enzimes Introducción 2010

5/17/2018 enzimes Introducci n 2010 - slidepdf.com

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Introducción

Beatriz Alvarez

Laboratorio de Enzimología



Curso de Enzimología 2010

Coordinación: Beatriz Alvarez, [email protected]: Segundo semestre, del 7 de setiembre al 11 de noviembre.Teóricos: 2 teóricos semanales de 2 horas cada uno, los díasmartes y jueves de 10 a 12 horas, salón 107. Total de horas deteórico: 40 horas.Prácticos: 1 práctico por semana de 4 horas, los días martes o losdías jueves, de 13 a 17 horas, en el salón 304 o en los Laboratorios

de Enzimología y Fisicoquímica Biológica. Total de horas depráctico: 40 horas.Créditos: (40*2 + 40*1.5)/15 = 9.3Ganancia del curso: El curso se ganará por asistencia a los

prácticos y aprobación de los correspondientes informes.Evaluación: Examen.Cupo: 40 estudiantes.

Apoya PEDECIBA Biología. Auspicia PEDECIBA Química.



Material para el curso, protocolos depráctico, repartidos de ejercicios:

Subespacio

http://enzimologia.fcien.edu.uy/



Temas

Introducción. Cinética enzimática.

Efectos del pH.

Efectos de la temperatura.Inhibición.

Reacciones de dos sustratos.

Cinética preestacionaria.

Mecanismos.

Regulación y cooperatividad.Sistemas multienzimáticos.



ObjetivosEstudio sistemático de diferentes temas de

enzimología que permitan una aproximación a lapregunta: ¿cómo funcionan las enzimas?

Curso dirigido a estudiantes avanzados y deposgrado que provee de conceptos de cinéticaenzimática y mecanismos, así como deherramientas prácticas para el trabajo con enzimas.



Bibliografía

Textos de BioquímicaLehninger, Stryer, Voet (Bioquímica), Mathews, Devlin, Zubay

Segel, Biochemical calculations, John Wiley (1976)

Textos de EnzimologíaDixon and Webb, Enzymes, Longman (1979) SUBESPACIO

Fersht, Structure and mechanism in protein science, Freeman (1999)

Cornish-Bowden, Fundamentals of enzyme kinetics, Portland (1995)Segel, Enzyme kinetics, Wiley (1993)

Methods in Enzymology, volúmenes 63, 64, 87, 249, Academic Press.

Price and Stevens, Fundamentals of enzymology, Oxford (1989)Frey and Hegeman, Enzymatic reaction mechanisms, Oxford (2007)

Eisenthal and Danson, Enzyme Assays, A Practical Approach, Oxford (2002)

Jencks, Catalysis in Chemistry and Enzymology, Dover (1987). Incluye elcapítulo de 1975 “The Circe Effect”.



RECURSOS DE RED

Brenda http://www.brenda.uni-koeln.deManual Worthingtonhttp://www.worthington-biochem.com/manual/manIndex.html

ExPASy Proteomics Server (DE TODO!) http://ca.expasy.org

ExPASy Enzyme Nomenclature Database http://ca.expasy.org/enzyme/

ExPASy Metabolic Pathways http://us.expasy.org/cgi-bin/search-biochem-index

Enzyme Structures Databasehttp://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/enzymes/

Enzyme Nomenclature

http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/index.htmlPubMed http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi

Protein Data Bank http://www.rcsb.org/pdb/



Las enzimas son catalizadores biológicos.

Un catalizador es una sustancia que acelera lavelocidad de una reacción y se recupera

incambiado.

La catálisis biológica tiene gran importancia:

El azúcar puede guardarsepor años. Sin embargo, nos

sirve como fuente de energíaen segundos, gracias a lacatálisis.



La especie humana no demoró mucho en aprender aaprovechar el poder catalítico de las enzimas, por

ejemplo, para procesar alimentos (queso, pan,cerveza, vino).

La referencia más antigua acercade la utilización de enzimas es la

elaboración de vino en el Códigode Hammurabi (2100 AC,Babilonia).

Reseña histórica

“I ♥ enzymes”



La historia de la enzimología es la historia de labioquímica.

La comprensión de los mecanismoscomo actúan las enzimasevolucionó de estudios acerca de lafermentación alcohólica realizados

en el siglo XIX.



Jöns Jakon Berzelius1837, SueciaEl concepto de catálisis

"Tenemos una nueva fuerza que pertenece ala Naturaleza orgánica e inorgánica, queprovoca reactividad química ... reordenandolos componentes de una sustancia hacia

otras relaciones sin necesariamente cambiar sus propios componentes..."



Pasteur y Liebig¿Están vivas las enzimas?



Justus von Liebig

famoso por inventar los laboratorios para estudiantes Alemania, 1839Teoría química de la fermentación

"Los átomos de un cuerpo en putrefacción, el fermento,están en continuo movimiento; cambian sus posiciones yforman nuevas combinaciones. Estos átomos móviles estánen contacto con los átomos del azúcar, que está unida solopor fuerzas débiles. El movimiento de los átomos delfermento no puede pasar sin efecto sobre los átomos delazúcar. O se anula el movimiento o el azúcar se moverá

también. Así el azúcar sufre un desplazamiento de susátomos que se rearreglan para formar alcohol y dióxido decarbono."

Liebig creía que la fermentación era causada por la trasmisión devibración de los fermentos al material a fermentar.



Louis Pasteur

Francia, 1858Teoría de la "fuerza vital"

"Veo en el hecho de la fermentación un fenómeno relativo ala vida -un hecho fisiológico- que origina múltiples productos,todos los cuales son necesarios para la célula. Creo que no

existe fermentación sin que haya, simultáneamente, laorganización, el desarrollo y la multiplicación (es decir elcrecimiento) de la levadura u otros glóbulos, o al menos lacontinuación de la vida de los glóbulos que ya estabanpresentes. La totalidad de los resultados me parece enoposición a las opiniones de M. Liebig."

