Espectrometría de Masas MALDI de Imágenes Para El Análisis Directo de Tejidos

7/21/2019 Espectrometra de Masas MALDI de Imgenes Para El Anlisis Directo de Tejidos

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Espectrometra de masas MALDI de imgenes para el anlisis

directo de tejidos: una nueva frontera para la histologa

molecular

Resumen: La espectrometra de masas de ionizacin/desorcin de

matriz asistida en imgenes es una poderosa herramienta para lainvestigacin de la distribucin de protenas y pequeas molculas

dentro de los sistemas biolgicos a travs del anlisis in situ de las

secciones de teido! "#L$%&%"' puede determinar la distribucin de

cientos de compuestos desconocidos en una sola medicin y permite

obtener los per(les de e)presin celular mientras se mantiene la

integridad celular y molecular! *n los +ltimos aos, han tenido lugar

muchos avances en la prctica de espectrometra de masas de

imgenes, haciendo que esta tcnica sea ms sensible, robusta y

(nalmente muy +til! *n este resumen, nos en-ocamos en el estadoactual de la tcnica de "#L$%&%"' para describir el desarrollo

tecnolgico bsico de "#L$%&%"' en teido humano y animal y discutir

algunas aplicaciones recientes en la investigacin bsica y en

entornos clnicos!

Palabras clave: *spectrometra de masas "#L$% en imgenes&

teido&in situ&protemica &patologas!

Introduccin: *n la investigacin biomdica, el descubrimiento de

nuevos biomarcadores y nuevas drogas demandan tcnicas analticascon alta sensitividad unto con mayor rendimiento! La posibilidad de

localizar o seguir cambios en organismos a nivel molecular por la

distribucin de -ormacin de imgenes de componentes de teidos

espec(cos es la importancia primordial para desentraar patrones

bioqumicos y desarrollar nuevos tratamoientos y medicamentos

.Rohner et al 0012! *n los +ltimos aos, varias metodologas

proteomicas han sido desarrolladas que ahora hacen posible

identi(car, caracterizar y comparar cuantitativamente los niveles

relativos de e)presin de cientos de protenas que se coe)presan enun tipo de celular o teido dado! *stas ventaas han resultado por la

integracin de diversas disciplinas cient(cas incluyendo biologa

celular y molecular, quimica de protenas/pptidos, bioin-ormatica,

quimica analtica y bioanalitica, y de usar herramientas

instrumentales y so-t3are! La espectrometra de masas se ha

convertido en una herramienta indispensable para estudios

proteomicos! Las tcnicas de ionizacin y desorcin por laser como

espectrometra de masas de ionizacin/desorcin por laser en matriz

asistida ."#L$%&"'2 y espectrometra de masas de ionizacin por

electrospray .*'%&"'2 han revolucionado el anlisis de protenas!


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*stas meoras o-recen niveles de presicion de masa y sensibilidad

nunca antes alcanzados en la deteccin e identi(cacin de protenas!

"#L$%&"' es una herramienta ideal para investigar mezclas

compleas de protenas! 4ue utiliza como matriz, una molecula

aromatica acida pequea que absorbe energa a la longitud de ondadel laser de radiacin! La molecula del analito es me)clada con la

matriz, depositada en el target o en un portaobetivos de vidrio

conductor y es deada secar! $urante el proceso de secado, matriz&

analito cocristalizan! *stos cristales son sometidos a pulsos muy

cortos del laser .tpicamente un laser 562, dando como resultado la

ionizacin y desorcin de la molecula del analito! Los iones masa&

7arga .m/z2 se miden en un analizador de tiempo de vuelo .892

;asta la -echa, hay muchos tecnologas disponibles para analizar

protenas en un espcimen de teido! La tecnologa mas com+nmenteusada es la separacin y visualizacin de protenias por electro-oresis

en gel en dos dimensiones y posteriormente la identi(cacin por

espectrometra de masas y b+squeda en bases de datos! 5no de los

inconvenientes de la tecnologa de gel en $ es que la preparacin

de la muestra elimina la relacin directa entre las regiones de teido

mor-olgico y una protena espec(ca! 5na solucin a este problema

es puri(car las clulas de secciones de teido delgadas mediante

tcnicas de microdiseccin antes de la e)traccin de protenas!

