ENZIMOLOGA CLNICA

Q.B.P. RICARDO LOZANO M.

DEFINICION DE CONCEPTOS

ENZIMAS: Son protenas especializadas que tienen la funcin de acelerar reacciones qumicas. VELOCIDAD: Cambio en la cantidad de materiales iniciales o bien, de productos por unidad de tiempo. Ej.(moles/s) CATALIZADOR: Agente que incrementa la velocidad de la reaccin qumica sin alterarse as mismo durante el proceso.

ENZIMA = CATALIZADOR

DEFINICION DE CONCEPTOS APOENZIMA: Parte proteica de la enzima COFACTORES: Molculas pequeas, orgnicas o inorgnicas necesarias para la actividad de la apoenzima HOLOENZIMA: Enzima Activa SUSTRATO: Molcula sobre la cual acta la enzima para formar productos

CARACTERSTICAS DE LAS ENZIMAS Todas son protenas Son Altamente Especficas Son sensibles a cambios de pH y Temperatura

CLASIFICACION GENERAL DE ACUERDO A SU FUNCIN 1. Oxidoreductasas 2. Transferasas 3. Hidrolasas 1. Liasas 2. Isomerasas 3. Ligasas

ENZIMOLOGA CLNICAEs la aplicacin del conocimiento de las enzimas al diagnstico, tratamiento y pronstico de algunas enfermedades. La alteracin de la concentracin srica de una enzima determinada, nos orienta sobre los tejidos ms probablemente afectados. Con frecuencia se relacionan los valores de dos o ms enzimas distintas para realizar un diagnstico ms preciso

Principios del anlisis de enzimasLa concentracin srica de las enzimas es muy baja, pero debido a su alta capacidad de catlisis, se puede determinar su actividad. Y se asume queACTIVIDAD ENZIMATICA CONC. DE ENZIMA

Enzimologa Clnica se basa en la evaluacin de la actividad cataltica in vitro

Principios del anlisis de enzimas

Existen dos formas de evaluar la actividad enzimtica: Por la Aparicin de productos Por la Desaparicin del sustrato

Las dos formas se evalan bajo condiciones controladas de pH y Temperatura. (los ptimos para la enzima)

Principios del anlisis de enzimas

La actividad enzimtica se expresa como Unidades Internacionales por unidad de volumen (UI/mL, UI/L)

UI= cantidad de enzima que transforma un micromol de sustrato / min. En condiciones estndar previamente establecidas

Fases de una reaccin enzimticaProducto Fase de agotamiento de sustrato LINEAL

RETARDO Tiempo (minutos)

Fase de Retardo: Ocurre inmediatamente despus de mezclar los reactivos (sustrato) con el suero (enzima) Fase Lineal: La formacin del producto permanece constante. El factor limitante es la concentracin de la enzima Fase de agotamiento de sustrato: El sustrato se va agotando y la velocidad de la reaccin disminuye hasta anularse

Fases de una reaccin enzimticaDesaparicin de sustrato

Sustrato

RETARDO

LINEAL Fase de agotamiento de sustrato Tiempo (minutos)

Fases de una reaccin enzimtica

Es necesario realizar las determinaciones enzimticas en la fase lineal Factor limitante es la concentracin de la enzima Condiciones de reaccin son ptimas(exceso de sustrato, pH, Temperatura, etc.)

Tcnicas de evaluacin enzimtica Se emplean mtodos espectrofotomtricos Si el producto absorbe luz a cierta , se registra el aumento de la Absorbancia Si el sustrato absorbe luz a cierta , se registra la disminucin de la Absorbancia

Tambin es posible analizar la variacin de algn cofactor u otro componente de la reaccin.

Tcnicas de evaluacin enzimtica Frecuentemente se emplea la aparicin de NADH o NADPH como evaluacin enzimtica.NAD+ NADP+ NADH NADPH NADH NADPH NAD+ NADP+

Aumenta la absorbancia a 340nm

Disminuye la absorbancia a 340nm

Con cualquiera de estas 3 formas es posible: Analizar el A/min

Tcnicas de evaluacin enzimtica Se emplean mtodos espectrofotomtricos Pueden ser de dos tipos: Mtodos a Punto Final Mtodos Cinticos

Tcnicas de evaluacin enzimtica Mtodos a Punto Final Se ponen en contacto los reactivos y la muestra (sustrato y enzima) Posterior a un perodo de incubacin se determina la absorbancia a la indicada (Ai) Al cabo de un tiempo establecido se detiene la reaccin y se mide la absorbancia final. (Af)

Tcnicas de evaluacin enzimtica Mtodos Cinticos 1. Se ponen en contacto los reactivos y la muestra (sustrato y enzima) 1. Se determina la absorbancia a la (Ai) indicada

1. Se realizan lecturas cada minuto durante 3-5 minutos. Para estar seguros de que se esta trabajando en la fase lineal de la curva.