Pasteur creía que la fermentación era inseparable de las células vivas.



¿De dónde sale el nombre ENZIMA?

El nombre "enzima" fue acuñado en 1878 por Fredrich Wilhelm Kühne.

Proviene del griego:

en (dentro de) + zima (levadura).

Enfatiza que hay algo en la levadura, por oposición a la levadura misma, que cataliza

los procesos, y distingue las enzimas de losorganismos que las producen.



Hans y Eduard Büchner Alemania, 1897

Las enzimas son moléculas

"Respecto a la teoría de la fermentación ahora podemoshacer la siguiente afirmación: NO es necesario tener unaparato tan complicado como la célula viviente de unalevadura para que se lleve a cabo la fermentación. Más bienun fermento soluble, o enzima, se considera el portador dela actividad fermentativa del jugo de la prensa. Llamaremos

a este agente subcelular de la fermentación zimasa ."Los hermanos Buchner observaron que extractos libres de células soncapaces de realizar la fermentación del azúcar a etanol y dióxido de

carbono.

(Nobel 1907)



Emil Fischer

Alemania, 1894Las enzimas son selectivas

Hipótesis llave-cerradura

“El efecto específico en los glucósidos puede ser explicadoasumiendo que el contacto íntimo entre las moléculas,necesario para la liberación de la reacción química, es posiblesolo con configuraciones geométricas similares. Para ilustrarlodiré que la enzima y el glucósido encajan uno en el otro comouna llave y una cerradura...”

Las enzimas puedenas distinguir entre diferentesestereoisómeros de azúcar. Las enzimas consisten en"moléculas construidas asimétricamente". Así, "la enzima y el

sustrato encajan uno en el otro como una llave en unacerradura".

(Nobel 1902)



Las enzimas son proteínas

James Sumner (Estados Unidos)

1926. Cristaliza la ureasa y obtiene sóloaminoácidos cuando la hidroliza (Nobel 1946).

John Northrop (Nobel 1946) y Moses Kunitz

1926. Northrop cristaliza la pepsina. Cristalizanenzimas digestivas y comprueban que laactividad biológica no se puede separar de la

proteína.



COENZIMAS Y COFACTORES

Las enzimas son proteínas. La actividad catalíticadepende de la integridad de la estructura y de que laproteína no esté desnaturalizada.

Los grupos funcionales de los aminoácidos participan enla catálisis. Muchas enzimas no requieren nada más,

pero algunas enzimas requieren un cofactor.Los cofactores pueden ser iones metálicos o coenzimasorgánicas.

Si el cofactor está unido muy fuertemente ocovalentemente se denomina grupo prostético.

apoenzima + cofactor = holoenzima



NOMENCLATURA

En general, las enzimas se nombran agregando elsufijo asa .

Ej: ureasa, lactato deshidrogenasa.Este sufijo proviene del nombre del extracto de maltaque hidrolizaba almidón en el siglo XIX, “diastasa”.

La Comisión de Enzimas de la Unión Internacional deBioquímica y Biología Molecular propone clasificar y

nombrar las enzimas de acuerdo a las reaccionesquímicas que catalizan.



Formación de enlaces acoplada a

la hidrólisis de ATP

6. Ligasas

Isomerización5. Isomerasas

Eliminación de grupos para formar dobles enlaces

4. Liasas

Reacciones de hidrólisis3. Hidrolasas

Transferencia de gruposfuncionales

2. Transferasas

Reacciones redox1. Oxidorreductasas

Tipo de reacción catalizadaClasificación



Cada enzima pasa a tener: Un nombre recomendado, generalmente el nombre trivial

histórico. Un nombre sistemático: nombre del sustrato seguido por el tipode reacción.

Un número formado a su vez por 4 números: EC _._._._ carboxipeptidasa Apeptidil-L-aminoácido hidrolasa

EC 3.4.17.1EC indica “Enzyme Commission”El primer número indica la clase: hidrolasaEl segundo indica subclase: actúa en enlaces peptídicos

El tercero, la subsubclase: metalocarboxipeptidasa (Zn2+

)El cuarto es un número arbitrario en la subsubclase

alcohol deshidrogenasaalcohol:NAD+ oxidorreductasa

EC 1.1.1.1



A diferencia de otros catalizadores

químicos, las enzimas se caracterizanpor:

1. Altísimo poder catalítico.2. Condiciones de reacción suaves.

3. Alta especificidad por el sustrato (reactivo) ypor los productos de la reacción.

4. Su actividad puede ser regulada.5. Pueden acoplar transformaciones de energía.



Las enzimas son catalizadores extraordinarios. Aceleran las reacciones por factores de 105 a

1017

. Consideremos 109

como promedio.¿Cuánto es 109?

Por ejemplo, un estudiante tiene 21 años.21 x 109 = 21 mil millones de años =

21,000,000,000 años.