#unque al en-oque ha sido e)itoso, la e)traccin de una cantidadsu(ciente de material es un trabao intensivo y requiere una gran

cantidad de clulas micro&diseccionadas! La mayor ventaa de un

anlisis "#L$% directo es evitar consumir tiempo en la e)traccin,

puri(cacin o etapas de separacin, que tienen el potencial para la

produccin de arte-actos! 5na de las recientes aplicaciones de "#L$%&

"' es su uso para el per(l y la imagen de las protenas directamente

desde la seccin de teido!

*spectrometria de imgenes con "#L$% es una nueva tecnologa que

permite un mapeo simultaneo de cientos de pptidos y protenaspresentes en una seccin delgada de teido con una resolucin lateral

de apro)imadamente


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de ese compuesto sobre toda la super(cie de la imagen! *sta

tecnologa proporciona una herramienta de descubrimiento de gran

alcance para la investigacin de procesos biolgicos porque las

entidades de las protenas observadas no necesitan ser conocidas de

ante mano! "#L$%&"' bao diversas -ormas ha sido ya e)itosamenteusada para caracterizar la e)presin de las protenas y otros

compuestos biolgicos orgnicos en numerosos teidos normales y

en-ermos! >or eemplo, se ha estudiado la organizacin de protenas

en el colon, cerebro y el epidimio en los ratones asi como la

organizacin de -os-olpidos en el teido cristalino de los mam-eros!

6ariaciones en la e)presin de las protenas han sido investigadas en

casos de en-ermos de >ar?inson y #lzheimer! 6arias -ormas de cncer

tambin han sido investigadas incluyendo gliomas, cncer de mama,

cncer de prstata, cncer de colon y cncer de pulmon! *n este

ultimo estudio, patrones de protenas han sido mostrados para

predecir el diagnostico y el pronostico! "etodologias dirigidas a la

deteccin y mapeo de componentes -armacuticos por el anlisis

directo de "#L$%&"' de secciones de teido dosi(cado tambin han

sido descritas!

*ste articulo&resumen proporciona una visin general de varias

aplicaciones de imgenes de teido animal y humano realizadas por

"#L$%&"', incluyendo la preparacin de la muestra, seleccin de la

matriz y aplicacin, mancha histolgica en el anlisis "#L$%, per(lesde teido, imgenes y anlisis de datos! 6arias aplicaciones

representan la traduccin directa de esta tecnologa a la investigacin

bsica y a las aplicaciones clnicas!

Analisis in situ de protenas a partir de secciones de tejido

&%ntrumentacion

>ara usar un espectrmetro de masas como instrumento de imagen,

es senecial que el espectrmetro este equipado con una -uncion de

barrido automatico, un sistema automatico de adquisicin de datos y

un so-t3are de visualizacin! Recientemente, varias -abricantes han

lanzado nuevos instrumentos que poseen estas caractersticas! 7asi

todos los -abricantes han desarrolado su propio so-t3are para sus

instrumentos y han incluido un controlador para el instrumento y la

reconstruccin de imgenes! %nstrumentos usados para

espectrometra de masas de imgenes puede ser clasi(cado de

acuerdo a como son generados los iones a partir de la muestra: ya

sea por pulsos de radiacin del laser o por bombardeo de partculas

energticas! 'istemas basados en laser incluyen "#L$% einstrumentos de ionizacin de desorcin por laser! *l sistema de


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*spectrometria de masas de iones secundarios .'%"'2 usa el

bombardeo de partculas con un haz continuo altamente en-ocado,

iones energticos! *n general, estos isntrumentos de imgenes estn

basados en su mayora en "#L$%&89, "#L$%&89/89 o 89&'%"'!