Consideraciones Importantes

1. No emplear sueros hemolizados 1. No emplear muestras que hayan sido congeladas y descongeladas varias veces 1. Si se realiza transporte de la muestra desde un lugar lejano al laboratorio se debe conservar en fro sin congelar

Normalmente los niveles de enzimas en el suero son muy bajos o nulos. La importancia del anlisis de la actividad enzimtica se fundamenta en el hecho de que Las enzimas se encuentran y actan en DENTRO de la clula.

Si ocurre un dao celular, hay ruptura de la misma y se libera el contenido, aumentando as la concentracin de la enzima en el suero o plasma.

Existen muy pocas enzimas especficas de un tejido.

Pero la concentracin de una enzima por lo general es mayor en un tejido que en otro.

Es decir, la enzima X, podemos encontrarla en rin, hgado y cerebro, pero su concentracin ms alta es en rin.

FOSFATASASSon un grupo de enzimas afines y clnicamente se dividen en dos grupos importantes.

Fosfatasa Alcalina: actividad ptima a pH= 9.8 Fosfatasa cida: actividad ptima a pH= 4.9 5.0 Su funcin consiste en transferir grupos fosfato de un sustrato donador a un compuesto receptor que contiene un grupo -OH

FOSFATASASSu funcin consiste en transferir grupos fosfato de un sustrato donador a un compuesto receptor que contiene un grupo -OHFosfatasa

R1 O PEster donador de fosfato

+

R2 O - HAlcohol receptor Fosfatasa

R1 O H

+

R2 O - P

R1 O PEster donador de fosfato

+

HO-HAGUA (receptor)

R1 O H

+

HO-PIon Fosfato (HPO4)

FOSFATASA ALCALINA (ALP)

Se le da el nombre de Fosfatasa lcalina a la fosfatasa que tiene actividad ptima a un pH de 9 -10 Su funcin es remover grupos fosfato del sustrato.

Se encuentra en hgado, conductos biliares, hueso, placenta , intestino y rin,.

FOSFATASA ALCALINA (ALP) Esta prueba se emplea como marcador de tumores y como indicadora de enfermedad de hgado y huesos cuando se correlaciona con otros datos clnicos y pruebas de laboratorio. Forma parte de las Pruebas de Funcin Heptica En enfermedad sea se incrementa debido principalmente a la actividad aumentada de las clulas osteoblsticas. En enfermedad heptica se incrementa debido a que su excrecin se encuentra impedida por alguna obstruccin biliar principalmente

FOSFATASA ALCALINA (ALP) Uno de los mtodos ms empleados para su determinacin es el de Bessey- Lowry- Brook modificado por Bowers & McComb

p-nitrofenilfosfato + H2O

Fosfatasa alcalina OH-

p-nitrofenol + HPO-4 + 2H+Color amarillo = 405 nm

FOSFATASA ALCALINA (ALP) Prueba Cintica BCO SUERO Pb. Mezcla Reaccin de Sustrato 0 2.5 mL Pb 25 L 2.5 mL

Incubar a 37C/1min

Registrar Absorbancia a = 405 nm despus del minuto de incubacin. A1 a 1minuto A2 a 2 minutos A3 a 3 minutos

FOSFATASA ALCALINA (ALP)Clculos 0.047. x 2.525 mL x 1000 Fosfatasa Alcalina U/L = 18.8 x 1cm x 0.025 mL Fosfatasa Alcalina U/L = 0.047. x 5372 Fosfatasa Alcalina U/L = 252 U/L A/min. = Cambio de absorbancia por minuto Volumen del ensayo = Volumen total de la reaccin en mL 1000 = Conversin de U/mL a U/L 18.8 = Coeficiente de absorbancia del p-nitrofenol a 405 nm Paso de luz = Longitud del paso de luz en cm Volumen de muestra = Volumen de la muestra en mL 5372 = Factor derivado de las constantes en la ecuacin

FOSFATASA ALCALINA (ALP)VALORES ESPERADOS Fosfatasa Alcalina < 103 U/L (30C) < 138 U/L (37C)

Valores Aumentados Enfermedad Heptica: Ictericia obstructiva Cncer y Abscesos hepticos Cirrosis hepatocelular Cirrosis biliar Enfermedad Osea: Enfermedad metasttica de hueso Sarcoma ostegeno

FOSFATASA ACIDA (AcP)

Se le da el nombre de Fosfatasa cida a la fosfatasa que tiene actividad ptima a un pH de 4.9

Se encuentra en prstata, hgado, hueso, bazo y rin.