Enzyme Nonenzyma-tic half-life

Uncatalyzedrate (k un, s -1)

Catalyzed rate(k cat, s -1)

Rate enhance-ment (k cat/k un)

OMPdecarboxylase 78,000,000years 2.8 × 10-16

39 1.4 × 1017

Staphylococcalnuclease

130,000years

1.7 × 10-13 95 5.6 × 1014

AMPnucleosidase

69,000 years 1.0 × 10-11 60 6.0 × 1012

Carboxypepti-dase A

7.3 years 3.0 × 10-9 578 1.9 × 1011

Ketosteroidisomerase

7 weeks 1.7 × 10-7 66,000 3.9 × 1011

TPI isomerase 1.9 days 4.3 × 10-6 4,300 1.0 × 109

Chorismatemutase

7.4 hours 2.6 × 10-5 50 1.9 × 106

Carbonicanhydrase 5 seconds 1.3 × 10-1

1 × 106

7.7 × 106



Especificidad de la glucosa oxidasa por el sustrato

glucosa + O2→ ácido glucónico + H2O2

0glucosa-6-fosfato

0sacarosa

0D-fructosa

0.64α-D-glucosa

0.98D-manosa

1.856-metil-D-glucosa

36-desoxi-6-fluoro-D-glucosa

252-desoxi-D-glucosa

100β-D-glucosa

Velocidad relativa Azúcar



Sitio activo

Los sustratos se unen a una región específica de laenzima denominada sitio activo para formar el complejoenzima-sustrato.

La idea de complejo enzima-sustrato surge de experimentos coninvertasa a fines del siglo XIX.

O’Sullivan y Thompson, en 1890, ven que la resistencia térmica

de la invertasa aumenta cuando hay sacarosa.Brown, en 1892, relaciona la cinética de saturación con laformación de un complejo enzima-sustrato, deduce que cuando

se alcanza la velocidad máxima, toda la enzima está como ES.Chance, en 1943, “ve” por primera vez un complejo enzima-sustrato. En este trabajo utiliza por primera vez

espectrofotometría de flujo detenido y simulaciones numéricas.



¿Qué características tienen los sitios activos?

1. El sitio activo ocupa una porción pequeña de laproteína.

Unión de laquimotripsina a

su sustrato



2. El sitio activo es una entidad tridimensional formadapor grupos funcionales que provienen de diferentes

partes de la secuencia proteica.

Lisozima ydiferentes

residuos desu sitioactivo



3. Los sustratos se unen a las enzimas por

múltiples uniones débiles.- Interacciones de van der Waals.

- Interacciones electrostáticas

- Puentes de hidrógeno

- Interacciones hidrofóbicas

Las constantes de equilibrio de los complejos ES

van de 10-2 a 10-8 M, lo cual corresponde aenergías libres entre -3 y -12 kcal/mol,considerando que ΔGº' = -RT ln K'

eq.

I t i t l i t i i l t t



Interacciones entre la quimotripsina y el sustrato



3. Los sitios activos son ranuras o hendiduras. En

general, tienen carácter no polar, excluyen elagua, y tienen ciertos residuos polares, de talforma que constituyen un microambiente.

5 L ió d l t t d d d



5. La unión del sustrato depende de una

disposición definida de átomos en el sitio activo.El sitio de unión al sustrato

puede existir en ausencia desustrato (hipótesis de llave-cerradura de Emil Fischer).

O puede formarse el sitio deunión al unirse el sustrato(hipótesis de encaje inducidode Daniel Koshland).



Encaje inducido

Estructuras de la hexoquinasa con y sin glucosa

glucosa + ATP→ glucosa 6-fosfato + ADP



¿Cómo lo hacen?

La cuestión fundamental de la enzimología es

comprender cómo hacen las enzimas para ser catalizadores tan potentes y específicos



Las enzimas son catalizadores, aceleran la

velocidad de la reacción pero no alteran laposición del equilibrio.

ΔGº' = -RT ln K'eq

Teoría del estado de transición (Henry Eyring 1935)



Teoría del estado de transición (Henry Eyring, 1935)

La teoría del estado de transición relaciona la velocidad de unareacción a la diferencia en energía libre entre el estado basal y elestado de transición.

La transformación de S en P ocurre a través de la formación de

un estado de transición S*.K* kS S* P ⎯⎯→ ⎯⎯→←⎯⎯

La energía de activación de Gibbs ΔG* es la diferencia deenergía entre el estado de transición y el sustrato.

La velocidad k es proporcional a [S*], la cual a su vez depende

de K*.[S*] = [S] e- ΔG*/RT (pues ΔGº' = -RT ln K'eq)

k = kBT /h e- ΔG*/RT

donde kB es la constante de Boltzmann y h es la constante de Planck.

Teoría del estado de transición (Henry Eyring 1935)



Teoría del estado de transición (Henry Eyring, 1935)

k = (kB

T /h) e- ΔG*/RT

La velocidad de una reacción aumenta cuando la energía deactivación, ΔG*, disminuye.

A su vez, ΔG* tiene un componente de entropía y uncomponente de entalpía: ΔG* = ΔH* -T ΔS*

k = (kBT /h) e- ΔS*/R e- ΔH*/RT

La energía de activación puede ser grande y la reacciónlenta cuando el estado de transición es demasiadoenergético u ordenado.

ΔH* es siempre positivo porque se requiere energía parareorganizar los enlaces. ΔS* puede ser negativo o positivodependiendo si el estado de transición tiene más o menosgrados de libertad.

L i l l i



Las enzimas aceleran las reacciones porque

estabilizan el estado de transición y bajan labarrera de activación.

La unión de laenzima al sustratogenera una nuevavía de reacción enla que la energíadel estado detransición es

menor que enausencia deenzima

El poder de las enzimas deriva de la energía de unión



El poder de las enzimas deriva de la energía de uniónentre la enzima y el sustrato. Esta energía surge de las

múltiples interacciones débiles entre la enzima y elsustrato, y contribuye a la catálisis y a la especificidad.

Las interacciones débiles entre la enzima y el sustratose optimizan en el estado de transición. Los sitiosactivos de las enzimas no son complementarios a lossustratos sino que son complementarios a los estadosde transición.