Los instrumentos de imgenes "#L$%&89 son de alto rendiemiento, ylos instrmentos de imgenes 89&'%"' puede pproporcionar

resolucin espacial de apro)idamente 100nm! #mbos instrumentos

tienen poderosas ventaas en la espectrometra de masas de

imgenes! ;ay varios artculos publicados de discusin y comparacin

de "#L$% y '%"' en imgenes! *ste articulo se centra en imgenes

con "#L$%!

dquisicion y preparacin de la muestra de teido!

La representatividad de los e)perimentos de espectrometra demasas de imgenes, en trminos tanto de representatividad quimica

e intregridad espacial, slo puede ser tan bueno como el peor paso en

todo el proceso de adquisicin de muestras, preparacin, -ormacin

de imgenes espectrometra de masas, y la interpretacin! # lo largo

de todas las etapas de adquisicin y preparacin de la muestra, la

integridad quimica y espacial de la muestra debe ser mantenida,

dentro de la escala de longitud determinada por la resolucin espacial

del la tcnica de espectrometra de masas usada! Los mtodos de

preparacin para -ormacin de imgenes de teido en "#L$%&%"'

deben realizarse con cuidado para mantener la disposicin espacial

de los compuestos y evitar la deslocalizacin y degradacin de los

analitos! >armetros e)perimentales que pueden ser considerados

incluyen tratamiento del teido inmediatamente despus de la

e)traccin de la muestra, seccionamiento, trans-erencia de la

muestra al target o al portaobetos de vidrio conductor de "#L$%,

aplicacin de la matriz y almacenamiento del teido despus del

seccionamiento! *l maneo cuidadoso de las muestras de teido,

incluida la congelacin del teido en nitrgeno liquido inmediatamente

despus de la e)traccin, es esencial para preservar la condicinnatural del teido! 8picamente, el interior de las muestras de teido se

e)pone utilizando tcnicas de crioseccionamiento! %ncrustacin en

polmero a temperatura de corte optima .9782 o 8issue&8e?@ pueden

ser evitados ya que pueden manchar la muestra y esto compromete

la integridad quimica! %ncrustacin en gelatina y agarosa ha sido

usada para -acilitar el maneo de muestras pequeas o -rgiles pero

mas a menudo la crioseccion es realizada directamente con muestras

de teido congelado! #unque el espesor es no crtico, secciones

gruesas de A0&0=m son optimas para el maneo y anlisis en elambiente de alto vaco del espectrmetro de masas! *l grosor de las


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secciones de teido usado es normalmente A0&0=m: secciones

delgadas pueden ser muy -rgiles y di-ciles de manipular, mientras

que las secciones ms gruesas necesitan ms tiempo para secarse y,

debido a que son muestras aislantes, puede a-ectar negativamente el

rendimiento del analizador de masas! La placa de muestra a elegir esun portaobetos transparente de vidrio conductor como o)ido&indio&

estao revestido que permite la adquisicin de la imagen

microscpica ptica y la espectrometra de masas sea realizada en la

misma muestra!

*l potencial signi(cativo de estudios de biomarcadores protemicos

basado en los teidos puede ser restringido por di(cultades de acceso

a las muestras de teido en -orma de -resco congelado ptimo!

