Enzimas - enobiotec.files.wordpress.com · •Invertasa •Lisozima Son considerados ^Aditivos, por lo ... Proceso mejorado Perfil de la actividad Beneficios para el enólogo Mejora

DR. PATRICE PELLERIN

DIRECTOR TÉCNICO DE OENOBRANDS

Enzimas

ORIGEN PRODUCCIÓN LEGISLACIÓN

QUE son las Enzimas ?

Clases de Enzimas: qué es el número EC?

• EC = “Enzyme commission” , parte de IUBMB

• 1er número describe el tipo de reacción EC 1. oxidoreductasas

EC 2 Transferasas (acil metil, fosforil,..)

EC 3 Hidrolasas

EC 4 liasa = el enlace covalente se rompe sin hidrólisis

EC 5 isomerasa : Glucosa en fructosa

EC 6 ligasas : crea un enlace covalente

Clases de Enzimas: qué hidrolasas ?

• EC 3 Hidrolasas

EC 3.1 hidrólisis de enlaces éster

EC 3.2 glicosidasas

EC 3.3 hidrolisis de enlaces éter

EC 3.4 hidrolisis de enlaces péptidos

13 en total

Clases de Enzimas : glicosilasas ?

• EC 3.2.1 rompe enlaces O- y S-glicosil

• El último dígito describe el sustrato EC 3.2.1.1 . Alfa-amilasa

EC 3.2.1.4 Celulasa

EC 3.2.1.8 endo-xilanasa

EC 3.2.1.15 Poligalacturonasa

EC 3.2.1.21 beta-glucosidasa

till EC 3.2.1.184 diacetil bacillosamine epimerasa

Enzimas Industriales: orígenes?

• Hongos : A. niger , A. aculeatus, A. oryzae

Trichoderma longibrachiatum, reseei, harzianum

Disporotrichum dimorphosporum

Talaromyces emersonii

…


• Bacterias: Bacillus subtilis

Bacillus amyloliquefaciens

Bacillus licheniformis

Escherichia Coli

…


• Levaduras: S. cerevisiae

Kluyveromyces lactis

…


• Plantas: Malta de cebada

Papaya

Piña

…

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http://www.google.es/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=images&cd=&cad=rja&uact=8&ved=0ahUKEwiA4_zLiIvLAhVDVxQKHfGnDagQjRwIBw&url=http://www.imujer.com/salud/2010/09/01/beneficios-de-la-papaya&psig=AFQjCNGRsVbe9UVYOiNX5b3OqgRknbersA&ust=1456220056651009

http://www.google.es/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=images&cd=&cad=rja&uact=8&ved=0ahUKEwjLqPLiiIvLAhUI7xQKHabXAwYQjRwIBw&url=http://www.masquesalud.com/pina-propiedades-y-beneficiosos/&bvm=bv.114733917,d.d24&psig=AFQjCNGRLkj8HqXVKhRuV6X97JY9FdpBhQ&ust=1456220101553007


• Animales: Clara de huevo

Pancreas de cerdo

Estómago del becerro

…

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http://www.google.es/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=images&cd=&cad=rja&uact=8&ved=0ahUKEwjpicaOiovLAhVI7xQKHahgAp0QjRwIBw&url=http://oregonaitc.org/oregon-grown/oregon-grown-commodities/oregon-commodities-beef-cattle/&bvm=bv.114733917,d.d24&psig=AFQjCNHmwAzmf9KWRtQYIotOMBbry_CL3w&ust=1456220403323709

Producción de enzimas por fermentación: cuáles son los principales procesos?

• Fermentación Sumergida (líquida)

• SSF : “solid state fermentation”: fermentación en estado sólido

DSM Business Group

More than a century of enzyme technology

• En 1906...Una AMILASA de origen bacteriano es descubierta por un alumno del Instituto Pasteur de Lille, Auguste BOIDIN, fundador de RAPIDASE

…Es el origen de su empresa, y empieza a producir enzimas en Seclin (Francia)

Fermentación Sumergida Líquida

DFS France : Seclin

PRODUCTION

STRAIN

PRE-CULTURE

PHASE 1

PRE-CULTURE

PHASE 2

STAGE 1

INOCULUM

FERMENTATION

MAIN

FERMENTATION BROTH FERMENTATION

STORAGE

STAGE 2

SEPARATION

SOLID-LIQUID

(membranes filters)