Se establecen interacciones débiles entre la enzima y

el sustrato, pero éstas son optimizadas en el estado detransición. La energía liberada en el establecimientode estas interacciones débiles hace disminuir la

barrera de activación.



sin enzima

con enzimacomplementariaal sustrato

con enzima

complementaria alestado de transición

Los análogos del estado de transición son



Los análogos del estado de transición son

inhibidores competitivos de alta afinidad.Ejemplo: prolina racemasa bacteriana

El estado detransición esplanar. Por lo

tanto,análogosplanos de laprolina actúancomoinhibidorescompetitivosmuy potentes.

Análogos de estado de transición



Análogos de estado de transición

P t d i



Proteasas de serina

Se unen preferentemente alintermediario tetraédrico.



Si una enzima acelera la velocidad de una reacciónpor un factor de 109, ¿cuánto debe bajar la barrera

de activación?Haciendo cuentas con la ecuación k = (kBT /h) e- ΔG*/RT

podemos concluir que para acelerar la reacción por

un factor de 109, la barrera de activación debedisminuir 12 kcal/mol.

¿Cuánta energía se libera con una estas



¿ guniones?

- Interacciones de van der Waals.

- Interacciones electrostáticas- Puentes de hidrógeno

- Interacciones hidrofóbicasLa energía que se libera al establecerse una de

estas uniones débiles es de 1-7 kcal/mol. Por lotanto, la formación de múltiples uniones débiles anivel del estado de transición puede dar cuenta

de las aceleraciones observadas.

La energía de unión entre la enzima y el sustrato



g ypuede utilizarse para bajar el componente entrópico de

la barrera de activación ( ΔG* = ΔH* -T ΔS*)Uno de los aspectos más importantes de la catálisis enzimáticaes la entropía. Las reacciones en solución son lentas porque la

aproximación de los reactivos implica una pérdida importante deentropía.

Las reacciones enzimáticas están confinadas al sitio activo. Los

grupos que reaccionan forman parte de la misma "molécula", elsitio activo, por lo cual no hay pérdidas de entropía traslacionalo rotacional al formarse el estado de transición. La enzima, alunirse al sustrato, logra que los reactivos estén próximos,inmovilizados y alineados óptimamente para reaccionar.

Esta ventaja entrópica "se paga" con la energía de unión entrela enzima y el sustrato.


http://slidepdf.com/reader/full/enzimes-introduccion-2010 48/107 Además de los ya mencionados:



1. catálisis por efecto de proximidad y orientación

2. catálisis por unión preferencial de estado detransición

Determinados grupos funcionales alineadosapropiadamente en el sitio activo contribuyen a lacatálisis mediante los siguientes mecanismos:

3. catálisis general ácido-base

4. catálisis covalente

5. catálisis por iones metálicos

6. catálisis electrostática

Catálisis general ácido base



g

Un grupo de la enzima participa como aceptor o dador de protón, estabilizando intermediarios cargadosinestables.

a) nocatalizada

b) Catálisisgeneral ácida

b) Catálisisgeneral básica

Catálisis covalente



Catálisis covalente

Un grupo del sitio activo de la enzima, generalmente unbuen nucleófilo, reacciona covalentemente con elsustrato modificándose transitoriamente.

C táli i i táli



Catálisis por iones metálicos

70 % de las enzimas necesitan metales!

Algunas formas por las cuales los metales participan en

la catálisis:1. Uniéndose a los sustratos para orientarloscorrectamente.

2. Mediando reacciones redox a través de cambios en elestado de oxidación del metal.

3. Estabilizando cargas negativas.

C táli i l t táti



Catálisis electrostática

En el sitio activo de las enzimas, las interaccioneselectrostáticas son muy fuertes porque el agua estáexcluida y las constantes dieléctricas son bajas.

La distribución de cargas en el sitio activo es tal queestabiliza los estados de transición.

¿Qué se preguntan hoy en día los enzimólogos?



La revolución de la ingeniería genética y los datos deestructura cristalográfica han vuelto disponibles muchísimosdatos.

Se ha avanzado mucho en la elucidación de mecanismosenzimáticos y en la base estructural de la catálisis.

Los ejemplos más estudiados ponen de manifiesto que es

necesaria información estructural, cinética y mecanísticapara comprender un determinado sistema enzimático.

Pero, ¿qué queda por responder?

Aún no se cuenta con explicaciones cuantitativas para losaltos niveles de catálisis. Los efectos de estabilización delestado de transición, efectos de proximidad, catálisis ácido-base, etc., quedan cortos.



Repaso de cinética



REPASO DE CINÉTICA QUÍMICAUna reacción ocurre en una serie de pasos individuales. Cada uno deestos pasos se denomina reacción elemental .

Una reacción de estequiometría A→

P puede ocurrir a través de unasecuencia de reacciones elementales A→ Ia→ Ib→ P que describenel mecanismo.

En una reacción elemental, el número de especies que se combinanpara formar el estado de transición se denomina molecularidad . Engeneral las reacciones son unimoleculares o bimoleculares.Excepcionalmente, termoleculares.

A una temperatura determinada, la velocidad de una reacción elemental



es proporcional a la concentración de especies que participan, pues

depende de la frecuencia con que se encuentran las moléculas.Convención de la IUPAC:

El orden de una reacción es la suma de los exponentes de los factoresde concentración en la ley de velocidad. Debe ser determinadoexperimentalmente.

Para una reacción elemental, el orden es igual a la molecularidad.