FOSFATASA ACIDA (AcP)

Su mayor importancia se encuentra en la prstata, ya que su actividad es 100 veces mayor en esta glndula que en otros tejidos.

FOSFATASA ACIDA (AcP) Su cuantificacin se emplea para diagnosticar el cncer metasttico de prstata y monitorear la eficacia del tratamiento.

La AcP prosttica se puede diferenciar de las dems en anlisis de laboratorio mediante la adicin de L-tartrato, ya que es sensible a este componente. El aumento de la AcP-prosttica se observa cuando el cncer ha migrado a otros tejidos, principalmente hacia el hueso.

FOSFATASA ACIDA (AcP)

-naftilfosfato + H2O

AcP

-naftol + HPO4-

-naftol + Colorante orgnico Rojo de TR Compuesto Diazicomax=405 nm

Si se agrega L-Tartrato a la solucin de reaccin, se inhibe la actividad de la AcP-prosttica presente en el suero, pero todas las dems fosfatasas cidas siguen reaccionando.

FOSFATASA ACIDA (AcP) Prueba CinticaPb AcP Total 3.0 mL Pb + Tartrato (AcP no prosttica) 3.0 mL 60 L

BCO Mezcla Reaccin de Sustrato Tartrato de Sodio 3.0 mL 0

Atemperar a 37C todos los tubos SUERO Pb 0 0.2 mL 0.2 mL Incubar a 37 C durante 5 minutos y leer absorbancia inicial de cada uno de los tubos

Despus de 5 minutos de incubacin leer Absorbancia final de los tubos.

FOSFATASA ACIDA (AcP)Clculos A/min. x 2 Volumen del ensayo (mL) x 1000 Fosfatasa Acida U/L = Coefici.de abs. x Paso de la luz (cm) x Vol. De muestra (mL) Fosfatasa Acida U/L = A/min. x 1240 para AcP Total A/min. = Cambio de absorbancia por minuto Volumen del ensayo = Volumen total de la reaccin en mL 1000 = Conversin de U/mL a U/L 12.9 = Coeficiente de absorbancia del a-naftol a 405 nm Paso de luz = Longitud del paso de luz en cm Volumen de muestra = Volumen de la muestra en mL 1240 = Factor derivado de las constantes en la ecuacin para AcP Total 1264= Factor derivado de las constantes en la ecuacin para AcP No prosttica

FOSFATASA ACIDA (AcP)Clculos 0.003. x 3.2 mL x 1000 Fosfatasa Acida Total U/L = 12.9 x 1cm x 0.02 mL Fosfatasa Acida Total U/L = 0.003. x 1240 Fosfatasa Acida Total U/L = 3.7 U/LA/min. = Cambio de absorbancia por minuto Volumen del ensayo = Volumen total de la reaccin en mL 1000 = Conversin de U/mL a U/L 12.9 = Coeficiente de absorbancia del a-naftol a 405 nm Paso de luz = Longitud del paso de luz en cm Volumen de muestra = Volumen de la muestra en mL 1240 = Factor derivado de las constantes en la ecuacin para AcP Total 1264= Factor derivado de las constantes en la ecuacin para AcP No prosttica

FOSFATASA ACIDA (AcP)Clculos 0.001. x 3.260 mL x 1000 Fosfatasa Acida No Prosttica U/L = 12.9 x 1cm x 0.02 mL Fosfatasa Acida No Prosttica U/L = 0.001. x 1264 Fosfatasa Acida No Prosttica U/L = 1.3 U/LA/min. = Cambio de absorbancia por minuto Volumen del ensayo = Volumen total de la reaccin en mL 1000 = Conversin de U/mL a U/L 12.9 = Coeficiente de absorbancia del a-naftol a 405 nm Paso de luz = Longitud del paso de luz en cm Volumen de muestra = Volumen de la muestra en mL 1240 = Factor derivado de las constantes en la ecuacin para AcP Total 1264= Factor derivado de las constantes en la ecuacin para AcP No prosttica

FOSFATASA ACIDA (AcP)Clculos

Fosfatasa Acida Prosttica U/L = AcP Total (sin tartrato) AcP No Prosttica Fosfatasa Acida Prosttica U/L = 3.7 U/L 1.3 U/L Fosfatasa Acida Prosttica U/L = 2.4 U/L

VALORES ESPERADOS Fosfatasa Acida Total U/L = 2.4 5.0 U/L Fosfatasa Acida Prosttica U/L = 0.0 U/L 1.2 U/L