FILTRATE

STORAGE

CONCENTRATION

(Ultra-Filtration)

_ _ _ _

FILTRATION ON

PLATE 1FILTRATE

STORAGE

CHROMATOGRAPHY

_ _ _ _

CONCENTRATION

(Ultra-Filtration)

Dairy product

AUTOLYSE/

KILLING (If necessary)

STAGE 3

STAGE 4

Liquid way

MIXING

STANDARDISATIONPACKAGING OF SOLID

ENZYME

SPRAY DRYING

(Granulation)FINAL PRODUCT

STORAGE

PACKAGING OF LIQUID

ENZYME

Solid way

STAGE 5

PERÍMETRO DE CERTIFICACIÓN DE SEGURIDAD ALIMENTARIA

FILTRATION

ON PLATE 2FORMULATION

Microfiltration

El Proceso de Producción DSM: Fermentación Sumergida Líquida

Enzimas Industriales: mercados de aplicación?

• Farmacéutica y salud • Diagnostic and analyses • Detergentes • Fuel etanol de 1ª y 2ª generación • Bioplásticos • Textil • Conversión de almidón • Alimentación animal • Mejora digestiva

“Food Enzymes” : mercados de aplicación?

• Food Panadería (amilasas, galactolipasas , xilanasas,

proteasas) Lácteos (lactasa, chymosine , proteasas, lipasas) Carne (transglutaminasa) Desgomado de aceite en refinado (fosfolipasa) Cervecería: glucanasas, xilanasas, amilasas Procesado de fruta: pectinasas, xilanasas, amilasas, AG Vino Alcohol: amilasas , AG Mayonesa (fosfolipasa) Galletas y “snacks” (asparaginasa)

Pan Cerveza Lácteos

Procesado de Frutas

Alcohol

Vino

Ejemplos de DSM « Food Enzymes » PRODUCIDAS EN SECLIN

Mayonesa

Tartas& snacks

Zumos de frutas

http://www.dsm.com/en_US/html/dfs/baking_home.htm

http://www.dsm.com/en_US/html/dfs/beer-home.htm

http://www.dsm.com/en_US/html/dfsfp/DFSFP_home.htm

http://www.dsm.com/en_US/html/dfs/potable_alcohol-home.htm

http://dsm.starbrand.com/scripts/dsm.exe?ctx=4597e1&open=BasketImage:003f2722

Las Enzimas y el etiquetado de los Alimentos: cuales son las reglas?

• Las enzimas son “coadyuvantes” de elaboración y no “Aditivos” Ausente en el producto final

Presente pero no “funcionalmente activo”

NO se requiere etiquetado en el producto final

Las Enzimas y el etiquetado de los Alimentos: las excepciones

• Invertasa

• Lisozima

Son considerados “Aditivos”, por lo que está sometidos a etiquetado

Regulación de las enzimas de vino

“OIV International Enological Codex and Code”

Regulación de la EU

18 | 04 | 2012

La aplicación de las enzimas en enología está definida por el “OIV International Enological

codex and Code”

Hasta 2013 Desde 2013

Pectinasas para la clarificación de mostos de uva

Pectinasas, celulasas, glucanasas, xilanasas para varias aplicaciones: maceración, rendimiento, clarificación , …

Beta-glucanasas para filtración de vinos

Beta-glucanasas para filtración y crianza sobre lías

Glicosidasas para la hidrólisis de precursores aromáticos de la uva

Ureasa para la prevención del carbamato de etilo en vinos

Ureasa para la prevención del carbamato de etilo

Lisozima para la prevención de contaminación microbiana durante la fermentación

Lisozima para la prevención de contaminación microbiana

18 | 04 | 2012

Enzimas enológicas

Enzimas Producción micro-organismo

Producción técnica

Formulaciones

Polisacarido-hidrolasas : pectinasas, celulasas, glucanasas, xilanasas …

A. niger, A. aculeatus, T. longibrachiatum….

Fermentaciones sumergida o de

superficie

Líquida glicerol/ KCl

Microgranuladas maltodextrina

Glicosidasas A. niger

Glucanasas T. harzianum, T sp.

Ureasa L. fermentum

Lisozima Clara de huevo Purificada por Cromatografía

Microgranulada pura

Enzimas, un poco de bioquímica

Qué es lo que parecen?