A + B + .... P + Q + ....a b p q →

1 [A] 1 [B] 1 [P] 1 [Q][A] [B]a b d d d d

v = - = - = = = k a dt b dt p dt q dt

REACCIONES DE ORDEN UNO



REACCIONES DE ORDEN UNO

A→ P[A] [P]

[A]d d

v = - = = k dt dt

Integrando entre t = 0 y t:

o[A] = [A] exp (- )kt

oln [A] = ln [A] - kt

o[P] = [A] [1 - exp (- )]kt

En una reacción de orden uno, la vida media es constantee independiente de la concentración inicial, t1/2 = ln2/k

[ P r o d u c t o ]

Tiempo

REACCIONES DE ORDEN DOS v = k [A]2



REACCIONES DE ORDEN DOS, v = k [A]2

2 A→ P

21 [A]

[A]2

d v = - = k dt

0

0

0[A][A] = 1 + [A] 2

1 1= + 2[A] [A]

kt

kt

REACCIONES DE ORDEN DOS



A + B→

P[A]

[A][B]d

v = - = k dt

00 0

0

[B][B]ln = ln + ([B] -[A] )[A] [A]

k t

Ahora, si [B]0 >> [A]0 la reacción es de pseudo primer

orden y la constante de velocidad aparente es k’ =k [B]0.

[ P r o d u c t o ]

Tiempo

obs 0

obso[P] = [A] [1 - exp (- )]

k = k[B]

k t k

o b s

[B]0

REACCIONES DE ORDEN CERO



0

[A]

[A] = [A] - t

d v = - = k

dt k


http://slidepdf.com/reader/full/enzimes-introduccion-2010 62/107¿Cómo puede determinarse el orden de reacción?



Método integral: Se observacómo varía la concentración deproducto (o reactivo) a lo largo

del tiempo, hasta completitud. Seve cómo ajusta a la ecuación develocidad integrada, por ejemplo,a una función exponencial.

Método de las velocidadesiniciales: Se observa la

formación de concentracionesmuy pequeñas de producto,durante un período en el cual lasconcentraciones de reactivos se

mantienen constantes.

DIMENSIONES



DIMENSIONES

Concentraciones en MVelocidades en M s-1

Constantes de velocidad de primer orden en s-1

Constantes de velocidad de orden dos en M-1 s-1

PASO DETERMINANTE DE LA VELOCIDAD

En una reacción compleja, si un paso es mucho más

lento que los otros, la velocidad del proceso será la delpaso lento.

REACCIONES CATALIZADAS ENZIMÁTICAMENTE



REACCIONES CATALIZADAS ENZIMÁTICAMENTE

Las reacciones catalizadas enzimáticamente notienen un orden de reacción simple. Sin embargo, lospasos individuales sí tienen órdenes simples.

Unión de enzima a sustrato

E + S ES ⎯⎯→←⎯⎯ proceso bimolecular de orden dos

Transformación del complejo ES en producto

ES E + P→ proceso unimolecular de orden uno



Cinética enzimática

Historia

Las velocidades de las reacciones catalizadas enzimáticamente



Las velocidades de las reacciones catalizadas enzimáticamente

fueron estudiadas por primera vez a fines del Siglo XIX.

Estudios con invertasa: sacarosa + H2O → glucosa + fructosa

O’Sullivan y Thompson (1890) ven que la velocidad depende dela acidez y que es proporcional a la cantidad de enzima. Laresistencia térmica aumenta en presencia del sustrato sacarosa.

Brown (1892) ve que la velocidad primero aumenta con laconcentración de sacarosa y luego se vuelve independiente.Pone el concepto de complejo ES en términos cinéticos.

Problemas experimentales: control de pH y mutarrotación de laglucosa.

No se pudo progresar hasta que se controló el pH.

Concepto de amortiguadores y escala de pH: Sorensen, 1909.



Michaelis y Menten deciden hacer experimentos más prolijos

1. Fijan el pH con amortiguador acético.

2. Consideran la mutarrotación de la glucosa.

3. Miden velocidades iniciales

¿Hoy en dìa, cómo se determina la velocidad de



una reacción catalizada enzimáticamente?

pH y temperatura constantes, amortiguador

se adiciona sustrato y enzima a una solución amortiguadora y semide la desaparición de sustrato o la aparición de producto

se puede seguir una propiedad física que varíe en forma

proporcional a la concentración

métodos continuos o discontinuos (de muestreo)

se determina la velocidad inicial, v0

v0 = d[P]/dt = -d[S]/dt a tiempo cero

VELOCIDAD INICIAL



Cuando se está en velocidad

inicial, las gráficas deconcentración de producto enfunción del tiempo son lineales.

En general, cuando se está envelocidad inicial, reaccionó menosde 10% del sustrato.

Los enzimólogos casi siempre determinan velocidad inicial, v0.

Esto es muy importante, pues se evita que la enzima se inactive,que se consuma sustrato, que cambie el grado de saturación de

la enzima, que ocurra la reacción reversa, que haya inhibición por producto.

Experimentalmente, los primeros enzimólogosencuentran que:



encuentran que:

- la velocidad inicial varía en forma lineal con laconcentración de enzima

V 0

[sustrato]

V 0

[enzima]

- la velocidad inicial depende hiperbólicamente de la

concentración de sustrato

Para empezar a derivar la ecuación de Michaelis y Menten



1 2

-1

k k

kE + S ES E + P ⎯⎯→ ⎯⎯→←⎯⎯

2

[S] [P]k [ES]

d d v = - = =

dt dt

Asumimos:

• velocidades iniciales

•

[S]T = [S] + [ES]como [S]T >> [E]T entonces [S]T = [S]

• [E]T = [E] + [ES]

Hipótesis de equilibrio(Michaelis y Menten, 1913)

ES está equilibrio con E y con S



Equilibrio de disociación: ES E + S ⎯⎯→←⎯⎯

k1[E][S] = k-1[ES]

-1S

1

[E][S] kK

[ES] k= =

como [E] = [E]T – [ES]