"ientras colecciones de archivos de teidos (ados en -ormalina

adunto a datos clnicos y resultadaos representa un valioso recursoalternativo, el uso de -ormalina como (ador induce el

entrecruzamiento de protenas y ha sido generalmente asumido para

hacerlos no aptos para estudios protemicos! La (acin en -ormalina

de los teidos, generalmente seguido por la incrustacin de teido en

para(na, es el estndar y bien establecido mtodo de procesamiento

empleado por patlogos! #nalisis de teidos (ados en -ormalina e

incustraciones en para(na .>*2 de bibliotecas de biopsias han sido

hasta ahora un desa(o para el estudio de biomarcadores

proteomicos! # la -echa, incrustaciones de teido en para(na y teidos(ados en -ormalina son candidatos limitados para per(lar teidos con

"#L$%&"' porque estos tratamientos pueden obstaculizarla ionizacin

e(ciente de porteinas y pptidos! ;ay reportes de metodologas

recientes que demuestran la principal viabilidad de "#L$%&"' en

teidos .>*2!

&'elecccion y aplicacin de matrices "#L$%

Las m+ltiples -unciones desempeadas por la matriz en la desorcin e

ionizacin de grandes analitos han conducido a la eleccin ptima de

matrices para di-erentes clases moleculares que se determinaron

empricamente! >ara el anlisis de teidos, se ha in-ormado de que el

cido sinapnico o-rece las meores seales para las protenas de

mayor peso molecular, mientras que el cido B&ciano&C&

hidro)icinmico es ms conveniente para pptidos de bao peso

molecular! >ara una mayor resolucin espacial de anlisis, en el que la

deposicin de la solucin de matriz ha sido controlada

cuidadosamente para minimizar la reubicacin espacial, el cidosinapnico se ha recomendado!


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>rotocolos de aplicacin de la matriz incluyen mtodos manales como

la pulverizacin utilizando un aergra-o o 8L7 pulverizador o

inmersin de las secciones de teido contenidas en la solucin de la

matriz! 5na desventaa intrnseca de estos procedimientos manuales

es la pobre reproducibilidadD una mayor reproducibilidad se puedelograr usando dispositivos de preparacin de muestras

automatizados! *stos dispositivos se dividen en dos clases:

dispositivos de marcado y dispositivos de pulverizacin! Los

marcadores de matrices aplican pequeas gotas de solucin de

matriz en una cuadrcula sobre el teido! $ebao de cada gota la

in-ormacin espacial se pierde, por lo que la resolucin lateral es

de(nida por la distancia punto a punto! *sta distancia puede de hecho

ser signi(cativamente mas grande que el tamao real de la gota,

porque el requisito para observar en la misma posicin varias veces

para lograr revestimiento de matriz su(ciente causa prdida

signi(cativa de la resolucin debido a pequeas imprecisiones de

posicionamiento! #dicionalmente, las -uerzas capilares causan

movimiento de gotas en el teido -uera de su lugar de aterrizae! 9tra

razn para la reduccin de la resolucin del marcado es la

cristalizacin de la matriz en la boquillaD dispensadores

piezoelctricos que an-ectan el angulo de impacto de la gota! $iseos

de robots sin boquilla puede eliminar e(cientemen el problema de

obstruccion, aunque no los e-ectos nombrados anteriormente! #qu la

gota es e)pulsada desde un depsito abierto por un impulso snico!Los robots de marcado puede tambin ser usados para agregar

reactivos qumicos en el teido de una -orma controlada para realizar

modi(caciones qumicas o digestiones en el teido, como los

reportados con el 7hip .'himadzy2! 'in embargo, los robots de

marcado su-ren con respecto al tiempo de preparacin, que aumenta

cuadrticamente con el teido y la resolucin, y limitaciones de la

resolucin lateral! Los marcadores estn limitados para proporcionar

resoluciones de imgenes en el rango de 00&100=m!

$ebido a que pequeas gotitas no e)traen el analito tan

e(cientemente como las grandes, la calidad del espectro decae

rpidamente si la preparacin es usada para una mayor resolucin de

la imagen! Resoluciones signi(cativamente ms altas pueden ser

alcanzadas mediante la pulverizacin de la matriz sobre el teido! $osprincipios de pulverizacin se utilizan actualmente en equipos


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comerciales: pulverizacin neumtica y pulverizacin vibracional! *l

dispositivo %mage>rep .Eru?er $altonics2 utiliza vaporizacin de

vibracin de la matriz con un cabezal de pulverizacin piezo&elctrico!