La energía de activación de una reacción

Energia de

activación

Progreso de la reacción

Ene

rgía

No-enzimática

Enzimática

Temperatura Óptima

Temperatura

Act

ivid

ad

estabilidad actividad

• La actividad enzimática es el resultado de

• Incremento de actividad a mayor Tª

• Por encima de cierta Tª las enzimas se inactivan rápidamente

La actividad relativa en relación con la temperatura: criterios esenciales para la elección de las enzimas!

Bacterial Alpha – amilasas

Bacillus licheniformis Bacillus amyloliquefaciens

pH óptimo

pH

Act

ivid

ad

• Las enzimas tiene un cierto rango de pH en la que son activas

• Fuera de este rango existe un fuerte decreciemento de la actividad de manera habitual

Enzimas: son fácilmente desnaturalizables?

• pH shocks

• Calor, con excepciones

– Amilasas termoestables

Mecanismo de desnaturalización de enzimas?

• Actividad de agua

• Las enzimas termoestables son mas hidrofóbicas

• Opciones para la ingeniería de proteínas

Hidrolasa de ruptura “Exo” y “endo”

18 | 04 | 2012

Las enzimas son una herramienta fundamental para cualquier elaboración de vino! 3 familias de Enzimas función de sus objetivos:

1. Mejora de Proceso 2. Mejora de la calidad del vino 3. Resolución de problemas

18 | 04 | 2012

Mejora del Proceso

Mejora de la calidad

Resolución de problemas

Debates en marcha

18 | 04 | 2012

Proceso mejorado Perfil de la actividad Beneficios para el enólogo

Mejora del Prensado & rendimiento mosto

Actividades Pectinasas activas en cadenas laterales de homogalacturónico y arabinan

Ahorro de costes, mas rendimiento de mosto

Clarificación del mosto por flotación

Pectinasa activa en homogalacturónico

Ahorro de tiempo y trabajo

Clarificación del mosto por desfangado estático


Ahorro de energía & agua

Clarificación de mostos y vinos por filtración

Pectinasa activa en homogalacturónico Glucanasas

Sostenibilidad: menos viñedo para el mismo volumen de producción

Termovinificación Pectinasa termoestables Más calidad de mosto: flor

Menos oxidación por menor tiempo de producción antes de la FA

Enzimas de Mejora de proceso

Fermentación

Mosto prensa Mosto yema

Dep. desfangado

Aplicación de pectinasas Para prensado& mejora del rendimiento

Despalillado

crianza / almacenamiento

Prensa

Rapidase® Extra Press Estrujado

1-3 ml / 100kg

Rapidase® Clear

1 ml / hl

enfriamiento

incrementa el mosto yema: 4 – 15% facilita& reduce el tiempo de filtración especialmente útil en prensados de uvas difíciles

18 | 04 | 2012

Mejora de los rendimientos de prensado

Rapidase® Extra Press

Rendimiento total : 790 Litros/Ton

Chardonnay, Cooperativa Languedoc France

Enzima : 2 g/100kg

2 h at 20 °C

Rendimiento total : 825 Litros/Ton

20%

7%

15% 5 %

80%

18 | 04 | 2012













Sostenibilidad: menos energía utilizada

Termovinificación Pectinasa termoestables Más calidad de mosto: flor



18 | 04 | 2012

Induce la reducción accelerada de la viscosidad del mosto Facilita la agregación de las borras Accelera la decantación de los sólidos Permite conseguir borras más compactas

Modo de acción bioquímico :

hidrolisis completa de la cadena principal (homogalacturonano) de las pectinas solubles hidrolisis parcial de las cadenas laterales (ramnogalacturonano) de las pectinas solubles Facilita interacciones electro-estáticas entre las particulas de borras Disminuye la viscosidad del mosto debido a la pectina soluble

Dosis : ~ 1 a 2 g/ Hl Temperatura > 12 °C Contacto entre 1 y 12 horas

Rapidase® Clear

18 | 04 | 2012













Sostenibilidad: menos energía utilizada

Termovinificación Pectinasa termoestables Mejor calidad de mosto: menor turbidez para mejor calidad del vino



18 | 04 | 2012






Time and labour savings



Energy savings



Sustainability : less energy used

Termovinificación Pectinasa termoestables Proceso no realizable sin enzimas


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Mejora del Proceso

Mejora de la calidad

Resolución de problemas

Debates en marcha

18 | 04 | 2012

Mejoras de la calidad

Perfiles de actividad

Aplicadas a la etapa del proceso

Beneficios para los enólogos

Liberación de precursores aromáticos de la piel de la uva

Pectinasas , Rgasas, Maceración de pieles de uvas tintas y blancas

Incremento de aromas de uva como tioles y terpenos, ….