TS

[E][S] ([E] - [ES]) [S]K =

[ES] [ES]=

despejando [ES]

T

S

[E] [S][ES] =

K + [S]

entonces

maxT2 2

S S

V [S][E] [S]v = k [ES] = k =

K + [S] K + [S]

donde Vmax = k2 [E]T y-1

s1

kK =

k

Hipótesis de estado estacionario(Briggs y Haldane, 1925)

ES está en estado estacionario



1 -1 2

1 -1 2

-1 2M

1

[ES] = 0 = k [E][S] - k [ES] - k [ES]

k [E][S] = (k + k ) [ES]

[E][S] k + k= = K[ES] k

d dt

TM

[E][S] ([E] - [ES]) [S]K =

[ES] [ES]=

despejando [ES]:

T

M

[E] [S][ES] =

K + [S]

entonces

maxT2 2

M M

V [S][E] [S]v = k [ES] = k =

K + [S] K + [S]

donde Vmax = k2 [E]T y -1 2M1

k + kK = k

En suma:



⎯⎯→ ⎯⎯→←⎯⎯ 1 2

-1

k k

kE + S ES E + P

-1 2M

1

k + kK =k

max

M

V [S]

v = K + [S]

[ ]max 2 TV = k E

Del repartido de ejercicios




12. Para una enzima michaeliana, ¿cuánto debe

aumentar la concentración de sustrato para que lavelocidad pase de 10 % de Vmax a 90 % de Vmax? ¿Ysi la enzima presenta cooperatividad positiva?

13. La hexoquinasa cataliza la fosforilación de la glucosa con unKM de 0.13 mM.



glucosa + ATP → glucosa 6-fosfato + ADP.a. ¿Qué fracción de Vmax se observaría cuando la concentraciónde glucosa corresponde al valor fisiológico de 5 mM?

b. Cuando la glucosa se une a la enzima, ésta sufre un cambioconformacional. Recién entonces puede unirse el ATP a laenzima. ¿Qué sentido tiene este fenómeno?



¿Cómo se determinan los parámetros cinéticos (KM,

Vmax y Vmax/KM) de una reacción catalizadaenzimáticamente?

Midiendo la velocidad inicial para concentracionescrecientes de sustrato.

VMAX

error bars 5% VMAX

¿Cómo determinamos KM, VMAX

y VMAX/KM?



Slope = KM/V

MAX

1/VMAX

1 / v

0

1/[Substrate]

KM/V

MAX

Slope = 1/VMAX

[ S u b s t r a t e ] / v

0

[Substrate]

Slope = VMAX

/KM

KM

MAX

v 0

[Substrate]

y MAX M

XLineweaver-Burk plot Hanes or Woolf plot

From Cornish-Bowden, 1995, Fundamentals of Enzyme Kinetics, Portland Press.

¡Tratemos de no usar lalinealización del doblerecíproco de Lineweaver-Burk!



¿Qué significan KM

, Vmax

, kcat

y kcat

/KM

?

KM



• KM = [S] cuando v = ½ Vmax • tiene unidades de concentración (M)

•

-1 2

M 1

k + k

K = k • Si k2 << k-1, KM = KS

• Ks representa la afinidad entre la enzima y el sustrato,

pues es la constante de equilibrio de disociación

• KM representa una constante aparente de disociación,

pues M

[E][S]K = [ES]Σ

• cuanto más pequeño sea KM, hay menos enzima libre y

más complejo enzima-sustrato



En suma:KM es una constante aparente de disociación que puede ser considerada como la constante de disociación global de

todas las especies enzima-sustrato.

kcat



• Vmax = kcat [E]T entonces kcat = Vmax / [E]T • en un mecanismo simple, kcat = k2 y representa el proceso

de primer orden de transformación de ES en P

• en un mecanismo complejo, representa el límite inferior de las constantes de velocidad de la transformación deES en P

• unidades de tiempo-1

(s-1

)• es el número de recambio (turnover number), máximo

número de moléculas de S que se transforman en P por

unidad de tiempo y por sitio activo.



En suma:

kcat es una constante de primer orden que serelaciona con las propiedades del complejos enzima-sustrato (incluyendo enzima-intermediario y enzima-producto).

kcat/KM

• como M

[E][S]K =

[ES], la ecuación de Michaelis y Menten

catk



puede escribirse catM

v = k [ES] = [E][S]K

• kcat/KM representa la constante aparente de orden dos

para la reacción de la enzima y el sustrato

• tiene unidades de M-1 s-1

• debe ser menor o igual que las constantes de orden dos

en el mecanismo

• da idea de la eficiencia catalítica, puede llegar a ser igual

a k1 y estar limitada por difusióncat 2 1 2

-1 2M -1 2

1

k k k k= =

k +kK k +kk

• da idea de la especificidad de la enzima por el sustrato

⎯⎯→

⎯⎯→

E A A cat cat M A

EB B cat cat M B

cat M A A

B cat M B

A P v = k [EA] = (k /K ) [E] [A]

B P v = k [EB] = (k /K ) [E] [B]

(k /K ) [A]v=

v (k /K ) [B]



En suma:

kcat

/KM

es una constante aparente de orden dos que serelaciona con las propiedades de la enzima libre y elsustrato libre.

Algunos valores



Enzima Sustrato KM (M) kcat(s-1)

kcat/KM(M-1 s-1)

Acetilcolines-

terasa

Acetilcolina 9.5 x 10-5 1.4 x 104 1.5x106

Anhidrasacarbónica

CO2 0.012 1.0 x 106 8.3x107

Catalasa H2O2 0.025 1.0 x 107 4.0 x 108

Fumarasa Fumarato 5.0 x 10-6 800 1.6 x 108

Ureasa Urea 0.025 1.0 x 104

4.0 x 105

Sustrato KM (µM)[S] (µM)Enzima

Enzimas glicolíticas



Las enzimas que quieren maximizar la velocidad evolucionan detal forma de maximizar kcat/KM y de que KM sea mayor que [S], laconcentración fisiológica de sustrato, pues v = kcat/KM [E] [S].

