTTAAG
EcoRI
CTCGAGGAGCTC
XhoI
G-3CTTAA-5AA T-3T
5-TCGAG3-CTCG3-A
GAATTCTTAA
TCGAGAGCTC
Degradado de cadena sencilla
+ dNTPs
Rellenado parcial
Extremos no compatibles transformados en compatibles
AAGCTTTTCGAA
HindIII
TCTAGAAGATCT
XbaI
A-3TTCGA-5AG-3
5-CTAGA3-CC3-T
AAGTTCGA
CTAGATCC+ dATP, + dGTP
+ dCTP, + dTTP
Precauciones
Actividad star
Metilacin
Aspectos prcticos
Unidad: Cantidad de enzima que digiere 1 g de ADN en 1 hora a la temperatura y condiciones ptimas.
Inhibicin: Adicin de 20 mM EDTA.
Inactivacin: Por calor o tratamiento con fenol-CIA
Dos enzimas de restriccin pueden utilizarse simultneamente siempre que compartan las mismas condiciones de digestin (temperatura, pH, concentracin de sales)