Taninos y otros polifenoles

Pectinasas , Rgasas, Xilanasas, celulasas

Maceracion de uvas tintas

Incremento del color y polifenoles esenciales para la calidad del vino

Aromas glicosidados de la uva no volátiles convertidos en aromas volátiles

Glucosidasa, arabinosidasa, rhamnosidasa, apiosidasa

Aplicada al vino Incremento de terpenos y norisoprenoides

Liberación de compuestos específicos de la levadura

Beta-(1,6)-glucanasas

Crianza sobre lías, batonnage

Boca, aroma, mejora de la estabilidad

Enzimas de Mejora de la calidad

18 | 04 | 2012

Acelera y aumenta la extracción de los precursores aromáticos presentes en el hollejo de la uva durante la maceración pelicular El mosto escurrido (generalmente) no necesita nueva adición de enzima pectolíticas

Modo de acción bioquímico :

Degradación parcial de las paredes celulares del hollejo para liberar los precursores aromáticos de la uva hidrolisis avanzada de la pectina y de la protopectina , incluyendo las cadenas laterales de arabinanos hidrolisis parcial de las hemicelulasas

Dosis : entre 2 – 3 g/ 100kg Temperatura> 10 °C Contacto entre 2 y 18 h

Rapidase Expression Aroma

Aplicación de Rapidase Expression Aroma + Rapidase Clear en Sauvignon blanc de vendimia mecánica


Maceración en prensa ~ 2 horas a 15 °C Rapidase® Clear

1,5 g / 100kg

1 ml / hl de mosto al escurrir

+ 1 ml / hl después de 6

horas

Escurrido (55 % rendimiento)

tanque de desfangado estático + PVPP 10 g/hl

Prensa

Vendimia ~ 6 horas desde vendimia Intercambiador

hasta ~15 °C

16 horas después de escurrir la prensa :

Mosto limpio : 15 NTU, Pectina negativa

10,2 °Baumé

Intercambiador hasta 10 °C

18 | 04 | 2012

Enzimas de Maceración

pelicular y su impacto en

el aroma de los vinos

blancos

2008

IFV , Francia

18 | 04 | 2012

Enzimas de Maceración pelicular y su impacto

en el aroma de los vinos blancos

IFV Gaillac (France)-2008

Rapidase® Expression Aroma en Sauvignon blanc - extracción of precursores tiólicos - Uso combinado con levaduras de liberación/conversión - Impacto global en el perfil aromático del vino

Sauvignon blanc, AOC Gaillac,

8 tn/ha

20 Brix

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Enzima

Control No enzima


Rapidase Extra Color

Levadura

Fermivin TS28

Fermicru 4F9

2 Repeticiones x x

6 h maceración at 18°C, enzimas añadidas a 2 g/100kg ~ 65 kg uvas por ensayo

Enzimas de Maceración pelicular y su impacto en el aroma de los vinos blancos

18 | 04 | 2012

Los tioles

=> 12 micro-vinificationsen cuves de 30 Litres

CH3OH

SH

3-MercaptoHexan-1-ol (3MH)

60 ng/L

CH3OAc

SH

3-MercaptoHexyl acetato

4 ng/L

4-mercapto-4-metillpentan-2-one

0.8 ng/L

18 | 04 | 2012

=> 12 micro-vinificationsen cuves de 30 Litres

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

3MH (ng/l) Ac3MH (ng/l)

Control

R Expression aroma

R Extra Color

Media de 4 vinos , 2 cepas de levaduras No habia 4MMP en la uva

Enzimas de Maceración pelicular y su impacto en el aroma de los vinos blancos

18 | 04 | 2012

Mejoras de la calidad Perfiles de actividad Aplicadas a la etapa del proceso













Beta-(1,6)-glucanasas Crianza sobre lías, batonnage



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Enzimas de Maceración

pelicular y su impacto en

la calidad de los vinos

tintos

18 | 04 | 2012

Rapidase® Extra Color

Acelera e incrementa la extracción de polifenoles durante la maceración de uvas tintas

Modo de acción bioquímico:

Degradación de las células del hollejo y pulpa para la liberación rápida de color y precursores aromáticos Hidrólisis de la pectina y protopectina, incluido cadena de rhamnogalacturano Hidrólisis de las hemicelulasas

Recomendaciones de uso Adición a vendimia estrujada al llenar el dep. de fermentación Dosis : 1 - 3 g / 100kg Temperatura > 16 °C Tiempo de contacto: durante el tiempo de fermentación

18 | 04 | 2012

Rapidase® Extra Fruit

Favorece la extracción rápida de los precurosres aromáticos de los hollejos durante la maceración de uvas tintas Contribuye a la extracción de polifenoles

Modo de acción bioquímico: Degradación de las células del hollejo y pulpa para la liberación rápida de color y precursores aromáticos Hidrólisis de la pectina y protopectina Hidrólisis parcial de las hemicelulasas Recomendaciones de uso Adición a vendimia estrujada al llenar el dep. de fermentación Dosis : 1 - 3 g / 100kg Temperatura > 16 °C Tiempo de contacto: durante el tiempo de fermentación

Rapidase® Extra Color

3 g / 100kg

Prensa fin de FA

Hacia la FML

Recomendaciones de uso de Rapidase Extra Color en maceración tradicional de tintos

Despalillar limitar trituración

Maceración con Rapidase Extra Color aumenta extracción de

color, estructura y perfil aromático

de los vinos

Medir contenido en sólidos

añadir Rapidase Extra Color a 3 g / 100kg

al llenar el Depósito

Vino escurrido

TEMPRANILLO DE RIBERA DEL DUERO D.O

MACERACIÓN ENDEP DE 50 L

50kg uvas despalilladas & estrujadas

SO2 T 50mg/l

3 condiciones x 3 tiempos de Maceración x 2 replicados = 18 ENSAYOS

CONTROL, sin enzima. Maceración t : 4 , 8 and 12 días

RAPIDASE EXTRA COLOR a 3g/100kg. Maceración : 4 , 8 and 12 días

RAPIDASE EXTRA FRUIT at 3g/100 kg Maceración : 4, 8 and 12 días

18 | 04 | 2012


en el contenido en polifenoles

0

0,5

1

1,5

2

2,5

Anthocyanins (g/l) Tannins (g/l)

Control

R Extra Color

R Extra Fruit

Tempranillo, 12 días de maceración FA completa Antes de la FML

18 | 04 | 2012


en el Índice de Polifenoles

0

10

20

30

40

50

60

Drain wine Press wine

Control

R Extra Color

R Extra Fruit


18 | 04 | 2012


en el color del vino

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Color Intensity A 420nm A 520nm

Control

R Extra Color

R Extra Fruit


18 | 04 | 2012

y el impacto de la

maceración con

enzimas en el pH y

acidez del vino?

18 | 04 | 2012


en el pH y acidez del vino después de 12 días

de maceración


0

1

2

3

4

5

6

pH TA (g/l) K+ (g/l)

Control

R Extra Color

R Extra Fruit

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Mejoras de la calidad

Perfiles de actividad Aplicadas a la etapa del proceso













Beta-(1,6)-glucanasas

Crianza sobre lías, batonnage



Precursores aromáticos Glicosidados: hidrólisis enzimática secuencial

Fermentación Dep. Clarificación

Prensa

2-3 ml / Hl

libera los aromas volátiles (terpenos, norisoprenoides) desde sus precursores no volátiles por estar con enlaces glicosilicos

Aplicación de Glicosidasas

Rapidase Revelation Aroma Glu, Ara, Rha, Apio-sidases

storage

Rapidase Revelation Aroma

85

Liberación de geraniol desde sus precursores en vinos de Moscateles

0

50

100

150

200

250

300

350

400 Control

DP . AR 2000 à

10g/hl

Control

DP . AR 2000 à

10g/hl

DP . AR 2000 à

5 g/hl

DP Control

DP . AR 2000 à

5 g/hl

SM . Témoin

SM . AR 2000 à

5 g/hl

Diferentes concentraciones

Rapidase Revelation aroma

Diferentes concentraciones

Rapidase Revelation aroma

18 | 04 | 2012

Conclusión

las enzimas juegan un

papel fundamental en el

proceso de elaboración

del vino

una mejor compresión de

los mecanismos

moleculares de acción,

permiten el diseño de

mejores enzimas, y más

específicas

18 | 04 | 2012

MUCHAS

GRACIAS

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