(Ideas desarrolladas por Alan Fersht)

20023PEPPiruvato quinasa

5951Pyr Lactato deshidrogenasa

190220GPGlicerol fosfato deshidrogenasa

4603G3PTriosafosfato isomerasa

703G3PGliceraldehído 3P deshidrogenasa

2PG

3PG

3PG

FBPG6P

707Enolasa

500060Fosfoglicerato mutasa

120060Fosfoglicerato quinasa

100032 Aldolasa210130Glucosa 6-P isomerasa

Del repartido de ejercicios:

14. Con respecto a las reacciones catalizadas por enzimas indique si lasafirmaciones son verdaderas o falsas.



a) Una enzima participa en la reacción alterando la constante de equilibrio dela reacción, sin alterar la barrera de activación (Ea).b) El sustrato con menor valor de KM tiene la mayor afinidad aparente por laenzima.

c) Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzimaque cataliza la transformación de un (1) micromol de sustrato por minuto bajocondiciones definidas.d) El número de recambio (kcat) es el número de moles de sustratotransformado por minuto por mol de centro activo.e) La catálisis puede ser explicada por una unión tipo llave y cerradura entre elsustrato y la enzima.f) La velocidad inicial de una reacción catalizada enzimáticamente esindependiente de la concentración de sustrato.

g) La velocidad inicial aumenta proporcionalmente a la concentración deenzima.h) El KM equivale a la concentración de sustrato a la cual la velocidad es lamitad de la máxima.

i) El KM varía con la concentración de enzima.

Experimentalmente, se encuentra que:



V 0

[enzima]

- la velocidad inicial varía en forma lineal con laconcentración de enzima

- la velocidad inicial depende hiperbólicamente de la

concentración de sustrato

V 0

[sustrato]

1 2

kk



⎯⎯→ ⎯⎯→←⎯⎯ 1 2

-1

kkE + S ES E + P

-1 2M

1

k + kK =

k

max

M

V [S]v =K + [S]

[ ]max 2 TV = k E

⎯⎯→ ⎯⎯→←⎯⎯ 1 2

-1

k k

kE + S ES E + P



0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25

[ P r o d u c t o ]

Tiempo (s)

0 1000 2000 3000 4000 5000

[ P r o d u c t o ]

Tiempo (s)

Preestacionario Curso total de reacción

0 20 40 60 80 100 120

[ P r o d u c t o ]

Tiempo (s)

Velocidadinicial o de

estadoestacionario

Ecuación de Michaelis-Menten integrada



[ P r o d u c t o ]

Tiempo

Velocidad inicial

Cuando el enlentecimiento en la formación de productose debe solo a la depleción de sustrato, se puedeencontrar K

M

y VMAX

“con un solo tubo de ensayo”:

- Determinando v para diferentes [S] con las tangentes.

- Integrando la ecuación de Michaelis-Menten.

MAX

M

0

V [S]d[P] d[S]v = = - =

dt dt K + [S]

Balance de masa [S] = [S] + [P]

Integrando laecuación deMi h li



MAX 0

M 0

M 0 MAX

0

V ([S] - [P])d[P]=

dt K + [S] - [P]

d[P] (K + [S] - [P])= V dt[S] - [P]

Condicion de frontera [P] = 0 a t = 0

(K

∫ ∫

M 0 MAX

0 0

0MAX M

0

0MAX 0 M

+ [S] ) d[P] [P] d[P]- = V dt[S] - [P] [S] - [P]

[S]V t = [P] + K ln

[S] - [P]

Analogamente:

[S]V t = [S] - [S] + K ln

[S]

∫ ∫ ∫

Michaelis-Menten

0MAX 0 M

[S]V t = [S] - [S] + K ln

[S]



0

0

[S]Rearreglando:

[S] - [S]

t

[S]1ln

t [S]

VMAX/KM

VMAX

KM

MAXV [S]d[P] d[S]

v = = =dt dt K + [S]



M

M 0

MAX

MAX

v = = - =dt dt K + [S]

caso limite: K << [S]

d[P]= V

dt[P] = V t

MAX

M

V [S]d[P] d[S]v = = - =

dt dt K + [S]

C li it K >> [S]



M 0

MAX

M

MAX

0

M

MAX

0M

Caso limite: K >> [S]

Vd[S]

= [S]dt K

V

[S] = [S] exp tK

V

ln [S] = ln [S] tK

−

⎛ ⎞

−⎜ ⎟⎝ ⎠

−

VMAX

KM

Ln [S]

t

Sustratos con alta afinidad

Cuando [E]0 ~ [S]0 ya no se puede asumir que [E]0 <<



Cuando [E]0 ~ [S]0, ya no se puede asumir que [E]0 <<[S]0

Ya no se cumple:

No va a haber un buen ajuste a una hipérbola y laslinealizaciones van a presentar desviaciones.