*l cabezal de pulverizacin se mueve hacia una lamina estenopica

pr)ima a la depsito de la matriz para e)pulsar pequeas gotas conun dimetro promedio de 0 micrometros! *stas gotitas se depositan

sobre el teido y se incuban en una cmara de atms-era controlada!

8odo el proceso de pulverizacin y el secado se controla mediante un

sensor de dispersin de luz ptica que permite la evaluacin de la

humedad del teido, el espesor de la matriz y y la velocidad de

secado! >or lo tanto, %mage>rep permite altas resoluciones de hasta

1 micrometros con una buena calidad espectros por la operacin de

pulsador, siendo una ventaa signi(cativa para la operacin de

rutina! 9tro robot pulverizador, el 8"&sprayer .Leaptec2, utiliza un

capilar calentado con un aerosol neumtico que se mueve en

patrones prede(nidos sobre la muestra de teido! *sto hace que la

pulverizacin sea ms reproducible que una pulverizacin neumtica

manual! Los parmetros como la velocidad de secado y la humedad

de los teidos no se supervisan durante la preparacin, pero tienen

que ser sintonizado con antelacin!

!incin histolgica de los tejidos " MALDI#IM$

>ara la interpretacin de resultados "#L$%&%"' es absolutamente

necesario correlacionar la imagen "#L$% con la in-ormacin

histolgica! *l so-t3are avanzado "#L$%&%"' permite la superposicin

de las imgenes "#L$% sobre una imagen ptica macroscpica o

microscpica de la muestra tomada antes de la medicin "#L$%!

"ientras que la imagen ptica macroscpica primaria es su(ciente

parar reconocer el contorno del teido y para de(nir la zona de

medicin, por lo general no es posible ver caractersticas histolgicas

en esa imagen en contraste a las imgenes microscpicas! >ara una

interpretacin histomor-ologica es necesario el uso de secciones de

teido teidas! $os en-oques se han utilizado para correlacionar lahistologa con el resultado de "#L$%&%"' hasta ahora!

!incin histolgica de una seccin consecutiva

*n este en-oque, una seccin se utiliza para la -ormacin de imgenes

"#L$%, y otra seccin se utiliza para hacer la tincin histolgica! *ste

en-oque permite el uso de cualquier protocolo de tincin

especialmente para utilizar la hemato)ilina&eosina .; F *2 tincin!

*sta tcnica de tincin es la tincin histolgica pre-erida porque

produce un alto grado de in-ormacin sobre la muestra! La di(cultadprincipal con este en-oque es el hecho de que la imagen "#L$% se


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deriva de una seccin di-erente al de la imagen histolgica! >uede ser

su(ciente di-erenciar grandes caractersticas del teido, como las

grandes regiones tumorales invasoras de grandes regiones del teido

conectivo! ;asta cierto punto siguen siendo coneturas si las

caractersticas que se observan en la histologa se austancorrectamente con la in-ormacin molecular!

!incin histolgica de la seccin anterior a la MALDI#IM$

*ste planteamiento ha sido reportado para integrar la histologa y

"#L$%&%"' .7haurand et al! 00Cb2, y permite una correlacin

inequvoca de histomor-ologa y "#L$%&%"'! 5no de los

procedimientos de tincin de uso com+n en la patologa clnica

emplea ; F *, aunque lamentablemente la calidad de los espectros

de masas de estas secciones se ve comprometida signi(cativamenteen relacin a la obtenida a partir de secciones teidas! >ara evitar