En cambio se puede demostrar:

{ }− −2maxT T S T T S T T

T

Vv = ([E] + [S] + K ) ([E] + [S] + K ) 4 [E] [S]

2 [E]

max

M

V [S]v =K + [S]

Sustratos con alta afinidad



Reacciones reversibles ⎯⎯→ ⎯⎯→← ←

1 2

1 2

k k

k kE + S ES E + P



←⎯⎯ ←⎯⎯ -1 -2k kE + S ES E + Pf r max max

S P

M M

S PM M

V [S] V [P]-

K Kv = [S] [P]

1 + +K K

f max 2 Tdonde V = k [E] r

max -1 TV = k [E]

S -1 2M

1

k + kK =k

P -1 2M

-2

k + kK =k

En el equilibrio v = 0

Relación de Haldane

Los parámetros cinéticos de una reacción reversibleestán relacionados por la constante de equilibrio

( )

( )

f PCAT Mmax M S

r S

max M CAT M P

k KV K[P]Keq = = =

[S] V K k K


18. La enzima fumarasa cataliza la hidratación del fumaratopara dar malato Esta reacción tiene un ΔGº’ de –3 8 kJ/mol



para dar malato. Esta reacción tiene un ΔG de 3.8 kJ/mol.Para la enzima de corazón de chancho, se han reportadovalores, para la reacción directa, de KM = 1.7 mM y VMAX =

0.25 mM-1 s-1; y, para la reacción reversa, de KM = 3.8 mM yVMAX = 0.11 mM-1 s-1. En cambio, para la enzima de unabacteria, se han reportado valores de KM = 1.6 mM y VMAX =

0.024 mM-1

s-1

para la reacción directa, y KM = 1.2 mM yVMAX = 0.012 mM-1 s-1 para la reacción reversa. Comente enla plausibilidad de estos reportes.

(PARÉNTESIS)

UNIDADES DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

U id d l tid d d i t li l



Una unidad es la cantidad de enzima que cataliza latransformación de 1 µmol de sustrato en producto en 1 min bajo

condiciones definidas.

(Comisión de Enzimas, Unión Internacional de Bioquímica yBiología Molecular, 1961)

U mL-1: concentración

U mg-1: actividad específica

Otra unidad es el katal . Un katal corresponde a la conversión de 1mol de substrate por segundo.

En la mayoría de los casos, las unidades se refieren aconcentraciones altas de sustrato (>KM), por lo que las unidadesno dependen de la concentración de sustrato.



0 20 40 60 80 1000

2

4

6

8

v 0

( u M m

i n

- 1 )

[Xanthine] (uM)0 10 20 30 40 50

0

5

10

15

20

25

30

35

40

mU mL-1

v 0

( µ M m

i n - 1 )

Entonces, para formar más producto, o descomponer más

sustrato, o en un período más corto de tiempo, simplemente hayque añadir proporcionalmente más enzima.


1. Se quiere medir la actividad de la enzima



qmalato deshidrogenasa en un extractobacteriano.oxalacetato + NADH→ L-malato + NAD+

Para ello, se coloca amortiguador fosfato pH7.6, oxalacetato 0.6 mM y NADH 0.1 mM en unvolumen total de 3 mL. Se dispara la reacciónagregando 0.01 mL de extracto bacteriano. Este

extracto contiene 32 mg de proteína/mL. Seobserva la disminución de absorbancia a 340nm debido a la desaparición de NADH (ε = 6.22mM-1 cm-1).

a- ¿Cuál es la velocidad de reacción?b- Calcule la actividad de la enzima por mL deextracto.c- Calcule la actividad específica de la enzima.

0.324160

0.335140

0.356120

0.385100

0.43380

0.48460

0.53640

0.58420

0.6350

absorbanciatiempo (s)


2. La enzima glutamato oxalacetato transaminasa (TGO) se libera a lasangre en el infarto de miocardio Para analizarla se mide su actividad



g ( )sangre en el infarto de miocardio. Para analizarla, se mide su actividadsiguiendo la desaparición de NADH acoplándola a la malatodehidrogenasa:

En una mexcla de reacción se coloca un exceso de aspartato (100

veces el Km), 0.1 mL de suero de un paciente, 0.3 µmoles de NADH yexceso de malato deshidrogenasa para un volumen de 0.9 mL. Lareacción se inicia agregando un exceso de α –cetoglutarato contenidoen 0.1 mL. Luego de un período de latencia, se observa undecrecimiento en la absorbancia a 340 nm de 0.04 unidades deabsorbancia por minuto siendo la cubeta de reacción de 1 cm. Calcular la actividad de la TGO en unidades por mL de suero de paciente.

⎯⎯⎯→TGOaspartato + α-cetoglutarato glutamato + oxalaceto

oxalaceto NADH malato NADMDH+ ⎯ → ⎯⎯ + +


3. Se quiere medir actividad β-galactosidasa enun extracto bacteriano que contiene 5 mg de



un extracto bacteriano que contiene 5 mg deproteína por mL de extracto. Para ello, seincuban 0.25 mL de extracto en amortiguador

con 3 x 10-3 M de p-nitrofenil β-galactósido enun volumen total de 1 mL. Cada 90 segundos,se toman alícuotas de 0.1 mL y se agregan a2.9 mL de NaOH 0.1 M. Se mide la formación

de p-nitrofenol a 400 nm, siendo ε = 18300 M-1cm-1 en NaOH 0.1 M.a- ¿Cuál es la actividad de la enzima por mL deextracto?

b- ¿Cuál es la actividad específica del extracto?c- ¿Qué controles deben realizarse?

0.270360 s

0.202270 s

0.135180 s

0.06890 s

A400

tiempo


8. Un gramo de músculo fresco contiene 40 unidades dei E ti l t ió i t l l d



guna enzima. Estime la concentración intracelular dela enzima asumiendo que un gramo de músculo

fresco contiene 0.8 mL de agua intracelular:

a) Sabiendo que el número de recambio de la enzima

es de 6 x 104 min-1.

b) Sabiendo que la actividad específica de la enzima

pura es de 500 unidades/mg y su peso molecular es120.000.

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enzimes Introducción 2010