estas limitaciones, se han desarrollado protocolos para permitir

histomor-ologa y per(les de protenas que se realizarn en la misma

seccin de teido! 5na serie de tintes histolgicos com+nmente

utilizado -ue probado para la compatibilidad con el anlisis de

espectrometra de masas! 'e encontr que violeta de cresol y azul de

metileno, as como varios otros colorantes, no comprometen la

calidad general de los espectros de masa y permiten que las regiones

espec(cas de teidos puedan ser analizados -cilmente! *ste

planteamiento tiene dos desventaas, sin embargo, primero, se

somete la muestra a los pasos de manipulacin adicionales antes de

la medicin! 'egundo, y ms grave es el hecho de que la eleccin de

las manchas se limita a los compatibles "#L$%! *stas manchas .por

eemplo, azul de metileno o $#>%2 son su(ientes para localizar clulas

en la histologa, pero no producen la misma in-ormacin que una

mancha de ; F *, la in-ormacin crucial sobre la muestra puede ser

omitida y todava es necesario hacer una completa tincin ; F * en

una seccin consecutiva!

Recientemente, un nuevo planteamiento ha in-ormado: La tincin de

la muestra despus de la medicin "#L$% .'ch3amborn et al 00G!2!

*sto permite el uso de la tincin de ;F* y una correlacin inequvoca

con los resultados de "#L$%&%"'! 'in embargo, un requisito previo

para este en-oque es la integridad de teido bao la medicin "#L$%,

que se muestra en la (gura! A 9tros e)perimentos "#L$%&%"' se

muestran en las igs! , < y C de esta revisin se realizan mediante

tincin de la muestra despus de la medicin "#L$%!


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Procesamiento de datos% visuali&acin " anlisis estadstico

*n "#L$%&%"' se puede obtener mucha in-ormacin de los conuntos

de datos con cientos de seales de masas! *sto es claramente una

ventaa, pero puede convertirse en una limitacin cuando un gran

n+mero de conuntos de datos tiene que ser evaluado pico&a&pico,debido a que la evaluacin puede tardar tiempo! "uchos han

desarrollado herramientas para visualizar y analizar este vasto

conunto de datos de -orma inteligente y e(ciente! 5tilizando

di-erentes estrategias de procesamiento de datos para la

visualizacin, que permite una rpida -ormacin de imgenes de

espectrometra de masa de grandes super(cies a alta resolucin

espacial y por lo tanto ayuda en la comprensin de diversas

en-ermedades y trastornos .Hlin?ert et al! 00G, 6illmann et al! 00I2!

*sto incluye muchas caractersticas bsicas pero ampliamenteutilizadas, como el anlisis de la regin&de&inters, la eleccin de la

intensidad de las escalas de visualizacin de la imagen .paleta de

colores, lineal / logartmica2, superposicin de imgenes,

categorizacin de los datos espectrales y de imagen para meorar la

relacin seal&ruido , per(les de intensidad .variacin de la intensidad

con el tiempo o en el espacio2, y bibliotecas qumicas para la

identi(cacin del analito ."c$onnell y ;eeren 00G2! #dems de

estas -acilidades, spectrometros de imgenes de masas han

continuado desarrollando una amplia gama de herramientas! *stoshan meorado la calidad de la in-ormacin e)trada de los grandes

conuntos de datos, la reduccin de la dimensionalidad a niveles ms

prcticos y permiti que di-erentes datos de imgenes (as esten

alineados y comparados! 6arios programas de so-t3are disponibles

abordan la gestin de datos, incluyendo la determinacin de la

signi(cacin estadstica y la abundancia relativa entre las especies de

protenas particulares! >or otra parte, la necesidad de este tipo de

so-t3are en medio del creciente n+mero de laboratorios de

protemica se asegurar de que dicha programacin se estandarice,

continuamente actualizado, y -cil de usar! >ara los estudios clnicos,

un gran n+mero de pacientes que necesitan ser estudiados, cada uno

con los aspectos propios de su en-ermedad! $e hecho, la premisa de

la base de la medicina individualizada se -undamenta en esta

emocionante pero enormemente complea diversidad molecular! *s

evidente que


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